Nasjonalt referanselaboratorium for humant papillomavirus (HPV) Avdeling for mikrobiologi og smittevern, Akershus universitetssykehus Årsrapport 2014 HPV referansefunksjonen er organisert under Seksjon for forskning og utvikling (FoU) ved Avdeling for mikrobiologi og smittevern (MIKS), Akershus universitetssykehus (Ahus). Aktiviteten ved referanselaboratoriet foregår i godt samarbeid med øvrig aktivitet ved MIKS, samt med Avdeling for patologi og Kvinneklinikken ved Ahus. Personer som er involvert i aktiviteten og som representerer kompetansen ved referanselaboratoriet er: Leder av referanselaboratoriet (Irene Kraus Christiansen, PhD), seksjonsleder FoU (Ole Herman Ambur, PhD), avdelingssjef for MIKS (Merete Holth, MHA), overlege i medisinsk mikrobiologi (Truls Leegaard, 1. amanuensis), en avdelingsingeniør og en bioingeniør, tre overleger i patologi, samt en forsker, to bioingeniører og en avdelingsingeniør som er involvert i arbeidet med HPV-vaksineoppfølgingsprosjektet, HPVnorvaks (nasjonal oppfølging av HPV-vaksinasjonsprogrammet). Disse er eksternt, helt eller delvis, lønnet av prosjektmidler. HPVnorvaks var et samarbeidsprosjekt mellom Folkehelseinstituttet (FHI), Kreftregisteret (KRG) og HPV-referanselaboratoriet ved Ahus frem til dets opphør ved brev fra Helseog omsorgsdepartementet av 27/10-2014. Arbeidet med en permanent oppfølging av HPVvaksineeffekt i samarbeid med FHI startet høsten 2014. Rapporteringspunktene som følger under står i henhold til rundskriv nr. I-5/2013, 26/9-2013 «Krav til laboratorier med nasjonal referansefunksjon i medisinsk mikrobiologi». Referansediagnostikk Etablerte metoder for påvisning av HPV Seksjonen utfører HPV-diagnostikk (etter de nasjonale retningslinjene i Masseundersøkelsen mot livmorhalskreft) med analysen Cobas 4800 HPV test (Roche Diagnostics) for påvisning av 14 høyrisiko HPV-typer samt genotyping av HPV 16 og 18. Denne analysen ble akkreditert i 2011. I HPVnorvaks brukes en in-house Luminex-metode (betegnes heretter som Luminex ), utviklet ved WHO-referanselaboratoriet i Malmö, for genotyping av 37 ulike HPV-typer (videre tilpasset og validert hos oss). Denne metoden brukes også i referansediagnostikk til å genotype HPV-positive prøver eller for eventuell påvisning av et utvidet spekter av HPV-typer. I tillegg til de to metodene nevnt over, som først og fremst brukes i hhv. diagnostikk og vaksineoppfølging, har referanselaboratoriet i løpet av de siste årene etablert en rekke metoder for påvisning av HPV. Laboratoriet har utstyr og kompetanse til å kjøre seks ulike kommersielle HPV deteksjonsmetoder: Cobas 4800 (Roche Diagnostics) som beskrevet over; Amplicor HPV DNA test (Roche Diagnostics) for påvisning og genotyping av 13 høyrisiko typer; PreTect HPV-Proofer (NorChip AS) for genotyping av E6/E7 mrna fra fem høyrisiko typer; Linear Array (Roche Diagnostics) for genotyping av 37 HPV-typer, Hybrid Capture II (Qiagen) for påvisning av DNA fra 40 HPV-typer og Anyplex II HPV28 (Seegene) for påvisning og genotyping av 28 HPV-typer. I tillegg til kommersielle metoder har referanselaboratoriet i 2014 ferdigstilt arbeidet med utvikling av en metode for HPV genotyping med next-generation sequencing (Ion Torrent, Life Technologies) og som er en sekvenseringsmetode som kan brukes i forskning. Vi har i 2014 også jobbet videre med etableringen av en påvisningsmetode rettet mot HPV E6/E7 genene (HPV E6/E7 1
type-spesifikk PCR) der vi konsentrerer oss om de vanligste HPV typene. Dette er en metode som kan brukes ved eventuell mistanke om virus-integrasjon i det humane genomet (og eventuelt bortfall av L1 genet). Metoden kan også brukes for å bekrefte resultater fra andre analyser. Referanselaboratoriet deltar hvert år i ekstern kvalitetsvurdering i regi av QCMD (Quality Control for Molecular Diagnostics, benyttes for Cobas 4800) og også i 2014 med resultatet profficient (godkjent innenfor et gitt krav). Som referanselaboratorium ønsker vi å spesifisere at alle laboratorier har tilbud om HPV-testing hos oss og oppfordrer alle til å bruke oss ved 1) ønske om tilleggsanalyser for presis diagnosesetting og oppfølging (som for eksempel genotyping eller bruk av en analytisk mer sensitiv metode) eller 2) ved ønske om å kontrollere egne prøvesvar. Alle laboratorier som sender prøver for referansediagnostikk får skriftlig tilbakemelding og rapport over alle analyser utført med prøvesvar. Utførte analyser i 2014 Rutinediagnostikk (prøver analysert etter de nasjonale retningslinjene i Masseundersøkelsen mot livmorhalskreft, etter takst 701k) (Cobas 4800 HPV test): 1911 prøver (342 PreservCyt og 1569 SurePath). Laboratoriet mottar prøver for HPV-analyse fra Avdeling for patologi, Ahus (1377 henvisninger i 2014), samt fra Avdeling for patologi, Innlandet Sykehus, Lillehammer (534 henvisninger i 2014). Laboratoriet har kapasitet til å ta imot flere prøver/fra flere laboratorier for rutinediagnostikk. HPVnorvaks: 8368 urinprøver er ekstrahert for DNA, hvorav 6609 er analysert på Luminex. Betaglobin PCR kjøres på alle prøvene som en kontroll på at vi har humant DNA i prøvene (ekstraksjonskontroll + kontroll på at vi har tilstrekkelig prøvemateriale). Referansediagnostikk Tilleggsanalyser utført for andre laboratorier for presis diagnosesetting og oppfølging: - Universitetet i Nord-Norge (UNN): 20 prøver - Avdeling for patologi, Ahus: 5 prøver - Laboratorium for molekylær patologi, OUS: 2 prøver Validering og verifisering Metodeverifisering: - Bruk av QIAsymphony (Qiagen) for DNA ekstraksjon fra formalinfiksert parafininnstøpt materiale. - Verfisering av Anyplex II HPV28 (Seegene), for Østfold sentralsykehus Opprettholdelse av referansemateriale Plasmid-banker Referanselaboratoriet har en L1-fragment plasmidbank for HPV-typene som inngår i Luminex. I tillegg har vi en plasmidbank med en rekke helgenom HPV plasmider. Biobanker I 2010 ble det etablert en egen HPV-forskningsbiobank for prøver mottatt i forbindelse med HPVnorvaks. Urinprøvene samlet inn i forbindelse med prosjektet lagres ved FHI mens total nukleinsyre (DNA og RNA) ekstrahert fra disse lagres midlertidig ved Ahus. DNA-biobanken ved Ahus inneholdt pr 31.12.2014 ca. 18000 prøver. Det ble i 2005 etablert en forskningsbiobank ved Ahus Tverrfaglig humant papillomavirus prosjekt, Ahus, REK ref. nr.: 2010/849. Prosjektansvaret er i 2014 overført fra Ameli Tropé til Irene Kraus Christiansen. 2
Cellelinjer Vi har i 2014 etablert følgende cellelinjer hos oss: SiHa (squamous carcinoma, cervix; contains HPV16) CaSki (epidermoid carcinoma, cervix, contains HPV16 as well as sequences related to HPV18) MS751 (epidermoid carcinoma, cervix, contains HPV18 sequences and a partial HPV45 genome) HeLa (adenocarcinoma, cervix; contains HPV18 sequences) Vitenskapelig råd og støtte Vi ved referanselaboratoriet jobber kontinuerlig med å opprettholde solid kompetanse på alle områdene innenfor HPV-feltet (HPV-relaterte kreftformer, diagnostikk, screening mot livmorhalskreft, HPV-vaksine og vaksineoppfølging). Dette gjør vi blant annet ved å delta på seminarer og konferanser. Vi har flere samarbeidsprosjekter gående der vi i tillegg til HPV-analyse bidrar med vitenskapelig kompetanse på området (se neste avsnitt for gående samarbeidsprosjekter). Referanselaboratoriet er representert i følgende faggrupper nedsatt av Helsedirektoratet: - Faglig Rådgivningsgruppe for Masseundersøkelsen mot livmorhalskreft (v/irene Christiansen) - Faglig panel for innføring av HPV-testing i primærscreening (v/irene Christiansen) - Praksisforberedende gruppe for innføring av HPV-testing i primærscreening (v/ole Herman Ambur) - Faggruppe for vurdering av HPV-tester opp mot kravene stilt i Masseundersøkelsen (v/irene Christiansen) - Arbeidsgruppe for hjemme-prøvetakning i Masseundersøkelsen mot livmorhalskreft (v/irene Christiansen) Besøk Karolinska Institutet Stockholm, 9. juni 2014, Nasrin Perskvist og Joakim Dillner Formål med besøk: Presentasjon og demonstrasjon av Clinical Cytology Biobank for referanselaboratoriet v/irene Christiansen og Ole Herman Ambur. Besøk Hvidovre Hospital København, 5. september 2014, Jesper Bonde og Carsten Rygård I september 2014 avla referanselaboratoriet et besøk til Hvidovre Hospital, Avdeling for patologi (i regi av Kreftregisteret for Faglig Rådgivningsgruppe for Masseundersøkelsen mot livmorhalskreft). Vi fikk en god gjennomgang av alle laboratorieprosesser og fikk et innblikk i automatisert cytologi og hjemmetesting. God nytteverdi og som vi vil ta med oss videre inn i arbeidet for forbedret logistikk og diagnostikk her hjemme. Samarbeid og forskning Internt I 2012 ble det etablert et HPV-fagråd ved Ahus som er sammensatt av representanter fra Avdeling for mikrobiologi og smittevern, Avdeling for patologi og Avdeling for gynekologi, alle med bred kompetanse innen cervixcancer og HPV-diagnostikk og forskning. Det har vært avholdt fire møter i 2014. Referanselaboratoriet er i gang med en studie for å dokumentere de ulike HPV analysemetodene vi har tilgjengelig hos oss. Mens noen metoder først og fremt er aktuelle for klinisk diagnosesetting, er andre metoder i første omgang aktuelle for bruk i prevalensundersøkelser av HPV i ulikt vev. God analytisk 3
sensitivitet og spesifisitet er viktig blant annet i vaksineoppfølgingsprosjektet, samt ved utredning av hvorvidt en kreftform eller et enkelt sykdomstilfelle er HPV-relatert eller ikke. Samarbeid med Avdeling for patologi: I gang med studie (REK ref nr 2013/1646) der vi skal se på forekomst av HPV i normalt vev fra tonsiller. Referanselaboratoriet har et løpende samarbeid til Avdeling for klinisk molekylærbiologi og laboratoriefag (Epigen) ved sykehuset. Referanselaboratoriet ble i 2014 tildelt interne strategiske forskningsmidler for arbeid med HPV kromosomal integrasjon. MinION (Oxford Nanopore Technologies) er et lite DNA sekvenserings-instrument (mindre enn en mobiltelefon) og der sekvensering baserer seg på nanopore-teknologi (enkelttrådet DNA trekkes gjennom en nanopore samtidig som basesekvensen leses). Begrensingen ved annen sekvenseringsteknologi er gjerne sekvenseringslengde, men som ikke vil være en begrensing med denne teknologien. Hastigheten av sekvenseringen er også betydelig høyere enn for eksisterende metoder samtidig som prøvebearbeidelsen er forenklet. Referanselaboratoriet er en av et begrenset utvalg brukere som er med på uttestingen av teknologien, gjennom et "early access" MinION Access Programme. Eksternt FHI og KRG I samarbeid med FHI og KRG har referanselaboratoriet i 2014 arbeidet videre med HPVnorvaks, etter mandat fra Helse- og omsorgsdepartementet (HOD). Leder for FoU (Ole Herman Ambur) har sammen med avdelingssjef for MIKS (Merete Holth) sittet i Styringsgruppen for HPVnorvaks nedsatt av HOD, frem til nedleggelse av denne ved brev av 27/10-2014. Permanent oppfølging av HPV-vaksinens effekt gjøres fremover gjennom lovgivning for Meldesystem for infeksjonssykdommer (MSIS) og gjennom prosjekt med godkjenning av Regional Etisk Komité (REK). HPV-forekomst i uvaksinerte kohorter ved 17 og 21 års alder er ferdig analysert og arbeid med publisering av disse er satt i gang i samarbeid med FHI. Et samarbeidsprosjekt (startet opp 2013) mellom referanselaboratoriet, FHI og KRG for utvikling av en metode for HPV genotyping med next-generation sequencing (Ion Torrent, Life Technologies) ble ferdigstilt i 2014. KRG Samarbeid med KRG og FIMM (Insitute for Molecular Medicine Finland) for etablering av metode for påvisning av HPV med high-throughput next-generation sequencing (Illumina, MiSeq). Oslo universitetssykehus (OUS) Samarbeid til Avdeling for tumorbiologi, OUS og Institutt for informatikk, UiO. Foredrag og presentasjoner HPVnorvaks, nasjonalt oppfølgingsprogram for HPV-vaksinasjonsprogrammet Ole Herman Ambur, Høstkonferansen i mikrobiologi, 30-31. oktober 2014, Ahus Humant papillomavirus: Forebygging av livmorhalskreft - Screening og vaksinasjon Irene Kraus Christiansen, Nettundervisning Mikrobiologi, 18. sept 2014 High throughput DNA sequencing for the detection and genotyping of human papillomavirus Roger Meisal, Trine B. Rounge, Tor F. Molden, Merete M. Worren, Irene Kraus Christiansen, Eivind Hovig, Truls M. Leegaard and Ole Herman Ambur. Poster, International Papillomavirus Conference (IPV 2014), 21-25. august 2014, Seattle 4
Human papillomavirus prevalence and genotype distribution in urine samples from non vaccinated cohorts of 17 and 21 year old girls/women in Norway. Mona Hansen, Ellen Myrvang, Irene Kraus Christiansen, Tor F. Molden, Alexander Eieland, Roger Meisal, Berit Feiring, Truls Leegaard, Jeanette Stålcrantz, Trine Rounge, Ole Herman Ambur, Christine M. Jonassen and Lill Trogstad. Poster, International Papillomavirus Conference (IPV 2014), 21-25. august 2014, Seattle Nasjonalt referanselaboratorium for humant papillomavirus Mona Hansen, Hanne Kristiansen-Haugland, Ellen Myrvang, Alexander Eieland, Nermin Zecic, Roger Meisal, Merete Holth, Truls Leegaard, Ole Herman Ambur, Irene Kraus Christiansen. Poster, Molekylærmøte i Medisinsk Mikrobiologi (MIMM 2014), 11-13. juni 2014, Oslo universitetssykehus Ullevål HPV-referanselaboratoriet og Masseundersøkelsen kvalitetskontroll av HPV testing Irene K. Christiansen, Fagdag for Masseundersøkelsen mot livmorhalskreft, 25. mars 2014, Oslo Kongressenter Minimetodevurdering og validering av HPV-testing på SurePath-konserveringsvæske Ole Herman Ambur, Allmøte DDT, 13. februar 2014, Ahus Minimetodevurdering og validering av HPV-testing på SurePath-konserveringsvæske Ole Herman Ambur, Norsk Forening for klinisk Cytologis årsmøte, 1. februar 2014, SAS Radisson hotell, Gardermoen Overvåking, beredskap og respons ved utbrudd av smittsomme sykdommer HPV-referanselaboratoriet er involvert i det nasjonale oppfølgingsprogrammet for HPV-vaksinasjon i barnevaksinasjonsprogrammet (HPVnorvaks), der vi skal se på effekt av vaksinen. HPV-forekomst i urin fra flere uvaksinerte kohorter ved 17 og 21 års alder er analysert og legger grunnlaget for videre å kunne studere eventuelle endringer i forekomst av de ulike HPV-typene etter vaksinasjon. Ny og mer sensitiv, spesifikk og kostnadseffektiv teknologi for genotyping av HPV har blitt utviklet ved HPVreferanselaboratoriet slik at sikrere dokumentasjon om vaksineeffekt kan gis. Kartlegging av HPVforekomst før og etter vaksinasjon er også viktig for å kunne studere eventuell kryssbeskyttelse av vaksinen. Annet Webside Hjemmesiden til referanselaboratoriet (http://www.ahus.no/hpv-reflab) oppdateres kontinuerlig. Metodeverifisering Referanselaboratoriet har utført en metodeverifisering av QIAsymphony (Qiagen) for DNAekstraksjon fra formalinfiksert parafininnstøpt materiale. Mastergrad Mona Hansen, avdelingsingeniør ved Referanselaboratoriet, jobber med sin Mastergrad og har i 2014 bestått kursene Genomisk analyse og Molekylær cellebiologi ved Høyskolen i Oslo. 5
Ahus, 25. mars 2015 Irene Kraus Christiansen Ole Herman Ambur Truls Leegaard Leder for HPVreferanselaboratoriet, PhD Seksjonsleder, forskning og utvikling, PhD Avdelingsoverlege dr.med. 6