Nutec NORSK UNDERVANNSTEKNOLOGISK SENTER A.S Postboks 6, 5034 Ytre Laksevåg. Telefon 55 34 16 00. Telex : 42892 nutec n. Telefax: 55 34 47 20 Rapport nr: 47-93 Revisjon nr: 0 Dato: Prosjekt nr: 25.01.94 11330.4A Rapportens tittel: Kontrollert av: 4 /2 METODER FOR STUDIER AV HYPERBAR TOKSIKOLOGI I Einar iliorsen, BIOLOGISKE MODELLSYSTEMER Godkjent av : - Brit K. Kambestad L)4. 7 //,,,. twv /.4- KiientJoppdragsgiver: FUDT (Statoil, Norsk Hydro a.s, Saga Petroleum Co., Oljedirektoratet). Arbeidet utført av: Rune Djurhuus, Anne Gurd Lindrup, Harald A. Sundland og Asbjørn Svardal. KlientWkontaktpersons referanse: C. Hordnes, A. Bang, Norsk Hydro E.W. Svendsen, Statoil Rapportskrivers sigratur: / LLy C&&t y I Sammendrag To nye cellelinjer er anskaffet. CCD-l9Lu humane lungefibroblaster er etablert, frosset ned i flytende nitrogen og tilgjengelig for forsøk. Pmsedyre for nedfrysing av CCD-l9Lu er også klar. Cellene er karakterisert m.h.p. vekstkinebkk og kloneeffektivitet. HUV-EC-C humane endoteiceller er anskaffet og oppbevart i flytende nitrogen på NUTEC. Sammen med C3HJIOT1I2 Cl 8 muse embiyo fibroblaster som er etablert tidligere, gir dette tre cellelinjer fra to forskjellige species, inkludert mennesket, og danner et godt grunnlag for eksperimentelle studier av hypetbar toksikologi. En metode for å måle toksisk effekt ved å måle intracellulær metabolisme ved hjelp av et irgereagens (XTT) er etablert. Assayet vil være godt egnet for testing av et stort antall forbindelser i forskjeffige konsentrasjoner. Metodikk for å måle detoksifiseringsagenset glutation både iniracellulært og ekstracellulært, er demonstrert og viste stor grad av reproduseibarhet. Eksponering for 0,8 bar 02 ga ca 100 % økning i intracellulært glutalionnivå i C3H/lOTlt2 Cl 8 celler. Det er ønskelig å utvide antall metoder for bestemmelse av toksiske effekter for i større grad å siki-e at ikke enkelte forbindelser har toksiske effekter som ikke oppdages ved de allerede etablerte teknikkene. Cellekulturer kan eksponeres for toluen og xylen ved å løse disse i en liten mengde av et lavtoksisk løsningsmiddel som aceton, og deretter løse dette i vekstmediet. Et eksempel på dette er vist med toksisk effekt av xylen. Dette ble målt som kloneeffektivitet under normobare forhold og ga sammenlignbaie resultater mellom de to cellelinjene C3H/10T112 Cl 8 og CCD-l9Lu. En modell med dyrking av endotelcellene på en membran og eksponering for forbindelser i gassform via en væske/gass grensefiate er presentert. Denne eller lignende modell bør utvikles/tilpasses studier av hyperbar toksikogi. Emneord på engelsk: Cell culture Toxicity Hyperbaric xtr Glutathione Exposure Emneord på norsk: Cellekultur Toksisitet Hyperbar x rr Glutation Eksponering ERKLÆRING VED FORDELING I I Graderingen gjelder til : Frigitt av FUDT ISBN: 82-7280-332-1 Fri Distribusjon Antall Sider : 29 Un ikiftlig üui$1ic a NU1EC nrribis ai.æt awi i rnn lalirt
INNHOLD SIDE 1 INNLEDNING 2 2 MATERIALE OG METODER 5 2.1 KJEMIKALIER, GASS 5 2.2 CELLELINJER OG KULTURBETINGELSER 5 2.3 EKSPONERING AV CELLEKULTIJRER FOR TRYKK 6 2.4 BESTEMMELSE AV KLONEiiFFEKTWITET 6 2.5 BESTEMMELSE AV CPJJFVEKST 7 2.6 BESTEMMELSE AV METABOLSK AKTIVITET MED XTT 7 2.7 HØSTING AV CELLER TIL BESTEMMELSE AV GLUTATION 7 2.8 ANALYSE AV GLUTATION 7 3 RESULTATER 9 3.1 CPTJEKULTURER 3.2 BESTEMMELSE AV METABOLSK AKTIVITET MED xr 10 3.3 BESTEMMELSE AV GLUTATION 11 3.4 EKSPONERINGSMETODER 11 3.5 MODELL FOR EKSPONERING AV CELLER FOR GASSFORMJGE FORBINDELSER VIA EN VÆSKE/GASS GRENSEFLATE 12 4 DISKUSJON 14 4.1 CELLEKULTURER 14 4.2 MÅLFORTOKSISKEFFEKT 14 4.3 EKSPONERINGSMETODER 15 5 KONKLUSJON 17 6 REFERANSER 18 7 FIGURER 21 NUTEC Rapp4l-93, Rev.O-RD
2 INNLEDNING Det eksisterer i dag ikke grenseverdier for kjemiske forurensninger i dykkesystemer basert på toksikologiske data fremkommet under hyperbare forhold. Til tross for at det eksisterer en del data vedrørende toksisitet av mange kjemiske forbindelser ved overflaten, er det svært lite kunnskap om hvordan et Økt totaltrykk virker inn i denne sammenhengen. Tidligere arbeider med metallsalter som finnes i sveiserøyk under hyperbare forhold, har vist at trykket har til dels betydelige effekter og at disse ikke kan forutsies. Dette innebærer at fastsettelse av hyperbare grenseverdier for denne type kjemiske forbindelser kun kan gjøres på bakgrunn av eksperimentelle data (1,2). Dette prosjektet har som målsetning å undersøke hvordan kjemiske forbindelser som er giftige ved normale betingelser, oppfører seg når de utsettes for trykk som tilsvarer det man har ved dypdykking. Dette innebærer å finne ut om og hvordan den giftige effekten (toksisiteten) endres under trykk, og evt. hvilke mekanismer som ligger bak denne endringen. Til dette arbeidet er det valgt å bruke cellekulturer som modellsystem. Cellekukurer har vært benyttet tidligere, både til generelle toksikologiske studier (3) og til studier av toksiske effekter under hyperbare betingelser (1, 2, 4-6). Andre arbeider med cellekulturer har også vist betydelige effekter av trykket i seg selv, både på cellemorfologi (4, 7, 8) og på protein- og RNA-syntese (9). Studier med sjøpinnsvin-egg viste at høyt trykk reduserte både DNA-syntesen og forsinket celledelingen (10). 11992 ble det i FUDT deiprosjektet Kjemisk arbeidsmiljø - toksikologi utført en del innledende studier av hyperbar toksisitet ved bruk av cellekulturer (11), og det ble bl.a. funnet en betydelig effekt av trykket og/eller gassblandingen alene. I det arbeidet ble det benyttet en fibroblast cellelinje (bindevevsceller) isolert fra muse-embryo. Dette er en veletablert, ikke-transformert cellelinje, som ble isolert og karakterisert i USA i 1973 (12), og som idag er tilgjengelig fra cellebanken i ierican Type Culture Collection (ATCC). Cellene vokser som enkelt cellelag på fast overflate (monolayer), er lett å dyrke og er brukt til testing av cytotoksisitet og kreftfremkallende aktivitet i flere sammenhenger (13-17). For å verifisere at observerte toksiske effekter ikke er spesifikke for et enkelt cellekukursystem, bør dette undersøkes i flere typer cellekulturer. I det foreliggende arbeidet ble det derfor planlagt å benytte to humane cellelinjer, nemlig humane lungefibroblaster og humane endotelceller. Dette er også etablerte cellelinjer som er tilgjengelige fra ATCC. Toksisk effekt har i dette prosjektet så langt vært målt ved endring i NUTEC Rapp47-93, Rev.O-RD
3 overlevelse/formeringsevne ved bruk av et klonogent assay og ved bestemmelse av veksthemmende effekt (vekstinhibering). I tillegg er det viktig å etablere metoder for å måle andre effekter enn de rent cytotoksiske. Dette kan være metoder som viser effekter på DNA (arvestoffet), på cellemembranen ved f.eks. immunologiske metoder, effekter på intracellulære strukturer som cytoskjelett og metabolske effekter. I det foreliggende arbeidet er det tatt i bruk en metode som måler dannelse av et fargestoff ved hjelp av mitokondriell dehydrogenase og bruker dette som et mål for metabolsk aktivitet (18). Dette kan gi et verdifullt supplement til de andre metodene til å måle cytotoksisk effekt på, og i tillegg kan denne metoden være bedre egnet til rutinetesting av et stort antall prøver. En annen sentral komponent i denne sammenheng er tripeptidet glutation (GSH) som utgjør en av cellens vilctigste forsvarsmekanismer mot toksiske forbindelser (19). Det er derfor av stor interesse å undersøke om GSH påvirkes av høyt trykk/endring i sammensetning av omgivende gass, og om dette evt. har betydning for toksiske effekter av andre komponenter i dykkeatmosfæren. Svært mange toksiske forbindelser avgiftes via glutationsystemet, og en endring av intracellulært glutation-nivå kan indikere en respons på et toksisk agens. Dette vil også kunne gi informasjon om mekanismen ved hyperbar toksisitet. Metodikken for å måle glutation i celler i kultur er velkjent (20). I det foreliggende arbeidet er denne teknikken tatt i bruk for å undersøke effekten både på intracellulært og ekstracellulært glutation-nivå etter eksponering av celler for hyperbare betingelser. Et viktig punkt ved undersøkelse av toksiske effekter på celler i kultur, er måten disse eksponeres for det toksiske agenset på. Den enkleste metoden, som også ble benyttet under forsøkene i 1992 (11), er å løse det toksiske agenset i vekstmediet og tilsette dette til kukurene. Dette forutsetter imidlertid at den aktuelle forbindelsen er vannløselig. Det er tidligere ved NUTEC (2) gjort forsøk med å eksponere cellekulturer for gass/damp-fase av løsningsmiddel ved å dyrke cellene på en gasspermeabel membran. Det er imidlertid noe uldart hvor stor diffusjonen av store, organiske molekyler er gjennom denne membranen. Leverandør av slike membraner har vært kontaktet, og informasjonen derfra er gjengitt i rapporten. I det foreliggende arbeidet har det derfor primært vært forsøkt å eksponere cellene via vekstmediet. Det har spesielt vært undersøkt hvordan løsningsmidler som toluen og xylen lar seg løse i en liten mengde av et lavtoksisk løsningsmiddel som er blandbart med vann, og om dette gir fornuftig dose-respons ved eksponering overfor celler i kultur. Rapporten beskriver også forslag til en modell for eksponering av celler for gass/dampfase NUTEC Rapp47-93, Rev.O-RD
4 av organiske forbindelser. Dette er hentet fra lignende beskrivelser gitt på Congress on Cell and Tissue Culture, San Diego, USA, 1993, og omfatter bruk av celler dyrket på en membran i et enkelt cellelag og eksponering av disse via en væskelgass grensefiate (21). NIJTEC Rapp47-93, Rev.O-RD
5 2 MATERIALE OG METODER 2.1 KJEMIKALIER, GASS Phenazm methosulfat (PMS), 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfofenyl)-2H-tetrazolium-5- carboxanilide inner salt (Na-, XTT) og N-etylmorfolin var fra Sigma Chemical Co, St. Louis, MO. L-glutamin, hydrogenbromid, 5-sulfosalicylsyre, perklorsyre, eddiksyre, orto-fosforsyre, metanol, acetonitril, Giemsa-løsning, dimetylsulfoksid (DMSO) og fenol var fra Merck, Darmstadt, Tyskland. Natrium borhydrid, dithioerythritol (DTE), redusert (GSH) og oksidert (GSSG) glutation var fra Fluka Chemie AG, Sveits, og moitobromobiman (mbrb) var fra Molecular Probes, USA. Trypsin (2,5 %) i Hanks balanced salt solution og REPES buffer (1M) var fra BioWhittaker, mc., Walkersville, Ved eksponering av cellekulturene for He/O 2 blandinger/trykksetting ble det benyttet følgende gass-blandinger: 1. He/O blanding (80/20), 80 % He, 20 % 02, Gardner Cryogenics A/S, Sandnes. 2. He/0 21CO 2 blanding (15/80/5), 15 % He, 80 % 02, 5 % CO2, Gardner Cryogenics A/S, Sandnes. 3. He, Hydrogas Norge A/S, Bergen. 4. CO2, Hydrogas Norge A/S, Bergen. 2.2 CELLELINJER OG KULTUREETINGELSER Stamkulturer av ilcke-transformerte C3H/1OT1/2 CI 8 muse-embryo fibroblaster (12) ble dyrket som tidligere beskrevet (16). Ved forsøk ble cellene (passasje 12-21) sådd ut på plastskåler (6 cm eller 4 cm, Nunc, Danmark) eller plastflasker (25 cm2, Nunc, Danmark) i Basal Medium Eagle (BioWhittaker, mc., Wallcersville, MD) tilsatt 10 % varmeinaktivert, føtalt kalveserum (FCS, Biological Industries, Beth Haemek, Israel). Humane lungefibroblaster, CCD-l9Lu (ATCC CCL 210), ble kjøpt inn fra ATCC (Rockville, MD, USA) i frosset tilstand og oppbevart i flytende nitrogen. Etter opptining ble stamkulturene dyrket i plasifiasker (25 cm2, Nunc) i Eagle Minimal Essential Medium med ikke-essensielle aminosyrer (Sigma Chemical Co, St. Louis, MO) og tilsatt 10 % varmeinaktivert FCS (Biological md.). Ved forsøk ble cellene (passasje 9-10) sådd ut på plastskåler (6 cm eller 4 cm, Nunc). NIJTEC Rapp47-93. Rev.O-RD
6 Humane endoteiceller fra navlesnor, HUV-EC-C (ATCC CRL 1730), ble kjøpt inn fra ATCC i frosset tilstand og oppbevart i flytende nitrogen. I eksperimenter som omfattet trykksetting, ble cellekulturmediet tilsatt HEPES buffer til 25 mm i mediet, inklusiv monobare kontrollgrupper. Alle stamkukurer og eksperimentelle kulturer ble dyrket uten tilsetning av antibiotika til mediet. Monobart (ved i bar) ble cellene dyrket ved 37 C i en atmosfære av 5 % CO2 i luft og 95-100 % relativ luftfuktighet. 2.3 EKSPONERING AV CELLEKULTURER FOR TRYKK Inknbering i He/O 2JCO 2 atmosfære med og uten økt totaltrykk, ble foretatt i to sylinderformete trykk-kamre med volum hver på 8,0 1. Kamrene hadde kontroller for regulering av temperatur, gass-blanding og trykk. Fuktigheten ble holdt mellom 95 og 100 % ved å ha et lite kar med destillert vann i bunnen av kamrene. Den relative fuktigheten ble målt kontinuerlig under trykksetting. Etter at kukurene var plassert i trykk-kamrene ble disse lukket igjen og gjennom strømmet av He/O 2-blanding (80/20) inntil luften i kammeret var skiftet ut. Utløpet ble stengt igjen og 50 mbar CO2 tilsatt. Deretter ble det trykksatt med He/O 2-blanding (80/20) til Ønsket partialtrykket av 02 var oppnådd, videre trykksatt med ren He til totalt 50 bar (49 bar overtrykk). Alternativt ble kamrene gjennomstrømmet av ren 2-blanding (15/80/5) i 10 min. 2/C0 He i 10 min, og deretter gjennomstrømmet av He/0 Utløpet ble stengt igjen (partialtrykk av 02 = 0, 8 bar), og kamrene ble videre trykksatt med ren He til totalt 50 bar (49 bar overtrykk). Temperaturen ble målt på tre forskjellige punkter i kamrene og holdt ved 36.5 ± 1.0 C. Partialtrykket ble målt kontinuerlig i begge kamrene ved hjelp av elektrokjemiske 02- celler. Kompresjon ble foretatt med 0,8-1 bar/min, for å unngå temperaturøkninger i kammeret. Dekompresjon ble foretatt med 0,5-0,6 bar/min, for å unngå temperaturfall og ceilesprengning. 2.4 BESTEMMELSE AV KLONEEFFEKTW1TET 200 celler ble sådd ut pr. skål (6 cm, Nunc). 24 timer senere ble mediet fjernet, og nytt medium (5 mi/skål) tilsatt med økende konsentrasjoner av testsubstans. Grupper som 2-blanding, ble satt i trykk-kamre og trykksatt/inkubert skulle eksponeres for trykk/he/0 som angitt ovenfor. 24 timer senere ble trykk-kammeret dekomprimert, kulturene tatt ut og mediet fjernet. Nytt medium (5 mi/skål) uten testsubstans ble tilsatt, og kulturene ble inkubert videre monobart. 9-10 døgn (C3H/1OT1/2 Cl 8) eller 12-13 døgn (CCD-l9Lu) NUTEC Rapp47-93, Rev.O-RD
7 etter utsåing ble mediet fjernet, cellene vasket med en isoton bufferløsning ( Buffered Saline Solution, BSS ), fiksert med metanol og farget med Giemsa. Kolonier av celler ble talt opp, og antall kolonier pr. skål angitt som % av kontroll. 2.5 BESTEMMELSE AV CFJLFVEKST Cellene ble sådd ut i skåler (6 eller 4 cm, Nunc). Ved eksponering for toksiske agens ble mediet fjernet 3-4 døgn senere (tidlig i eksponentiell vekstfase), og nytt medium (5 mljskål) tilsatt med Økende konsentrasjoner av testsubstans. Grupper som skulle eksponeres for trykk ble satt i trykk-kammer og trykksatt/inkubert som angitt ovenfor. Celtene ble vasket med BSS, trypsinert og antall celler pr. skål talt v.h.a. en Coulter Counter Model D Industrial (Coulter Electronics Ltd., Luton, UK). 2.6 BESTEMMELSE AV METABOLSK AKTW11ET MED XTf Cellene ble sådd ut i brønnplater (24 brønner, Costar, Cambridge, MA), 1 eller 2 ml cellesuspensjon pr. brønn. XTT-løsning (1 mg/ml i BME-medium uten serum) ble tilsatt 20 p1 PMS-løsning (1,25 mm i PBS) pr. ml XTT-lØsning. Begge IØsningene ble laget til umiddelbart før bruk. 100-200.tl XTT/PMS-løsning ble tilsatt hver brønn, og platene ble inkubert ved 37 C i 2-4 timer. Hvert eksperiment inneholdt noen brønner med rent medium (uten celler). Deretter ble platene tatt ut, i ml av mediet i brønnene tatt ut med pasteurpipette og overført til engangskyvetter (1,5 ml, Kartell). 0D 450 ble avlest på et spektrofotometer (Pye Unicam Sp8-400) med brønner uten celler som b[indprøve. 2.7 HØSTING AV CELLER TIL BESTEMMELSE AV GLUTATION 0,9 ml mediam ble overført til rør (på is) med 0,1 ml 50 % sulfosalicylsyre (tilsatt 500 jim DTE). Rørene ble ristet forsiktig og oppbevart ved 0-4 C til de ble analysert. Resten av mediet på skålene ble fjernet, skålene plassert på is, og cellene vasket forsiktig 2 ganger med 5 ml iskald BSS, og rester av BSS suget godt av. Deretter ble skålene tilsatt 300 il iskald 5 % sulfosalicylsyre (tilsatt 50 J.LM DTE), cellene skrapt av med en gummiskrape, cellesuspensjonen overført til mikrorør (2 ml) og oppbevart ved 0-4 C til de ble analysert. 2.8 ANALYSE AV GLUTATION Analyser for redusert og totalt fritt glutation (sum av redusert og oksidert glutation) ble utført som beskrevet tidligere (20). Utfelt protein ble fjernet ved sentrifugering. For 4, 160 bestemmelse av totalt fritt glutation ble 30 il celle-ekstrakt tilsatt 30.il 1,4 M NaBH NUTEC Rapp47-93, Rev.O-RD
8 Iii 140 mm HBr tilsatt 44 % DMSO, 50 jil 1,0 M N-etylmorfolin (ph 9,0) og 10111 mbrb (20 mm i acetonitril). Etter 10 min. inkubering i mørke ved romtemperatur, ble det tilsatt 20 l.tl 1,06 N perklorsyre, og prøvene ble analysert ved høytrykksvæske kromatografi (HPLC). For bestemmelse av redusert glutation ble 30 111 celle-ekstrakt tilsatt 30 p1 5 % sulfosalicylsyre (tilsatt 50 11M DTE), 160 il distilled water, 50 i,tl 1,0 M N-etylmorfolin (ph 8,5) og 10 i! mbrb (20 mm i acetonitril). Etter 10 min. inkubering i mørke ved romtemperatur, ble det tilsatt 20 p.l 1,06 N perklorsyre, og prøvene ble analysert ved HPLC. 25 av prøvene ovenfor ble injisert på et HPLC system med en 150 mm x 4,6 mm kolonne pakket med 3 Lm ODS-Hypersil partilder (Shandon Southem Ltd., Chesire, UK) og eluert ved 25 C med 1,5 mi/min. 3 løsninger ble benyttet til elueringen: A. 0,25 % eddiksyre med 10 mm tetrabutylammonium fosfat (ph 3,4), B. 20 % acetonitril med 0,25 % eddiksyre med 10 mm tetrabutylammonium fosfat (ph 3,4), C. 75 % acetonitril. Elueringsprofilen var som følger: 0-13 min., 3-22 % B i A lineær gradient; 13,1-22 min., 45 % B i A isokratisk og 22,1-28 min., 45-70 % B i A lineær gradient. Kolonnen ble vasket i 5 min, med C mellom hver injeksjon. Instrumenteringen forøvrig var som tidligere beskrevet (20). NUTEC Rapp47-93, Rev.O-RD
9 3 RESULTATER 3.1 CFJ i EKULTURER C3H/1OT1/2 CJ 8 muse embryo fibroblaster er beskrevet og benyttet tidligere til studier av hyperbar toksisitet. Cellelinjer har svært reproduserbar vekstkinetikk, og toksisk effekt på disse har hittil vært målt ved bestemmelse av kloneeffektivitet og inhibering av cellevekst (11). CCD-l9Lu humane lungefibroblaster ble tint opp og sådd ut i store flasker (80 cm2, Nunc) for å få nok celler til at disse kunne fryses ned i små porsjoner. 17, 7 106 celler ble resuspendert i iskald EMEM + 10 % FCS +5 % DMSO og fordelt på 11 cryorør (1,8 ml, Nunc), dvs. 1,6 106 celler/rør. RØrene ble satt 2 timer i fryseboks ved -20 C, og ble deretter flyttet over i tank med flytende nitrogen. Opptining av rørene 2 dager senere ga dårlig resultat, morfologisk observasjon umiddelbart etter opptining tydet på at bortimot alle cellene var døde, og inkubasjon ved standard betingelser i flere døgn endret ikke dette bildet. Tidligere erfaring med nedfrysing av celler har vist at DMSO-konsentrasjonen ofte er kritisk. 10 % FCS +5 % DMSO i mediet ved nedfrysing var anbefalt av ATCC, og kan være begrunnet av frykt for at høyere DMSO-konsenlrasjon kan føre til differensiering av cellene (22). Egne forsøk med andre typer celler inklusive humane leukemiceller, har vist at DMSO-konsentrasjonen må være fra 10 til 20 % for å få tilstrekkelig overlevelse. økning av mengden FCS har også hatt positiv effekt. Ny oppdyrking ble derfor foretatt, og cellene ble nå resuspendert i iskald EMEM + 20 % FCS + 10 % DMSO og fordelt på 10 cryorør (1,8 ml, Nunc), dvs. 14 106 celler/rør. Rørene ble satt i fryseboks ved -20 C. For å få bedre kontroll over innfrysingshastigheten som er anbefalt til ca 1 C/min.(22), ble rørene etter 45 min. pakket inn i flere lag papir og plassert i plastboks like under korken i en tank med flytende nitrogen. 45 min, senere ble rørene pakket ut og plassert nede i selve tanken. Opptining av disse cellene to uker senere ga meget bra resultat. Observasjon i mikroskop umiddelbart etter opptining, tydet på høy overlevelsesgrad, og etter inkubasjon i 6 timer ved standard betingelser hadde anslagsvis over 90 % av cellene festet seg til overflaten. Stamkukur CCD-l9Lu/8 er dermed frosset ned i flytende nitrogen og tilgjengelig for forsøk. Prosedyre for nedfrysing av ny porsjon med slik stamkultur er også klar. Det er viktig å ha en stor porsjon med stamkultur fordelt på flere rør, fordi normale, humane NUTEC Rapp47-93, Rev.O-RD
10 celler etter en tid i kultur vil stoppe å dele seg. Disse kan da ikke brukes til forsøk lenger, og nye celler må tines opp. Det ble deretter utført en del karakterisering av cellene ved at det ble tatt opp en vekstkurve (Fig.1), og generasjonstiden for cellene ble bestemt (Tabell 1). Kloneeffektivitet (PE) ble bestemt til 20, 2 ± 2,1 % (Tabell 1). Dette stemmer svært bra med de 19 % som var oppgitt fra ATCC, til tross for at PE kan være meget varierende, avhengig av kvaliteten på serumet som brukes i kulturrnediet. TABELL 1: Veksthastighet og kloneeffektivitet (PE) for C3H/1OT1/2 Cl 8 og CCD-l9Lu celler. Verdiene er typiske verdier fra representative eksperimenter. Cellelinje PE - % av 200 ± SD Generasjonstici, timer C3H/lOTlf2 Cl 8 27,2 ± 0,9 18,2 CCD-l9Lu 20,2 ± 2,1 25,2 HUV-EC-C humane endotelceller fra navlesnor er oppbevart i tank med flytende nitrogen på NUTEC. Cellene er foreløpig ikke tint opp, fordi det har vært for risikabelt å tine opp og dyrke opp/fryse ned to nye cellekulturer samtidig uten tilstrekkelig reserve i flytende nitrogen, spesielt når disse krever helt forskjellige kulturmedier og behandling forøvrig. Endotelcellene blir etter planen tint opp og dyrket for nedfrysing i stor porsjon under videreføring av dette prosjektet (NUTECs a-program). Endotelcellene er spesielt interessante med tanke på en modell for eksponering for forbindelser i gassform (se kap. 3.5). 3.2 BESTEMMELSE AV METABOLSK AKTIVITET MEDxr Det ble gjort en del eksperimenter for å finne optimale betingelser ved denne metoden m.h.p. mengde XTT-reagens, inkubasjonstid og antall celler pr. brønn/skål. 10 vol.% så ut til å være passende mengde XTT reagens. Det er ønskelig å utføre assayet med små volumer for på den måten å begrense mengden XTT, da dette reagenset er kostbart. Plater med 24 brønner og 1-2 ml medium/cellesuspensjon pr. brønn så ut til å være hensiktsmessig. Fig. 2 viser sammenhengen mellom antall celler pr. brønn og NUTEC Rapp47-93, Rev.O-RD
11 fargeintensiteten (0D 450 etter XTT-assay på C3H/1OT1/2 Cl 8. Ved disse betingelsene ser det ut til at celletallet bør være mellom 5000 og 50000 pr. brønn med en inkuberingstid på 4 timer ved 37 C. Et eksempel på anvendelse av denne metodikken til å måle toksisk effekt på er vist i Fig. 3. C3HJ1OT1/2 Cl 8 celler er eksponert for fenol, og toksisk effekt er bestemt både ved å bestemme antall celler pr. brønn og ved XTT-assay. Beregning av 1C 90 (inhibitorkonsentrasjon 90; dvs, den konsentrasjon som gir 90 % reduksjon i cellevekst 43) ga 3,0 mm beregnet fra netto cellevekst og 6,5 mm beregnet fra XTI -assay, eller0d noe som viser rimelig bra overensstemmelse. 3.3 BESTEMMELSE AV GLUTATION Glutation ble bestemt både intracellulært og i kulturmediet etter eksponering av C3HJ1OT1/2 Cl 8 celler for høyt partialtrykk av 02 og høyt totaltrykk. Resultater fra eksponering ved 0,8 bar 02 er vist i Fig.4 og viser at 0,8 bar 02 gir en økning i intracellulært glutation-nivå på ca 100 %. Dette gjenspeiles også i økning i eksporten av glutation til kulturmediet (data ikke vist). økningen i intracellulært glutation-nivå ser ut til å skyldes 02 partialtrykket og ikke høyt totaltrykk. 3.4 EKSPONERINGS METODER Gasspermeable membraner. Det er tidligere gjort forsøk med å dyrke celler på membraner (Petriperm, hydrofil, Bachofer GmbH, Reutlingen, Tyskland) som er gjennomtrengelige for gasser, men ikke for væsker (2). På denne måten kunne cellene vokse på oversiden av membranen med et medium lag over seg, og samtidig eksponeres for gass som trenger opp gjennom membranen fra undersiden (Fig. 5). Det er imidlertid noe uklart i hvor stor grad organiske molekyler penetrerer denne membranen. IfØlge produsenten er membranen ikke gjennomtrengelig for væsker, men permeabel for gassene 02, CO2 og N2. Det angis videre at membranen har meget lav permeabilitet for vanndamp. Dette ledet til spørsmålet om membranen da er permeabel for større, organiske molekyler. På direkte spørsmål om dette svarte produsenten at man selv ikke hadde data for dette, og heller ingen litteratur-referanser å vise til. Videre forsøk med denne metodikken bør derfor avventes til slike data foreligger. Bruk av lavtoksiske Iøsningmidler for å øke løselighet av organiske forbindelser i vandig medium. En rekke organiske forbindelser som har svært liten NUTEC Rapp47-93, Rev.O-RD
12 vannløselighet, løses lett i flere forskjellige løsningmidler. Dersom dette løsningsmidilet er blandbart med vann, kan man ofte få løst den aktuelle forbindelsen ved først å løse den i løsningsmiddelet og deretter tilsette denne løsningen til vann. Løsningmidler som har vært mye brukt ved testing av toksisitet i cellekulturer, inkluderer etanol, aceton og dirnetylsulfoksid (DMSO). Disse har alle liten egentoksisitet, men DMSO som er et meget kraftig løsningsmiddel for svært mange forbindelser, har stor effekt på cellemembranen og fører til Økt transport av en rekke organiske forbindelser over cellemembranen (23). Dette kan gi overestimering av toksisitet i eksperimentelle modeller der DMSO benyttes til å løse testagenset. Etanol eller aceton er bedre egnet i så måte. I det foreliggende arbeidet ble det undersøkt hvordan to aktuelle forurensninger fra dykkesystemer, toluen og xylen, lot seg løse i vann ved først å løse disse i aceton. Resultatene viste at med 0,1 % aceton i ferdig løsning var maks. konsentrasjon i BME med 10 % FCS 2,0 mm toluen og 1,0 mm xylen. Med 0,5 % aceton i ferdig løsning var maks. konsentrasjon 5 mm for både toluen og xylen i samme medium. Ved toksisitetstesting av xylen ble det derfor benyttet en stamløsning på 1,0 M i aceton. Denne ble fortynnet i mediet til maksimalt 5 mm, og aceton-innholdet ble justert til 0,5 % i alle grupper. Resultater fra slike toksisitetstester er vist i Fig. 6 og 7. CCD-l9Lu cellene (Fig. 7) var omtrent like sensitive overfor xylen som C3HI1OT1/2 Cl 8 (Fig. 6), men begge viser en dose-responskurve med en svært brå økning i toksisitet. Dette er næmiere diskutert i en annen rapport (24) som omhandler toksisitet av xylen under hyperbare betingelser. Kontrollgrupper med 0,5 % aceton i kulturmediet viste at egentoksisiteten av aceton var liten eller lik null (relativ kloneeffektivitet på 87,9 ± 5,8 % for CCD- l9lu og 102,2 ± 9,94 % for C3HJ1OT1/2 Cl 8). Et punkt som bør bemerkes her er at toksisiteten var større når HEPES buffer var inkludert i mediet (Fig. 6 og 7) enn når det bare ble benyttet karbonat/bilcarbonat-buffer (data ikke vist). I et nylig publisert arbeide er det nettopp vist at HEPES buffer Økte permeabiliteten i endotelceller fra kanin-lunger (25). I det foreliggende arbeidet ble HEPES buffer brukt for å hindre ph-økning ved eksponering av cellene i trykk-kammer, men det bør vurderes å bruke andre måter for å kontrollere ph på bakgnmn av disse resultatene. 3.5 MODELL FOR EKSPONERING AV CELLER FOR GASSFORMIGE FORBINDELSER VIA EN VÆSKE/GASS GRENSEFLATE På Congress on Cell and Tissue Culture, San Diego, USA, 1993, ble det gitt en rekke NUTEC Rapp47-93, Rev.O-RD
13 beskrivelser av cellekulturmodeller der man eksponerte cellene for gassformige forbindelser via en væskelgass grensefiate. Cellene ble dyrket på bunnen av en sylinder som ble satt ned i en kultur-skål eller -brønn med næringsmedium. Denne innsatsen hadde en porøs membran i bunnen som cellene vokste på, og cellene kunne dermed få næring gjennom membranen fra mediet under og samtidig bare ha en tynn væskefilm over seg mot omgivende gass. En skisse som illustrerer eksempel på dette er vist i Fig. 8. Mange av modellene benyttet seg av epiteiceller, men for studier av hyperbar toksisitet kan det være mer hensiktsmessig å bruke endotelceller. For det første fordi normale endotelceller kan fåes som etablerte cellelinjer fra ATCC, mens epitelcellene stort sett enten er primærkukurer eller maligne cellelinjer. For det andre er det sterke indikasjoner på at høyt oksygenpartiakrykk (som i hyperbare dykkesystemer) fører til skader på endoteicellene først og ikke på epitelcellene i lungevevet (26). I den foreslåtte modellen er det derfor brukt endoteiceller. Disse har også den fordelen at de kan dyrkes til et enkeklag som er så tett at det fungerer som en barriere mot mediet på undersiden av membranen (Fig.8). Denne modellen vil bli forsøkt utviklet under videreføring av toksilcologi-prosjektet (under NUTECs ct-program). NiJTEC Rapp47-93, Rev.O-RD
14 4 DISKUSJON 4.1 CELLEKULTURER Både musefibroblastene, C3H/1OT1/2 Cl 8, og de humane lungefibroblastene, CCD l9lu, har vist seg å være godt egnet til studier av hyperbar toksikologi. De gir begge reproduserbar vekstkinetikk og har tilstrekkelig høy kloneeffektivitet til at dette kan brukes til å måle toksisk effekt med. Resultatene fra undersøkelser av toksisk effekt av xylen målt som kloneeffektivitet, ga også svært sammenlignbare resultater fra de to cellelinjene med LD på h.h.v. 2,7 mm for C3H/1OT1/2 Cl 8 og 2,3 mm for CCD-l9Lu under normobare forwold (Fig. 6 og 7). Dette gir atskillig større tyngde i resultatene fra de kvantitative målingene av toksisiteten av xylen enn om det hadde vært funn fra bare en cellelinje. Det blir ilcke gått nærmere inn på diskusjoner om de kvalitative og kvantitative funnene vedrørende toksisiteten av xylen her, da dette er utførlig omtalt annetsteds (24). Toksiske effekter av høyt 02 partialtrykk og høyt totaltrykk blir heller ikke omtalt videre her da dette også er utførlig behandlet annetsteds (24, 27). De humane endoteicellene, HUV-EC-C, er som nevnt anskaffet og oppbevart i tank med flytende nitrogen på NIJTEC. Cellene blir etter planen tint opp og dyrket for nedfrysing under videreføring av dette prosjektet (NUTECs a-program). Som nevnt ovenfor (kap. 3.5) er endotelcellene spesielt interessante med tanke på en modell for eksponering for forbindelser i gassform. Vi vil dermed ha tre cellelinjer tilgjengelig som omfatter både celler fra forskjellige vev, og fra to forskjellige species, inkludert mennesket. Dette utgjør et solid fundament for eksperimentelle studier av hyperbar toksikologi. 4.2 MÅL FOR TOKSISK EFFEKT I tillegg til å bestemme toksisk effekt ved inhibering av cellevekst og kloneeffektivitet er det i det foreliggende arbeidet tatt i bruk både en metode som måler en effekt på den generelle, intracellulære metabolismen (XTT), og en metode til å bestemme glutation, som er en av cellens viktigste forsvarsmekanismer mot toksiske forbindelser. XT1 assayet fungerte bra så lenge celletall og inkubasjonstid ble innenfor visse grenser. Dette assayet vil sannsynligvis være spesielt godt egnet når man skal teste et stort antall forbindelser ved mange forskjellige konsentrasjoner. Glutation-bestemmelsen er meget reproduserbar, det viste bl.a. parallellene i de forsøkene som ble utført i dette arbeidet. En endring av intracellulært glutation-nivå kan indikere en NUTEC Rapp47-93, Rev.O-RD
15 respons på et toksisk agens samtidig som det gir indilcasjon på at det aktuelle agenset avgiftes via glutationsystemet, enten direkte eller etter aktivering via f.eks. cytokrom P450 systemet. Slik informasjon er viktig, fordi kunnskap om virkningsmekanismen kan gi bakgrunn for tiltak, både forebyggende og ved akutt forgiftning. I det foreliggende arbeidet ble det funnet en Økning i intracellulært glutation-nivå på ca 100 % etter eksponering for 0,8 bar 02 (Fig.4). Dette er ikke overraskende når man vet at uskadeliggjøring av oksygenradilcaler og lignende reaktive species som dannes under et høyt oksygenpartialtrykk, er en av de viktigste funksjonene til glutation. Det er derfor ikke unaturlig at glutation-nivået Økes som et svar på de oksidative omgivelsene. Nærmere diskusjoner vedr. de aktuelle funnene finnes annetsteds (24, 27). I videreføringen av dette prosjektet vil det være Ønskelig å utvide antall metoder for bestemmelse av toksiske effekter. Dette kan være metoder som viser effekter på DNA (arvestoffet), på cellemembranen ved f.eks. immunologiske metoder, effekter på intracellulære strukturer som cytoskjelett og evt. andre metabolske effekter enn glutation og mitokondrielle dehydrogenaser (XTT). Dette vil gi et mer komplett bilde av den totale toksiske effekten, og vil i større grad sikre at ikke enkelte forbindelser har toksiske effekter som ikke oppdages ved de allerede etablerte teknikkene. 4.3 EKSPONERINGSMETODER Forsøkene med toluen og xylen viste at disse forbindelsene kan løses i en liten mengde av et lavtoksisk løsningsmiddel som aceton, og dette kan så løses i vekstmediet. Tilsvarende er benyttet av andre f.eks. ved toksisitets-studier av xylen på humane lymfocytter, der xylen ble løst i DMSO og tilsatt kulturmediet (28). Dose-respons kurvene med xylen i det foreliggende arbeidet viste svært stor økning i toksisitet innenfor små konsentrasjonsendringer. Det er uldart om dette gjenspeiler en reell toksisk effekt, eller det f.eks. skyldes at xylen bindes til protein i mediet (fra serum) og at toksisiteten inntrer brått når proteinet i mediet er mettet med xylen. Dette er et punkt som bør undersøkes nærmere. Eksponering av cellekulturer for gass/damp-fase av løsningsmiddel kan være både ønskelig og helt nødvendig i en del tilfeller der det ikke er mulig å få løst forbindelsene i mediet. Metoden med å dyrke cellene på en membran som er gasspermeabel, men ikke permeabel for væsker, virker tiltalende. Men som nevnt ovenfor bør det gjøres videre forsøk med denne metodikken for å avkiare i hvilken grad store, organiske molekyler trenger gjennom denne membranen. NUTEC Rapp47-93, Rev.O-RD
16 Modellen for eksponering av celler for gass/dampfase av organiske forbindelser ved dyrking på en membran i et enkelt cellelag og eksponering av disse via en væske/gass grensefiate bygger på lignende metodikk som allerede er i bruk og bør utvikles/tilpasses studier av hyperbar toksikologi. NUTEC Rapp47-93, Rev.O-RD
17 5 KONKLUSJON 1. Stamkulturer av C3H/1OT1/2 Cl 8 muse-embryo fibroblaster og CCD-l9Lu humane lungefibroblaster er nå etablert, frosset ned i flytende nitrogen og tilgjengelig for forsøk. Prosedyre for nedfrysing av CCD-l9Lu er også klar. 2. Karakterisering av CCD-l9Lu m.h.p. vekstkinetikk (generasjonstid) og kloneeffektivitet (PE) er utført. 3. HUV-EC-C humane endotelceller er anskaffet og oppbevart i tank med flytende rfitrogen på NUTEC. En modell med dyrking av endoteicellene på en membran og eksponering for forbindelser i gassform via en væske/gass grensefiate er presentert. 4. Toksisk effekt er målt som effekt på intracellulær metabolisme ved hjelp av et fargereagens (XTT), og optimale betingelser ved utførelsen av assayet er etablert. Assayet vil være godt egnet for testing av et stort antall forbindelser i forskjellige konsentrasjoner. 5. Metodikk for å måle detoksifiseringsagenset både intracellulært og ekstracellulært, er demonstrert og viste stor grad av reproduserbarhet. Eksponering for 0,8 bar 02 ga ca 100 % Økning i intracellulært glutation-nivå i C3HJ1OT1I2 Cl 8 celler. 6. Cellekulturer kan eksponeres for toluen og xylen ved å løse disse i en liten mengde av et lavtoksisk løsningsmicklel som aceton, og deretter løse dette i vekstmediet. 7. Modell for eksponering for gassformige forbindelser ved dyrking av celler på en membran og eksponering av disse via en væske/gass grensefiate, bør utvikles/tilpasses studier av hyperbar toksikologi. 8. Toksisk effekt av xylen målt som kloneeffektivitet under normobare forhold, ga sammenlignbare resultater mellom de to cellelinjene C3H/1OT1/2 Cl 8 og CCD- l9lu. 9. Det er Ønskelig å utvide antall metoder for bestemmelse av toksiske effekter. Dette vil i større grad sikre at ikke enkelte forbindelser har toksiske effekter som ikke oppdages ved de allerede etablerte teknikkene. NIJTEC Rapp47-93, Rev.O-RD
18 6 REFERANSER 1. Jenssen J, Syversen T. Effects of high pressure and metal saks on cell growth. Alt. Lab. Animals 1991; 19: 245-249. 2. Jakobsen K. Årsrapport for FUDT deiprosjekt Kjemisk arbeidsmiljø - 1991. NUTEC. 52/91, 1992. toksikologi 3. Wilson AP. Cytotoxicity and viability assays. In: Freshney, RI eds. Animal cell culture. Oxford: IRL Press Ltd., 1986: 183-2 16. 4. Syversen T, Jenssen J. High hydrostatic pressure potentiation of the toxic effects of chromate in cell culture. Undersea Biomed. Res. 1987; 14: 11-19. 5. Jenssen J, Syversen T. High hydrostatic pressure and chromate-induced effects on cell cycie kinetics. Undersea Biomed. Res. 1987; 14: 2 1-29. 6. Jenssen J, Syversen T. Efffects of high pressure and vanadium on cell growth. Undersea Biomed. Res. 1988; 15: 353-359. 7. Dibb W, Morild E, Lærum OD. Effects of high hydrostatic pressure on normal and neoplastic rat ceils in culture. Virchows Arch. 1981; 38: 169-176. 8. Hall AC, Ellory JC. Effects of high hydrostatic pressure on passive monovalent cation transport in human red ceils. J. Membrane Biol. 1986; 94: 1-17. 9. Landau JV. Hydrostatic pressure on the biosynthesis of macromolecules. In: Zimmermann, AM eds. High pressure effects on cellular processes. New York: Academic Press, Inc., 1970: 45-70. 10. Zimmermann AM. High pressure studies on synthesis in marine eggs. In: Zimmermann, AM eds. High pressure effects on cellular processes. New York: Academic Press, mc., 1970: 235-257. 11. Djurhuus R, Lindrup AG, Sundland HA. Testing av hyperbar toksisitet i et biologisk modellsystem. N1JTEC. 1-93, 1993. NUTEC Rapp47-93, Rev.O-RD
19 12. Reznikoff CA, Brankow DW, Heidelberger C. Establishment and characterization of a cione of C3H mouse embryo ceils sensitive to postconfluence inhibition of cell divisjon. Cancer Res. 1973; 33: 323 1-3238. 13. von Hofe EH, Billings PC, Heidelberger C, Landolph JR. In vitro genotoxicity studies using complex hydrophobic mixtures: Efficient deliveiy of a petroleum sample to cultured C3HI1OT1/2 celis via lipid vesicie incorporation. Environm. Mutagen. 1986; 8: 589-609. 14. Boreiko CJ. Methodology for cell transformation assays with C3H/1OT1/2 mouse embryo fibroblasts. J. Tissue Cult. Meth. 1986; 10: 165-172. 15. Patierno SR, Lehman NL, Henderson BE, Landolph JR. Study of the ability of phenacetin, acetaminophen, and aspirin to induce cytotoxicity, mutation, and morphological transformation in C3H/1OT1/2 cione 8 mouse embryo ceils. Cancer Res. 1989; 49: 1038-1044. 16. Djurhuus R, Svardal AM, Ueland PM, Male R, Lillehaug JR. Growth support and toxicity of homocysteine and its effect on methionine metabolism in non-transformed aud chemically transformed C3H/lOTlt2 ceils. Carcinogenesis 1988; 9: 9-16. 17. Djurhuus R, Svardal AM, Ueland PM. Differential effects on growth, homocysteine, and related compounds of two inhibitors of S-adenosylhomocysteine catabolism, 3- deazaadenosine, aud 3-deazaaristeromycin, in C3H/1OT1/2 cells. Cancer Res. 1989; 49: 324-330. 18. Scuciero DA, Shoemaker RH, Paull KD, Monks A, Tierny S, Nofziger TH, Currens MJ, SeniffD, Boyd MR. Evaluation of a soluble tetrazolium/formazan assay for cell growth aud drug sensitivity in culture using human aud other tumor cell lines. Cancer Res. 1988; 48: 4827-4833. 19. MeisterA, Anderson ME. Glutathione. Ann. Rev. Biochem. 1983; 52: 711-760. 20. Djurhuus R, Svardal AM, Mansoor MA, Ueland PM. Modulation of glutathione content and the effect on methionine auxotrophy and cellular distribution of homocysteine aud cysteine in mouse cell lines. Carcinogenesis 1991; 12: 24 1-247. NUTEC Rapp47-93, Rev.O-RD
20 21. Adler KB, Cohn LA. Use of air/liquid interface cultures to assess polarized responses. Abstract Congress on cell and tissue culture, San Diego, 1993. In vitro Cell. Dev. Biol. 1993; 29A: 46A. 22. Freshney RI. Culture of animal celis. A manual of basic technique. In: New York: Alan R. Liss, mc., 1987. 23. Brayton CF. Dimethyl sulfoxide (DMSO): A review. Comell Vet. 1986; 76: 61-90. 24. Djurhuus R, Lindrup AG, Sundland HA, Svardal AM. Undersøkelse av hyperbar loksisitet av xylen på mammalske celler i kultur. NUTEC. 48-93, 1993. 25. Douglas GC, Swanson JA, Kern DF. HEPES buffer perfusate alters rabbit lung endothelial permeabiity. J. Appl. Physiol. 1993; 75: 1423-1425. 26. Thorsen E, Segadal K, Reed JW, Eliott C, Gulsvilc A, Hjelle JO. Contribution of hyperoxia to reduced pulmonary function after deep saturation dives. J. Appi. Physiol. 1993; 75: 657-662. 27. Djurhuus R, Svardal AM, Thorsen E, Lindrup AG, Sundland HA. Virkningsmekanismer ved hyperbar toksisitet i et biologisk modellsystem. NUTEC. 1-94, 1994, manuskript under utarbeidelse. 28. Richer C-L, Chakrabarti S, Senécal-Quevillon M, Duhr MA, Zhang XX, Tardif R. Cytogenetic effects of low-level exposure to toluene, xylene, and their mixture on human blood lymphocytes. Int. Arch. Occup. Environ. Health. 1993; 64: 58 1-585. NUTEC Rapp47-93, Rcv.O-RD
21 7 FIGURER FIGURER i -8 NUTEC Rapp47-93, Rev.O-RD
106 i05 oc (I) Ç ) io I I I I 0 2 4 6 8 10 12 DØgn etter utsåing FIGUR.1: Vekstkurve - CCD l9lu/10. 9000 celler ble sådd ut pr. skål (6 cm) dag 0. Hvert punkt representerer gjennomsnittet av to skåler.
1,2. 1,0. 0 0,8-0,6-0,4. 0,2. 0. I I I I 0 10000 20000 30000 40000 50000 Celler/brønn FIGUR 2: XTT-bestemmelse på C3H/1OT1/2 Cl 8 celler. Sammenheng mellom antall celler og 0D450 nm. 200-20000 celler sådd ut i 1,0 ml pr. brønn i plater 24 brønner. 100.tl XTT-reagens tilsatt til hver brønn 2 døgn etter utsåing. OD 450 nm avlest 4 timer senere med brønner uten celler som blindprøve.
200. 0 XTT-bestemmelse - 175 Netto cellevekst 0D450 150 125. ioo./ 75. 50. 25. 0..# 0 I 10_ [FenolJ, M FIGUR 3: Toksisitet av fenol på C3H/1OT1/2 Cl 8 celler. 1000 celler sådd ut i 1,0 ml pr. brønn på plater ä 24 brønner. 2 dager senere ble 100 tl XTT reagens tilsatt til hver brønn og OD 450 nm ble avlest 4 timer senere. Parallelle brønner ble trypsinert og antall celler talt. Hvert punkt er gjennomsnittet av 4 brønner ± SD.
= Ç) G -, ( 0 50 40 30 A Redusert glutation G Totalt glutation - B 20 10 Fl i 0 0.tÖo FIGUR 4: Glutation i C3H/1OT1/2 Cl 8 celler etter eksponering for trykk og forhøyet oksygen partialtrykk i 24 timer. 4000 celler sådd ut pr. skål (6 cm) og eksponert som angitt i eksponentiell vekstfase. Resultatene er fra to separate forsøk (A og B). Hvert punkt representerer gjennomsnittet av fire skåler.
FIGUR 5: Datablad for Petriperm kulturskåler act as a diffusion barrier. med gasspermeabel membran som dyrkningsfiate. No inherent fluorescence. allows excellent microscopic evaluation of celis. Optically clear as glass Very low permeability to water vapor. AHows air incubation. Liquid cutture medium covering ceils does not, therefore, Useful area is 20 cm2. 21N2t 0 Uses Dimensions are 50 mm diameter and 12 mm hight. CeIls are at the boundary between liquid and gas phase. Non toxic. Assures no random attachment. Transparent from UV 200 nm All microscopic methods. Inert against most laboratory chemicals. In situ UV/visible/IR irradiation e.g. for virus and interferon activation Electron microscopy: dish is inert against propionic acid etc. Cioning by cutting out foil on which ceils are growing. Entire foil can be removed from dish and kept for documentation. All methods of fixation and staining of celis possible. Celler Vekstmedium t02100
.1 0 0 \. c IS G) 5-4 210 [xylenj, M i02 FIGUR 6:Toksisitet av xylen på C3HI1OT1/2 Cl 8 celler. 200 celler ble sådd ut pr. skål (6 cm) og eksponert for xylen i 24 t. 9 døgn etter utsåing ble cellene farget og antall kolonier bestemt. Resultatene er angitt som antall kolonier pr. skål i % av kontroll (relativ kloneeffektivitet). Hvert punkt representerer gjennomsnittet av 6 skåler ± SD. Kontroll med 0,5 % aceton hadde relativ kloneeffektivitet på 102,2 ± 9,94 %.
120 100*T 80. > 40. c 20-0.77...i -4-3 -2 210 10 10 [xylen], M FIGUR 7:Toksisitet av xylen på CCD-l9Lu celler. 200 celler ble sådd ut pr. skål (6 cm) og eksponert for xylen i 24 t. 9 døgn etter utsåing ble cellene farget og antall kolonier bestemt. Resultatene er angitt som antall kolonier pr. skål i % av kontroll (relativ kloneeffektivitet). Hvert punkt representerer gjennomsnittet av 6 skåler ± SD. Kontroll med 0,5 % aceton hadde relativ kloneeffektivitet på 87,9 ± 5,8 %.
Endoteiceller Innsats med porøs membran i bunnen Cellekulturskål Dyrkes til tett lag med celler Mediet over cellene suges av Eksponering av celler i kanimer Cellelaget er tett, cellene suger næring gjennom membranen. Toksiske agens i gassform Oversiden av celle-laget danner en væskelgass grensefiate. Måler cellulære parametre. (\ FIGUR 8: Modell for eksponering av endoteiceller for gassformige forbindelser ved dyrking av celler på porøs membran og eksponering via en væske/gass-grensefiate.