Tor-Henning Iversen, Plantebiosenteret (PBS),Botanisk institutt,ntnu

Cell Motility - Microtubules and Intermediate Filaments - Kap. 19 Tor-Henning Iversen, Plantebiosenteret (PBS),Botanisk institutt,ntnu e-mail : Tor- Henning.Iversen@chembio.ntnu.no Tlf. 73 59 60 87 PBS`s hjemmeside (hvor forelesningene er samlet) ; www.stud.ntnu.no/studorg/pbs

Emner som gjennomgåes Innledning Mikrotubuli : Mikrotubuli struktur - tubulin Mikrotubuli - dynamikk og assosierte proteiner: Mikrotubuli - organisering av oppbyggingen av mikrotubuli Forbindelser som påvirker mikrotubuli-dynamikken Kinesin, dynein og intracellulær transport : Mikrotubuli - et spor for vesikel- og organell-transport? Kinesin og dynein - mikrotubuli motor proteiner Cilier og flageller : Struktur og bevegelse - mikrotubuli Dynenin

Emner som gjennomgåes Mikrotubuli - dynamikk og motorproteiner i mitose Mikrotubuli maskin og kromosom-separasjon Kinetochore - kromosom-sentromer Spindelfunksjon Kromosom-bevegelse Anafase Cytokinese Plantecellevegg Intermediære filamenter (IF) Struktur og funksjon av IF IF proteiner og organisering i filamenter IF som dynamiske polymere IF og kobling til andre cellestrukturer IF - membraner, cell junctions, sarcomerer og keratin

Innledning Mikrofilamenter som er den minste typen av cytoskjellettfibre, er gjennomgått i Kap. 18. Kap. 19 tar for seg Mikrotubuli og Intermediære filamenter (IF) som er viktige for bevegelse og form hos cellen - begge er lange protein-polymere Lokalisert i cytosol - mellom kjerne og cellemembran I en overordnet sammenheng så er : Mikrotubuli - ansvarlig for cellebevegelse gjennom polymerisering/depolymerisering (cilier, flageller, transport av vesikler, kromosomforflytning, bevegelse av nervecelle-axoner) IF - kun strukturell funksjon

Mikrotubuli Mikrotubuli struktur - tubulin Mikrotubuli er en polymer av globulære tubulin-underenheter arrangert i et sylindrisk rør Byggeblokker er α - og β - tubulin i en heterodimer (også en tredje form - γ-tubulin deltar under polymeriseringen ). GTP deltar ved irreversibel og reversibel binding på to seter til α - og β - tubulin. I β - tubulin-setet hydrolyseres GTP --> GDP. Dette er et utbyttbart sete hvor GDP kan erstattes av GTP. Den fysiske lokalisering er vist på Figure 19-2. Den tubulære form opprettholdes gjennom laterale og longitudinelle interaksjoner mellom de tubulin-underenheter. Det longitudinelle protofilament er lateralt assosiert gjennom sylindre til et enkelt (singlet) rør - dvs. en mikrotubulus (Figure 19-2b). Hver mikrotubulus består vanligvis av 13 protofilamenter - kan også være dubletter (f.eks. i cilier) og tripletter (f.eks. i sentrioler) av rørene (Figure 19-3). Mikrotubuli har også en (+) og (-) ende. Mikrotubuli kan være både lang- og kortlivet. De siste (ustabile ) deltar i mitosen - de langlivete finnes i ikke-replikerende celler mens f.eks. neuroner (axoner) har en indre kjerne av stabile mikrotubuli av fundamental betydning(figure 19-4b).

Mikrotubuli (forts.) Mikrotubuli - organisering av oppbyggingen av mikrotubuli I interfase vil cytosol struktureres av et hjul med skjeker (spoke) -mønster hvor skjekene går ut fra et sentral sete - en sentrosom (i dyreceller) eller generelt et mikrotubuli-organiserende senter (MTOC) som i dyr (men ikke planter og sopp) kan inneholde et par sentrioler (Figure 19-5b). Depolymerisering av mikrotubuli kan skje eksperimentelt ved endringer i temperatur (0 o -37 o C) eller ved bruk av f.eks. colcemid. Når dette fjernes deltar sentrosomen i en repolymerisering av mikrotubuli (Figure 19-6). MTOC er ansvarlig for organisering og derved polariseringen av de cellulære mikrotubuli i ulike celler og cellefaser (Figure 19-7). I organiseringen (assembley) og polymeriseringen av av mikrotubuli underenheter deltar også proteinet γ-tubulin (Figure 19-8).

Mikrotubuli - dynamikk og assosierte proteiner Hvordan skjer assembley, disassembley og polarisering av mikrotubuli? Mikrotubuli samles ved polymerisering av α /β - tubulin-dimerene. Dette skjer primært ved (+)-enden. Etter samlingen er mikrotubuli-stabiliteten temperatur- og konsentrasjons- avhengig (Figure 19-9). Den kritiske konsentrasjonen (C c ) er hvor dimere α /β - tubulin er i likevekt med mikrotubuli. Mikrotubuli samlingen omfatter tre trinn : 1. Dannelse av protofilamenter fra α /β - underenheter, 2. Assosisering av protofilamentene til å danne vegg i mikrotubuli og 3. Forlengelse av protofilamentene ved påføring av nye underenheter (Figure 19-11). Forbindelser som påvirker mikrotubuli-dynamikken Dynamisk ustabilitet er en fremtredende egenskap ved mikrotubuli (se Figure 19-13) - påvist både in vitro og in vivo. Vekst og reduksjon i lengde av mikrotubuli kan følges på video. Over og under den kritiske konsentrasjonen (C c ) gir resp. vekst og reduksjon av den totale masse av mikrotubuli. Lokalisering av GTP ellergdp på det utbyttbare setet på β - tubulin ved (+) enden påvirker også stabiliteten til mikrotubuli (Figure 19-15). Drugs som påvirker stabiliteten av mikrotubuli er colchicine, taxol og vinblastine - alle isolert fra planter. Bruk av colchicine - og colcemid - blokkerer metafase. Taxol påvirker forlengelse/avkorting og vinblastine blokkerer ved å danne vinblastine parakrystaller.

Mikrotubuli - dynamikk og assosierte proteiner (forts.) Mikrotubuli -assosierte proteiner (MAP) Mikrotubuli-assosierte proteiner er blitt isolert sammen med tubuliner. D e såkalte assembley-maps som er ansvarlig for kryss-binding av mikrotubuli i cytosol, er organisert i to domains. De ulike grupper av MAPs er presentert i Table 19-1. For detaljer i funksjon og struktur av disse vises til tabellen og teksten i boken. Når MAP dekker den ytre veggen av et mikrotubulus er tubulin-underenhetene ikke istand til å til å dissosiere fra endene av mikrotubuli dvs. MAP hindrer cytosoliske mikrotubuli fra å depolymerisere. Lengden av mikrotubuli kontrolleres ved modulering av bindingen av MAP. Sentralt i dette er fosforylering av MAP. To enzymer - MAP-kinase som er viktig i fosforyleringen av MAP - og cdc2 kinase, har stor betydning i celle signalisering og kontroll (Kap. 20) av cellesyklus (Kap. 13).

Kinesin, dynein og intracellulær transport Mikrotubuli - et spor for vesikel- og organell-transport? Vesikler og proteiner transporteres inne i cellen langs mikrotubuli-spor Et meget konkret eksempel er den axonale transport. Hastighet og formen på denne transporten kan bestemmes ved puls-radioaktivitetsforsøk (Figure 19-19). Den axonale transport skjer i begge retninger ; anterograde transport fra cell-body til de synaptiske junctions og retrograde transport mot cell-body. Også i melanoforer dvs. spesialiserte pigmentceller som amfibier og fisk bruker for å endre farge, skjer transporten av pigment-kornene langs mikrotubuli-spor. Mest alment kjent er transporten av Golgi-vesikler og det at ER-membraner bindes med bestemte proteiner til mikrotubuli og at membranene synes å forlenges langs slike spor. Begge systemer er tett koblet opp mot MTOC.

Kinesin, dynein og intracellulær transport Kinesin og dynein - mikrotubuli motor proteiner For å avklare de axonale mekanismer er det undersøkt i in vitro-forsøk hvilke proteiner som kan fremme transporten av synaptiske vesikler langs mikrotubuli. Ved eksperimentelt bruk av vesikler, nerve cytosol, AMPPNP (analog til ATP) og ATP ble det påvist at kinesin er et motor-protein som transporterer vesikler, proteiner og organeller langs mikrotubuli. Strukturen av kinesin er vist i Figure 19-23 ; tre domains - to tunge kjeder (hode), et α- helix nakke-område og to lette kjeder ( hale). Respektive oppgaver ; 1. Hode: ATPhydrolyse + binding av mikrotubuli (ansvarlig for motor-aktiviteten) og 2. Hale : binding til vesikler (cargo). Kinesin ligner strukturelt Ras (guanin-nukleotid-bindingsprotein) og har også likheter med myosin-motor-domain - viser felles opphav. Kinesin-motor transport er anterograde dvs. transporterer vesikler fra (-) til (+) enden på et mikrotubuli (Figure 19-24). Kinesin tilhører en familie (12 medlemmer) av beslektede motor-proteiner men med bl.a. forskjell i hale-domain. Kinesin kan også deles i to funksjonelle grupper - cytosolisk- og spindel-kinesin - avhengig av cargo (se oversikt i Table 19-2).

Kinesin, dynein og intracellulær transport Kinesin og dynein - mikrotubuli motor proteiner (forts.) Dynein tilhører en annen gruppe av ekstra store motor-proteiner, men med transportretning motsatt (retrograde) av kinesin - dvs.mot (-)enden av mikrotubuli. Dynein er delt i to funksjonelle klasser (Table 19-2); cytosolisk (vesikler og kromosomer) og axonemal (cilia og flageller). Strukturelt ligner dynein kinesin pga de to hoder (Figure 19-25). Men -dynein kan ikke fremme transport uten hjelp av komplekser av mikrotubuli-bindingsproteiner (MBP). Best karakterisert er dynactin med 8 underenheter bl.a. dynamatin, actin-capping protein Arp 1 og Glued. I Figure 19-26 er vist en generell - men forenklet modell - for kinesin-(anterograde) og dynein-(retrograde) fremmet transport i cellen.retningen av vesikeltransporten er også avhengig av orienteringen av mikrotubuli som er bundet av MTOC.

Cilier og flageller - struktur og bevegelse Struktur og bevegelse - betydning av mikrotubuli Bølgebevegelsen er karakteristisk for cilier og flageller - illustrert i Figure 19-27 med sædcelle og Chlamydomonas.Merk at bøyningen presser på omgivende medium og presser cellen forover eller beveger væske langs et fiksert epitel. Merk også forskjellen mellom de to faser ; effective og recovery stroke. Axonem er den sentrale samling av mikrotubuli i et 9 + 2 mønster (Figure 19-28) avgrenset av en plasmamembran. Hver dublett mikrotubulus inneholder A og B -rør bundet sammen med proteinet tektin. Forøvrig finnes 13 og 10 protofilamenter med dynein-armer, nexinbinding, inner sheat og radielle skjeker (spoke) med hode på. Axonemet er festet til et basal-legeme (Figure 19-29) som hver består av ni triplettmikrotubuli(figure 19-3). Biokjemiske og genetiske studier av Chlamydomonas reinhardtii og mutanter av denne har gitt mye kunnskap om flageller. Axonem- bevegelsen er en gliding av protein-filamenter relativt til hverandre. Her spiller dynein en sentral rolle.

Cilier og flageller - struktur og bevegelse Betydning av dynenin Mekanismene for dynein-fremmet gliding av de axonemale ytre dublett-mikrotubuli er vist i Figure 19-31 og 19-32. Sentrale elementer i bevegelsen er : Dynenin er flerhodete motor-proteiner Kraften som kreves for aktiv gliding krever ATP Cilier og flageller har en aktiv ATPase er forbundet med dynein-armene Binding og hydrolyse av ATP medfører at dynein-armene suksessivt frigjøres fra og bindes til nærliggende dublett Glidingen (lineær) skjer relativt mellom dublett A og B subfiberen og mot (-)-basis av B Axonemalt dynein består strukturelt av basis og hode, basis er festet til A-delen og hodet til B-delen, ATP hydrolyseres i A-delen, ATP bindes til hodet. Bøyningen i cilier og flageller dannes i områder hvor gliding og motstand mot gliding forekommer. Kontrollen av bøyningen har sin basis i respektiv bøyning i to halvdeler av dynenin-armen. De radielle skjeker (spokes), de to sentrale mikrotubuli og indre-arm dyneiner (Figure 19-28) spille en viktig rolle i flagell-bøyningen. Dynamikk, oppbygging og stabilitet i axenomale mikrotubuli er vist i fusjonsforsøk med Chlamydomonas (Figure 19-33).

Mikrotubuli - dynamikk og motorproteiner i mitose Mikrotubuli maskin og kromosom-separasjon Regulering av cellesyklus - herunder mitose - ble gjennomgått i Kap. 13. De fire hovedtrinn (profase, metafase, anafase og telofase) er vist i Figure 19-34. Det mitotiske apparatet - dannet av mikrotubuli - endres kontinuerlig under mitose med den primære oppgave å separere kromosomene. I metafase er det mitotiske apparatet en kort tid statisk og organisert i to deler ; 1. En mitotisk spindel (bilateral, symmetrisk samling av mikrotubuli) og 2. Et par med asters (dannet av astrale mikrotubuli) (Figure 19-36). I hver halvdel av spindelen organiserer en sentrosom tre sett av mikrotubuli; 1. Astrale mikrotubuli, 2. Kinetochore mikrotubuli og 3. Polare mikrotubuli. Spindelen utgjøres av kinetochore og polare mikrotubuli. Organiseringen i gjærceller avviker noe fra overnevnte. Planteceller mangler synlig sentriole (Figure 19-5b).

Mikrotubuli - dynamikk og motorproteiner i mitose (forts) Kinetochore - kromosom-sentromer Søster-kromatidene i metafase-kromsomene transporteres til hver pol langs kinetochore mikrotubuli. Kinetochoren (Figure 19-39) observeres først i sen profase men før etableringen av det mitotiske apparatet. Kinetochoren ligger i sentromeren som er høyst spesialisert område av kromosomet hvor søster-kromatidene ligger tettest. Lokaliseringen av kinetochoren og dermed sentromeren er direkte kontrollert av en spesifikk sekvens av kromosomalt DNA kalt sentromerisk (CEN) DNA.. CEN DNA er organisert i tre regioner kalt CDE I-III (Figure 19-41) eller sentromer DNA-elementer I, II og III. Den siste er viktigst for sentromer-funksjonen og samvirker med en sentromer-bindingsfaktor (CBF3). Sentrosomen skal dupliseres i mitosen og beveges mot polen. Prosessen kalt sentriolesyklus (eller sentrosom-syklus) starter i G1-fasen (Figure 19-40). Høy omsetning av tubulin i mikrotubuli under mitosen viser betydningen av mikrotubuli-dynamikk i mitosen (Figure 19-41). Levetiden for mikrotubuli går ned fra 10 min i interfase til 30 sek i mitotisk spindel dvs. raskere organisering/deorganisering.

Mikrotubuli - dynamikk og motorproteiner i mitose (forts) Kinetochore - kromosom-sentromer (forts.) Spindelfunksjon Kinsein-relaterte proteiner (KRP) eller spindel-kinesiner deltar i bevegelsen av sentrosomen og dermed i organiseringen av spindel og spindel-aster. I tillegg virker cytosolisk dynein i sentrosom-bevegelsen og spindel-orienteringen (Figure 19-42). KRP, dynein og NuMA kryssbinder (-)enden av spindel-mikrotubuli i dannelsen av spindel-polen koblet mot sentrosomen (Figure 19-43b). Hurtige fluktuasjoner i lengden av (+)enden av mikrotubuli, brukes for å fange opp kromsomene i kinetochoren under profase mens kjernemembranen brytes ned (Figure 19-44). Kromosom-bevegelse Kromsomene bundet til kinetochor-mikrotubuli beveger seg ved hoppende (=saltatory) bevegelser på veien mot ekvator av spindelen. Før alle mikrotubuli er bundet til kinetochorer vil ikke anafase inntre. Det er tenkt alternative mekanismer for hvordan samlingen av kromsomene i ekvator skjer. Dette omfatter bl.a. polymerisering og depoylymerisering av vil tubulinunderenheter, CENP-E og dynein (Figure 19-45)

Mikrotubuli - dynamikk og motorproteiner i mitose (forts) Anafase De samme krefter som virker ved dannelsen av spindelen i pro- og metafase, er også med å trekke kromosomene mot de motsatte poler i anafase. Denne deles i tidlig (Anafase A) og sen (Anafase B) anafase. Ved at mikrotubuli forkortes gjennom depolymerisering fra (+)enden i Anafase A vil kromosomene forflyttes mot (-)enden og derved mot polene (Figure 19-46). I Anafase B vil spindelen forlenges ved påleiring av tubulin til (+)enden av de polare mikrotubuli (Figure 19-47). Cytokinese Når kromosomene er kommet til polene, gjendannes kjernemembranen rundt kromosomene og cellen deles (cytokinese - Figure 19-34). Delingsplanet og delingsfuren bestemmes ikke av spindelen selv men av to asters (Figure 19-48) som sender signaler som aktiverer actin og myosin med påfølgende dannelse av delingsfuren. Plantecellevegg I planteceller dannes i cytokinesen en fragmoplast (--> celleplate) fra Golgi-vesikler. I gjendannelsen av celleveggen deltar kortikulære mikrotubuli (cmt) - Figure 19-49.

Intermediære filamenter (IF) Struktur og funksjon av IF IF er det tredje settet av cytoskjellett-fibre i eukaryote celler (Figure 19-50 : mikrofilamenter, mikrotubuli og IF) IF`s primære funksjon er struktur-styrking av cellen og organisering til vev. I hår og klover er IF-proteiner i sin mest ekstreme funksjon. Forskjell fra mikrofilamenter og mikrotubuli ; IF deltar ikke i bevegelser, er ekstremt stabile (tåler detergenter, salter, urea), mellom-størrelse, alfa-heliks som samles i taulignende filamenter, krever ikke GTP/ATP, bindes ikke til nukleotider. IF-proteiner er klassifisert i 6 typer (Table 19-3) av stor variasjon og MW ; * Sure og basiske keratiner (Type I og II) i harde epitelceller (negler etc.) og cytokeratiner * Vimentin (leukocytter,fibroblaster m.fl.), desmin (muskelceller), glial-sure proteiner (GFAP; filamenter i glial-celler omkring neuroner og ascocyter) og peripheriner (neuroner i perifert nervesystem) - Type III IF * Neurofilamenter (NFs) i neuronale axoner - Type IV polypeptider. Ansvarlig for radiell vekst (diameter) av et axon dvs. bestemmer hastigheten av ledningsimpulsen. * Laminer -Type V IF proteiner - i kjernen Kunnskap om IF proteiner brukes i kreftdiagnostisering og behandling. Tumorceller uttrykker de IF proteiner den opprinnelige normale cellen hadde og man kan diagnostisere celletypen på basis av spesifikke Mabs.

Intermediære filamenter (IF) - forts. IF proteiner og organisering i filamenter Felles domain-struktur : α-helix-kjerne flankert av globulære N- og C-terminale domains (Figure 19-51, øverst) separert av 4 spacers (ikke-helixer). To monomerer danner en parallel dimer med hode (NH-grupper) og hale (COOHgruppe) som videre danner antiparallele tetramerer som bindes sammen ende til ende og danner underenheten (protofilamentet) i IF. Protofilamenter parres sammen til protofibriller - fire av disse danner et enkelt IF. Ulike IF proteiner kan danne både homopolymere og heterodimere filamenter. IF som dynamiske polymere Man diskuterer fortsatt om tetrameren er grunnenheten for organisering av IF. Eksperimenter med bl.a. biotin-merket Type 1 keratin i tidstudier (Figure 19-53) og FRAP-teknikk (Figure 5-36) har vist at IF-proteiner kan erstatte IF-cytoskjelletet. IFunderenheter fra en løselig pool i cellen vil derfor påleires og avsnøres fra intakte IF. Det er viktig for cellen å ha et dynamisk system av IF - spesielt i mitotiske celler hvor bl.a. filamenter av vimentin, desmin og laminer nedbygges tidlig og reorganiseres etter celledelingen. I dette dynamiske systemet deltar kinaser (cdc2-kinase) og fosfataser.

Intermediære filamenter (IF) IF og kobling til andre cellestrukturer IF-assosierte proteiner (IFAPs) kryssbinder IF til hverandre og danner en samling (tonofilament) eller et nettverk som også er bundet til andre cellestrukturer.kun noen få IFAP er identifisert. En forutsetning for den fysiske bindingen mellom IF og mikrotubuli er tilstedeværelse av sammenbindende proteiner (IFAP) og mikrotubuli. Et slikt IFAP er påvist - kalt plectin. Dette kan også samvirke med andre cytoskjellettproteiner (f.eks. spectrin), MAPs og lamin B. På Figure 19-54 demonstreres immuno-gullmerket MAbs til plectin som viser de tynne plectin-forbindelser mellom mikrotubuli og vimentin. IF - membraner, cell junctions, sarcomerer og keratin Et nettverk av IF danner en mekanisk støtte for cellulære membraner - f.eks. kjernelamina. Epitel-celler i organer i kroppen og i huden holdes sammen av IF i spesialiserte cell junctions kalt desmosomer (celle-celle-tiltrekning) og hemidesmosomer (binding til underliggende membraner) - se Figure 19-56. Bindingene som IF her representerer er med å gi mekanisk støtte til hele cellen.

Intermediære filamenter (IF) IF - membraner, cell junctions, sarcomerer og keratin (forts.) IF av Type III - desmin - omgir sarcomeren i muskelceller (Figure 19-57). Desmin filamentene er kryssbundet til plasmamembranen av flere typer IFAP. I lengderetningen finnes også desmin-filamenter som holder sammen Z-skiver innen og mellom myofibriller. Desmin deltar ikke i kontraktile bevegelsre i muskelen. I epidermis som bl.a. hindrer vanntap, er bunter av keratin kryssbundet av filaggrin (en IAFP) og forankret i endene til desmosomer. Alvorlige degenerative sykdommer i huden, muskler og neuroner forårsakes av nedbrytning av IF cytoskjellettet eller dets forbindelser til andre cellestrukturer.