DNA-replikasjon Ulike former for DNA-replikasjon I løpet av cellens livssyklus, må DNAinnholdet i cellekjernen fordobles Dette skjer i S- (syntese-) fasen i cellesyklus. Selve prosessen kalles DNA-replikasjon Tallet foran n angir hvor mange kopier av hvert kromosom (unntatt xog y) som er tilstede i cellekjernen 2n 2n M 4n G0 G1 G2 S 2n 4n Replikasjon av DNA i cellekjernen Skjer 1 gang pr cellegenerasjon, i S-fasen Replikasjon av mitokondrielt DNA I tillegg til kromosomene i cellekjernen, inneholder også cellenes mitokondrier DNA. Dette må også replikeres før mitokondriene deles, men denne replikasjonen er ikke synkronisert med celledelingen. Replikasjon ved DNA-reparasjon Ved skade i arvematerialet, vil cellulære enzymer kunne fjerne det skadde DNA-segmentet. Den manglende delen må deretter fylles inn ved DNA-replikasjon DNA er selv templat for replikasjon Meselson og Stahls eksperiment (1958) I 1940-årene ble det kjent at DNA var det genetiske materialet i cellene. Det var imidlertid ikke før på slutten av 1950-tallet, etter at Watson og Crick utledet DNAstrukturen (1953), at en fant at DNA også kunne tjene som en templat (utgangspunkt) for replikasjon og overføring av genetisk informasjon Meselsohn og Stahl dyrket celler i flere generasjoner i nærvær av 15 N ( tungt nitrogen) inntil alt nitrogen i DNAet var 15 N. Cellene ble deretter overført til medium med normalt 14 N, og tettheten av DNAet i de påfølgende to generasjoner ble målt ved sentrifugering. Slik ble det påvist at DNAet replikerte semikonservativt Light DNA Generasjon 0 Tungt DNA ( 15 N) Generasjon 1 Hybrid DNA ( 15 N/ 14 N) Generasjon 2 Lett DNA ( 14 N) Hybrid DNA g Originalmolekyl Førstegenerasjons dattermolekyler Medium DNA Heavy DNA Andregenerasjons dattermolekyler 1
Kromosomal DNA replikasjon skjer i to retninger DNA replikasjon starter i bestemte punkt Etter at det ble slått fast at DNA replikeres semikonservativt, ble en rekke forsøk satt i gang for å finne ut hvordan dette foregikk. De fleste av disse ble gjort i bakterier og virus, og prosessen er fremdeles mye bedre kartlagt i disse enn i høyere organismer. Ved elektronmikroskopi kunne en vise at replikasjon av bakteriekromosomet skjedde ved at dobbelttråden åpnet seg til en boble, og at denne vokste i begge retninger under replikasjonen (bidireksjonell replikasjon) Endepunktene i denne boblen kalles replikasjonsgafler Replikasjonsgafler DNA som varmes opp vil etterhvert denaturere til enkelttråder. Dette skjer først i A:T-rike DNAsekvenser. Ved å varme opp det sirkulære kromosomet fra bakteriofagen λ (48 502 basepar), kunne en selektivt smelte disse områdene, og derved skaffe seg et kart over viruskromosomet. Ved å behandle λ-dna som inneholdt en replikasjons boble på denne måten, viste det seg at replikasjonen alltid startet i ett og samme punkt, som kalles et replikasjonsorigo. Hos mennesker finnes mange slike replikasjonsorigi på hvert kromosom, og de er lokalisert med 30 000-300 000 bp mellomrom. Som hos bakterier og virus foregår replikasjonen bidireksjonelt. Smelte bobler Ny replikasjons boble Initiering av replikasjonen Replikasjonsinitiering er best kartlagt i bakterier. DNA-syntesen skjer i 5-3 retning dnaa-proteinkomplekset danner en heliksstruktur som presser opp DNAdobbelheliksen Eukaryote celler har også distinkte replikasjonsorigi, som sannsynligvis gjenkjennes ved lokal nukleotidesekvens (f. eks. DUE=DNA unwinding element), og tredimensjonal struktur (bøyd DNA, cruciform DNA), og grad av DNA-metylering. De to trådene i DNA-heliksen går i motsatt retning av hverandre (de er antiparallelle). Den enden av DNAtråden som mangler en nukleotid i 5 - pososjon på sukkerringen, kalles 5 - enden, og tilsvarende kalles den enden som mangler en nukleotide i 3 -posisjon, 3 -enden. Den DNA-tråden som tjener som templat, leses alltid i 3-5 -retning, og dattertråden syntetiseres i 5-3 - retning 5 3 2
Nytt DNA dannes av DNA polymeraser å 1950-tallet begynte en også å lete etter enzymer som kunne syntetisere DNA. Det første av disse ble renset fra tarmbakterien E. coli, og ble kalt DNA polymerase I. Dette er fremdeles den best karakteriserte DNA polymerasen, og det har vist seg at virknings-mekanismen til dette enzymet har mange likhetstrekk med alle kjente DNA polymeraser. Enzymet katalyserer et nukleofilt angrep av oksygen på 3 -OH enden av en voksende DNA tråd mot 5 α- i en innkommende nukleotid 5 3 HO O O O O O O O O O O HO DNA polymerase I C A T G T A C G A C G OH 3 5 roteinstrukturanalyser ved hjelp av røntgenkrystallografi har vist at DNA/polymeraser inneholder bevegelige deler ( domener ) som bidrar til inkorporeringen av nye nukleotider Hvordan blir riktig nukleotid satt inn? Et magnesiumion bundet i enzymets aktive sete bidrar til å orientere den innkommende nukleotiden i riktig posisjon for katalyse Spesifikk baseparing Tymin Adenin Cytosin Guanin Induced fit olymerasen registrerer templat-basen, og modifiserer strukturen i det aktive setet slik at det er optimalt for binding av den korrekte basen 3
Mange polymeraser har rettefunksjon Enkelte ganger vil feil base bli satt inn i den voksende tråden. Flere av polymerasene har derfor utviklet en egen rettefunksjon - en 3-5 - eksonuklease-aktivitet. Når en feil base settes inn, vil den nydannede dupleksen smelte ved enden, DNA-polymerasen stopper opp, og den nydannede 3 -enden overføres til et sekundært aktivt sete på enzymoverflaten. I dette eksonuklease-setet fjernes den feilinkorporerte basen, og 3 -enden føres tilbake til polymerasesetet. Ulike DNA polymeraser har ulik funksjon Mammalske polymeraser oymerase Lokalisering Hovedfunksjon α (alfa) β (beta) Initiering av Okazakifragment DNA-reparasjon Binding av ssdna templat δ (delta) ε (epsilon) Kromosomal replikasjon (lagging strand) Kromosomal replikasjon (leading strand) olymerasesete γ (gamma) Mitokondriene Replikasjon av mitokondriekromosomet Eksonuklease-sete DNA-replikasjonen er semikontinuerlig Hvordan endre grad av supercoil - Topoisomeraser Siden templattrådene har motsatt orientering, oppstår det tilsynelatende et problem når begge trådene ved en replikasjonsgaffel skal forlenges i samme retning etterhvert som replikasjons- boblen vokser. Dette er imidlertid løst ved at replikasjonen langs den ene tråden skjer diskontinuerlig i mindre fragmenter. Disse kalles Okazaki-fragmenter, og limes (ligeres) etterhvert sammen til en kontinuerlig tråd. Templattråd 3-5 -retning Leading strand Okazaki fragment. 1000-2000 nucleotides in bacteria, 150-200 in eukaryotes Lagging strand Templattråd 5-3 -retning Svært forenklet oversikt Helicase Topo I kutter den ene DNA-tråden, fører den ene enden rundt helixen, og religerer endene. Dette enzymet krever ikke AT, kan fjerne både negative og positive supercoiler i eukaryote celler, og ser ut til å være den type topoisomerase som er ansvarlig for å løse opp supercoils under replikasjonen Topo II kutter begge DNAtrådene, og ser ut til å være involvert både i kondensering av kromosomer, og separasjon av datterkromatider under mitosen i eukaryote celler 4
Topoisomerasehemmere brukes som cytostatika Lagging strand danner en loop for å orientere trådene i samme retning Inhibitorer av topoisomerase I er mye brukt som cytostatika innen kreftbehandling. De vanligste er derivert fra plantestoffet camptothecin f. eks topotecan Topotecan hemmer ikke det første trinnet - spaltingen av DNA-tråden, men hemmer religeringen, slik at hele prosessen stopper opp Replisom = proteinkompleks med DNA-polymerase + andre protein Loopen på lagging strand dannes en gang pr Okazakifragment DNA-replikasjon i eukaryote celler Eukaryot replikasjonsgaffel Mange sider ved eukaryot DNA-replikasjon er fundamentalt forskjellig fra E. coli Kromosomal replikasjon skjer inne i en cellekjerne Eukaryote kromosomer er komplekse nukleoproteinstrukturer Replikasjonen må skje svært koordinert, da det er mange replikasjonsorigi i hver celle In vitro studier av DNA fra SV40-virus har vært et uvurderlig verktøy for å studere eukaryot DNA-replikasjon, da SV40 DNA har mange likhetstrekk med mammalsk DNA. Ved å sette ulike celleekstrakt og rensede proteiner til slikt DNA, har man kunnet studere effekten på replikasjonsprosessen. 5
rosessering av Okazaki-fragmentene Hva skjer ved enden av kromosomene? Topoisomerase olymerase δ/ε CNA RFC Helikase ε α δ Fen-1 og RNaseH1 fjerner RNA primer ol α/primase RA RNA primer olymerase ε forskyver RNAprimeren og fyller igjen gapet Når replikasjonsgaffelen når enden av et kromosom (telomer-regionen), vil ikke den ytterste 3 -enden kunne kopieres, da DNA-polymerasen ikke har en primer her. Dette gjør at kromosomene blir kortere og kortere for hver celledeling. Dette fenomenetharblittsatti forbindelsemed aldringsprosessen Templattråd Dattertråd DNA ligase I ligerer trådene I embryonale celler og mannlige kjønnsceller finnes et enzym - telomerase- som bidrar til å opprettholde korrekt lengde på kromosomene Mekanismer som sikrer korrekt replikasjon Cellene har ulike mekanismer som tilsammen gjør at den akkumulerte feilfrekvensen (AEF) er 1 feil pr 10 10 baser Balansertenivåavde ulikebyggestenene(dnt) Komplementær baseparing til templaten AEF = 10-3 -10-4 pr bp Induced fit mellom DNA-polymerasen innkommende nukleotid AEF = 10-5 -10-6 pr bp roofreading ved 3-5 -exonukleaseaktivitet AEF = 10-7 -10-9 pr bp Mismatch reparasjon (skjer etter replikasjonen) AEF = 10-10 pr bp 6
Cdk2/cyklinA Overordnet kontroll av DNA-replikasjon Ved DNA-skade eller cellestress, vil ikke replikasjon starte. Dette kontrolleres ved et restriksjonspunkt (R) sent i G1-fasen DNA skade Vekstfaktorer Økt/akt. p53 G0 G1 R Cdk2/cyklinE Økt uttrykk av M E2F Rb E2F Rb S binder CNA G2 7