TBT4170 Bioteknologi Eksamensnotater. Audun F. Buene audunfor@stud.ntnu.no

TBT4170 Bioteknologi Eksamensnotater Audun F. Buene audunfor@stud.ntnu.no 9. mai 2012

Chapter 1: Basics of biotechology DNA står for deoxyribonucleic acid og er bygget opp av lange kjeder med nukleotider. DNA er en dobbel-stranded helix som vrir seg med klokken, nedover. Trådene er antiparallelle, dvs at de løper i 5 til 3 retning, motsatt veg. De fire nukleotidene i DNA heter Adenine, Cytosine, Guanine og Thymine. Disse er alle bundet sammen med et phosphodiester bond, og bindingene på tvers av trådene er hydrogenbindinger mellom hhv. C - G og A - T. En DNA-tråd har en 5 -ende, som består av en terminal fosfatgruppe (PO 3 2 ). Den andre enden, 3 er en terminal hydroksylgruppe (OH). RNA står for ribonucleic acid. I RNA er Thymine byttet ut med Uracil. I motsetning til DNA som er dobbeltrådig er RNA enkelttrådig. Nukleotidene kan deles inn i to grupper, puriner og pyrimidiner. Purinene består av guanine og adenine mens pyrimidinene er cytosine og thymine/uracil. Når hydrogenbindingene i DNA dannes, er disse mellom en purin og pyrimidin. A-T og A-U har kun to hydrogenbindinger, mens G-C har tre. Pakking av DNA er nødvending, fordi det er utrolig mye av det i hver celle. I Prokaryoter supercoiles DNA et i cellene. I eukaryoter er det litt vanskeligere, fordi det finnes egne proteiner (histoner) som DNA pakkes rundt. Kulene som dannes kalles nukleosomer og sammen danner de et chromatin, som igjen coiles sammen og pakkes inn i proteiner til 30 nm fiber. Da er DNA et komprimert nok til å få plass i cellekjernen. Escherichia Coli (E.coli) er modellorganismen for bakterier. Den er normalt omtalt som en farlig bakterie om den forekommer i matvarer, fordi den finnes naturlig som tarmbakterie i pattedyr. E.coli er en gram-negativ bakterie, som betyr at den har en cytoplasmic membram, så en tynn cellevegg før den helt ytterst har en ytre cellemembran. Bakterier har ingen cellekjerne, så kromosomene flyter fritt rundt i cytoplasmaen. 1

På utsiden av E.coli finnes det ca. 10 flagella, som er med på å gi bakterien bevegelse, og det er tusenvis av pili, som lar den feste seg til overflater. Plasmider er DNA som ikke er en del av kromosomet i bakterier. De er runde ringer, og det finnes som regel flere av dem i hver celle (avhenger av kopitallet). Disse inneholder gener som er med på å gi bakterier egenskaper i konkurranse med andre, som f.eks. toksiner. Plasmider finnes hovedsaklig i prokaryoter, men er også funnet i gjær, som er en eukaryot. Plasmider er skikkelig viktige for bioteknologien. De er små nok til å dytte inn i andre celler, og greit stabile, så de er enkle å jobbe med. Diploide organismer har to like kopier av sine kromosomer. Dette gjelder for de fleste pattedyr og de fleste eukaryoter generelt. Polyploide organismer har flere enn to kopier av deres kromosomer. Mange planter er polyploide, men polyploide dyr er ytterst sjeldent. Germline cells (kjønnsceller) er i dyr de eneste cellene som deler seg i to uten å duplisere kromosomene. En kjønnscelle kan celledele seg til to haploide celler. Ved befruktning vil to haploide celler danne en diploid celle, som kalles zygot. Fra den utvikler forsteret seg. Somatiske celler er resten av cellene i kroppen, unntatt kjønnscellene. Somatiske celler er diploide, og under mitose dannes to nye diploide celler. Stamceller er viktige for medisinsk forskning, fordi de kan utvikle seg til hvilken som helst celle i kroppen. De er totipotente i motsetning til andre celler i kroppen som har sin "jobb", og ikke kan utføre en annen celles jobb. 2

Chapter 2: DNA, RNA and Protein Sentraldogmet sier at DNA transkriberes til mrna, som igjen transleres til protein. Transkripsjon er prosessen hvor DNA blir skrevet av til mrna. Skjer ved hjelp av enzymet RNA transkriptase. mrna står for messenger RNA. Inneholder koden for proteiner, og består av basene G, C, A og U. Translasjon er prosessen hvor mrna blir avskrevet, og protein dannet. Dette gjøres av enzymet RNA polymerase. (RNApol-II i eukaryoter). RNA-polymerase er en samling av protein utgjør et enzym som omgjør mrna til protein ved å lese av, og koble sammen aminosyrer i riktig rekkefølge. Proteiner kalles også for polypeptider, fra de mange peptidbindingene som dannes mellom aminosyrene. Cistron kalles den kodende region for et gen på DNA. Open reading frame (ORF) er DNA-sekvensen som inneholder koden for det som kommer til å bli det ferdige proteinet. ORF inneholder ingen stoppkodoner. Promotor er en region på DNA-tråden som RNA-polymerase gjenkjenner, og binder seg til for å starte transkripsjon. 5 -TATAAA-3 (/TTGACA) kalles TATA-boksen, og er et recognition site for transkripsjonsfaktorer. Ligger typisk -10 eller -35 bp oppstrøms for promotoren. TATA-boksen antas å være uendret gjennom evolusjonen. Siden den består av A og T, skal det lite til for å åpne DNA ved denne sekvensken. Det vil gjøre transkripsjon enklere. 3

5 /3 -UTR er deler av DNA såvel som plasmider, og heter 5 /3 -ende UTranslert Region. Koder ikke for gener men inneholder regulatoriske seter. Kodende tråd (Coding strand) er tråden i DNA som er identisk med mrna (utenom at U erstatter T). Template strand er tråden hvor RNA polymerase kjører. Motsatt av coding strand. På bakgrunn av denne tråden blir RNA bygget til å være tilnærmet likt den kodene tråden. CAT er et typisk startkodon for RNA polymerase på DNA. Tilsvarer GTA på den kodende tråden, som igjen tilsvarer AUG på mrna. Operon er en samling av gener som deler samme promotor, og er transkribert som ett mrna. Under translasjonen vil de deles opp i separate proteiner. Regulatorer kan regulere transkripsjonen av spesifikke gener. Det finnes aktivatorer som aktiverer et ellers inaktivt gen, og repressorer, som stopper transkripsjonen av et ellers aktivt gen. Regulatorene er molekyler som binder seg til eller fjernes fra et område på DNA-tråden som er essensielt for at transkripsjon skal kunne skje. Signal molecules/inducers er molekyler som endrer formen på repressorer/aktivatorer slik at disse kan være avhengig av ytre påvirkninger. Operator (LacO) er setet hvor repressoren LacI kan binde seg. CRP (cyclic AMP reseptor protein) aka CAP, er en global aktivator for transkribering av operoner. Aktiveres av camp (cyclic AMP). Enhancere er sekvenser på DNA som kan være tusenvis av basepar fra promotoren. DNA bøyes slik at denne kommer i nærheten av promotoren, og øker transkripsjonen av det gitte genet. Trenger ikke engang være på samme kromosom! 4

Insulators er sekvenser som blokkerer enhancere, slik at enhancerene ikke aktiverer feil gen. Intron er kjipe, ubrukelige kodesekvenser som ofte er på feil sted. Kan spleises vekk. De koder stort sett for ingen verdens ting. Exons derimot er alle sekvensene vi er glade i, som koder for noe nyttig. Spleising er sammenføying av kuttet DNA. Brukes for å fjerne introns. Triplet/kodon er et sett av tre basepar som koder for en aminosyre i et polypeptid. I et kodon er den siste posisjonen kalt wobble-posisjonen. Det siste baseparet har ofte liten betydning for hvilken aminosyre det kodes for, men er nyttig for å kunne variere kodonbruken mellom forskjellige organismer. trna er kort for transfer RNA. Er proteiner som er ansvarlige for at riktig aminosyre fester seg til riktig mrna-sekvens under translasjonen. trna består av et Anti-codon, som tilsvarer sekvensen trna må ha for å kunne binde seg til mrna. trna inneholder også en acceptor stem, som er stedet på trna hvor amonisyren er festet. Ribosomet er "maskinensom henter inn riktig trna og linker sammen de riktige aminosyrene til et protein. Shine-Dalgarno-sekvensen i E.coli er AGGAGGU, som også er en ganske god tilnærming til SD-sekvenser i andre organismer. Som regel plassert 9-15 bp (Wiki sier 8 bp) oppstrøms (mot 5 -enden) fra startkodonet AUG. Er en RBS på mrna. Elongering er prosessen hvor aminosyrene adderes en etter en for å danne proteiner. Skjer nødvendigvis i ribosomet. Polysom (polyribosom) er et cluster av ribosomer som kan binde seg til mrna i prokaryoter. Transkripsjon og translasjon kan ofte skje samtidig i prokaryoter, fordi de ikke har noen cellekjerne. 5

Symbiotic theory kalles historien om hvordan mitokondriene og kloroplastene hoppet inn i cellene våre. De var visst en gang selvstandige bakterier eller alger som dannet et symbiotisk forhold til våre forfedres celler. Chapter 3: Recombinant DNA Technology Isolasjon av DNA skjer ved først å fjerne cellevegger, som kan gjøres mekanisk eller kjemisk. Proteiner kan fjernes med fenol, mens RNA som finnes i cellen fjernes med ribonuklease (RNase). Gjøres forskjellig i alle organismer. Elektroforese er en metode for å skille DNAmolekyler basert på deres lengde. Baserer seg på at fosfatgruppen i DNAskjelettet er negativt ladet og vil tiltrekkes en positiv elektrode. DNA ledes gjennom agarose/(polyacrylamide) og korte molekyler beveger seg lengst. DNA/RNA kan farges med ethidium bromid, slik at det blir orange flekker der det er DNA. Pulsed field gen electrophoresis (PFGE) er en metode for å få veldig lange DNA-molekyler gjennom agarosegel. Pulserende og alternerende elektriske felt med forskjellige vinkler gjør at DNA beveger seg tredimensjonalt. Restriksjonsenzymer binder seg til sine egne spesifikke DNA-sekvanser, og kutter. De kan enten kutte blunt eller sticky, som resulterer i rette ender eller overlappende ender. Type II restriksjonsenzymer er nyttigst for bioteknologi, da disse kutter midt i sekvensen. Okazaki fragment er en sammenhengende DNA-sekvens laget på lagging strand ved DNA-replikasjon. Limes sammen med DNA ligase. Merking av DNA kan generelt skje på to måter. Enten ved hjelp av radioaktive isotoper substituert inn på DNA-skjelettet, eller ved hjelp av fluorescerende atomer. Enten kan fosforatomet i fosfatgruppen byttes ut med isotopen 32 P, eller så 6

kan et av oksygenatomene substitueres med 35 S. Southern blot er en metode for å sjekke hvor et enkelt gen er plassert i en lang DNA-sekvens. En DNA-probe med radioaktive/forforescerende isotoper blir laget, og denne vil binde seg til splittet DNA (vha. varme eller sterk syre). Kun den DNA-sekvensen som matcher proben vil da dukke opp i screening. Northern blot er noe likt southern blot bortsett fra at det er mrna som matches med en probe vha nucleic acid hybridization. Trenger ikke sterk syre, og man slipper introns, som man har i DNA. Kloning vectors er plasmider med visse egenskaper som gjør de ideelle for kloning av gener. Disse inneholder ofte et gen for antibiotikaresistens, slik at kolonien kan dyrkes. De har et kopitall, som helst skal være stort. Dette fordi da vil det til enhver tid være mange kopier av plasmidet i en celle. De inneholder også et multiple cloning site (MCS) sammensatt an mange kuttesekvenser for restriksjonsenzymer. Det er her insertet plasseres. Construct heter det sammenføyde plasmidet som har det klonede genet på plass. Brukes om alle rekombinante molekyler konstruert med genetisk engineering. Shuttle vektorer er vektorer som har alt som trengs for å overleve i to typer celler. Dette kan for eksempel være både i gjær og bakterier. Mitose er celledelingen som hovedsaklig skjer i gjær og bakterier. Diploide celler har to sett med kromosomer. Disse splitter seg, og to nye diploide celler dannes med dobbelt gensett. Meiose er dannelse av haploide celler (kjønnsceller) fra diploide celler. Man går fra en celle med to gensett, til fire celler med enkle gensett. Transformasjon er prosessen hvor en endret vektor skal klones inn i en celle. For at dette skal være mulig, må cellen åpnes en liten stund. Dette kan gjøres på to 7

måter: Kalsiumioner på is fulgt av termosjokk i 5 min, eller elektroporering. Sistnevnte er oftest best, da denne er svært allsidig, rask, og ikke så ødeleggende som førstnevnte. Gen-bibliotek er nor et helt genom kuttes med et restriksjonsenzym, og klones inn i en mengde vektorer som kan dyrkes i cellekolonier. Slik har man et helt genom i mange små cellekolonier på noen agarskåler. Ekspresjonsbibliotek Det samme som et gen-bibliotek, men alle genene kan også uttrykkes som proteiner. Om det er gener eller ukodende sekvenser som translateres er ikke så viktig. For eukaryoter bør man bruke cdna for å unngå alt ikke-kodende DNA. For prokaryoter er det lite ikke-kodende DNA, så da er det ikke så viktig. Revers transkriptase er et enzym som danner cdna fra mrna. Lenge var dette tenkt umulig, fordi det strider mot sentral dogmet i biologien. Chapter 4: DNA Synthesis in Vivo and in Vitro Replikasjon av DNA skjer i eukaryoter med en hastighet på ca 50 kb/s, mens i prokaryoter kopieres ca 1000 kb/s. DNA helicase åpner DNA-helixen, slik at replikasjon kan starte. DNA-trådene holdes fra hverandre med proteiner som hindrer annilering. Origin of replication (ori) er stedet på DNA hvor repliksajonen starter. I eukaryoter finnes det mange slike ori er, mens i prokaryoter er det kun ett. Disse er typisk 245 bp lange, og består hovedsaklig av Adenine og Thymine. Disse er puriner med kun to hydrogenbindinger mellom seg, og krever dermer mindre energi for å åpnes. Leading strand replikeres i 5 til 3 -retning. Lagging strand er den andre siden av replikasjonsgaffelen, og her lages mange 8

små Okazaki fragments pga retningen av replikasjonen. RNA-primerene blir fjernet av RNaseH, deretter vil DNA polymerase I fylle inn de manglende basene. Til slutt kommer DNA ligase for å tette hullene i stråden som DNA pol I ikke kunne tette. RNA-primer er et 10-11 bp lang RNA-tråd, som binder seg først på leading strand og kontinuerlig i starten av hvert Okazaki fragment. Dette skjer slik at DNApolymeraske skal ha en 3 -OH å starte replikasjonen fra. Mismatch repair system er en måte å for cellen å finne feil i replikasjonen. Dette gjøres ved å lete etter buler langs DNA-molekylet. Disse vil komme av at en base med 2 hydrogenbindinger må pares med en som har 3. Det antas at tråden med minst metyleringer er den originale, korrekte tråden, og denne brukes da som mal når feilen skal fikses. Theta-replikasjon skjer f.eks. i E.coli fordi replikasjonen starter i oric og går i begge retninger, slik at halvveis ser det ut som den greske bokstaven theta. Mitose er begrepet som brukes for celledeling, hvor cellen replikerer sitt DNA, og deler sine andre cellekomponenter i to. Deretter blir to datterceller dannet. in Vitro DNA syntese kan gjøres på laben, og følger stort sett samme metode som in Vivo DNA syntese. Man trenger nukleotider, primere, DNA polymerase. Bland godt, og vips! Oligonukleotider er et samlebegrap på korte, syntetiserte DNA-molekyler som er kortere enn 20 bp. DNA-syntese av hele gener er ganske vanskelig. Det er slik at om man skal lage 100 bp DNA med 98 % nøyaktighet, vil utbyttet være omtrent 10 % tilslutt. Syntetiserte gener er derfor laget med overlappende endre, og limes sammen til komplette gener som dette er nødvendig. 9

Sanger-sekvensering er oppkalt etter Frederick Sanger, som sekvenserte Insulin først. Han gjennomførte vanlig oligonukleotid-syntese, men innførte en viss andel dideoxynukleotider. Disse har ingen 3 -OH-gruppe. Derfor vil det ikke kunne syntetiseres videre noe i den DNA-tråden som får et slikt molekyl. Dermed vil en viss mengde dna-molekyles stoppes ved hver base. Når dideoxynukleotidene i tillegg er radioaktive, kan man lese basesekvensen ut fra en elektroforesegel. Polymerase chain reaction (PCR) er bioteknologiens kopimaskin. Man bruker små spesifikke primere som annilerer seg til start og slutt (hhv. 5 og 3 -ende), etter denaturering av DNA-tråden. Deretter tilsettes DNA polymerase og nukleotider. PCR kjøres da mellom primerene, og oppamplifiserer kun det området man er interessert i. Etter noen omganger med eksponensiell vekst/kopiering, har man mange millioner like kopier av genet. PCR-sekvensering eller cycle-sequencing brukes PCR og en viss andel dideoxynukleotider med forskjellig forforescens for A, T, G og C. Derfor vil PCR lage mange kopier av forskjellige lenger, som kan kjøres i elektroforesegel. En maskin kan lese av de forskjellige fosforescensene, slik at kun en mix er nødvendig. Dette er en veldig rask og ryddig prosess. Revers transkriptase PCR (RT-PCR) bruker enzymet revers transkriptase for å lage cdna fra mrna. Deretter kjøres PCR på cdna et, som oppamplifiseres. Dette er en god metode for å oppamplifisere DNA fra eukaryoter, siden disse har masse uniteressante introns som er kjipt. Chapter 8: Genomics and Gene Expression Chromosome walking er en måte for å sekvensere lengere gener, typisk 1.3 til 7 kb. Man trenger en primer, deretter bruker man PCR-sekvensering et lite stykke. Fra sekvensen lager man en ny primer og går videre derfra. Fungerer greit for middels korte stykker, men tar lang tid. De startet The Human Genome Project på denne måten, men gikk etter hvert over på Shotgun sekvensering. 10

Shotgun sekvensering er en annen måte å sekvensere STORE gener på. Først kuttes genet opp med restriksjonsenzymer, før det klones og alle bitene sekvenseres separat. Til slutt brukes en datamaskin for å sette sammen alle bitene. Dette kan den gjøre fordi det statistisk sett vil finnes overlapper. Menneskets genom består av omtrent 2.9 10 9 basepar. Det antas at det består av 25.000 gener, hvor vi kun vet fuksjonen til halvparten. I motsetsning har Mycoplasma kun 500 gener i sitt genom, mens enkelte planter kan ha over 40.000. Pseudogener er gener som opptrer flere steder i genomet, men som ikke uttrykkes. For å kunne kalle noe et gen, må det ofte finnes en tilsvarende sekvens i et mrna. Det finnes også DNA som transkriberes, men som ikke translateres til protein. Dette kan bli til rrna eller trna. Familier av gener er vanlige grupperinger. Disse kommer av mutasjoner, slik at gener som gjør helt forskjellige ting kan ha vært samme gen i en organisme for lenge siden. Superfamilier er et navn på slike grupper som er utviklet fra ett gen, som f.eks. globin-superfamilien som inneholder hemoglobin (transporterer oksygen i blodet) og myoglobin (gjør det samme, men i musklene). Mutasjoner foregår hele tiden, men med forskjellige rater for forskjellige gener. Dette avhenger av mange faktorer, som f.eks. metylering. Mutasjoner kan være helt ufarlige, om de f.eks. skjer på wobble-posisjonen (siste av 3 baser i et kodon) da dette ikke har noen effekt på proteinet som lages. Essensielle gener har historisk sett hatt en lavere mutasjonsfrekvens enn ikke-essensielle. Gen-ekspresjon er hvorvidt et gen uttrykkes som protein. Å sjekke dette er litt vanskelig, men gjøres ofte ved at genet fjernes og erstattes med et reporter-gen. Dette vil innføre en synlig forandring for cellene genet er i, og genet er aktivt under de gitte forholdene. Reporter-genet kan splitte disaccharider, eller gjøre cellene fosforescerende/fluorescerende. Et positivt utslag med reporter-gen vil si at plassen genet sitter på er aktiv. 11

Chapter 9: Proteomics Betyr analyse av proteiner. Proteomet er den totale samlingen av alle proteiner hos en organisme. Translatomet er den totale samlingen av proteiner som til enhver tid translateres fra mrna. Translatomet avhenger av hvilke forholde det er i cellen. Polyakrylamid-gel-elektroforese (PAGE) er en måte å skille proteinger på, etter størrelse. For at proteinene skal kunne bevege seg i det elektriske feltet, må de få en netto ladning. Dette gjøres med kokende SDS (sodium dodecyl sulfate). SDS pakker inn proteinene, og gir de en negativ ladning. Siden SDS fordeler seg homogent på proteinene, vil de største proteinene få størst negativ ladning. Denne prosessen kalles ofte SDS-PAGE. 2D-PAGE er det samme som SDS-PAGE, men i "2 dimensjoner". Først blir proteinene separert mhp sin egen native charge. Dette kommer av at alle proteiner har en viss mengde aminosyrer med hhv. positive og negative sidegrupper. I et elektrisk felt vil proteinene fordele seg mhp sin ladning i en polyakrylamid-gel med en ph-gradient. Deretter behandles gelen med de fordelte proteinene med SDS, og legger inntill en polyakrylamidgel, og elektroforese gjøres. På denne måten kan men få fordel proteinene mhp både egenladning og molvekt. Western blotting er en måte å finne akkurat det proteinet man vil finne i en blanding av mange. Det antas at aminosyresekvensen av proteinet er kjent. Først gjennomføres SDS-PAGE eller 2D-PAGE, slik at proteinene er fordelt i en polyakrylamidgel. Proteinene overføres deretter til en membran av papir (nitrocellulose) eller nylon. Dette gjøres ved at membranen gis en positiv ladning, slik at de negativt ladede proteinene fester seg. 12

Deretter behandles gelen med et antistoff, som binder seg til akkurat det proteinet vi er interessert i. Fortsatt synes ingenting på membranen, inntil vi tilsetter et andre antistoff, som er merket. Dette er et antistoff som gjenkjenner alle andre antistoff, og som vi enten kan se med det blotte øyet, eller som har fosforescens eller radioaktivt. Western blotting brukes til å bevise at et protein er uttrykket, men også til å anslåp mengden av protein. Dette kan gjøres fordi styrken på signalet fra antistoffet er proporsjonalt med mengde protein. High Pressure Liquid Chromatography (HPLC) er en metode for å separere såvel som detektere proteiner i løsning. Dette gjøres ved eluering, som er å la en mobil fase bevege seg gjennom en stasjonær fase (kolonne full av drit). Lette molekyler vil komme først ut, og om vårt protein er merket kan vi detektere når dette kommer ut på andre siden. Om man tar ut mange prøver kontinuerlig, vil man få en fordeling av proteiner. Bestemmelse av proteiner kan være vanskelig, men man kan f.eks. bruke massespektrometri. Problemet her er at proteiner ofter er skikkelig store, og dermed vanskelige å ionisere. Det finnes avanserte metoder for å få dette til, som electrospray ionization (ESI) og Matrix-assisted laser desorption-ionization (MALDI). Protein-tagging er en metode å separere de ellers ganske inaktive proteinene. Dette skjer ofte helt ned på DNA-nivå, ved at man legger til en tag i direkte tilknytning til genet, som transkriberes sammen med genet. En tag kan være polyhistidine, også kalt His6 tag. Det blir kodet 6 histidiner før genet, som binder seg til Ni + 2, f.eks. i en kolonne. Når en blanding av proteiner heller gjennom kolonnen, vil de med His6 tag bli hengende igjen i nikkelcoatingen. Disse kan vaskes ut senere med histidine eller imidazole. Til slutt må taggen fjernes fra resten av proteinet. En annen metode for å gjøre dette er med en FLAG-tag (AspTyrLysAspAspAspAspLys), som fester seg til FLAG-antistoff som kan være i en kolonne. 13

Metabolomics er analysen av alle små molekyler som finnes inne i en celle eller en organisme. Dette kan f.eks. være lukt- og fargemolekyler. Mange metabolitter er funnet ved hjelp av NMR og thin layer chromatography (TLC). Massespektrometri er den ideelle metoden for å analysere et helt metabolom. Chapter 10: Recombinant proteins Rekombinante proteiner er proteiner fra klonede gener, som kan produseres i stort antall. Ekspresjonsvektorer er plasmider med en sterk promotor, og antibiotikaresistens. Disse plasmidene har også et MCS/polylinker for å plassere inn inserts. Ekspresjonsvektorer brukes til å lage eukaryotproteiner i bakterier. Translasjons ekspresjonsvektorer er vektorer spesialisert for å bedre translasjonen. Dette gjør de ved å ha et RBS (ribosome binding site) med tilhørende startkodon ATG, i vektoren. Restriksjonsenzymet NcoI brukes til å kutte, fordi dette kutter i sekvensen C/CATGG, som inneholder startkodonet. Om genet ikke har et slikt kuttesete, kan dette lages med site-directed mutagenase. Kodonbruken varierer fra organisme til organisme. For å ha riktig, og nok mengde trna i en celle, finnes det plasmider som har genene for å lage de trna vertscellen selv ikke har. Protein fusion er en måte for å få cellen til å eksportere de fremmede proteinene den har laget. Dette gjøres ved å klone to proteiner ved siden av hverandre i ekspresjonsvektoren, ett cellen vanligvis eksporterer og ett som vi vil lage selv. Delen av proteinet som vanligvis eksporteres vil gjenkjennes og passere gjennom cellemembranen, mens det tar med seg genet vi vil ha. Mellom de to genene kodes det for et protease-kløyve-sete, slik at de to proteinene kan separeres etter de er utenfor cellen. 14

Produksjon av proteiner i pattedyr er ofte svært vanskelig og langsomt, men kan gjennomføres med mammalian shuttle vectors. Man trenger nye origoer for replikasjon, og disse kan hentes fra virus som infiserer pattedyr, eller fra gener som uttrykkes hyppig i deler av et pattedyr. Chapter 11: Protein Engineering Protein engineering er å endre egenskapene til eksisterende proteiner. Dette gjøres ved å endre sekvensen i genet, og kan gi fordelaktige egenskaper. Stort sett handler protein engineering om å lage mer stabile proteiner for bruk i industrielle prosesser, ofte ved høye temperaturer. Disulfidbindinger bidrar til å øke stabiliteten i en polypeptidkjede (protein). Disse bindingene dannes mellom to og to Cystein-aminosyrer i proteinet (Cys- S-S-Cys). Det er nødvendig at proteinet bøyer seg for at Cysteinene skal møtes. Aminosyrer kan endres, slik at det Cysteiner kommer på riktig plass, og danner disulfidbindinger. Dette fører igjen til økt stabilitet for proteinet. Stabilitet kan oppnås på andre måter også: Man kan bytte ut små aminosyrer, som har stor bevegelsesfrihet, med større, mer forgreinete amonisyrer. Dette fører til at proteinet blir med rigid, og vil øke stabiliteten. Proteiner har en sekundærstruktur som heter en alpha helix. Det er en høyrehåndsvridd enkelt coil, med fire aminosyrer for hver runde oppover. Denne konformasjonen gjør proteiner til dipoler. Ved å innføre aminosyrer på C- og N-terminalen med hhv. motsatt ladning av dipolen til proteinet, vil dette stabilisere proteinet i helhet. Directed evolution er en metode brukt i protein engineering for å dra nytte av naturens egen seleksjon i utviklingen av proteiner og RNA. Direkte evolusjon gjen- 15

nomføres enten ved error-prone PCR eller med DNA shuffling. Error-prone PCR (eppcr) er vanlig PCR, men gjennomført i omgivelser rike på MnCl 2. Dette fører til at feil gjort av polymerasen blir stabilisert, og ført videre til neste generasjon av gener. Slik innføres randomiserte feil i DNA. DNA shufflling er PCR gjennomført i uten primere på oppkuttede biter 100-300 bp lange, hvor DNA blir stokket om og satt sammen igjne. Til slutt blir det oppamplifiert med vanlig PCR. Etter at mutasjonene er gjennomført må resultatet screenes for å sjekke om noen av klonene har de ønskede egenskapene. Når disse er funnet kan de igjen oppamplifiseres videre. Chapter 12: Environmental Biotechnology Viktig kapittel for verden, kanskje ikke så viktig for eksamen.. Metagenomics er studien av genomene til store samlinger av organismer samtidig. F.eks. fra jordsmonn eller sjøvann. Metagenomics kan bidra til å finne nye antibiotikum og andre proteiner/stoffer av interesse. Ved å studere organismer fra ekstreme områder kan man finne nye biologiske veger for syntese eller nedbryting av stoffer. Dette kan f.eks. være organismer som lever ved vulkaner på sjøbunnen, ved oljebrønner eller organismer som lever i områder med høy radioaktivitet. Analyse av metagenomer kan foregå enkelt med PCR, om man har riktige primere. Det spiller ingen rolle om blandingen er fra 1000 organismer, siden PCR kan være gen-spesifikt. 16

Chapter 13: Pathway Engineering Dette handler om hvordan man kan få organismer til å lage et stoff vi vil ha. Da må man ofte lage nye biokjemiske veger, via gener fra en eller flere organismer. Bioremidering er et viktig begrep i bioteknologien. Det handler om å bryte ned forurensninger i miljøet ved å bruke mikroorganismer. De kan f.eks. bryte ned ugressmiddel, forurensninger og jordbruksavfall. Fermentering er produksjon av alkohol fra biologisk materiale. Etanol produseres biologisk ved hjelp av gjær, som i øl, vin eller vodka. I Tequila produseres alkoholen av en bakterie som heter Zymomonas ved fermentering av Agaveplanten. Mange andre bakterier og mikroorganismer produserer alkoholer så vel som andre organsike kjemikalier, ofte en blanding. Stivelse og cellulose kan nedbrytes til kortere polysaccharider, som igjen kan brytes ned til glukose. Av glukosen kan man fremstille alkohol. Måten å bryte opp stivelsen på skjer med to enzymer α-amylase (kutter rette stykker) og glucoamylase (kutter forgreininger). Cellulose består av lange kjeder med polysaccharider, som har rette stykker og mer krøllete stykker. Cellulose er ganske greit å bryte ned med 3 forskjellige enzymer: Endoglucanase, Cellobiohydrolase og Exoglucanase. Til slutt kan Cellobiase brukes for å bryte små biter ned til glukosemolekyler. Alle disse enzymene kan klones inn i f.eks. Zymomonas, slik at bakterien kan lage dem selv. Da har man til slutt en bakterie som kan spise papir, og lage alkohol direkte. Dette gjøres med pathway engineering. Polyketider er lineære kjeder av carbon, med keton- og alkylgrupper. Disse er visst en måte å lage nye antibiotikum på, slik at man kan sloss mot resistente bakterier som følge av overdreven antibiotikabruk. Det er sikkert enkelt å endre på den kjemiske formelen i disse polymerene, slik at man kan få andre antibiotikum som knekker de resistente bakteriene. 17

Biopolymere, også kalt bioplastikk, kan man få bakterier til å lage. Forskere fant en bakterie som lagret en biopolymer inne i cellen når det var gode forhold, og tæret på dette lageret i dårlige tider. Litt som vårt kroppsfett. Genet for dette kan overføres til f.eks. planter, og man kan fikse det slik at det produseres hele tiden. Dette kan bety at en soyaavling kan produsere biologisk nedbrytbar plastikk. Polymeren som lages heter Polyhydroxybutyrate (PHB), og går under produktnavnet Biopol. Chapter 14: Transgenic Plants and Plant Biotechnology Gregor Mendel er genetikkens far. Han eksperimenterte med erteplanter på 1860- tallet, og fant ut at gener kan være dominante overfor andre gener. Han gjennomførte sine eksperimenter ved kryss-pollinering. Mutation breeding er et begrep brukt på forskningen som ble gjort på tidlig 1900-tallet. Man bestrålte plantefrø med røntgenstråler, og så om det hadde noen effekter på plantene. Slik ble nye farger og størrelser på blomster oppdaget. Transgene planter er planter som har et transgen. Det er et fremmed gen fra en annen organisme som er ment å endre egenskapene til planten. Slike egenskaper kan være f.eks. plantemiddelresistens eller mer tørketolerante planter. Planteceller er totipotente, som betyr at enhver celle i en plante har mulighet til å bli til en helt ny plante. Det betyr at få planteceller kan dyrkes opp til mange nye like planter. Dette kan gjøres på en petri dish, også kalt en calluskultur, eller i væske kalt suspension culture. Suspansion culture er måten man dyrker planteceller i en væske. I væsken har man planteceller ofte kalt protoplasts, som er planteceller med fjernet cellevegg, sammen med næringsstoffer og plantehormoner. Man kan også bruke microsporer 18

(pollen) eller makrosporer (eggceller). Calluskulturer er planteceller som dyrkes på fast medium. Her brukes planteceller fra røtter eller skudd, og dyrkes sammen med næringsstoffer på petri-plater. Cellene overføres til plater med gradvis lavere hormonkonsentrasjoner, til de til slutt slår rot. Genetisk modifisering av planter kan gjøres for mange formål, som f.eks. å øke vitamininnholdet i ris (Golden Rice), gjøre planter (soyabønner) immune for Round-up eller gjøre planter giftige for skadedyr. Ti-plasmidet er en kjekk sak for å transformere gener inn i planter via bakterier. Skadede planter avgir noen fenol-lignende stoffer, som trigger bakterien Agrobacterium. Bakterien starter transkripsjonen av genene for Ti-plasmidet. Plasmidet kopierer av en bit som heter T-DNA, som innkapsuleres i proteiner og fraktes inn i plantecellen, og integreres i plantegenomet. Biten av T-DNA som nå sitter i plantens DNA vil være ansvarlig for produksjonen av to enzymer, nemlig auxin og cytokinin. Disse sørger for å hhv. gjøre plantecellene større, og å fremme celledeling. Akkurat som en kreftsvulst. For å få inn det genet vi vil planten skal produsere, trenger vi kun erstatte genet som koder for T-DNA. Round-Up er et populært ugressmiddel, som egentlig er glyphosate. Det stopper enzymet EPSPS i å gjøre jobben sin i omforming av energi for planten, slik at det sulter i hjel. EPSPS finnes ikke i pattedyr, så vi kan spse Round-Up på frokostblandingen. Forskerene sjekket bakterier som også har EPSPS, men som tåler glyphosate, og fant det ansvarlige genet. Dette genet kan få plantepromotor og -terminator, og kan klones inn i planter. Det kan gjøres enten med Ti-plasmid, eller med en gene gun. Gene gun er en metode for å få DNA inn i vertsceller. Dette gjøres ved å coate tungmetallpartikler med klonede plasmider som inneholder riktig insert. Disse partiklene skytes på planten, og noen av partiklene treffer blink. 19

Insektsresistens går ofte ut på at planter har muligheten til å produsere toksiner som tar livet av skadedyr som spiser på planten. Bt toxin brukes for å bekjempe skadedyr, og kommer fra Cry proteine som brytes ned. Genet som produserer dette genet ble funnet i en bakterie, og plassert i genomet til planter. Dette førte til at plantene produserte ganske små mengder av toksinet. Ved å endre kodonbruken, samt kutte ned på antall aminosyrer, ble produksjonen av Cry proteinene større. Chapter 15: Transgenic Animals Også dyr kan få endret sitt arvemateriale, og om de har fått ett eller flere fremmede gener, kalles de transgene dyr. Fremgangsmåten for transgene dyr er ganske grei. Først må en eggcelle og en spermcelle fusjonere. Rett etter dette vil den nye cellen ha to kjerner. Transgenet injiseres i spermcellekjernen, da den er størst og enklest å treffe med en veldig liten nål. Den befruktede cellen med transgenet plasseres deretter i en fostermor, som føder unger. De av ungene som har transgenet kalles founder animals, vil kun ha det i halvparten av sine kromosomer. Når to founder-dyr pares, vil statistisk sett 25 % av avkommet ha transgenet i begge kromosomene. Når slike dyr krysses vil alle etterkommere ha transgenet. Chimeric animals er delvis transgene dyr. Dette skjer fordi det injiserte DNA et har integrert seg for sent i celledelingen. Da har visse celler allerede fått noen funksjoner, og transgenet vil kun finnes i visse kropsdeler. Eksempel på dette kan være en mus med selvlysende flekker eller halvveis selvlysende mark osv. Knockout mice er et viktig steg innen genforskningen. Det handler om å ødelegge enkelte gener, for deretter å se hva resultatet blir i avkommet. I praksis ødelegges genet ved at det settes inn en ubrukelig kodebit (kasett) midt i genet. Dette fører til at genet mister sin funksjon. Knockout mus har hatt stor betydning for å finne ut hvilke gener som har hvilken funksjon i kroppen, og de første som gjennomførte det fikk Nobelprisen i medisin. 20

Sauen Dolly var det første klonede dyret, og ble født i 1996 i Scotland. Senere er det blit klonet en rekke dyr, og det er ikke noe i veien for å kunne klone mennesker, bortsett fra at det er helt ulovlig, overalt! Kloning kan ha mange fordeler. Man kan redde en utdøende rase, ved å klone ett av de siste dyrene. En utdødd rase kan gjenopplives, om man har uskadet DNA. I forbindelse med kloning kan man også tilføre transgener, slik at det klonede dyret kan produsere enzymer nyttige for andre formål. Det vil også være ulemper ved kloning, som at en bestand basert på et klonet dyr vil være mer mottakelige for arvelige sykdommer, såvel som epidemier osv. De fleste forsøk på kloning går galt, så å utføre kloning av mennesker er svært uetisk. 21