Intracellulær proteinsortering, endocytose, eksocytose.. riktig protein på riktig sted i cellen. Forelesning for IB, mai 2008 Terje Espevik, IKM "What the?... This is lemonade! Where's my culture of amoebic dysentery?" Intracellulær transport av proteiner (ca 50% av cellevolumet) 1
Forenklet veikart over proteintrafikken i en celle All proteinsyntese starter på frie ribosomer i cytosol. De fleste proteiner har ikke sorteringssignal; disse forblir i cytosol Her må ribosomene feste seg til ER Transportmekanismer for proteiner mellom forskjellige kompartment Vesikkeltransport fra ett kompartment til et annet 1. Transport av proteiner og andre molekyler vha vesikkelbevegelse og fusjon 2. Gjelder for transport mellom ER, Golgi, lysosomer, endosomer og plasma membranen 3. Toveis transport 4. Orienteringen av lipid-dobbeltlaget beholdes ved vesikkeltransporten 5. Nødvendig for proteinmodifisering (glykosylering) 2
Sorteringssignalet bestemmer reisens mål Det finnes minst to typer av sorteringssignaler på proteiner: - signalpeptid, lengde 15-60 aminosyrer. Før sekresjon fjernes disse vha en signalpeptidase. Brukes for å dirigere proteiner fra cytosol inn i ER, mitochondriene, peroxisomene og kjernen. - signal lapp (patch) dannes når proteinet er riktig foldet. Brukes f.eks. til å merke enzymer som skal til lysosomene. Forenklet veikart over proteintrafikken i en celle All proteinsyntese starter på frie ribosomer i cytosol Her må ribosomene feste seg til ER Transportmekanismer for proteiner mellom forskjellige kompartment 3
Kjernen og kjerneporer portstyrt transport 1. Kjernens dobbeltmembran penetreres av kjerneporer og er kontinuerlig med ER. 2. Kjerneporene består av komplekse elastiske strukturer (ca 30 ulike proteiner) som styrer aktiv import og eksport av proteiner 3. Signalsekvens for import: 4. Eksempel på proteiner som importeres/eksporteres:. histoner, DNA- og RNA polymeraser, transkripsjonsfaktorer, ribosomale proteiner som reagerer med rrna før de eksporteres (som ribosomale subenheter) 5. Ca 3000-4000 kjerneporer/celle Nuclear pore complex (NPC) porestørrelse: 9 nm 26 nm Forenklet veikart over proteintrafikken i en celle All proteinsyntese starter på frie ribosomer i cytosol Her må ribosomene feste seg til ER Transportmekanismer for proteiner mellom forskjellige kompartment 4
Import av proteiner i mitochondria TOM komplekset transporterer signal sekvensen over ytre membran. TIM komplekset åpner kanalen slik at proteinet kommer gjennom indre membran. ATP avhengig prosess Glatt og rutt ER Alle eukaryote celler har ER. Utgjør ca 50% av den totale membranmengde. Fungerer som Ca 2+ lager. Rutt ER har ribosomer festet på ytre membran: Import av proteiner i lumen av ER skjer under protein syntesen (ko-translasjon). Rutt ER fra celle i pancreas som produserer enzymer Glatt ER: finnes f.eks. i celler som lager mye steroider og lipider. Enzymer for detoksifisering (cytochrom P450 familien) finnes også i glatt ER. Hepatocytter har mye glatt ER: produserer lipoprotein partikler. I ER finnes enzymer og chaperoner som gir proteiner riktig tertier struktur kvalitetskontrollen av proteinene skjer her. Proteiner med feil blir ikke sendt videre i det sekretoriske systemet. Glatt ER fra en celle som produserer testosteron 3D rekonstruksjon av et område av rutt og glatt ER i en levercelle. Post translatoriske modifikasjoner finnes i ER 5
ER signal hypotesen slik den opprinnelig ble foreslått (ca 1970) Membranproteiner translokeres bare delvis gjennom ER membranen Proteiner som skal bli værende i lumen av ER må ha et ER retensjonssigal. Hvis dette mangler, vil proteinet transporteres videre til Golgi og ut av cellen. Eks. på et ER retensjonssignal: Binding av ribosomer til ER og translokering over ER membranen Protein translokatoren i ER mkalles Sec61 som består av et kompleks av flere proteiner som danner en pore i ER membranen. Dette er en dynamisk struktur som åpnes når ribosomet binder seg SRP: Proteinkompleks bestående av 6 subenheter og ett RNA molekyl. Bindes til signalpeptidet og til ribosomet; dette fører til pause i translasjonen Et protein med ER signal lokaliseres til ER membranen via: 1. SRP som finnes i cytosol og som bindes til ER signalsekvensen når denne eksponeres i ribosomet 2. SRP reseptor som finnes på ER membranen SRP: signal recognition particle 6
De fleste proteiner i ER blir glykosylert på asparagin Asparagin koblede (N-koblede) oligosakkarider settes på de fleste proteiner i ER. De fem sukkerenhetene merket med grått utgjør kjerneregionen av oligosakkaridet. Bare asparagin i sekvenser Asn-X-Ser eller Asn-X-Thr (X: hvilken som helst aminosyre) blir glykosylert. Oligosakkaridene settes på proteinet som en blokk. Prosessen katalyseres av enzymet: oligosakkaryl transferase. Figure 12-50 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Forenklet veikart over proteintrafikken i en celle All proteinsyntese starter på frie ribosomer i cytosol Her må ribosomene feste seg til ER Transportmekanismer for proteiner mellom forskjellige kompartment 7
Organisering av Golgi (mot ER siden) I Golgi: modifisering av N-koblede oligosakkarider Begercelle i tynntarmen som produserer mucus: blanding av glykoproteiner og proteoglycaner Det finnes to hovedklasser av asparaginkoblete oligosakkarider i glykoproteiner: - Komplekse oligosakkarider (B) - Mannoserike oligosakkarider (C) Hvert oligosakkarid har en kjerne som består av de N-koblede sakkaridene som ble satt på i ER (A). De komplekse oligosakkaridene kan være svært heterogene og lages ved trimming av de opprinnelige som ble satt på i ER, og ved påkobling av nye sukkermolekyler. I tillegg har man O-koblet glykosylering i Golgi: dvs. oligosakkarider som kobles til OH grupper i Ser og Thr. 8
Golgi apparatet er delt inn i funksjonelle kompartment 1) I cis Golgi nettverket settes fosfatgrupper på mannose enheter i proteiner som skal til lysosomer. 2) I cis Golgi vil mannose-rike oligosakkarider som er koblet til asparagin enheter trimmes ned. 3) I medial og trans Golgi vil nye karbohydrater settes på den trimmede strukturen. Her foregår også O-koblet glykosylering til serin og treonin. For proteoglykanene er det siste trinnet sulfatering av karbohydrat sidekjedene og av tyrosiner i peptidkjeden. 4) I trans Golgi pakkes molekyler i vesikler som sendes til sitt bestemmelsessted. Intracellulære kompartments for endocytotiske- og sekretoriske veier Figure 13-3 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Biosyntetisk sekretorisk vei Vei for gjenvinning Endocytoseveien 9
Secretory pathway Exocytosis 10
Forenklet veikart over proteintrafikken i en celle All proteinsyntese starter på frie ribosomer i cytosol Her må ribosomene feste seg til ER Transportmekanismer for proteiner mellom forskjellige kompartment Cellulære opptaksmekanismer Fagocytose: Opptak av partikler, bakterier eller celler (>1-2 µm) antistoffdekket kreftcelle Aktinavhengig prosess Det finnes en rekke fagocytiske reseptorer (f.eks. Fc-R, komplement R) Monocytter/Makrofager, nøytrofile granulocytter og dendritiske celler er viktige fagocyterende celler monocytt How to eat something bigger than your head Trenger mye membran for å kunne omslutte celler som skal fagocyteres: ER er en viktig membrankilde 11
Reseptor mediert endocytose Klatrin-dekkede groper og vesikler Internalisering av makromolekyler bundet til sin reseptor starter når reseptorkomplekset befinner seg over coated pits i cellemembranen. Slike strukturer snøres av fra membranen og danner coated vesicles. Slike vesikler er nødvendig for opptak av ligander som er bundet til en reseptor. Coated vesicles kan også transportere proteiner fra Golgi til plasmamembranen via sekresjonsprosesser. Den ytre overflaten av vesiklene består av et protein, klatrin. Når klatrin polymeriserer dannes strukturer som ligner på basketballnett som har pentagon og hexagonstrukturer. 12
Strukturen av klatrin Klatrin triskelion Flere forskjellige coat proteiner er nødvendig for vesikkeltransport i cellen Biosyntetisk sekretorisk vei Vei for gjenvinning Endocytoseveien I tillegg deltar også SNARE proteinene i feste og fusjonering av vesikler SNAREs (står for: soluble N-ethylmaleimide-sensitive fusion protein attachment protein receptors) En familie av membran proteiner som er nødvendig for sammenkobling av vesikler v-snare =vesikkel SNARE t-snare = target membran SNARE v- and t-snares utgjør spesifikke par for å styre vesikkelen til riktig mål Spesifikke medlemmer av SNARE familien finnes på forskjellige kompartment i den sekretoriske veien 13
Opptak av kolesterol i celler ApoB-100 Skjematisk struktur av en LDL partikkel. Masse: 3 x 10 6 daltons Normale og muterte LDL reseptorer. A) LDL reseptorer på plasmamembranen binder seg til LDL partikler som tas opp i cellen via coated pits. B) En form for familiær hyperkolesterolemi som skyldes en genetisk defekt i genet som koder for LDL reseptoren. Celler fra disse pasientene har LDL reseptorer som kan binde LDL partikler, men ikke transportere dem inn i cellene. Dette resulterer i høye kolesterolverdier i blod og tidlig hjerteinfarkt. Forekomst: 1:500. Reseptor-mediert endocytose av LDL. 14
Reseptor-mediert endocytose av LDL. Lysosomer 15
Den endocytiske vei fra plasma membranen til lysosomer Modning av lysosomer Ubiquitin og endocytose/ degradering Ub Ub Ub Ub K K K K Monoubiquitinering: Endocytose, sortering av membranproteiner til lysosomer Proteiner blir vanligvis merket for selektiv ødeleggelse i proteolytiske komplekser som kalles proteasomer. Dette skjer ved at ubiquitin, et lite og kompakt protein, kovalent kobles til lysin enheter i proteinet som skal ødelegges. Ubiquitin er også en merkelapp for lysosomal degradering av membranreseptorer Ub Ub Ub Ub Ub K Polyubiquitinering: Proteasomal degradering 16
clathrin Ubiquitin MVE: multivesicular endosome/late endosome Intracellulær proteinsortering, endocytose, eksocytose sammendrag All proteinsyntese starter på frie ribosomer i cytosol. De fleste proteiner har ikke sorteringssignal; disse forblir i cytosol Sorteringssignaler Mekanismer for hvordan ribosomene fester seg. Glykosylering i ER Inndeling av Golgi og funksjoner Biosyntetisk- og endocytotisk vei Transportmekanismer for proteiner mellom forskjellige kompartment 17