1 DNA replikasjon, Stadium IC, 2012, Tonje Strømmen Steigedal 2 Vil bli gjennomgått: Hovedvekt på prosesser i eukaryote celler Initiering av replikasjonen Dannelse av primere og Okazaki-fragment Koordinering av DNA-syntesen i leading og lagging strand Fjerning av gamle primere Hva skjer ved inkorporering av feil base, eller hvis replikasjonskomplekset møter en DNA-skade? 1
3 I løpet av cellens livssyklus, må DNA-innholdet i cellekjernen fordobles Dette skjer i S- (syntese)- fasen i cellesyklus. Selve prosessen kalles. Tallet foran n angir hvor mange kopier av hvert kromosom (unntatt xog y) som er tilstede i cellekjernen 4 Viktige punkt (repetisjon) skjer i cellekjernen og i mitokondriene. I cellekjernen skjer dette en gang pr generasjon, i S-fasen. Nytt DNA kan også dannes i forbindelse med DNA-reparasjon. Replikasjonen er semikonservativ (Meselsohn & Stahl). Kromosomal replikasjon er bidireksjonell. Replikasjonen skjer i bestemte replikasjonsorigi. DNA-syntesen skjer i 5-3 - retning. DNA-polymeraser utfører selve syntesen. 2
5 Replikasjon foregår i replikasjonsfabrikker Ved hjelp av immunologiske teknikker, og studier av merkede proteiner, har en vist at en foregår i store proteinkompleks som dannes tidlig i S-fasen. Disse kompleksene inneholder svært mange (også uidentifiserte) proteiner. Mye tyder på at kompleksene ligger på relativt fikserte punkt i kjernen, og at DNAet spoles gjennom kompleksene under replikasjonen. Hver fabrikk inneholder sannsynligvis mange replikasjonsgafler. PCNA (Proliferating cell nuclear antigen) koblet til Green Fluorescent protein kolokaliserer med nydannet DNA i S-fasen, visualisert med anti-brdu antistoff. 6 De klassiske eukaryote DNApolymerasene Hovedfunksjon Initiering av Okazakifragment Kromosomal replikasjon (lagging str.) Kromosomal replikasjon (leading str.) DNA reparasjon Replikasjon av mitokondrie DNA Masse (kda) 180 170 256 36-38 160-300 Lokalisering Kjernen Kjernen Kjernen Kjernen Mitokondrier 3-5 exonuklease Nei Ja Ja Nei Ja Primase Ja Nei Nei Nei Nei Prosessivitet Lav Høy Høy Lav Høy Nøyaktighet Høy Høy Høy Lav Høy Replikasjon Ja Ja Ja Nei Ja Reparasjon Ja Ja Ja Ja Ja 3
7 DNA-syntesen skjer i 5-3 retning De to trådene i DNA-heliksen går i motsatt retning av hverandre (de er antiparallelle). Den enden av DNAtråden som mangler en nukleotid i 5 - pososjon på sukkerringen, kalles 5 - enden, og tilsvarende kalles den enden som mangler en nukleotide i 3 - posisjon, 3 -enden. Den DNA-tråden som tjener som templat, leses alltid i 3-5 -retning, og dattertråden syntetiseres i 5-3 -retning. 5 3 8 Initiering av replikasjonen (dagens modell) Langs DNA-molekylet ligger mange replikasjonsorigi (ori) P P I G1-fasen vil et prereplikasjonskompleks av ORC-proteiner, Cdc6, Cdt1 og MCM2-7 binde til ori. I S-fasen fosforyleres MCM av S- fasespesifikke kinaser, slik at det lastes rundt DNA-trådene og helikaseaktiviteten aktiveres. Dette danner et åpent replikasjonskompleks. Det åpne replikasjonskomplekset rekrutterer Cdc45 og DNApolymerase /primase, og dannelsen av primere kan starte. Samtidig binder Geminin til Cdt1 og inaktiverer det, slik at enda en initiering av samme ori ikke kan skje før neste S-fase. Helikase ori 4
9 Transkripsjonsfaktorer påvirker initieringen ORC i høyere eukaryoter (inkludert mennesket) ser ut til å ha lav DNAsekvensspesifisitet. Dette er en av årsakene til at vi har mange potensielle initieringsseter. Enkelte replikasjonsorigi blir aktivert i starten av S-fasen, og disse ser ut til å ligge i områder med høy transkripsjonsaktivitet. En tror at transkripsjonsfaktorene påvirker initieringen enten via kromatin-remodellering (indiriekte), eller via direkte interaksjon med ORC. 10 Hvordan blir riktig nukleotid satt inn? Spesifikk baseparing Tymin Adenin Cytosin Guanin Induced fit Polymerasen registrerer templat-basen, og modifiserer strukturen i det aktive setet slik at det er optimalt for binding av den korrekte basen 5
11 Replikasjonen starter med en RNA-primer Korte fragmenter av RNA dannes først, og tjener som utgangs-punkt for forlengelse ved DNA polymerase (og ) (både på leading og lagging strand) 12 Mange primere dannes på lagging strand Leading strand syntetiseres kontinuerlig fra én primer, og i samme retning som replikasjonsgaffelen. Lagging strand syntetiseres i små biter fra hver sin primer, og i motsatt retning av replikasjonsgaffelen. Syntesen av begge trådene er imidlertid nøye koordinert. 6
13 Lagging strand danner en loop for å orientere trådene i samme retning Replisom = proteinkompleks med DNA-polymerase + andre protein Loopen på lagging strand dannes en gang pr Okazakifragment 14 Primerene dannes av Pol /primase DNA-polymeraser kan ikke starte DNA-syntese direkte på ss (single-strand)-dna. DNA pol Replikasjonen er avhengig av et spesialisert enzym, primase til å lage korte RNA-primere. I eukaryoter er dette enzymet et kompleks, som blant annet inneholder DNA pol. Pol / primase DNA-polymeraseaktivitet i p180. RNA-primase-aktivitet i p49/p58. p70 dirigerer komplekset til replikasjonsgaffelen. Eukaryoter: p49 danner et 8-12 nt RNAfragment, og p58 overfører dette til p180, som forlenger dette med ca 20 DNA-trinn. Det to delene utgjør tilsammen primeren. Deretter dissosierer primasekomplekset, og Pol fortsetter forlengelsen av Okazakifragmentet. 7
15 Okazaki-fragmentene forlenges av Pol og hjelpeproteiner RFC (replikasjonsfaktor C) binder først på enden av primeren. PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen - prosessivitetsfaktor for polymerasen) binder RFC, og lastes på DNA-tråden. Polymerase / binder til PCNA og DNA-syntesen starter. Krystallstrukturen til PCNA i kompleks med RFC 16 Modell av eukaryot replikasjonsgaffel Basert på studier av replikasjonsgaffelen i bakterier, og lignende forsøk i gjær og mammalske celler, har en kommet frem til en modell av replikasjonsgaffelen som har mange likhetstrekk med den i E. coli. Det er imidlertid flere proteiner involvert i eukaryot replikasjon, noe som tyder på et mer komplekst reguleringsnivå. Forenklet modell 8
17 Hva skjer når Okazakifragmentet når det forrige Okazakifragmentet? 1 Pol pløyer av primeren i det forrige fragmentet. 2 RPA (replikasjonsprotein A, ss- DNA-bindende) binder. 3 Endonukleasen Dna2 rekrutteres av RPA, og kutter av RNA-delen. 4 Fen1 (Flap-endonuklease1) (eller andre) kutter resten av primeren. 5 DNA ligase 1 danner fosfodiesterbinding mellom gammelt og nytt fragment. 18 Prosessering av Okazaki-fragmentene Topoisomerase Helikase Polymerase / PCNA RFC Templattråd Dattertråd Fen-1 og RNaseH1 fjerner RNA primer Pol /primase RPA DNA ligase I ligerer trådene RNA primer Polymerase forskyver RNAprimeren og fyller igjen gapet 9
19 Hva skjer ved enden av kromosomene? Når replikasjonsgaffelen når enden av et kromosom (telomer-regionen), vil ikke den ytterste 3 -enden kunne kopieres, da DNA-polymerasen ikke har en primer her. Dette gjør at kromosomene blir kortere og kortere for hver celledeling. Dette fenomenet har blitt satt i forbindelse med aldringsprosessen. Kjønnsceller, stamceller og kreftceller løser problemet med telomerforkortning vha enzymet telomerase. Mye forskning på dette feltet mtp ny kreftterapi og aldring. Humane kromosomer forkortes med ca 100 bp for hver replikasjonsrunde. 20 Hva skjer når polymerasen treffer en DNA-skade? Mange typer DNA-skader fører til at de replikative polymerasene blir blokkert, og replikasjonen stanser opp. En slik stans gjør cellen i stand til å reparere DNA-skaden. Hvis massive skader opptrer, kan cellen velge å gå inn i programmert celledød (apoptose) for å unngå å introdusere mutasjoner. Endel celler kan ikke ofres på denne måten, og det fins derfor en gruppe (relativt nyoppdagete) polymeraser som kan polymerisere over skadene. Slike polymeraser kalles translesion-synthesis (TLS-) polymeraser. Disse har generelt lav nøyaktighet, selv om enkelte faktisk setter inn riktige nukleotider ovenfor bestemte skader. Ett eksempel på sistnevnte er DNA polymerase (eta), som vil sette inn AA ovenfor en tymindimer (vanlig UV-skade) eller C ovenfor 8-oxoG (oksydert guanin). Pol kan bytte plass med Pol ved at PCNA først ubiquitineres som følge av DNA-skade. 10
21 TLS-polymeraser (foreløpige data) Navn MW Karakteristika hittil funnet Pol (eta) 78 TLS av UV skader (AA ovenfor TT-dimer C ovenfor 8-oxoG) (defekt gir Xeroderma pigmentosum type V, XPV) Pol (iota) 81 TLS av UV skader. Setter ofte inn feil nukleotid ovenfor skade, men foretrekker G ovenfor U Pol (zeta) 353 TLS? Mispar ekstensjon Pol (kappa) 99 TLS? Mispar ekstensjon. Kan lese gjennom bulky skader dcmp transferase 138 TLS? Setter inn dcmp ovenfor AP-seter Pol (theta) 198 Helikase? Reparasjon av kryssbindinger Pol (lambda) 66 Meiose-assosiert DNA reparasjon Pol (my) 55 Somatisk hypermutering 22 Vil helikasen fortsette å åpne DNA-heliksen om polymerasen stopper? Flere faktorer kan forsinke eller stoppe DNA-polymeriseringen, blant annet mangel på DNA-byggesteiner (eks: Hydroxyurea (Droxia); hemmer ribonukleotid reduktase). For å unngå at helikasekomplekset fortsetter å spole ut ssdna, er polymerasene koblet fysisk sammen med helikasene via et Fork protection complex (FPC), som består av 4 proteiner. FPC-komplekset danner også en plattform for DNA-skade signalisering, og binder kinaser som medierer intras-cellesyklusarrest. 11
23 Oppsummering: Hva bør du kunne etter denne forelesningen? Relevante læringsmål, Biokjemi; 5 Genetikk, cellebiologi 5.1 Studenten skal kunne: 5.1.1 gjøre detaljert rede for nukleinsyrenes kjemiske og fysiske egenskaper, den genetiske koden, replikasjon, transkripsjon, translasjon og prinsipper for regulering av genekspresjon Initiering av replikasjonen Dannelse av primere og Okazaki-fragment Koordinering av DNA-syntesen i leading og lagging strand Fjerning av gamle primere Hva skjer i telomerregionen? Hva skjer ved inkorporering av feil base, eller hvis replikasjonskomplekset møter en DNA-skade? 12