TEKNISK HÅNDBOK Maxwell CSC RNA Blood Kit Bruksanvisning for produktet AS1410 Forsiktig: Håndter kassetter med forsiktighet, forseglingskantene kan være skarpe. BRUKANVISNING FOR PRODUKTET AS1410 2800 Woods Hollow Rd. Madison, WI USA MDSS GmbH Schiffgraben 41 30175 Hannover, Germany Revidert 5/18 TM434
Maxwell CSC RNA Blood Kit Alle teknisk litteratur er tilgjengelig på: www.promega.com/protocols/ Gå til nettstedet for å kontrollere at du bruker den mest oppdaterte versjonen av denne tekniske håndboken. Send e-post til Promega Technical Services dersom du har spørsmål vedrørende bruk av dette systemet: techserv@promega.com 1. Beskrivelse...1 2. Produktkomponenter, oppbevaringsbetingelser og symbolforklaring...2 3. Tiltenkt bruk av produktet...5 4. Bruksbegrensninger for produktet...5 5. Før du begynner: Klargjøre løsninger...6 6. Rensing av RNA fra ferskt fullblod i EDTA-prøvetakingsrør...6 6.A. Forbehandling av fullblodprøver...7 6.B. Klargjøring av Maxwell CSC-kassett...8 7. Instrumentkjøring... 10 8. Etter rensing... 12 9. Feilsøking... 12 10. Skape et ribonukleasefritt miljø... 14 11. Referanser... 14 12. Tilhørende produkter... 15 13. Oppsummering av endringer... 15 Maxwell CSC RNA Blood Kit er bare tilgjengelig i visse land. Dette produktet overholder de vesentlige kravene i EU-direktiv 98/79/EF vedrørende in vitro-diagnostiske medisinske enheter. 1. Beskrivelse Maxwell CSC RNA Blood Kit (a,b) brukes sammen med Maxwell CSC-instrumentet for å oppnå en enkel metode for effektiv og automatisert rensing av RNA fra ferskt (ikke nedfryst) humant fullblod samlet inn i EDTA-rør. Maxwell CSC-instrumentet leveres med forhåndsprogrammerte rensemetoder. Det er utformet for bruk med de forhåndsdispenserte reagenskassettene samt ytterligere reagenser som følger med i settet, noe som maksimerer enkelthet og brukervennlighet. Instrumentet kan behandle opptil 16 prøver på ca. 60 minutter, og det rensede RNA-et kan brukes direkte i en rekke forsterkningsbaserte nedstrøms bruksområder, for eksempel RT-PCR. Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI 53711-5399 USA Grønn linje i USA: 800-356-9526 608-274-4330 Faks: 608-277-2516 1 www.promega.com TM434 Revidert 5/18
1. Beskrivelse (fortsettelse) Maxwell CSC RNA Blood Kit renser RNA ved hjelp av paramagnetiske partikler, som gir en mobil solid fase for å optimalisere prøveinnhenting, vask og rensing av RNA. Maxwell CSC-instrumentet er et instrument til håndtering av magnetiske partikler. Dette systemet muliggjør effektiv binding av RNA til de paramagnetiske partiklene i første brønn av en forhåndsfylt kassett, og beveger prøven gjennom brønnene i kassetten. Denne tilnærmingen til magnetisk registrering unngår vanlige problemer knyttet til systemer for håndtering av væsker, som tette tupper eller delvise reagensoverføringer, som resulterer i suboptimal rensebehandling, som oppstår i andre ofte brukte systemer. 2. Produktkomponenter, oppbevaringsbetingelser og symbolforklaring PRODUKT STØRRELSE KAT.NR. Maxwell CSC RNA Blood Kit 48 preps AS1410 For in vitro-diagnostisk bruk. Kun til profesjonell bruk. Tilstrekkelig til 48 automatiserte isoleringer fra blodprøver. Maxwell CSC-kassetter er kun beregnet på engangsbruk. 15 C 30 C 6010TB 48 Inneholder: 48 Maxwell CSC RNA Blood Cartridges 4 100ml Solution A 30ml Solution B 20ml Lysis Buffer 2 vials DNase I (lyophilized) 900µl 1-Thioglycerol 100µl Blue Dye 2 1ml Proteinase K (PK) Solution 25ml Nuclease-Free Water 50 CSC/RSC Plungers 50 Elution Tubes (0.5ml) Oppbevaringsbetingelser: Ved mottak fjerner du 1-Thioglycerol og setter det til oppbevaring ved 2 10 C. Oppbevar de resterende settkomponentene ved romtemperatur (15 30 C). 1-Thioglycerol kan oppbevares ved romtemperatur (15 30 C), der det holder seg stabilt i inntil 9 måneder. Oppbevar rehydrert DNase I ved -30 til -10 C. Ikke frys og tin opp igjen mer enn 10 ganger. 2 Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI 53711-5399 USA Grønn linje i USA: 800-356-9526 608-274-4330 Faks: 608-277-2516 TM434 Revidert 5/18 www.promega.com
Sikkerhetsinformasjon: Reagenskassettene inneholder etanol, som er brennbar. 1-Thioglycerol er giftig. Guanidintiocyanat og guanidinhydroklorid (komponenter i løsning B og lyseringsbuffer) er skadelige irritanter. Lyseringsbuffer utgjør også en mulig risiko for skade på et ufødt barn. Bruk hansker og følg standard sikkerhetsprosedyrer ved kontakt med disse midlene. The Maxwell CSC RNA Blood Kit-komponentene er designet for bruk med potensielt smittefarlig materiale. Brukere må ha på seg riktig personlig verneutstyr (f.eks. hansker, laboratoriefrakk og beskyttelsesbriller) ved håndtering av smittefarlig materiale. Brukere skal følge institusjonens retningslinjer for håndtering og kassering av smittefarlig materiale brukt med dette systemet. Merk: Blekemiddel reagerer med ammoniumklorid og guanidintiocyanat slik at det produseres giftig røyk. Guanidintiocyanat and ammoniumklorid er til stede i henholdsvis løsning B og løsning A. Ikke dekontaminer avfall fra dette settet ved hjelp av blekemiddel. Forsiktig: Håndter kassetter og åpne hetteglass med lyofilisert DNase I med forsiktighet, da kantene kan være skarpe. Tilleggsinformasjon: Maxwell CSC Blood RNA Kit-komponentene er kvalifisert og kvalitetssikringstestet for å fungere sammen. Det anbefales ikke å blande settkomponenter mellom forskjellige settloter. Bruk bare komponentene som følger med i settet. For ytterligere sikkerhetsinformasjon henvises det til produktdatabladet, som fås på: www.promega.com Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI 53711-5399 USA Grønn linje i USA: 800-356-9526 608-274-4330 Faks: 608-277-2516 3 www.promega.com TM434 Revidert 5/18
2. Produktkomponenter, oppbevaringsbetingelser og symbolforklaring (fortsettelse) Symbolforklaring Symbol Forklaring Symbol Forklaring Medisinsk utstyr for in vitro-diagnostikk Autorisert representant 15 C 30 C Oppbevares ved 15 30 C. 2800 Woods Hollow Rd. Madison, WI USA Produsent Viktig Irriterende Kreftfremkallende Giftig Korroderende Innholdet rekker til n tester Conformité Européenne Advarsel. Biologisk fare. Advarsel. Klemfare. Bestillingsnummer Lotnummer Skal ikke gjenbrukes 4 Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI 53711-5399 USA Grønn linje i USA: 800-356-9526 608-274-4330 Faks: 608-277-2516 TM434 Revidert 5/18 www.promega.com
3. Tiltenkt bruk av produktet Maxwell CSC Blood RNA Kit er beregnet på bruk sammen med Maxwell CSC-instrumentet og Maxwell CSC Blood RNA-rensemetoden, som en in vitro-diagnostisk (IVD) medisinsk enhet for å utføre automatisert isolering av RNA fra 2,5ml av humant fullblod innsamlet i EDTA-prøvetakingsrør med antallet av hvite blodlegemer (WBC) i området 4 10 6 til 10 10 6 WBC per milliliter. Det rensede RNA-et er egnet for bruk i amplifikasjonsbaserte in vitrodiagnostiske analyser. Maxwell CSC RNA Blood Kit er beregnet på bruk med 2,5 ml humant fullblod. Maxwell CSC RNA Blood Kit skal brukes ved en temperatur på 15 30 C. Bruk utenfor dette temperaturområdet kan medføre suboptimale resultater. Maxwell CSC Blood RNA Kit skal ikke brukes som en del av en spesifikk diagnostisk test. Maxwell CSC Blood RNA Kit er bare beregnet på profesjonell bruk. Diagnostiske resultater som oppnås med RNA-et som renses med dette systemet, må tolkes i sammenheng med andre kliniske funn eller laboratoriedata. 4. Bruksbegrensninger for produktet Maxwell CSC RNA Blood Kit er kun beregnet på bruk med humane fullblodprøver innsamlet i EDTA-rør. Det er ikke beregnet på bruk med ikke-fullblodprøver, som benmarg eller fibrinlag, prøver oppbevart i andre prøvetakingsrør eller prøver oppbevart utenfor produktutsagnene. Maxwell CSC Blood RNA Kit er ikke beregnet på bruk med ikke-humane prøver eller til rensing av DNA. Ytelsen til Maxwell CSC RNA Blood Kit har blitt evaluert for isolering av RNA fra 2,5 ml humant fullblod i EDTAprøvetakingsrør. Produktet skal ikke brukes med prøver på mer eller mindre enn 2,5 ml. Det er ikke beregnet på bruk med fullblod fra andre prøvetakingsrør enn EDTA-rør. Det er ikke beregnet på bruk med prøver som inneholder mindre enn 4 10 6 WBC per milliliter eller med prøver som inneholder mer enn 10 10 6 WBC per milliliter. Brukeren er ansvarlig for å kontrollere hvilke ytelseskarakteristikker som kreves til nedstrøms diagnostiske formål. Egnede kontroller skal inkluderes i alle nedstrøms diagnostiske applikasjoner med RNA renset med Maxwell CSC RNA Blood Kit. Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI 53711-5399 USA Grønn linje i USA: 800-356-9526 608-274-4330 Faks: 608-277-2516 5 www.promega.com TM434 Revidert 5/18
5. Før du begynner: Klargjøre løsninger 1-Thioglycerol/løsning B Klargjør en blanding av 1-Thioglycerol og løsning B ved hjelp av én av følgende metoder: Tilsett 600 µl 1-Thioglycerol i flasken med løsning B og bland grundig. 1-Thioglycerol er viskøst, og forsiktig pipettering kreves for nøyaktig måling. Før bruk avkjøler du 1-Thioglycerol/løsning B på is eller ved 2 10 C. Alternativt klargjør du små volumer ved å tilsette 20 µl 1-Thioglycerol per milliliter av løsning B. Klargjør 200 µl avkjølt 1-Thioglycerol/løsning B per prøve. Merk: Oppbevar klargjort 1-Thioglycerol/løsning B ved 2 10 C, der det holder seg stabilt i opptil 30 dager. DNase I Tilsett 275 µl nukleasefritt vann i hetteglasset med lyofilisert DNase I. Vend for å skylle DNase I fra undersiden av hetten og virvle forsiktig rundt for å blande. Ikke bland i virvelblander. Tilsett 25 µl blåfarge i rekonstituert DNase I som et visuelt hjelpemiddel for pipettering og kassettklargjøring. Hver rensing krever 10 µl av klargjort DNase I-løsning. Oppbevar rekonstituert DNase I ved -30 til -10 C. Ikke frys og tin opp igjen DNase I mer enn ti ganger. Forsiktig: Åpne DNase I-hetteglasset med forsiktighet, da hetteglasskantene kan være skarpe. 6. Rensing av RNA fra ferskt fullblod i EDTA-prøvetakingsrør Sørg for RNase-frie omgivelser under behandling. Bruk alltid RNase-frie og aerosolresistente pipettespisser. Bytt hansker ofte for å redusere muligheten for RNase-kontaminering. Se del 10, Skape et ribonukleasefritt miljø, for detaljer. Materialer som må anskaffes av bruker fullblod i EDTA-prøvetakingsrør (ikke frosset), blodet kan oppbevares i opptil 3 dager ved 2 10 C før rensing mikrosentrifuge 10 ml serologiske pipetter (sterile) pipettorer og RNase-frie, sterile, aerosolresistente pipettespisser 15 ml rør (sterile) sentrifuge med svingende spannrotor 6 Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI 53711-5399 USA Grønn linje i USA: 800-356-9526 608-274-4330 Faks: 608-277-2516 TM434 Revidert 5/18 www.promega.com
6.A. Forbehandling av fullblodprøver 1. Overfør 2,5 ml godt blandet fullblod (ikke frosset) fra EDTA-prøvetakingsrøret til et sterilt 15 ml rør. 2. Tilsett 7,5 ml av løsning A, og vend røret 5 10 ganger for å blande. Dette er et differensielt lyseringstrinn. De røde blodcellene lyseres, mens de hvite blodcellene forblir intakte. 3. Inkuber lysatene i 10 minutter ved romtemperatur. To ganger under inkubasjonen vender du prøvene i trinn 2 for å blande. 4. Sentrifuger røret/rørene ved 3000 g i 10 minutter i en svingende spannrotor. 5. Fjern supernatanten ved å dekantere eller pipettere. Roter røret kort for å samle opp den gjenværende væsken på bunnen av røret. Bruk en pipette til å fjerne og kaste så mye av den gjenværende supernatanten som mulig uten å forstyrre den synlige WBC-pelleten. 6. Tilsett 200 µl av avkjølt 1-Thioglycerol/løsning B i pelleten og bland i virvelblander for å resuspendere pelleten. 7. Tilsett 200 µl lyseringsbuffer og 25 µl of proteinase K i den resuspenderte pelleten. Bland i en virvelblander i 15 20 sekunder. Merk: Hvis du må stoppe under forbehandling, kan prøvene oppbevares etter trinn 7 ved -30 til -10 C i opptil 5 dager. Ved disse oppbevaringstemperaturene er det mulig at prøvene fryses helt, eller ikke. Når du er klar til å gjenoppta prøverensing, tiner du rørene ved romtemperatur i 10 minutter før du fortsetter med neste trinn. 8. Inkuber ved romtemperatur i 10 minutter. I løpet av denne tiden klargjør du kassetter som beskrevet i del 6.B. 9. Tilsett lysat i brønn nr. 1 i Maxwell CSC RNA Blood Cartridge (den største brønnen i kassetten). Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI 53711-5399 USA Grønn linje i USA: 800-356-9526 608-274-4330 Faks: 608-277-2516 7 www.promega.com TM434 Revidert 5/18
6.B. Klargjøring av Maxwell CSC-kassett 1. Bytt hansker før du håndterer Maxwell CSC RNA Blood Cartridges, CSC/RSC-stempler og elueringsrør. Kassetter settes opp på Maxwell CSC-dekkbrettet utenfor instrumentet, og dekkbrettet som inneholder kassettene og prøvene, overføres deretter til instrumentet for rensing. Plasser kassettene som skal brukes, i Maxwell CSC-dekkbrettet (figur 2). Plasser hver kassett i dekkbrettet med brønn nr. 1 (den største brønnen i kassetten) lengst borte fra elueringsrørene. Trykk ned kassetten slik at den sitter helt på plass. Kontroller at begge kassettendene er helt festet dekkbrettet. Dra forsiktig vekk forseglingen slik at hele forseglingen fjernes fra toppen av kassetten. Kontroller at all forseglingsteip og eventuelt gjenværende klebende materiale er fjernet fra kassetten. Forsiktig: Håndter kassetter med forsiktighet, forseglingskantene kan være skarpe. 2. Plasser et CSC/RSC-stempel i brønn nr. 8 i hver kassett. Merk: Bruk bare stemplene som følger med i Maxwell CSC RNA Blood Kit. Stempler for Maxwell 16 LEV og SEV Kit er ikke kompatible med Maxwell CSC-instrumentet. 3. Plasser et tomt elueringsrør i elueringsrørposisjonen for hver kassett i Maxwell CSC-dekkbrettet. Merk: Bruk bare elueringsrørene som følger med i Maxwell CSC RNA Blood Kit. Andre elueringsrør vil kanskje ikke være kompatible med Maxwell CSC-instrumentet og kan påvirke RNA-renseytelsen. 4. Tilsett 50 µl nukleasefritt vann i bunnen av hvert elueringsrør. Elueringsrørene må forbli åpne under RNArensingen. Merk: Bruk bare det nukleasefrie vannet som følger med i Maxwell CSC RNA Blood Kit. Bruk av andre elueringsbuffere kan påvirke RNA-renseytelsen eller nedstrøms bruk. 5. Tilsett 10 µl rekonstituert DNase I (blå) i brønn nr. 4 (gul) i hver kassett. Den resulterende fargen er en visuell indikator på at DNase I-løsningen ble tilsatt i brønn nr. 4. 8 Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI 53711-5399 USA Grønn linje i USA: 800-356-9526 608-274-4330 Faks: 608-277-2516 TM434 Revidert 5/18 www.promega.com
6.B. Klargjøring av Maxwell CSC-kassett (fortsettelse) Merknader for klargjøring av Maxwell CSC RNA Blood Cartridge 1. Dersom du behandler færre enn 16 prøver, skal kassettene midtstilles på dekkbrettet. 2. Fjern prøve- eller reagenssøl på alle deler av Maxwell CSC-dekkbrettet som angitt i Maxwell CSC Instrument Operating Manual. Ikke bruk blekemiddel på noen av instrumentdelene. 1 2 3 4 5 6 7 8 Brønninnhold 1. Bindeløsning 2. Magnetiske partikler 3. Vaskemiddel 4. DNase I-buffer 5. Bindeløsning 6. Vaskemiddel 7. Vaskemiddel 8. Tomt Bruker tilsetter i brønner 1. Forbehandlet prøvelysat 4. 10 µl klargjort DNase I 8. CSC/RSC-stempel Figur 1. Maxwell CSC-kassett. Denne figuren viser innholdet i en kassett. Det forbehandlede blodprøvelysatet tilsettes i brønn nr. 1, 10 µl DNase I tilsettes i brønn nr. 4, og et CSC/RSC-stempel settes i brønn nr. 8. 10828TB 11339TA Figur 2. Oppsett og konfigurering av Maxwell CSC-dekkbrettet. Nukleasefritt vann (50 µl) tilsettes i elueringsrørene som angitt. Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI 53711-5399 USA Grønn linje i USA: 800-356-9526 608-274-4330 Faks: 608-277-2516 9 www.promega.com TM434 Revidert 5/18
7. Instrumentkjøring Maxwell CSC RNA Blood-metoden kan lastes ned fra Promega-nettstedet: www.promega.com/resources/tools/ maxwellcscmethod. Se Maxwell CSC Methods Installation Technical Manual #TM401 for mer detaljert informasjon. Hvis du mistenker at instrumentet kan være kontaminert med RNase, rengjør du instrumentet før du kjører det, med et rengjøringsmiddel, for eksempel Steris LpH. Følg instruksjonene i delen Rengjøring og vedlikehold i Maxwell CSC Instrument Operating Manual. 1. Slå på Maxwell CSC-instrumentet og nettbrettet. Instrumentets brukergrensesnitt starter automatisk, og instrumentet fortsetter med en selvtest og setter alle bevegelige deler i utgangsposisjon. 2. Velg Start på startskjermbildet. 3. Skann eller skriv inn metodestrekkoden på Maxwell CSC RNA Blood Kit-etiketten for automatisk å velge metoden som skal kjøres (figur 3). Merk: Maxwell CSC RNA Blood Kit-metodestrekkoden er påkrevd for rensing av RNA på Maxwell CSCinstrumentet. Settetiketten inneholder to strekkoder. Metodestrekkoden er angitt på figur 3. Hvis strekkoden ikke kan skannes, kontakter du Promega Technical Services. 4. Velg kassettposisjoner som skal kjøres (se Maxwell CSC Instrument Operating Manual), og skann eller legg manuelt inn den påkrevde prøvesporingsinformasjonen. Velg bort eventuelle ubrukte posisjoner. Velg Fortsett når all prøveinformasjonen har blitt angitt. 12571TA Figur 3. Settetiketten som indikerer metodestrekkoden som skal skannes. Den røde boksen og pilen øverst på etiketten markerer metodestrekkoden på settetiketten. Skann denne strekkoden for å starte en rensekjøring. 10 Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI 53711-5399 USA Grønn linje i USA: 800-356-9526 608-274-4330 Faks: 608-277-2516 TM434 Revidert 5/18 www.promega.com
7. Instrumentkjøring (fortsettelse) 5. På nettbrettet kontrollerer du at prøvene ble tilsatt i brønn nr. 1 i kassettene (som anvist i del 6.B), at kassettene er lastet på instrumentet, at elueringsrørene som inneholder 50 μl nukleasefritt vann, er til stede og åpne, og at stemplene er til stede i brønn nr. 8. 6. Overfør Maxwell CSC-dekkbrettet som inneholder de klargjorte kassettene, til Maxwell CSCinstrumentdekket. Kontroller at dekkbrettet er plassert i Maxwell CSC-instrumentet med elueringsrørene nærmest døren. Dekkbrettet får bare plass i instrumentet dersom det vender i denne retningen. Dersom dekkbrettet ikke passer på plattformen, kontrollerer du at det er satt inn riktig vei. Kontroller at dekkbrettet sitter plant på instrumentdekket. Merk: Hold Maxwell CSC-dekkbrettet etter sidene for å unngå å forflytte kassettene fra stativet. Advarsel: Klemfare. 7. Bekreft at all angitt forbehandling har blitt utført, og trykk på Start for å lukke instrumentdøren og starte behandlingen. 8. Maxwell CSC-instrument starter rensingen umiddelbart. Skjermen viser trinnene som utføres og omtrentlig tid som er igjen i kjøringen. Merk: Dersom kjøringen avbrytes før fullføring, vil instrumentet vaske partiklene av stemplene og slippe stemplene i brønn nr. 8 i kassetten. Prøvene vil da gå tapt. Ikke forsøk å rense på nytt prøver fra en avbrutt instrumentkjøring. 9. Når kjøringen er fullført, viser nettbrettskjermen en melding som angir at metoden er avsluttet. Kjøring avsluttet 10. Følg instruksjonene på skjermen etter at metoden har blitt fullført, for å åpne døren. Kontroller at stemplene befinner seg i brønn nr. 8 i kassetten etter fullført kjøring. Fjern dekkbrettet fra instrumentet og fjern eluerte prøver fra dekkbrettet. Hvis alle stempler ikke har blitt fjernet fra stempelstangen: a. Etter en avbrutt kjøring følger du meldingene på skjermen for å utføre rengjøringsmetoden. b. Etter en vellykket fullført kjøring velger du rengjøringsmetoden skjermbildet for innstillinger. 11. Sett på hetter og fjern elueringsrørene som inneholder RNA, umiddelbart etter kjøringen for å forhindre fordampning av eluatene. Fjern Maxwell CSC-dekkbrettet fra instrumentet. Merk: Hvis du vil fjerne stativet fra instrumentplattformen, holder du stativet etter sidene. RNA-prøver kan oppbevares over natten ved -30 til -10 C, eller ved lavere enn 60 C for langvarig oppbevaring. Sørg for at prøvene er fjernet fra instrumentet før kjøring av instrumentets UV-steriliseringsprotokoll, for å unngå skader på den rensede nukleinsyren. 12. Fjern kassettene og stemplene fra Maxwell CSC-dekkbrettet og håndter dem som farlig avfall i henhold til institusjonens prosedyrer. Kassettene, stemplene og elueringsrørene er bare til engangsbruk. Maxwell CSC-kassetter, CSC/RSC-stempler og elueringsrør må ikke brukes på nytt. Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI 53711-5399 USA Grønn linje i USA: 800-356-9526 608-274-4330 Faks: 608-277-2516 11 www.promega.com TM434 Revidert 5/18
8. Etter rensing Fastslå om utbyttet og renheten til det rensede RNA-et oppfyller de angitte kravene for den diagnostiske nedstrøms analysen før bruk i denne analysen. 9. Feilsøking For spørsmål som ikke besvares her, bes du kontakte ditt lokale Promega-kontor eller den lokale forhandleren. Kontaktinformasjon er tilgjengelig på: www.promega.com. E-post: techserv@promega.com Symptomer Lavere enn forventet konsentrasjon av RNA i eluat (en vanlig prøve skal gi >50 ng/µl renset RNA.) Årsaker og kommentarer Blodprøvens WBC-antall var under eller over produktets tiltenkte bruksområde på 4 10 6 til 10 10 6 WBC/ml. Settet er optimalisert for å rense RNA fra blodprøver med et WBC-antall på 4 10 6 til 10 10 6 WBC/ml. Feil volum fullblod ble brukt. Hvis de tilsettes mer eller mindre enn 2,5 ml fullblod, kan det resultere i lavere utbytte. Blodprøven var for gammel. Best utbytte oppnås med ferske blodprøver. Prøver som har blitt oppbevart ved 2 10 C i mer enn 3 dager, kan føre til i redusert utbytte. Prøven ble oppbevart under 2 C eller over 10 C før rensing. Feil oppbevaringstemperaturer kan føre WBC-lysering eller RNA-degradering. RNaser kan ha blitt introdusert under prøvebehandling eller kvantifisering. Se del 10 for informasjon om å skape et ribonukleasefritt miljø. Utilstrekkelig supernatantfjerning etter differensiallysering. Kontroller at supernatanten er fjernet så fullstendig som mulig. WBC-pelleten ble forflyttet under supernatantfjerning. Unngå å berøre WBC-pelleten når du fjerner supernatanten. Feil prøvetype. Settet er beregnet på bruk med humant fullblod. Andre prøvetyper (f.eks. benmarg, plasma, fibrinlag osv.) har ikke blitt testet med dette settet. Feil type blodtakingsrør. Settet er beregnet på bruk med humant fullblod i EDTA-prøvetakingsrør. Andre rørtyper har ikke blitt testet med dette settet og vil kanskje ikke være kompatible med rensekjemikalene. 12 Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI 53711-5399 USA Grønn linje i USA: 800-356-9526 608-274-4330 Faks: 608-277-2516 TM434 Revidert 5/18 www.promega.com
9. Feilsøking (fortsettelse) Symptomer Lav RNA-kvalitet (eluater skal ha et A 260 /A 280 -forhold på over 1,8 og et A 260 /A 230 -forhold mellom 1,8 og 2,4.) Høye nivåer av DNA er til stede i eluatene (Eluatene er kontaminert med DNA, noe som kan interferere med nedstrøms analyser.) Forbehandlet lysat er for viskøst til å kunne pipetteres Årsaker og kommentarer Blodprøvens WBC-antall var over produktets tiltenkte bruksområde på 4 10 6 til 10 10 6 WBC/ml. Settet er optimalisert for å rense RNA fra blodprøver med et WBCantall på 4 10 6 til 10 10 6 WBC/ml. Feil volum fullblod ble brukt. Hvis de tilsettes mer enn 2,5 ml fullblod, kan det resultere i dårlig eluatkvalitet. Blodprøven var for gammel. Best utbytte oppnås med ferske blodprøver. Prøver som har blitt oppbevart ved 2 10 C i mer enn 3 dager, kan føre til i redusert RNA-kvalitet. Prøven ble oppbevart under 2 C eller over 10 C før rensing. Feil oppbevaringstemperaturer kan føre WBC-lysering eller RNA-degradering. Utilstrekkelig supernatantfjerning etter differensiallysering. Kontroller at supernatanten er fjernet så fullstendig som mulig. Feil prøvetype. Produktet er beregnet på bruk med humant fullblod. Andre prøvetyper (f.eks. benmarg, plasma, fibrinlag osv.) har ikke blitt testet med dette produktet. Blodprøvens WBC-antall er over produktets tiltenkte bruksområde på 4 10 6 til 10 10 6 WBC/ml. Feil volum fullblod ble brukt. Hvis de tilsettes mer enn 2,5 ml fullblod, kan det resultere i DNA-kontaminering i eluater. DNase I ble ikke tilsatt i kassetten. Undersøk om mulig brønn nr. 4 i de festede kassettene. Brønn nr. 4 skal være grønn (ikke gul) hvis DNase I ble tilsatt i kassettene i del 6.B, trinn 5. Blodprøvens WBC-antall var over produktets tiltenkte bruksområde på 4 10 6 til 10 10 6 WBC/ml. Feil volum fullblod ble brukt. Hvis de tilsettes mer enn 2,5 ml fullblod, kan det resultere i lysater som er for viskøse og vanskelige å pipettere. Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI 53711-5399 USA Grønn linje i USA: 800-356-9526 608-274-4330 Faks: 608-277-2516 13 www.promega.com TM434 Revidert 5/18
10. Skape et ribonukleasefritt miljø Ribonukleaser er svært vanskelige å inaktivere. Sørg for å unngå å introdusere RNase-aktivitet i RNA-prøvene under og etter isolasjon. Dette er spesielt viktig hvis utgangsmaterialet var vanskelig å få tak i eller er uerstattelig. Følgende merknader kan bidra til å forhindre utilsiktet RNase-kontaminering av prøvene. 1. To av de vanligste kildene til RNase-kontaminering er brukerens hender og bakterier eller mugg som kan finnes på luftbårne støvpartikler. For å hindre smitte fra disse kildene må du bruke steril teknikk ved håndtering av reagensene som leveres med dette systemet. Bruk alltid hansker. Bytt hansker når det kan ha oppstått kontakt med ribonukleaser. 2. Når det er mulig, må det brukes sterile engangsplastenheter for håndtering av RNA. Disse materialene er generelt RNase-frie og krever ikke forbehandling for å deaktivere RNase. 3. Behandle ikke-sterile glassenheter, plastenheter og elektroforesekamre før bruk for å sikre at de er RNase-frie. Sett glassenheter i ovn ved en temperatur på 200 C over natten, og rengjør plastenheter med 0,1 N NaOH, 1 mm EDTA, etterfulgt av RNase-fritt vann. Kommersielt tilgjengelige produkter for fjerning av RNase kan også brukes, i henhold til produsentens instruksjoner. Merk: Elektroforesekamre kan være kontaminert med nukleaser, spesielt RNase A, etter analyse av DNAprøver. Når det er mulig, setter du av et nytt eller dekontaminert apparat for kun RNA-analyse. 4. Behandle løsninger som ikke følger med systemet, ved å tilsette dietyl-pyrokarbonat (DEPC) til 0,1 % v/v i en avtrekkshette. Inkuber over natten med omrøring ved romtemperatur i hetten. Autoklaver i 30 minutter for å fjerne eventuelle spor av DEPC. Forsiktig: DEPC er et mistenkt karsinogen og må bare brukes i en kjemisk avtrekkshette. DEPC reagerer raskt med aminer og kan ikke brukes til å behandle Tris-buffere. Merk: For alle nedstrøms bruksområder er det viktig at du fortsetter å beskytte RNA-prøvene fra RNaser. Bruk rene hansker og bruk RNase-frie løsninger og sentrifugeringsrør. 11. Referanser 1. Clinical Laboratory Standards Institute (2007) Handling, transport, and storage of specimens for molecular methods. Dokumentet kan leses online på: www.clsi.org 2. Murray, P.R. et al. (2007) Manual of Clinical Microbiology, 9th Edition, ASM Press. 14 Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI 53711-5399 USA Grønn linje i USA: 800-356-9526 608-274-4330 Faks: 608-277-2516 TM434 Revidert 5/18 www.promega.com
12. Tilhørende produkter Instrument og tilbehør Produktstørrelse Kat.nr. Maxwell CSC-instrument* 1 stk. AS4000 Maxwell RSC/CSC-dekkbrett 1 stk. SP6019 *Til in vitro-diagnostisk bruk. Dette produktet er kun tilgjengelig i enkelte land. Maxwell CSC Reagent Kits Gå til www.promega.com for en liste over tilgjengelige Maxwell CSC-rensesett. 13. Oppsummering av endringer Følgende endringer ble foretatt i 5/18-revisjonen av dette dokumentet: 1. Oppdatert med tilføying av kravene i EU IVD-direktivet (98/79/EF). (a) amerikansk pat. nr. 6,027,945 og 6,368,800. (b) amerikansk pat. nr. 7,329,488 og andre patenter. 2014, 2015, 2018 Promega Corporation. Med enerett. Maxwell er et registrert varemerke tilhørende Promega Corporation. LpH er et registrert varemerke tilhørende Steris Corporation. Produkter kan være omfattet av anmeldte eller utstedte patentbeskyttelser, eller kan ha visse begrensninger. Det henvises til vårt nettsted for ytterligere informasjon. Alle priser og spesifikasjoner oppgis med forbehold om endringer. Produktutsagn oppgis med forhold om endringer. Kontakt Promega Technical Services eller se Promegas online-katalog for oppdatert informasjon vedrørende Promega-produkter Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI 53711-5399 USA Grønn linje i USA: 800-356-9526 608-274-4330 Faks: 608-277-2516 15 www.promega.com TM434 Revidert 5/18