COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test

COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test FOR BRUK TIL IN VITRO-DIAGNOSTIKK. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMVCAP 72 Tests P/N: 04902068 190 CMV Test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan PG WR 5.1 Liters P/N: 03587797 190 Wash Reagent TILTENKT BRUK COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testen er en in vitro-nukleinsyreamplifikasjonstest for kvantitering av cytomegalovirus-dna i humant EDTA-plasma ved bruk av COBAS AmpliPrepinstrumentet for automatisk prøvebehandling og COBAS TaqMan -analysatoren eller COBAS TaqMan 48-analysatoren for automatisk amplifikasjon og deteksjon. Testen kan kvantitere CMV-DNA i området 150 10 000 000 kopier/ml. Én kopi av CMV-DNA (som definert av COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testen) tilsvarer 0,91 internasjonale enheter (IU) [1,1 kopier/iu] basert på den første WHO internasjonale standard for humant cytomegalovirus for nukleinsyreamplifikasjonsteknikker (NAT) (NIBSC 09/162) 40. Testen skal brukes sammen med kliniske funn og andre laboratoriemarkører til diagnostisering og behandling av CMV-infeksjon hos pasienter med risiko for CMV-sykdom. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testen skal ikke brukes som screeningtest for tilstedeværelse av CMV i blod eller blodprodukter eller som en diagnostisk test for å bekrefte tilstedeværelse av CMVinfeksjon. Resultatene fra COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testen må tolkes i sammenheng med alle relevante kliniske funn og laboratoriefunn. SAMMENDRAG OG BESKRIVELSE AV TESTEN Humant cytomegalovirus (HCMV eller CMV) er et humant viruspatogen som tilhører herpesvirusfamilien og finnes i både utviklede industrisamfunn og i isolerte urbefolkningsgrupper. 1,2 Det kan overføres via blod, orofarynkssekret, urin, cervikalt og vaginalt sekret, sædvæsker, brystmelk, tårer og avføring. 3-9 Primærinfeksjoner med CMV hos immunkompetente personer er vanligvis asymptomatiske og forårsaker ofte uoppdagede latente infeksjoner. Mononukleære celler i perifert blod og endotelceller er tilsynelatende de mest fremtredende infeksjonsstedene. CMV forblir på et latent stadium i monocytter/makrofager hos mennesker. 2 Latent infiserte personer kan periodevis spre viruset med kroppsvæsker og på den måten infisere andre. Personer med svekket immunforsvar, deriblant nyfødte, transplantatpasienter og AIDSpasienter, har høy risiko for å utvikle alvorlige CMV-infeksjoner, som kan medføre en økt sykdoms- og dødelighetsrate. 10 Alvorlige kliniske manifestasjoner av CMV-sykdom omfatter CMV-syndrom, retinitt, gastroenteritt, hepatitt, encefalitt, øsofagitt, enterokolitt, pankreatitt og lungebetennelse. 1-13 Laboratoriemetoder som brukes til å diagnostisere disseminert infeksjon og aktiv sluttorgansykdom på grunn av humant cytomegalovirus, omfatter isolering av virus ved dyrkning fra leukocytter fra perifert blod (PBL), histologi av biopsier, serologiske metoder, måling av pp65-antigen og deteksjon av CMV-DNA ved hjelp av polymerasekjedereaksjon (PCR). 14 Dyrkningsmetoder har dårlig prediktiv verdi. De tar fra 48 timer til 3 uker å gjennomføre og har begrenset nytteverdi, spesielt for pasienter med svekket immunforsvar. pp65-antigenemianalysen er arbeidskrevende og krever at blodet behandles innen seks timer etter prøvetaking, fordi antigennivået synker ved lagring. 15,22 pp65-analysen er også vanskelig å utføre på pasienter med fremskreden nøytropeni. Utviklingen av direkte deteksjon av CMV-DNA i plasma ved hjelp av PCR har vist seg å korrelere godt med positive resultater ved PBL-dyrkning og med økt risiko for å utvikle systemisk CMV-sykdom. En rekke undersøkelser har vist sammenhengen mellom CMV-virusmengde og risikoen for å utvikle CMVsykdom. 16-19 Avsnittet for informasjon om dokumentrevisjon er plassert ved slutten av dette dokumentet. 04898362055-03NO 1 Doc Rev. 3.0

Risikoen for CMV-sykdom blir klart definert ved høy virusmengde, noe som understreker at virustiter spiller en viktig rolle i sykdomspatogenese. 18,27,30,31 Undersøkelser av transplantatmottakere og AIDS-pasienter har vist at PCR-deteksjon av CMV-DNA er svært prediktivt for senere utvikling og klinisk sykdomsutfall. 17,23-26 Kvantitative vurderinger av CMV-DNA-nivåer har vist at høye virusmengder samt økning i virusmengde over tid korrelerer med dårligere kliniske prognoser for flere CMV-risikotilstander. 18,27,28 Kvantitative PCR-analyser gjør det også mulig å følge med på effekten av antiviral 26,29,30, 32 behandling og indirekte vurdere virusresistens. Gjeldende behandlingsretningslinjer anbefaler måling av CMV-virusmengde hos organtransplanterte pasienter for å monitorere risikoen for utvikling av CMV-sykdom og se om det er behov for forebyggende behandling, og for monitorering av pasienter med aktiv CMV-sykdom for å registrere deres respons på behandlingen. 21,22 Dette anbefales også i de diagnostiske kriteriene for identifisering av CMV-sykdom hos pasienter som har fått transplantasjon av hematopoietiske stamceller. 33 TESTPRINSIPPER COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testen er en nukleinsyreamplifikasjonstest for kvantitering av cytomegalovirus-dna (CMV-DNA) i humant plasma. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testen er basert på to hovedprosesser: (1) prøvepreparering for å isolere CMV-DNA og (2) samtidig PCRamplifikasjon av mål-dna og deteksjon av splittede dobbelmerkede og målspesifikke oligonukleotiddeteksjonsprober. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testen muliggjør automatisk prøvepreparering etterfulgt av PCR-amplifikasjon og deteksjon av mål-cmv-dna og CMV-kvantiteringsstandard-DNA (QS-DNA). Master Mix-reagenset inneholder primere og prober som er spesifikke for både CMV-DNA og CMV-QS- DNA. Deteksjonen av amplifisert DNA utføres ved hjelp av målspesifikke og QS-spesifikke dobbelmerkede oligonukleotidprober som gir uavhengig identifisering av CMV-amplicon og CMV-QS-amplicon. Kvantiteringen av CMV-virus-DNA utføres ved hjelp av CMV QS. Dette kompenserer for hemmingseffekter og kontrollerer preparerings- og amplifikasjonsprosessene slik at kvantiteringen av CMV-DNA blir korrekt i hver prøve. CMV-QS er en ikke-infeksiøs DNA-konstruksjon som inneholder identiske primerbindingsregioner som mål-cmv-dna og en unik probebindingsregion, som gjør det mulig å skille CMV-QSamplicon fra mål-cmv-amplicon. Et kjent kopiantall av CMV-QS tilsettes i hver prøve og medføres gjennom trinnene med prøvepreparering og samtidig PCR-amplifikasjon og deteksjon av splittede dobbelmerkede oligonukleotiddeteksjonsprober. COBAS TaqMan -analysatoren eller COBAS TaqMan 48-analysatoren beregner CMV-DNA-nivåene i testprøvene ved å sammenligne CMV-signalene med CMV-QS-signalene for hver prøve og kontroll. Valg av mål Generisk silisiumbasert prøvepreparering blir benyttet til å binde CMV-DNA og CMV-QS-DNA, og definerte oligonukleotider brukes som primere ved amplifikasjon av CMV-DNA og CMV-QS-DNA. En målspesifikk og en QS-spesifikk dobbelmerket oligonukleotidprobe gjør det mulig med uavhengig identifikasjon av CMV-ampliconet og CMV-QS-ampliconet. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMVtesten bruker to amplifikasjonsprimere for PCR. En signalgenererende dobbelmerket probe hybridiserer til en av de to trådene og splittes av Z05-DNA-polymerase under forlenging av primerne. Prøvepreparering COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testen benytter automatisert prøvepreparering i COBAS AmpliPrep-instrumentet ved hjelp av en generisk silisiumbasert bindingsteknikk. I prosedyren blir 500 μl plasma bearbeidet. CMV-viruspartiklene lyseres gjennom inkubasjon ved forhøyet temperatur med en protease og kaotropisk lyserings-/bindingsbuffer som frigjør nukleinsyrer og beskytter det frigjorte CMV- DNA fra DNaser i plasma. Protease og et kjent antall CMV-QS-DNA-molekyler tilsettes til hver prøve sammen med lyseringsreagens og magnetiske glasspartikler. Deretter blir blandingen inkubert, og CMV- DNA og CMV-QS-DNA bindes til overflaten av de magnetiske glasspartiklene. Ubundne substanser, slik som salter, proteiner og andre cellulære forurensninger, fjernes ved å vaske de magnetiske glasspartiklene. Etter separasjon av de magnetiske glasspartiklene og fullføring av vasketrinnene, elueres de adsorberte nukleinsyrene ved forhøyet temperatur i en vandig løsning. Den behandlede prøven, som inneholder det frigjorte CMV-DNA og CMV-QS-DNA, tilsettes til amplifikasjonsblandingen og overføres til COBAS TaqMan -analysatoren eller COBAS TaqMan 48-analysatoren. 04898362055-03NO 2 Doc Rev. 3.0

PCR-amplifikasjon PCR-amplifikasjonsreaksjonen utføres med det termostabile rekombinante enzymet Thermus specie Z05 DNA Polymerase (Z05). I nærvær av magnesium (Mg 2+ ) og under passende bufferforhold har Z05 DNApolymeraseaktivitet. 34 Dermed kan PCR-amplifikasjon finne sted sammen med sanntidsdeteksjon av ampliconet. Preparerte prøver tilsettes amplifikasjonsblandingen i amplifikasjonsrør (K-rør) der PCR-amplifikasjon skjer. Ved nærvær av Mg 2+ og deoksynukleotidtrifosfater (dntp) i overskudd, inkludert deoksyadenosin-, deoksyguanosin-, deoksycytidin-, deoksyuridin- og deoksytymidintrifosfater, forlenger Z05-polymerasen de hybridiserte primerne og danner DNA -tråder. Målamplifikasjon Termocycleren i COBAS TaqMan -analysatoren eller COBAS TaqMan 48-analysatoren varmer opp reaksjonsblandingen for å denaturere det dobbelttrådete DNA-et og eksponere de spesifikke primermålsekvensene. Når blandingen kjøles ned, hybridiseres primerne til mål-dna. Ved nærvær av Mg 2+ og deoksynukleotidtrifosfater (dntp) i overskudd forlenger Z05 de hybridiserte primerne langs måltemplatene og produserer dobbelttrådede DNA-molekyler som kalles et amplicon. COBAS TaqMan - analysatoren eller COBAS TaqMan 48-analysatoren gjentar denne prosessen automatisk i et bestemt antall sykluser, der hver syklus skal doble mengden amplicon-dna. Ønsket antall sykluser er forhåndsprogrammert i COBAS TaqMan -analysatoren eller COBAS TaqMan 48-analysatoren. Amplifikasjonen skjer kun i CMV-genomets region mellom primerne. Hele CMV-genomet amplifiseres ikke. Selektiv amplifikasjon Selektiv amplifikasjon av målnukleinsyre fra prøven oppnås i COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMVtesten ved hjelp av AmpErase (uracil-n-glykosylase)-enzym og deoksyuridintrifosfat (dutp). AmpEraseenzymet gjenkjenner og katalyserer destruksjon av DNA-tråder som inneholder deoksyuridin, 35, men ikke DNA som inneholder deoksytymidin. Deoksyuridin finnes ikke i naturlig forekommende DNA, men finnes alltid i amplicon på grunn av bruken av deoksyuridintrifosfat som en av dntp-ene i Master Mix-reagenset. Det er derfor kun amplicon som inneholder deoksyuridin. Deoksyuridin gjør kontaminerende amplicon mottakelig for destruksjon av AmpErase-enzymet forut for amplifikasjon av mål-dna. I tillegg vil uspesifikke produkter som oppstår etter innledende aktivering av Master Mix med magnesium, ødelegges av AmpErase-enzymet. AmpErase-enzymet, som inngår i Master Mix-reagenset, katalyserer nedbrytningen av DNA som inneholder deoksyuridin, ved å bryte deoksyuridingruppens deoksyribosekjede ved C1-posisjonen. Ved temperaturøkning i det første varmetrinnet brytes amplicon-dna-kjeden der deoksyuridinet finnes, noe som igjen fører til at DNA ikke lenger er amplifiserbart. AmpErase-enzymet forblir inaktivt i lengre tid når det utsettes for temperaturer over 55 ºC, dvs. gjennom alle termosykliske trinn, og derfor blir ikke målamplicon som dannes under amplifikasjonen, ødelagt. Deteksjon av PCR-produkter med en COBAS TaqMan -test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testen anvender sanntids 36,37 PCR-teknologi. Bruken av dobbel-fluorescensmerkede prober sørger for sanntidsdeteksjon av akkumulert PCR-produkt ved å måle emisjonsintensiteten av rapporteringsfluorescensen som frigjøres under amplifikasjonsprosessen. Probene består av CMV- og CMV-QS-spesifikke oligonukleotidprober med en rapporteringsfluorofor og en slukkerfluorofor. I COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testen er CMV- og CMV-QS-probene merket med ulike rapporteringsfluoroforer. Når disse probene er intakte, undertrykkes rapporteringsfluoroforenes fluorescens på grunn av nærheten til slukkerfluoroforen gjennom energioverføringer av Förster-type. Under PCR hybridiserer proben til en målsekvens og splittes av 5' 3' nukleaseaktivitet hos den termostabile Z05 DNA-polymerasen. Så snart rapporterings- og slukkerfluoroforene er frigjort og separert, forekommer det ikke lenger slukking, og rapporteringsfluoroforenes fluorescensaktivitet øker. Amplifikasjonen av CMV-DNA og CMV-QS-DNA måles uavhengig av hverandre og ved ulike bølgelengder. Denne prosessen gjentas et visst antall sykluser, der hver syklus effektivt øker emisjonsintensiteten hos de individuelle rapporteringsfluoroforene og gir en uavhengig identifikasjon av CMV-DNA og CMV QS-DNA. Den PCR-syklusen hvor starten på en eksponentiell vekstkurve inntreffer, er relatert til mengden kildemateriale ved starten av PCR-reaksjonen. 04898362055-03NO 3 Doc Rev. 3.0

Grunnleggende informasjon om kvantitering med COBAS TaqMan -testen COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testen gir et kvantitativt resultat i et stort dynamisk område, ettersom måling av amplicon utføres under amplifikasjonens eksponentielle fase. Jo høyere CMV-titer i prøven, desto tidligere øker fluorescenssignalet fra CMV-probens rapporteringsfluorofor utover fluorescensnivåets baseline (se figur 1). Ettersom mengden av CMV-QS-DNA er konstant i alle prøver, skal CMV-QS-probens rapporteringsfluorescens bli påvisbar i en lignende syklus for alle prøver (se figur 2). I prøver der QS-fluorescensen påvirkes justeres konsentrasjonen tilsvarende. Påvisningen av de spesifikke fluorescenssignalene rapporteres som en kritisk terskelverdi (Ct). Ct defineres som det relative syklusnummeret der rapporteringsfluorescensen overskrider en forhåndsbestemt terskelverdi (det tillagte fluorescens-terskelnivået) og starter signalets eksponentielle vekstfase (se figur 3). En høyere Ct-verdi indikerer et lavere titer av det introduserte mål-cmv-materialet. Generelt korrelerer en 2-folds økning i titer korrelerer med en reduksjon på 1 Ct for mål-cmv-dna, mens en 10-folds økning i titer korrelerer med en reduksjon på 3,3 Ct. Figur 1 viser eksempler på målvekstkurver for en fortynningsserie som spenner over et område på 5-log 10. Når viruskonsentrasjonen øker, forskyves vekstkurvene mot tidligere sykluser. Derfor tilsvarer vekstkurven lengst til venstre det høyeste virustiternivået, mens vekstkurven helt til høyre tilsvarer det laveste virustiternivået. Figur 1 Målvekstkurver for en fortynningsserie av virus som spenner over et område på 5-log 10 Normalisert fluorescens Høyeste titer Laveste titer Syklusnummer 04898362055-03NO 4 Doc Rev. 3.0

Figur 2 viser eksempler på vekstkurver for kvantiteringsstandarden for prøver fra en fortynningsserie av virus som spenner over et område på 5-log 10. Mengden kvantiteringsstandard som tilsettes hver prøve, er konstant for hver reaksjon. Kvantiteringsstandardens Ct-verdi er lik uavhengig av virustiter. Figur 2 Vekstkurvene for kvantiteringsstandarden for en fortynningsserie av virus som spenner over et område på 5-Log 10 Normalisert fluorescens Laveste titer Høyeste titer Syklusnummer Figur 3 viser et eksempel på hvordan fluorescensverdiene i hver syklus normaliseres for hver vekstkurve. Det relative syklusnummeret (Ct) beregnes når fluorescenssignalet krysser det tillagte fluorescensterskelnivået. Figur 3 Fluorescensverdier i hver syklus normaliseres for hver vekstkurve Normalisert fluorescens Tilordnet fluorescens-terskelnivå Ct-verdi = 27,3 Syklusnummer 04898362055-03NO 5 Doc Rev. 3.0

CMV-DNA-kvantitering COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testen foretar en kvantitering av CMV-virus-DNA ved å utnytte en annen målsekvens (CMV-kvantiteringsstandard), som tilsettes hver prøve i kjent konsentrasjon. CMV-QS er en ikke-infeksiøs DNA-konstruksjon som inneholder fragmenter av CMV-sekvenser med primerbindingsregioner som er identiske med dem i mål-cmv-sekvensen. CMV-QS inneholder CMVprimerbindingsregioner og genererer et amplifikasjonsprodukt av tilsvarende lengde og basesammensetning som mål-cmv-dna. CMV-QS' deteksjonsprobebindingsregion er modifisert for å kunne skille CMV-QS-amplicon fra mål-cmv-amplicon. Under PCR-hybridiseringsfasen i COBAS TaqMan -analysatoren eller COBAS TaqMan 48- analysatoren, blir prøvene belyst og eksitert med filtrert lys, og filtrerte emisjonsfluorescensdata registreres for hver prøve. Avlesningene fra hver prøve korrigeres deretter for instrumentvariasjoner. Instrumentet sender disse fluorescensavlesningene til AMPLILINK-programvaren, og de blir lagret i en database. Forhåndsdefinerte kontrollkriterier brukes for å avgjøre om resultatsettene for CMV-DNA og CMV-QS- DNA kan aksepteres som valide resultater. Dersom resultatsettene ligger utenfor de forhåndsbestemte akseptkriteriene, vil de bli flagget. Etter at alle forhåndskontroller er fullført og godkjent, behandles fluorescensresultatene for å generere Ct-verdier for CMV-DNA og CMV-QS-DNA. De lotspesifikke kalibreringsverdiene som leveres sammen med COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testen, brukes til å beregne titerverdier for prøver og kontroller basert på Ct-verdier for CMV-DNA og CMV-QS- DNA. Titerresultatene rapporteres i internasjonale enheter/ml (IU/ml) eller kopier/ml. REAGENSER COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test (P/N: 04902068 190) CMV CS1 (reagenskassett med magnetiske glasspartikler) Magnetiske glasspartikler Tris-base-buffer 0,09 % natriumazid 0,1 % metylparaben CMV CS2 (CMV lyseringsreagenskassett) Natriumsitratdihydrat 42,5 % guanidintiocyanat 3,6 % polydocanol 1,8 % ditiotreitol Xn 42,5 % (vekt per vekt) guanidintiocyanat CMVCAP 72 tester 1 x 72 tester 1 x 72 tester Helseskadelig R20/21/22-R52/53-R32: Farlig ved innånding, hudkontakt og svelging. Skadelig for vannlevende organismer, kan forårsake uønskede langtidsvirkninger i vannmiljøet. Ved kontakt med syre utvikles meget giftig gass. S24/25-S36/37/39-S61: Unngå kontakt med huden og øynene. Bruk egnede verneklær, vernehansker og vernebriller/ansiktsskjerm. Unngå utslipp til miljøet. Se helse-, miljø- og sikkerhetsdatablad (HMS-datablad) for ytterligere opplysninger. 04898362055-03NO 6 Doc Rev. 3.0

CMV CS3 CMV multireagenskassett inneholder: Pase (proteinaseløsning) Tris-buffer < 0,05 % EDTA Kalsiumklorid Kalsiumacetat 7,8 % proteinase Glyserol Xn 7,8 % (vekt per vekt) proteinase 1 x 72 tester 1 x 3,8 ml Helseskadelig R36-R42: Irriterer øynene. Kan gi allergi ved innånding. S23-S45: Unngå innånding av damp. Ved uhell eller illebefinnende er omgående legebehandling nødvendig. Vis etiketten om mulig. EB (elueringsbuffer) Tris-base-buffer Natriumhydroksid 0,09 % natriumazid CMV CS4 CMV-testspesifikk reagenskassett inneholder: CMV QS (CMV kvantiteringsstandard) Tris-HCl-buffer EDTA < 0,005 % Poly ra RNA (syntetisk) < 0,001 % ikke-infeksiøst plasmid-dna (mikrobielt) som inneholder CMV-primerbindingsekvenser og en unik probebindingsregion 0,05 % natriumazid CMV MMX (CMV Master Mix) Trisinbuffer Kaliumacetat Kaliumhydroksid < 20 % dimetylsulfoksid Glyserol < 0,05 % datp, dctp, dgtp, dutp, dttp < 0,01 % oppstrøms og nedstrøms CMV-primere < 0,01 % oligonukleotidaptamer < 0,01 % fluoroformerkede oligonukleotidprober spesifikke for CMV og CMV-kvantiteringsstandard < 0,05 % Z05 DNA-polymerase (mikrobiell) < 0,1 % AmpErase (uracil-n-glykosylase) enzym (mikrobiell) 0,09 % natriumazid MgCl 2 (CAP/CTM magnesiumløsning) < 0,6 % magnesiumklorid 0,09 % natriumazid 1 x 8,1 ml 1 x 72 tester 1 x 6,2 ml 1 x 3,2 ml 1 x 9,8 ml 04898362055-03NO 7 Doc Rev. 3.0

CMV H(+)C (CMV høy positiv kontroll) < 0,001 % Lambda-fag som inneholder CMV-DNA Humant plasma, ikke-reaktivt med US FDA-lisensierte tester for antistoff mot HCV, antistoff mot HIV-1/2 og HIV p24-antigen eller HIV-1-RNA, HBsAg. CMV-DNA er ikke detekterbart med PCR-metoden. 6 x 0,65 ml 0,1 % ProClin 300 konserveringsvæske Xi (3:1) blanding av 5-kloro-2-metyl-2H-isotiasol-3-en og 2-metyl-2H-isotiasol-3-en Irriterende S24-S37: Unngå hudkontakt. Bruk egnede vernehansker. R43: Kan gi allergi ved hudkontakt. CMV L(+)C (CMV lav positiv kontroll) < 0,001 % Lambda-fag som inneholder CMV-DNA i en gjennomsnittskonsentrasjon som er ca. 100-fold lavere enn gjennomsnittskonsentrasjonen av CMV-DNA i CMV H(+)C Humant plasma, ikke-reaktivt med US FDA-lisensierte tester for antistoff mot HCV, antistoff mot HIV-1/2 og HIV p24-antigen eller HIV-1-RNA, HBsAg. CMV-DNA er ikke detekterbart med PCR-metoden. 6 x 0,65 ml 0,1 % ProClin 300 konserveringsvæske Xi (3:1) blanding av 5-kloro-2-metyl-2H-isotiasol-3-en og 2-metyl-2H-isotiasol-3-en Irriterende S24-S37: Unngå hudkontakt. Bruk egnede vernehansker. R43: Kan gi allergi ved hudkontakt. CMV ( ) C (CMV negativ kontroll) Humant plasma, ikke-reaktivt med US FDA-lisensierte tester for antistoff mot HCV, antistoff mot HIV-1/2 og HIV p24-antigen eller HIV-1-RNA, HBsAg. CMV-DNA er ikke detekterbart med PCR-metoden. 6 x 0,65 ml 0,1 % ProClin 300 konserveringsvæske Xi (3:1) blanding av 5-kloro-2-metyl-2H-isotiasol-3-en og 2-metyl-2H-isotiasol-3-en Irriterende S24-S37: Unngå hudkontakt. Bruk egnede vernehansker. R43: Kan gi allergi ved hudkontakt. CMV H(+)C Clip (strekkodeklips for CMV høy positiv kontroll) CMV L(+)C Clip (strekkodeklips for CMV lav positiv kontroll) CMV ( ) C Clip (strekkodeklips for CMV negativ kontroll) COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Wash Reagent COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan vaskereagens (P/N: 03587797 190) PG WR (COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan vaskereagens) Natriumsitratdihydrat < 0,1 % N-metylisotiazolon-HCl PG WR 1 x 6 klips 1 x 6 klips 1 x 6 klips 1 x 5,1 l 04898362055-03NO 8 Doc Rev. 3.0

ADVARSLER OG FORHOLDSREGLER A. FOR BRUK TIL IN VITRO-DIAGNOSTIKK. B. Denne testen skal kun brukes for humant plasma med EDTA som antikoagulant. C. Ikke pipetter med munnen. D. Det må ikke spises, drikkes eller røykes i laboratoriets arbeidsområder. Bruk beskyttende engangshansker, laboratoriefrakk og vernebriller når du håndterer prøver og reagenser. Vask hendene nøye etter håndtering av prøver og reagenser. E. Unngå mikrobiell kontaminering og nukleasekontaminering av reagensene når du pipetterer ut porsjoner fra kontrollflasker. F. Bruk av sterile engangspipetter og DNase-frie pipettespisser anbefales. G. Kontroller fra ulike lot eller ulike flasker fra samme lot må ikke blandes sammen. H. Reagenskassetter eller kontroller fra ulike kit må ikke blandes. I. COBAS AmpliPrep-kassetter må ikke åpnes, og flasker må ikke byttes om, fjernes eller settes til. J. Kast ubrukte reagenser, avfall og prøver i henhold til nasjonalt, regionalt og lokalt regelverk. K. Kit som er utgått på dato, må ikke brukes. L. Dataark om materialsikkerhet (MSDS) kan på forespørsel sendes fra ditt lokale Roche-kontor. M. Prøver og kontroller skal håndteres som infeksiøst materiale, og sikre laboratorierutiner må følges, for eksempel de som er beskrevet i Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 38 og i CLSI-dokumentet M29-A3. 39 Rengjør og desinfiser alle arbeidsoverflater grundig med en fersk løsning av 0,5 % natriumhypokloritt i deionisert eller destillert vann. Merk: Kommersielt tilgjengelig blekemiddel til husholdningsbruk inneholder normalt natriumhypokloritt med en konsentrasjon på 5,25 %. En fortynning i forholdet 1:10 med et slikt blekemiddel gir en 0,5 % natriumhypoklorittløsning. N. ADVARSEL: CMV ( ) C, CMV L(+)C og CMV H(+)C inneholder humant plasma utskilt fra humant blod. Kildematerialet er testet og har vist seg å være ikke-reaktivt for hepatitt B overflateantigen (HBsAg), antistoffer mot HIV-1/2 og HCV og HIV p24-antigen eller HIV-1-RNA. Testing av negativt humant plasma med PCR-metoden viste ikke detekterbart CMV-DNA. Ingen kjente testmetoder kan fullstendig garantere at produkter fra humant blod ikke vil kunne overføre infeksiøse agens. Derfor må alt humant materiale betraktes som potensielt infeksiøst. CMV ( ) C, CMV L(+)C og CMV H(+)C skal håndteres som infeksiøst materiale, og sikre laboratorierutiner må følges, for eksempel de som er beskrevet i Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 38 og i CLSI-dokumentet M29-A3. 39 Rengjør og desinfiser alle arbeidsoverflater grundig med en fersk løsning av 0,5 % natriumhypokloritt i deionisert eller destillert vann. O. MGP, EB, CMV QS, MgCl 2 og CMV MMX inneholder natriumazid. Natriumazid kan reagere med bly- og kobberrør og danne svært eksplosive metallazider. Hvis løsninger som inneholder natriumazid, helles i avløp i laboratoriet, må de skylles ned med store mengder vann for å unngå oppsamling av azid. P. Bruk vernebriller, laboratoriefrakk og engangshansker ved håndtering av reagenser. Unngå kontakt med hud, øyne eller slimhinner. Skyll umiddelbart med mye vann hvis slik kontakt oppstår. Hvis kontaktstedet ikke blir behandlet, kan det oppstå brannskade. Fortynn med vann før du tørker opp eventuelt søl fra reagensene. Q. Ikke la CMV CS2 og flytende avfall fra COBAS AmpliPrep-instrumentet, som inneholder guanidintiocyanat, komme i kontakt med natriumhypoklorittløsning (blekemiddel). Disse blandingene kan produsere en svært giftig gass. R. Ved avhending av brukte COBAS AmpliPrep SPU-er (Specimen Processing Units), som inneholder guanidintiocyanat, må du unngå enhver kontakt med natriumhypoklorittløsning (blekemiddel). Disse blandingene kan produsere en svært giftig gass. 04898362055-03NO 9 Doc Rev. 3.0

OPPBEVARING OG HÅNDTERING A. Ikke frys reagenser eller kontroller. B. OppCbevar CMV CS1, CMV CS2, CMV CS3 og CMV CS4 ved 2 8 C. Når disse reagensene er uåpnet, er de stabile til utløpsdato. Når de er åpnet, er disse reagensene stabile i 70 dager ved 2 8 C eller til utløpsdato, avhengig av hva som kommer først. CMV CS1, CMV CS2, CMV CS3 og CMV CS4 kan brukes i maks. 6 instrumentsykluser, i maks. 100 timer totalt i COBAS AmpliPrep-instrumentet. Reagenser må oppbevares ved 2 8 C mellom instrumentsykluser. C. Oppbevar CMV H(+)C, CMV L(+)C og CMV ( ) C ved 2 8 C. Kontrollene er stabile til angitt utløpsdato. Etter åpning må alle ubrukte rester kastes. D. Oppbevar strekkodeklips [CMV H(+)C Clip, CMV L(+)C Clip og CMV ( ) C Clip] ved 2 30 C. E. Oppbevar PG WR ved 2-30 C. PG WR er stabilt til angitt utløpsdato. Etter åpning er dette reagenset stabilt i 28 dager ved 2 30 C eller til utløpsdato, avhengig av hva som kommer først. MATERIELL SOM MEDFØLGER A. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test (P/N: 04902068 190) CMVCAP CMV CS1 (CMV-reagenskassett med magnetiske glasspartikler) CMV CS2 (CMV lyseringsreagenskassett) CMV CS3 (CMV multireagenskassett) CMV CS4 (CMV-testspesifikk reagenskassett) CMV H(+)C (CMV høy positiv kontroll) CMV L(+)C (CMV lav positiv kontroll) CMV ( ) C (CMV negativ kontroll) CMV H(+)C Clip (strekkodeklips for CMV høy positiv kontroll) CMV L(+)C Clip (strekkodeklips for CMV lav positiv kontroll) CMV ( ) C Clip (strekkodeklips for CMV negativ kontroll) B. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Wash Reagent COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan vaskereagens (P/N: 03587797 190) PG WR PG WR (COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan vaskereagens) 04898362055-03NO 10 Doc Rev. 3.0

MATERIELL SOM KREVES, MEN SOM IKKE MEDFØLGER Instrumentering og programvare COBAS AmpliPrep-instrument COBAS TaqMan -analysator eller COBAS TaqMan 48-analysator Tilleggsutstyr: dokkingstasjon Tilleggsutstyr: cobas p 630-instrument AMPLILINK-programvare, Versjon 3.3 Series Datastasjon for AMPLILINK-programvaren, med skriver. Manualer for AMPLILINK-programvaren v3.3 Series: Instrumentmanual for COBAS AmpliPrep-instrument for bruk sammen med COBAS TaqMan -analysatoren, COBAS TaqMan 48-analysatoren, COBAS AMPLICOR -analysatoren eller cobas p 630-instrumentet, og AMPLILINKprogramvaren, versjon 3.2 og 3.3 Series Instrumentmanual for COBAS TaqMan -analysatoren (pluss evt. dokkingstasjon) for bruk sammen med applikasjonsmanualen for AMPLILINK-programvaren, versjon 3.2 og 3.3 Series Instrumentmanual for OBAS TaqMan 48-analysatoren for bruk sammen med applikasjonsmanualen for AMPLILINK-programvaren, versjon 3.2 og 3.3 series Applikasjonsmanual for AMPLILINK-programvaren, versjon 3.3 Series for bruk med COBAS AmpliPrep-instrumentet, COBAS TaqMan -analysatoren, COBAS TaqMan 48-analysatoren, COBAS AMPLICOR -analysatoren og cobas p 630- instrumentet. Valgfritt: Operatørmanualen for cobas p 630-instrumentet programvareversjon 2.2 Engangsartikler Prøvebehandlingsenheter: SPU-er Rør for innmating av prøver (S-rør) med strekkodeetiketter Stativ med K-spisser Stativ for K-rør ANNET MATERIELL SOM KREVES, MEN SOM IKKE MEDFØLGER Prøvestativ (SK24-stativ) Reagensstativ SPU-stativ K-carrier K-carrier, løfteverktøy K-carrier-stativ (kun påkrevd for bruk med COBAS TaqMan 48-analysatoren) Pipetter med aerosolbarriere- eller "positive displacement" DNase-frie spisser (kapasitet 1000 μl)* Engangshansker, uten pudder Vortexmikser * Pipettene må ha en nøyaktighet innenfor 3 % av angitt volum. Aerosolbarriere- eller "positive displacement" DNase-frie spisser må brukes der dette er angitt for å hindre krysskontaminering av prøver og amplicon. 04898362055-03NO 11 Doc Rev. 3.0

PRØVETAKING, PRØVETRANSPORT OG PRØVEOPPBEVARING Merk: Alle prøver og kontroller må behandles som om de er potensielt infeksiøse. Merk: Denne testen er kun validert for bruk sammen med humant plasma med EDTA som antikoagulant. Testing av andre prøvematerialer kan føre til feil resultat. A. Prøvetaking COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-test skal kun brukes for plasmaprøver. Blodprøver må tas i sterile rør med EDTA (lys lilla topp) som antikoagulant og blandet tilstrekkelig ifølge veiledningene fra glassprodusenten. B. Prøvetransport Oppbevar fullblod ved 2 25 C i maks. 6 timer. Separer plasma fra fullblod innen 6 timer etter prøvetaking ved å sentrifugere ved 800 1600 x g i 20 minutter ved romtemperatur. Overfør plasma til et sterilt polypropylenrør. Transport av fullblod, serum eller plasma må skje i henhold til nasjonalt, regionalt og lokalt regelverk for transport av biologisk materiale. 41 Fullblod må transporteres ved 2 25 C og sentrifugeres innen 6 timer etter prøvetaking. Plasma kan transporteres ved 2 8 C eller nedfryst ved 20 C. C. Prøveoppbevaring Plasmaprøver kan oppbevares ved 2 8 C i inntil 7 dager. Plasmaprøver har vist seg å være holdbare i 6 uker hvis de er nedfryst ved 20 C. Det anbefales at prøver oppbevares i porsjoner på 550-600 μl i sterile, 2,0 ml polypropylrør med skrukorker (slik som Sarstedt 72.694.006). Figur 4 viser holdbarhetsdata for prøver fra undersøkelser om prøveholdbarhet utført med COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMVtesten. 3,50 Figur 4 CMV-stabilitet i EDTA-plasma Titer log 10 (kopier/ml) 3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Prøve 2 8 ºC 0d 2 8 ºC 3d 2 8 ºC 7d 20 ºC 6u Plasmaprøver kan fryses ned og tines opptil 3 ganger uten betydelig tap av CMV-DNA. Figur 5 viser data fra en fryse/tine-studie utført på COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testen. 04898362055-03NO 12 Doc Rev. 3.0

Figur 5 CMV-resultater etter inntil 3 fryse-tine-sykluser (F-T-sykluser) (EDTA-plasma) 3,50 Titer log10 (kopier/ml) 3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Prøve 0x fryse/tine 1x fryse/tine 2x fryse/tine 3x fryse/tine BRUKSANVISNING Merk: For en detaljert bruksanvisning, en detaljert beskrivelse av de mulige konfigurasjonene, utskrift av resultat og tolking av flagg, kommentarer og feilmeldinger, se (1) Instrumentmanualen for COBAS AmpliPrep-instrumentet for bruk med COBAS TaqMan -analysatoren, COBAS TaqMan 48-analysatoren, COBAS AMPLICOR - analysatoren, eller cobas p 630-instrumentet, og AMPLILINK-programvaren, versjon 3.3 Series; (2) Instrumentmanualen for COBAS TaqMan -analysatoren (pluss valgfri dokkingstasjon) for bruk med applikasjonsmanualen for AMPLILINK-programvaren, versjon 3.2 og 3.3 Series; (3) Instrumentmanualen for COBAS TaqMan 48-analysatoren for bruk med applikasjonsmanualen for AMPLILINK-programvaren, versjon 3.2 og 3.3 Series; (4) Applikasjonsmanualen for AMPLILINK-programvaren versjon 3.3 Series for bruk med COBAS AmpliPrep-instrumentet, COBAS TaqMan -analysatoren og COBAS TaqMan 48-analysatoren, COBAS AMPLICOR -analysatoren og cobas p 630-instrumentet; (5) Valgfritt: Operatørmanualen for cobas p 630-instrumentet programvareversjon 2.2. Størrelse på analyseserie Hvert kit inneholder reagenser som er tilstrekkelig for 72 tester, og disse kan utføres i analyseserier på 12 til 24 tester. Minst ett replikat av henholdsvis CMV ( ) C, CMV L(+)C og CMV H(+)C må tas med i hver analyseserie (se "Kvalitetskontroll"). Arbeidsflyt Analyseringen i COBAS TaqMan -analysatoren eller COBAS TaqMan 48-analysatoren må startes innen 120 minutter etter at preparering av prøver og kontroller er fullført. Merk: Preparerte prøver og kontroller må ikke fryses ned eller oppbevares ved 2 8 C. Prøve- og kontrollpreparering Merk: Ved bruk av frosne prøver må prøvene stå i romtemperatur til de er helt tinte og deretter vortexes i 3 5 sekunder før bruk. Kontrollene skal tas ut fra kjølelagringen på 2 8 C og oppnå romtemperatur før bruk. 04898362055-03NO 13 Doc Rev. 3.0

Klargjøring av COBAS AmpliPrep-instrumentet Del A. Vedlikehold og gjennomskylling A1. COBAS AmpliPrep-instrumentet er klart for drift i stand-by-modus. A2. Slå datastasjonen for AMPLILINK-programvaren på (ON). Klargjør datastasjonen på følgende måte: a. Logg på operativsystemet Windows XP. b. Dobbeltklikk på ikonet for AMPLILINK-programvaren. c. Logg deg på AMPLILINK-programvare ved å taste inn tildelt bruker-id og passord. A3. Kontroller beholdningen av PG WR fra skjermbildet Status. Skift ut om nødvendig. A4. Utfør alle vedlikeholdsprosedyrer som er angitt på fanen Due. COBAS AmpliPrep-instrumentet vil automatisk skylle igjennom ("prime") systemet. Del B. Lasting av reagenskassetter Merk: Alle reagenskassetter skal tas ut fra 2 8 C lagringsstedet, umiddelbart lastes inn i COBAS AmpliPrep-instrumentet og skal stå i romtemperatur i instrumentet i minst 30 minutter før den første prøven skal analyseres. Ikke la reagenskassettene oppnå romtemperatur utenfor instrumentet, da det kan forårsake kondens på strekkodeetikettene. Ikke tørk av kondens fra strekkodeetikettene hvis dette skulle forekomme. B1. Plasser CMV CS1 i et reagensstativ. Plasser CMV CS2, CMV CS3 og CMV CS4 i et eget reagensstativ. B2. Sett inn reagensstativet som inneholder CMV CS1, i stativposisjon A i COBAS AmpliPrepinstrumentet. B3. Sett inn reagensstativet som inneholder CMV CS2, CMV CS3 og CMV CS4, i stativposisjon B, C, D eller E i COBAS AmpliPrep-instrumentet. Se tabell 1 for ytterligere informasjon. Del C. Lasting av engangsartikler Merk: Bestem antall COBAS AmpliPrep-reagenskassetter, prøveprepareringsenheter (SPU-er), Input S-rør, K-spisser og K-rør som skal brukes. Én SPU, ett Input S-rør, én K-spiss og ett K-rør er nødvendig for hver prøve eller kontroll. Det finnes flere mulige arbeidsflyter for bruk av COBAS AmpliPrep-instrumentet med COBAS TaqMan - analysatoren eller COBAS TaqMan 48-analysatoren. Se tabell 1 for mer informasjon. Avhengig av arbeidsflyten som brukes, settes det inn passende antall reagenskassettstativer, prøvestativer med Input S-rør, SPU-stativer, K-spiss-stativer, K-rørstativer og K-carrier på K-carrier-stativer i de respektive stativposisjonene i COBAS AmpliPrep-instrumentet (se tabell 1 for mer informasjon). C1. Plasser SPU-ene i SPU-stativene, og sett stativene i posisjon J, K eller L i COBAS AmpliPrepinstrumentet. C2. Avhengig av den valgte arbeidsflyten settes fylte K-rør-stativ(er) i posisjon M, N, O eller P i COBAS AmpliPrep-instrumentet. C3. Plasser fylte K-spiss-stativ(er) i posisjon M, N, O eller P i COBAS AmpliPrep-instrumentet. C4. Til arbeidsflyt 3 med COBAS TaqMan 48-analysatoren, settes K-carriers på K-carrier-stativ(er) i posisjon M, N, O eller P i COBAS AmpliPrep-instrumentet. 04898362055-03NO 14 Doc Rev. 3.0

Tabell 1 Mulige arbeidsflyter ved bruk av COBAS AmpliPrep-instrumentet med COBAS TaqMan -analysatoren eller COBAS TaqMan 48-analysatoren 1 2 3 Arbeidsflyt COBAS AmpliPrepinstrumentet pluss dokkingstasjon pluss COBAS TaqMan - analysatoren COBAS AmpliPrepinstrumentet pluss COBAS TaqMan - analysatoren COBAS AmpliPrepinstrumentet pluss COBAS TaqMan 48-analysator(er) Overføringsmodus for COBAS TaqMan - analysator eller COBAS TaqMan 48- analysator Automatisert overføring av K-carrier Manuell overføring av K-rør via prøvestativ til COBAS TaqMan - analysatoren Manuell overføring av K-carrier via K-carrier-stativ(er) til COBAS TaqMan 48-analysatoren Stativer og engangsartikler K-rør i fulle K-rør-stativer K-spisser i fulle K-spiss-stativer Input S-rør med prøver og kontroller i prøvestativ SPU-er i SPU-stativ CS1 i kassettstativ CS2, CS3, CS4 i kassettstativ K-rør i fulle K-rør-stativer K-spisser i fulle K-spiss-stativer Input S-rør med prøver og kontroller i prøvestativ SPU-er i SPU-stativ CS1 i kassettstativ CS2, CS3, CS4 i kassettstativ Etter fullført prøvepreparering: K-rør i prøvestativ (klar for manuell overføring) K-rør i prøvestativ K-spisser i fulle K-spiss-stativer Input S-rør med prøver og kontroller i prøvestativ SPU-er i SPU-stativ CS1 i kassettstativ CS2, CS3, CS4 i kassettstativ Tom, strekkodemerket K-carrier i K-carrier-stativ Etter fullført prøvepreparering: K-rør i K-carrier i K-carrier-stativ Posisjon på COBAS AmpliPrepinstrumentet M P M P F H J L A B E M P M P F H J L A B E Samme som over (F H) F H M P F H J L A B E M P Samme som over (M P) Del D. Bestilling og innlasting av prøver Merk: Se i operatørmanualen for cobas p 630-instrumentet hvis cobas p 630-instrumentet brukes til klargjøring av prøver. D1. Klargjør prøvestativene på følgende måte: Fest en strekkodeklips til hver prøvestativposisjon der en prøve (S-rør) skal plasseres. Fest en av de spesifikke strekkodeklipsene for kontrollene [CMV ( ) C, CMV L(+)C og CMV H(+)C] i hver prøvestativposisjon der kontrollene (S-rør) skal plasseres. Kontrollenes strekkodeklips skal ha samme kontrollotnummer som lotnummeret på kontrollflaskene i kitet. Sørg for å sette riktig kontroll i posisjonen med tilsvarende strekkodeklips. Plasser ett Input S-rør i hver posisjon som har en strekkodeklips. D2. Bruk AMPLILINK-programvaren til å opprette prøvebestillinger for hver prøve og kontroll i vinduet Orders i mappen Sample. Velg den korrekte testfilen, og avslutt med å lagre. D3. Tildel prøve- og kontrollbestillinger til prøvestativposisjoner i vinduet Orders i mappen Sample Rack. Prøvestativnummeret må stemme overens med det stativet som ble klargjort i trinn D1. D4. Skriv ut rapporten Sample Rack Order og bruk den som arbeidsark. 04898362055-03NO 15 Doc Rev. 3.0

D5. Klargjør prøve- og kontrollstativ i det reserverte området for tilsetting av prøver og kontroller på følgende måte: Vortex hver prøve og kontroll [CMV ( ) C, CMV L(+)C og CMV H(+)C] i 3 til 5 sekunder. Vær forsiktig, slik at hanskene ikke kontamineres når prøver og kontroller behandles. D6. Overfør 500 μl av hver prøve og kontroll [CMV ( ) C, CMV L(+)C og CMV H(+)C] til det tilsvarende strekkodemerkede Input S-røret ved hjelp av en mikropipette med aerosolbarriere- eller "positive displacement" DNase-fri spiss. Unngå å overføre partikler og/eller fibrinklumper fra den opprinnelige prøven til input S-røret. Prøver og kontroller må overføres til de rørposisjonene som er tildelt og registrert på arbeidsarket i trinn D4. Kontrollenes strekkodeklips skal ha samme kontrollotnummer som lotnummeret på kontrollflaskene i kitet. Sørg for å sette riktig kontroll i posisjonen med tilsvarende kontrollstrekkodeklips. Vær forsiktig, slik at den øvre delen av S-rørene ikke kontamineres av prøver eller kontroller. D7. Til arbeidsflyt 1 og 2 settes prøvestativ med Input S-rør i posisjon F, G eller H i COBAS AmpliPrepinstrumentet. D8. Til arbeidsflyt 3 ved bruk av COBAS TaqMan 48-analysatoren settes prøvestativ med Input S-rør og K-rør (ett til hvert Input S-rør, innsatt i posisjonen til høyre ved siden av Input S-rør) i posisjon F, G eller H i COBAS AmpliPrep-instrumentet. Del E. Start av kjøringen på COBAS AmpliPrep-instrumentet E1. Start COBAS AmpliPrep-instrumentet med AMPLILINK-programvaren. Del F. Avslutning av analyseserien på COBAS AmpliPrep-instrumentet og overføring til COBAS TaqMan -analysatoren eller COBAS TaqMan 48-analysatoren (kun for arbeidsflyt 2 og 3) F1. Sjekk om det kommer opp flagg eller feilmeldinger. F2. Ta ut de preparerte prøvene og kontrollene fra COBAS AmpliPrep-instrumentet på enten prøvestativ (for COBAS TaqMan -analysatoren uten dokkingstasjon) eller K-carrier-stativ (for COBAS TaqMan 48-analysatoren), avhengig av valgt arbeidsflyt (se del G for ytterligere informasjon). F3. Fjern avfall fra COBAS AmpliPrep-instrumentet. Merk: Preparerte prøver og kontroller må ikke utsettes for lys etter at prøve- og kontrollprepareringen er fullført. Amplifikasjon og deteksjon Klargjøring av COBAS TaqMan -analysatoren eller COBAS TaqMan 48-analysatoren Analyseringen i COBAS TaqMan -analysatoren eller COBAS TaqMan 48-analysatoren må startes innen 120 minutter etter at preparering av prøver og kontroller er fullført. Merk: Preparerte prøver og kontroller må ikke fryses ned eller oppbevares ved 2-8 C. Del G. Innlasting av preparerte prøver G1. Avhengig av den valgte arbeidsflyten utføres de nødvendige trinnene for å overføre K-rør til COBAS TaqMan -analysatoren eller COBAS TaqMan 48-analysatoren: Arbeidsflyt 1: Automatisk overføring av K-carrier via dokkingstasjon til COBAS TaqMan -analysatoren. Dette krever ikke manuelle inngrep fra brukeren. Arbeidsflyt 2: Manuell overføring av K-rør i prøvestativ til COBAS TaqMan - analysatoren. Arbeidsflyt 3: Manuell overføring av K-carrier på K-carrier-stativ til COBAS TaqMan 48-analysatoren. Manuell overføring av K-carriers til COBAS TaqMan 48-analysatoren ved hjelp av løfteverktøyet for K-carrier. 04898362055-03NO 16 Doc Rev. 3.0

Del H. Start av kjøringen på COBAS TaqMan -analysatoren eller COBAS TaqMan 48- analysatoren H1. Start COBAS TaqMan -analysatoren eller COBAS TaqMan 48-analysatoren ved å foreta et av valgene nedenfor avhengig av hvilken arbeidsflyt som er brukt: Arbeidsflyt 1: Arbeidsflyt 2: Krever ingen inngrep fra brukeren. Automatisk start av COBAS TaqMan -analysatoren etter innsetting av prøvestativ. Arbeidsflyt 3: Fyll K-carrier med tomme K-rør hvis det er færre enn 6 K-rør i K-carrier. AMPLILINK-programvaren veileder i fyllingen. Åpne termoblokkdekselet, sett inn K-carrier i termoblokken og steng lokket. Start kjøringen på COBAS TaqMan 48-analysatoren. Del I. Avslutning av kjøringen på COBAS TaqMan -analysatoren eller COBAS TaqMan 48-analysatoren I1. Skriv ut resultatrapporten når analyseserien i COBAS TaqMan -analysatoren eller COBAS TaqMan 48-analysatoren er fullført. Sjekk om det finnes flagg eller feilmeldinger i resultatrapporten. Prøver med flagg og kommentarer tolkes slik som beskrevet under "Resultater". Lagre dataene i arkivet når de er godkjent. I2. Ta ut brukte K-rør fra COBAS TaqMan -analysatoren eller COBAS TaqMan 48-analysatoren. RESULTATER COBAS TaqMan -analysatoren eller COBAS TaqMan 48-analysatoren beregner automatisk CMV-DNA-konsentrasjonen for prøvene og kontrollene. CMV-DNA-konsentrasjonen uttrykkes i kopier/ml. Konverteringsfaktoren mellom CMV-DNA-kopier/ml (som definert av COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testen) og internasjonale enheter (IU)/mL er 1,1 kopier/iu [0,91 IU/kopi], ved bruk av den første WHO internasjonale standard for humant cytomegalovirus for nukleinsyreamplifikasjonsteknikker (NAT) (NIBSC 09/162) 40. Denne konverteringsfaktoren mellom "kopi" og "IU" kan være forskjellig for andre CMV-DNA-analyser. AMPLILINK-programvare: Bestemmer syklusterskelverdi (Cycle Threshold, Ct) for CMV-DNA og CMV-QS-DNA. Bestemmer CMV-DNA-konsentrasjon basert på Ct-verdiene for CMV-DNA og CMV-QS- DNA og de lotspesifikke kalibreringskoeffisientene som er angitt på kassettenes strekkoder. Bestemmer om beregnet kopier/ml for CMV L(+)C og CMV H(+)C faller innenfor de fastsatte akseptområdene. Validering av analyseserien AMPLILINK versjon 3.3 Series For å sikre at analyseserien er gyldig, sjekk i resultatvinduet i AMPLILINK-programvaren eller på utskriften om det finnes flagg og kommentarer. For kontrollbestillinger blir det foretatt en sjekk for å bestemme om kopier/ml-verdien for kontrollen er innenfor det angitte akseptområdet. Hvis kopier/ml-verdien for kontrollen ligger utenfor området, blir det opprettet et flagg for å angi at kontrollen ikke lyktes. Analyseserien er gyldig hvis det ikke fremkommer flagg for kontrollene [CMV ( ) C, CMV L(+)C og CMV H(+)C]. Analyseserien er ikke gyldig hvis noen av de følgende flaggene vises for CMV-kontrollene: Negativ kontroll Flagg Resultat Tolkning NC_INVALID Invalid Et ugyldig resultat eller et "gyldig" resultat som ikke var negativt for mål-cmv 04898362055-03NO 17 Doc Rev. 3.0

CMV lav positiv kontroll Flagg Resultat Tolkning LPCINVALID CMV høy positiv kontroll Invalid Et ugyldig resultat eller kontroll utenfor akseptområdet Flagg Resultat Tolkning HPCINVALID Invalid Et ugyldig resultat eller kontroll utenfor akseptområdet Hvis analyseserien er ugyldig, må hele oppsettet gjentas, inkludert preparering av prøver og kontroller, amplifikasjon og deteksjon. Tolking av resultater For å validere analyseserien må hvert prøvesvar kontrolleres for å se om det finnes noen flagg eller kommentarer på resultatutskriften. Tolk resultatene på følgende måte: En gyldig analyseserie kan inkludere både gyldige og ugyldige prøveresultater, avhengig av om flagg og/eller kommentarer er kommet opp for de ulike prøvene. Prøveresultater tolkes på følgende måte: Kopier/ml Internasjonale enheter/ml Titerresultat Target Not Detected <1.50E+02 cp/ml 1.50E+02 cp/ml og 1.00E+07 cp/ml >1.00E+07 cp/ml <1.37E+02 IU/mL 1.37E+02 IU/mL og 9.10E+06 IU/mL >9.10E+06 IU/mL Tolkning Rapporter resultatene som "CMV-DNA ikke detektert". Beregnet kopier/ml er under analysens nedre kvantiteringsgrense. Rapporter resultater som "CMV-DNA detektert, mindre enn 150 CMV- DNA kopier/ml". Beregnede resultater er større enn eller lik 150 CMV-DNA kopier/ml og mindre enn eller lik 1,00E+07 CMV-DNA kopier/ml og ligger innenfor analysens lineære område. Beregnet kopier/ml ligger over analysens måleområde. Rapporter resultater som "større enn 1,00E+07 CMV-DNA kopier/ml". Hvis det er ønskelig med et kvantitativt resultat, kan den opprinnelige prøven fortynnes med CMV-negativt humant EDTA-plasma og analyseres på nytt. Multipliser det rapporterte resultatet med fortynningsfaktoren. Beregnet IU/ml er under analysens nedre kvantiteringsgrense. Rapporter resultater som "CMV-DNA detektert, mindre enn 137 CMV- DNA IU/ml". Beregnede resultater er større enn eller lik 137 CMV-DNA IU/ml og mindre enn eller lik 9,10E+06 CMV-DNA IU/ml og ligger innenfor analysens lineære område. Beregnet IU/ml ligger over analysens måleområde. Rapporter resultater som "større enn 9,10E+06 CMV-DNA IU/ml". Hvis det er ønskelig med et kvantitativt resultat, kan den opprinnelige prøven fortynnes med CMV-negativt humant EDTA-plasma og analyseres på nytt. Multipliser det rapporterte resultatet med fortynningsfaktoren. Merk: Prøver som ligger høyere enn analysens måleområde, og som gir et ugyldig resultat med flagget "QS_INVALID", skal ikke rapporteres som > 9,10E+06 IU/ml eller > 1,00E+07 kopier/ml. Den opprinnelige prøven bør fortynnes med CMV-negativt EDTA-plasma og analyseres på nytt. Multipliser det rapporterte resultatet med fortynningsfaktoren. Merk: Titerresultat "Failed". Tolkning: Prøven ble ikke riktig behandlet. Merk: Titerresultat "Invalid". Tolkning: Et ugyldig resultat. 04898362055-03NO 18 Doc Rev. 3.0

KVALITETSKONTROLL Ett replikat hver av COBAS TaqMan negativ kontroll, CMV lav positiv kontroll og CMV høy positiv kontroll må tas med i hver analyseserie. Analyseserien er gyldig hvis det ikke fremkommer flagg for kontrollene [CMV ( ) C, CMV L(+)C og CMV H(+)C]. Sjekk om det finnes flagg og kommentarer i analyseutskriften for å sikre at analyseserien er gyldig. Negativ kontroll CMV ( ) C skal vise resultatet "Target Not Detected". Hvis CMV ( ) C flagges som ugyldig, er hele analyseserien ugyldig. Gjenta hele prosessen (prøve- og kontrollpreparering, amplifikasjon og deteksjon). Kontakt det lokale Roche-kontoret for teknisk hjelp hvis CMV ( ) C er ugyldig i flere gjentatte analyseserier. Positive kontroller Det akseptable titerområdet for CMV L(+)C og CMV H(+)C er angitt på strekkodene for reagenskassettene for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testen. CMV-DNA kopier/ml for CMV L(+)C og CMV H(+)C må ligge innenfor de akseptable titerområdene. Hvis en av eller begge de positive kontrollene flagges som ugyldige, er hele analyseserien ugyldig. Gjenta hele prosessen (prøve- og kontrollpreparering, amplifikasjon og deteksjon). Kontakt det lokale Rochekontoret for teknisk hjelp hvis CMV-DNA-titer for en av eller begge de positive kontrollene konsekvent er utenfor angitt akseptområde i flere analyseserier. FORSIKTIGHETSREGLER Som for andre laboratorieprosedyrer, er god laboratorieteknikk essensielt for å sikre optimal ytelse for denne analysen. TESTENS BEGRENSNINGER 1. Denne testen er kun validert for bruk sammen med humant plasma med EDTA som antikoagulant. Testing av andre prøvematerialer kan føre til feil resultat. 2. Pålitelige resultater er avhengig av adekvat prøvetaking, transport, oppbevaring og håndtering. 3. Tilstedeværelse av AmpErase-enzymet i COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testens Master Mix reduserer risikoen for kontaminering fra amplicon. Men kontaminering fra CMVpositive kontroller og kliniske prøver kan kun unngås ved å bruke gode laboratorierutiner og ved å følge anvisningene i dette pakningsvedlegget nøye. 4. Dette produktet må kun brukes av personell som er opplært i PCR-teknikk. 5. Dette produktet kan kun brukes sammen med COBAS AmpliPrep-instrumentet og COBAS TaqMan -analysatoren eller COBAS TaqMan 48-analysatoren. 6. I sjeldne tilfeller kan mutasjoner innenfor de høykonserverte regionene av virusgenomer som er dekket av COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testens primere og/eller prober, føre til manglende evne til å påvise viruset. 7. Deteksjon av CMV-DNA avhenger av antall viruspartikler som er til stede i prøven, og kan påvirkes av metoden for prøvetaking og pasientfaktorer (dvs. alder, tilstedeværelse av symptomer og/eller infeksjonsstadium). 8. På grunn av de naturlige forskjellene mellom teknologier anbefales det at brukerne utfører metodekorrelasjonsstudier i laboratoriet for å kvantifisere de teknologiske forskjellene før en ny teknologi tas i bruk. 9. De kliniske beslutningsgrensene for virusmengdeverdier i internasjonale enheter/ml (IU/ml) er ennå ikke fastslått. Leger anbefales å bruke den gjeldende omregningsfaktoren fra IU/ml til kopier/ml når de tar kliniske beslutninger basert på resultater som er rapportert i IU/ml. 04898362055-03NO 19 Doc Rev. 3.0

INTERFERERENDE SUBSTANSER Økte nivåer av triglyserider (opptil 3300 mg/dl), konjugert bilirubin (opptil 20 mg/dl), ukonjugert bilirubin (opptil 20 mg/dl), hemoglobin (opptil 200 mg/dl) og humant DNA (opptil 0,4 mg/dl) i prøver samt nærvær av autoimmune sykdommer eller respektive markører slik som systemisk lupus erytematose (SLE), revmatoid artritt (RA) og antinukleært antistoff (ANA) har vist seg ikke å interferere med kvantiteringen av CMV-DNA eller påvirke spesifisiteten for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testen. Evalueringen ble utført i henhold til CLSI-retningslinje EP7-A2 41 ved bruk av én lot med reagenser for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testen. Følgende medikamenter som er testet ved 3 ganger høyeste plasmakonsentrasjonsnivå (Cmax), har vist seg ikke å interferere i kvantiteringen av CMV-DNA eller påvirke spesifisiteten for COBAS AmpliPrep/ COBAS TaqMan CMV-testen: Immunsuppressive medikamenter Antibiotika Azatioprin Sulfametoxazol Cyklosporin Trimetoprim Mykofenolatmofetil Cefotetan Mykofenolatnatrium Piperacillin Sirolimus Tazobaktamnatrium Takrolimus Klavulanatkalium Everolimus Ticarcillindinatrium Prednison Vancomycin Anti-CMV Ganciklovir Valganciklovir Cidofovir Foscarnet Soppdrepende midler Flukonazol VURDERING AV ANALYTISK YTELSE A. Sporbarhet i forhold til den første WHO International Standard for Human Cytomegalovirus Flere standarder og kontroller er brukt under utvikling av denne testen for å gi sporbarhet i forhold til WHOstandarden [den første WHO International Standard for Human Cytomegalovirus for Nucleic Acid Amplification Techniques (NIBSC 09/162)]. 40 Standardene som ble brukt under utvikling av testen, inkluderer CMV WHOstandard, RMS CMV-sekundærstandard, kildemateriale for RMS CMV-sekundærstandard og RMS CMVkalibreringspanel (Lambda CMA1.2). Standardene, kalibreringspanelet og en uavhengig klinisk CMV-prøve ble testet med lignende nivåer. Konsentrasjonsområdet som ble testet for CMV WHO-standarden, var fra 5,00E+02 IU/ml til 5,00E+05 IU/ml (2,70 5,70 log 10 IU/ml), kildematerialet til RMS CMV-sekundærstandard ble testet fra 5,00E+02 IU/ml til 1,00E+07 IU/ml (2,70 7,00 log 10 IU/ml), RMS CMV-kalibreringspanelet ble testet fra 5,23E+02 til 9,30E+06 IU/ml (2,72 6,97 log 10 IU/ml) og den uavhengige kliniske CMV-prøven ble testet fra 5,00E+02 IU/ml til 22 686 IU/ml (2,70 4,36 log 10 IU/ml). Alt materialet fungerte på lignende måte og viste kolineær fortynningsytelse over hele det lineære området til COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testen (CAP/CTM CMV) (figur 6). 04898362055-03NO 20 Doc Rev. 3.0

Figur 6 Sporbarheten til COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testen i forhold til den første WHO International Standard for Human Cytomegalovirus Gjennomsnittlig mål-ct-verdi 40 35 30 25 20 15 10 0 2 4 6 8 10 Log 10 konsentrasjoner basert på WHO-standard (IU/ml) WHO-standard: y = -3,9472x + 45,64; R 2 = 0,9971 Klinisk prøve: y = -3,8549x + 45,386; R 2 = 0,9979 CMV SS-kilde: y = -3,9358x + 45,514; R 2 = 0,9987 CAP/CTM CMV kalibreringspanel: y = -3,8574x + 45,383; R 2 = 0,9955 CMV WHO-standard Klinisk prøve nr. N565967-3 SS kildemateriale AD169 CAP/CTM CMV kalibreringspanel CMV SS, ufortynnet B. Deteksjonsgrense Deteksjonsgrensen for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testen ble bestemt ved å teste en CMV-DNA-positiv prøve og RMS-CMV-sekundærstandard, fortynnet i CMV-negativt humant EDTAplasma. Paneler for hvert av de 2 CMV-kildematerialene ble preparert som 6 uavhengige fortynningsserier i 6 unike CMV-negative donorenheter med EDTA-plasma. Fortynningsseriene med CMV-DNA-positive kliniske prøver besto av 6 nivåer (43, 85, 127, 169, 255 og 339 IU/ml eller 47, 93, 140, 186, 280 og 373 kopier/ml). Fortynningsseriene med RMS-CMV-sekundærstandard besto av 6 nivåer (46, 91, 137, 182, 273 og 364 IU/ml eller 50, 100, 150, 200, 300 og 400 kopier/ml). Minst 208 replikater per konsentrasjonsnivå ble testet etter å kombinere replikatene fra panelene preparert fra CMV-DNA-positive prøver og RMS-CMV-sekundærstandard. Deteksjonsgrensen ble bestemt ved å bruke 3 reagenslot og alle de 3 arbeidsflytene (COBAS AmpliPrep dokket til en COBAS TaqMan, COBAS AmpliPrep tilknyttet en COBAS TaqMan, og COBAS AmpliPrep tilknyttet en COBAS TaqMan 48). Evalueringen ble utført i samsvar med CLSI-retningslinjen EP17-A, protokoller for bestemmelse av deteksjonsgrenser og kvantiteringsgrenser, godkjente retningslinjer. 42 Konsentrasjonen av CMV-DNA som kan detekteres med en positivitetsrate på mer enn 95 %, som bestemt ved PROBIT-analyse, er 56 IU/ml (95 % konfidensintervall: 50 66 IU/ml) eller 61 kopier/ml (95 % konfidensintervall: 55 72 kopier/ml). De kombinerte resultatene for alle de 3 reagenslotene vises i tabell 2. 04898362055-03NO 21 Doc Rev. 3.0

Tabell 2 Deteksjonsgrense og PROBIT-analyse av COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testen, ved bruk av en prøve og RMS-CMV-sekundærstandard Nominell input (CMV-DNA-IU/ml) RMS CMVsekundærstandard Klinisk prøve Nominell input (CMV-DNA-kopier/ml) Klinisk prøve Antall replikater Antall positive RMS CMVsekundærstandard Positivitetsrate 364 339 400 373 208 208 100% 273 255 300 280 210 210 100% 182 169 200 186 209 209 100% 137 127 150 140 210 210 100% 91 85 100 93 210 209 99.50% 46 43 50 47 210 188 89.50% 0 0 0 0 210 0 0% PROBIT 95 % treffrate 56 IU/ml (95 % konfidensintervall: 50 66 IU/ml) 61 kopier/ml (95 % konfidensintervall: 55 72 kopier/ml) C. Presisjon Presisjonen til COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testen ble bestemt ved å analysere et panel med 8 prøver. Panelet ble preparert ved å bruke en CMV-DNA-positiv prøve for den nedre delen av det dynamiske området, og ved å fortynne dyrket CMV (stamme AD169) for den midtre og øvre delen av det dynamiske området, siden man ikke hadde tilgang på materiale med svært høyt titer. Begge kildematerialene ble fortynnet i CMV-negativt EDTA-plasma. Panelet med 8 prøver dekket et område fra 2,00E+02 CMV-DNA kopier/ml til 1,00E+07 CMV-DNA kopier/ml. Hver panelprøve ble testet med 2 replikater per analyseserie, med 2 analyseserier per dag, i minimum 12 dager, og for hver av de 2 arbeidsflytene (COBAS AmpliPrep-dokket til en COBAS TaqMan og COBAS AmpliPrep tilknyttet en COBAS TaqMan 48) for totalt 96 replikater per panelprøve der replikatene var jevnt fordelt over 3 kitlot, 4 COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan -systemer og minst 2 operatører. Hver prøve gjennomgikk hele prosedyren for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMVtesten, inkludert prøvepreparering, amplifikasjon og deteksjon. Derfor representerer presisjonen som er vist her, alle aspekter av testprosedyren. Resultatene for hver reagenslot og for de 3 kombinerte reagenslotene vises i tabell 3. Tabell 3 Presisjon for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testen Titer (kopier/ml) N Lot 1 Lot 2 Lot 3 Alle tre lot i kombinasjon Total Total Total Total Total % SD i N SD i N SD i N SD i CV log 10 log 10 log 10 log 10 Dyrket CMV (stamme AD169) 1,00E+07 32 0,10 32 0,08 32 0,12 96 0,12 28 % 1,00E+06 32 0,10 32 0,05 32 0,07 96 0,09 20 % 1,00E+05 32 0,10 32 0,08 32 0,10 96 0,10 24 % 2,00E+04 32 0,14 32 0,15 32 0,08 96 0,13 30 % 5,00E+02 32 0,22 32 0,23 32 0,26 96 0,24 59 % Prøve 1,00E+03 32 0,11 32 0,12 32 0,10 96 0,12 29 % 3,20E+02 32 0,17 32 0,16 32 0,13 96 0,16 39 % 2,00E+02 32 0,21 32 0,20 32 0,20 96 0,21 53 % 04898362055-03NO 22 Doc Rev. 3.0

D. Lineært område Det lineære området for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testen ble bestemt ved å analysere et panel med 10 prøver. Panelet ble preparert ved å bruke en CMV-DNA-positiv klinisk prøve for den nedre delen av det dynamiske området, og ved å fortynne dyrket CMV (stamme AD169) for den midtre og øvre delen av det dynamiske området, siden man ikke hadde tilgang på klinisk materiale med svært høyt titer. Begge kildematerialene ble fortynnet i CMV-negativt EDTA-plasma. Panelet med 10 prøver dekket et område fra 4,55E+01 CMV-DNA IU/ml til 1,82E+07 CMV-DNA IU/ml (5,0E+01 CMV-DNA-kopier/ml til 2,0E+07 CMV-DNA-kopier/ml). Hver panelprøve ble testet med 2 replikater per analyseserie, med 2 analyseserier per dag, i minimum 12 dager, og for hver av de 2 arbeidsflytene (COBAS AmpliPrep-dokket til en COBAS TaqMan og COBAS AmpliPrep tilknyttet en COBAS TaqMan 48) for totalt 96 replikater per panelprøve der replikatene var jevnt fordelt over 3 kitlot, 4 COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan -systemer og minst 2 operatører. Hver prøve gjennomgikk hele prosedyren for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMVtesten, inkludert prøvepreparering, amplifikasjon og deteksjon. Som vist i figur 7, basert på CLSI EP6-A, var COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testen lineær fra 4,55E+01 CMV-DNA IU/ml til 1,82E+07 CMV-DNA IU/ml (5,0E+01 CMV-DNA-kopier/ml til 2,0E+07 CMV-DNA-kopier/ml). Basert på den nedre kvantiteringsgrensen på 1,37E+02 CMV-DNA IU/ml (1,5E+02 CMV-DNA-kopier/ml) er det lineære området 1,37E+02 CMV-DNA IU/ml til 9,10E+06 CMV-DNA IU/ml (1,5E+02 CMV-DNA-kopier/ml til 1,0E+07 CMV-DNA-kopier/ml). Figur 7 Linearitet for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testen Resultater med COBAS AmpliPrep/ COBAS TaqMan CMV-testen Gjennomsnittlig Log 10 (CMV-DNA IU/ml) 8 7 6 5 4 3 2 1 0 y = 1,0574x - 0,3892 R 2 = 0,9987 Error bars = 1 standardavvik 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Nominell konsentrasjon Log 10 (CMV-DNA IU/ml) Merk: Hule og fylte symboler representerer gjennomsnittlig log 10 titerverdier for henholdsvis fortynninger av en klinisk prøve og en kultur med CMV-stamme AD169. 04898362055-03NO 23 Doc Rev. 3.0

E. Ytelsen til COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testen med Anti-CMV IgG negative prøver Ytelsen til COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testen ble bestemt med 2 reagenslot ved å analysere anti-cmv IgG-negative EDTA-plasmaprøver fra mottakere av nyreallograft som var donor (+) / mottaker ( ) i CMV-serologi før de fikk nyren. Ett hundre og femtien (151) av 157 EDTA-plasmaprøver fra 156 pasienter ga negative resultater for CMV DNA i COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testen. For de 6 CMV-DNA-positive resultatene indikerte en supplerende testing av løpende innsamlede prøver fra de samme pasientene at pasientene tidligere eller senere hadde hatt CMV-infeksjon. En uavhengig CMV- PCR-test bekreftet også tilstedeværelse av CMV-DNA i 5 av de 6 avvikende resultatene. Som et resultat av oppløsningstesting testet 151 av de 152 CMV-IgG-seronegative prøvene negativt for tilstedeværelse av CMV-DNA, noe som ga en spesifisitetsrate på 99,3 % (95 % konfidensintervall: 96,4 % 100,0 %). F. Analytisk spesifisitet Den analytiske spesifisiteten for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testen ble evaluert ved å tilsette dyrkede organismer (virus, bakterier, gjærsopp) med input-konsentrasjon på 1,0E+06 partikler/ml i CMV-negativt humant EDTA-plasma og i CMV-positivt EDTA-plasma med 7,5E+02 kopier/ml CMV (se tabell 4). Ingen av de testede organismene viste kryssreaktivitet med COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMVtesten. CMV-positive prøver ga titerresultater som var innenfor ± 0,3 log 10 fra en CMV-positiv kontroll. Tabell 4 Prøver brukt for evaluering av analytisk spesifisitet Humant herpesvirus Herpes simplex-virus type 1 Herpes simplex-virus type 2 Varicella-Zoster-virus Epstein-Barr-virus Humant herpesvirus 6 Humant herpesvirus 7 Humant herpesvirus 8 Bakterier Mycoplasma pneumoniae Propionibacterium acnes Salmonella typhimurium Staphylococcus aureus Streptococcus pneumoniae Andre virus BK polyomavirus JC polyomavirus Hepatitt A-virus Hepatitt B-virus Hepatitt C-virus HIV type 1 Adenovirus 5 Parvovirus B19 Sopp Aspergillus niger Candida albicans Cryptococcus G. Metodesammenligning med COBAS AMPLICOR CMV MONITOR-testen og LightCycler CMV Quant-testen Ytelsen til COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testen ble sammenlignet med COBAS AMPLICOR CMV MONITOR-testen ved å analysere 111 ufortynnede CMVCMV-positive kliniske prøver. Kun gyldige titerpar innenfor de lineære områdene for begge analysene som ble sammenlignet, ble vurdert for Deming-regresjonsanalyse (se figur 8). Ytelsen til COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testen ble også sammenlignet med LightCycler CMV Quant-testen ved bruk av LightCycler 480-systemet ved å analysere 90 ufortynnede CMV-positive kliniske prøver. Kun gyldige titerpar innenfor de lineære områdene for begge analysene som ble sammenlignet, ble vurdert for Deming-regresjonsanalyse (se figur 9). 04898362055-03NO 24 Doc Rev. 3.0

Figur 8 Korrelasjon mellom COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testen og COBAS AMPLICOR CMV MONITOR-testen 6,0 5,0 CAP/CTM CMV-testen, Log10 titer (CMV-DNA-kopier/ml) 4,0 3,0 2,0 1,0 Y = 1,193 X - 0,848 R 2 = 0,9218 N = 111 0,0 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 COBAS AMPLICOR CMV MONITOR-testen, Log10 titer (CMV-DNA-kopier/ml) Figur 9 Korrelasjon mellom COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testen og LightCycler CMV Quant-testen 7,0 6,0 CAP/CTM CMV-testen, Log10 titer (CMV-DNA-kopier/ml) 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 Y = 0,904 X - 0,072 R 2 = 0,8446 N = 90 0,0 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 LightCycler CMV Quant-testen, Log10 titer (CMV-DNA-kopier/ml) 04898362055-03NO 25 Doc Rev. 3.0

REFERANSER 1. Griffiths PD. 2000. Cytomegalovirus. In Principles and Practice of Clinical Virology. eds. Zuckerman, A.J., Banatvala, J.E. and Pattison, J.R. John Wiley and Sons, London. 79-116. 2. Pass R.F. 2001. Cytomegalovirus. In: Fields Virology. eds. Knipe, D., Howley, P. Lippincott, Williams and Wilkins, Philadelphia. 2675-2706. 3. Kapranos N., Petrakou E, Anastasiadou C, Kotronias D. 2003. Detection of herpes simplex virus, cytomegalovirus, and Epstein-Barr virus in the semen of men attending an infertility clinic. Fertility and Sterility 79:48-52. 4. Forbes BA. 1989. Acquisition of cytomegalovirus infection: an update. Clinical Microbiological Reviews 2:204-216. 5. Numazaki, K. 1997. Human cytomegalovirus infection of breast milk. FEMS Immunology and Medical Microbiology, 18:2:91-98. 6. Vochem M, Hamprecht K, Jahn G, Speer CP. 1998. Transmission of cytomegalovirus to preterm infants through breast milk. Pediatric Infectious Disease Journal. 17:55-53. 7. Souza IE, Nicholson D, Matthey S, et al. 1994. Detection of human cytomegalovirus in peripheral blood leukocytes by polymerase chain reaction and a nonradioactive probe. Diagnostic Microbiology Infectious Disease 20:13-19. 8. Alford CA, Brill WJ. 1990. Cytomegalovirus. In: Virology, Vol. 2, 2nd ed., eds. Fields, B.N. Knipe, D.M. Raven Press, New York, NY. 1981-2010. 9. Yasuda A, Kimura H, Hayakawa M, Ohshiro M, et al. 2003. Evaluation of cytomegalovirus infections transmitted via breast milk in preterm infants with a real-time polymerase chain reaction assay. Pediatrics. 111:1333-6. 10. Jordan MC. 1983. Latent infection and the elusive cytomegalovirus. Reviews in Infectious Diseases 5:205-215. 11. Drew WL. 1989. Other virus infections in AIDS: I: Cytomegalovirus. Immunology and Serology 44:507-534. 12. Drew WL. 1992. Nonpulmonary manifestations of Cytomegalovirus infection in immunocompromised patients. Clinical Microbiology Review 5:204-210. 13. Mocarski ES, Courcelle CT. 2001. Cytomegaloviruses and their replication. In: Fields Virology. eds. Knipe D and Howley P. Lippincott, Williams and Wilkins, Philadelphia. 2629-2674. 14. Fedorko DP,Yan SS. 2002. Recent advances in laboratory diagnosis of human Cytomegalovirus infection. Clinical and Immunological Reviews 2:155-167. 15. Schafer P, Tenschert W, Gutensohn K, Laufs R. Minimal effect of delayed sample processing on results of quantitative PCR for cytomegalovirus DNA in leukocytes compared to results of an antigenemia assay. Journal of Clinical Microbiology 1997 35: 741-744. 16. Bowen EF, Sabin CA, Wilson P, et al. 1997. Cytomegalovirus (CMV) viraemia detected by polymerase chain reaction identifies a group of HIV-positive patients at high risk of CMV disease. AIDS 11:889-893. 17. Gor D, Sabin C, Prentice HG, et al. 1998. Longitudinal fluctuations in cytomegalovirus load in bone marrow transplant patients: relationship between peak virus load, donor/recipient serostatus, acute GVHD and CMV disease. Bone Marrow Transplantation 21:597-605. 18. Hassan-Walker AF, Kidd IM, Sabin C, et al. 1999. Quantity of human cytomegalovirus (CMV) DNAemia as a risk factor for CMV disease in renal allograft recipients: Relationship with donor/recipient CMV serostatus, receipt of augmented methylprednisolone and antithymocyte globulin (ATG). Journal of Medical Virology 58:182-187. 19. Sanchez JL, Kruger RM, Paranjothi S, et al. 2001. Relationship of cytomegalovirus viral load in blood to pneumonitis in lung transplant recipients. Transplantation 2001 72:733-735. 20. Humar A, Mazzulli T, Moussa G, Razonable RR, Paya CV, Pescovitz MD, Covington E, Alecock E; Valganciclovir Solid Organ Transplant Study Group. Clinical utility of cytomegalovirus (CMV) serology testing in high-risk CMV D+/R- transplant recipients. Am J Transplant. 2005 May; 5(5):1065-701 04898362055-03NO 26 Doc Rev. 3.0

21. Griffiths P, Whitley R, Snydman DR, Singh N, Boeckh M; International Herpes Management Forum. Contemporary management of cytomegalovirus infection in transplant recipients: guidelines from an IHMF workshop, 2007. Herpes. 2008 Oct; 15(1):4-12. 22. Kotton CN, Kumar D, Caliendo AM, Asberg A, Chou S, Snydman DR, Allen U, Humar A; Transplantation Society International CMV Consensus Group. International consensus guidelines on the management of cytomegalovirus in solid organ transplantation. Transplantation. 2010 Apr 15; 89(7):779-95. 23. Marenzi, R., Cinque, P., Ceresa, D., et. al. 1996. Serum polymerase chain reaction for cytomegalovirus DNA for monitoring ganciclovir treatment in AIDS patients. Scandanavian Journal of Infectious Disease 28:347-351. 24. Rasmussen, L., Zipeto, D., Wolitz, R.A., et al. 1997. Risk for retinitis in patients with AIDS can be assessed by quantitation of threshold levels of cytomegalovirus DNAburden in blood. Journal of Infectious Disease 176:1146-1155. 25. Shinkai M, Bozzette SA, Powderly W, et al. 1997. Utility of urine and leucocyte cultures and plasma DNA polymerase chain reaction for identification of AIDS patients at risk for developing human cytomegalovirus disease. Journal of Infectious Disease 175:3029308. 26. Spector SA, Wong R, Hsia K, et al. 1998. Plasma cytomegalovirus (CMV) DNA load predicts CMV disease and survival in AIDS patients. Journal of Clinical Investigation 101:497-502. 27. Cope AV, Sweny P, Sabin C, et al. 1997. Quantity of cytomegalovirus viruria is a major risk factor for cytomegalovirus disease after renal transplantation. Journal of Medical Virology 52:200-205. 28. Gor D, Sabin C, Prentice HG, et al. 1998. Longitudinal fluctuations in cytomegalovirus load in bone marrow transplant patients: relationship between peak virus load, donor/recipient serostatus, acute GVHD and CMV disease. Bone Marrow Transplantation 21:579-605. 29. Einsele, H., Ehninger, G., Steidle, M., et al. 1991. Polymerase chain reaction to evaluate antiviral therapy for cytomegalovirus disease. Lancet 338:1170-1172. 30. Bowen EF, Wilson P, Cope A. et al. 1996. Cytomegalovirus retinitis in AIDS patients: influence of cytomegaloviral load on response to ganciclovir, time to recurrence and survival. AIDS 10:1515-1520. 31. Lanari M, Lazzarotto T, Venturi V, Papa I, Gabrielli L, Guerra B, Landini MP, Faldella G. Neonatal cytomegalovirus blood load and risk of sequelae in symptomatic and asymptomatic congenitally infected newborns. Pediatrics. 2006 Jan; 117(1):e76-83. 32. Eid AJ, Arthurs SK, Deziel PJ, Wilhelm MP, Razonable RR. Emergence of drug-resistant cytomegalovirus in the era of valganciclovir prophylaxis: therapeutic implications and outcomes. Clin Transplant. 2008 Mar-Apr; 22(2):162-170. 33. Ljungman P, de la Camara R, Cordonnier C, Einsele H, Engelhard D, Reusser P, Styczynski J, Ward K; European Conference on Infections in Leukemia. Management of CMV, HHV-6, HHV-7 and Kaposi-sarcoma herpesvirus (HHV-8) infections in patients with hematological malignancies and after SCT. Bone Marrow Transplant. 2008 Aug; 42(4):227-240. 34. Smith ES, Li AK, Wang AM, Gelfand DH, Myers TM. 2003. Amplification of RNA: High-Temperature Reverse Transcription and DNA Amplification with a Magnesium-Activated Thermostable DNA Polymerase. In PCR Primer: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Dieffenbach C.W. and Dveksler G.S., Eds. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, pp. 211-219. 35. Longo MC, Berninger MS, Hartley JL. 1990. Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reactions. Gene 93:125-128. 36. Higuchi R, Dollinger G, Walsh PS, Griffith R. 1992. Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences. Biotechnology (N Y). 10:413-417. 37. Heid CA, Stevens J, Livak JK, Williams PM. 1996. Real time quantitative PCR. Genome Research 6:986-994. 38. Richmond JY, McKinney RW. eds. 1999. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. HHS Publication Number (CDC) 93-8395. 39. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Protection of Laboratory Workers from Occupationally Acquired Infections. Approved Guideline-Third Edition. CLSI Document M29-A3 Wayne, PA:CLSI, 2005. 04898362055-03NO 27 Doc Rev. 3.0

40. Fryer JF, Heath AB, Anderson R, Minor PD and the collaborative study group. 2010 Collaborative Study to evaluate the proposed 1 st WHO International Standard for Human Cytomegalovirus (HCMV) for Nucleic Acid Amplification (NAT)-based Assays. WHO ECBS Report WHO/BS/10.2138. 41. International Air Transport Association. Dangerous Goods Regulations, 41st Edition. 2000. 704 pp. 42. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Interference Testing in Chemisty; Approved Guideline Second Edition. CLSI Document EP7-A2. CSLI, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvannia 19087-1898 USA, 2004. 43. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Protocols for Determination of Limits of Detection and Limits of Quantitation; Approved Guideline. CLSI Document EP17-A [ISBN 1-56238- 551-8]. CLSI, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvannia 19087-1898 USA, 2004. 04898362055-03NO 28 Doc Rev. 3.0

Informasjon om dokumentrevisjon Doc Rev. 3.0 06/2011 I avsnittet SAMMENDRAG OG BESKRIVELSE AV TESTEN er "Internasjonale enheter/ml (IU/ml)" lagt til som en rapporterbar resultatenhet. Navnene på instrument- og programvaremanualene er korrigert i avsnittene MATERIELL SOM KREVES, MEN SOM IKKE MEDFØLGER og BRUKSANVISNING. Avsnittene MATERIELL SOM KREVES, MEN SOM IKKE MEDFØLGER og BRUKSANVISNING er oppdatert for å gjenspeile inkludering av navnet til operatørmanualen for cobas p 630-instrumentet. I avsnittet BRUKSANVISNING er det lagt til en merknad for å henvise brukere til operatørmanualen for cobas p 630-instrumentet for å finne instruksjoner om preparering av prøver ved bruk av cobas p 630-instrumentet. I avsnittet RESULTATER er undertittelen "Analysevalidering" endret til "Validering av analyseserie" for å skape konsistens i teksten. I avsnittet RESULTATER er undertittelen Tolkning av resultater oppdatert for å inkludere tolkninger for resultater gjengitt med enheten IU/ml. I avsnittet TESTENS BEGRENSNINGER er det lagt til en anbefaling for leger om å bruke riktig konverteringsfaktor når de tar kliniske beslutninger basert på resultater rapportert i IU/ml. I avsnittet VURDERING AV ANALYTISK YTELSE er sporbarheten for CAP/CTM CMV-testen i forhold til den første WHO International Standard for Human Cytomegalovirus lagt til. I avsnittet VURDERING AV ANALYTISK YTELSE, under undertittelen Deteksjonsgrense, er de testede konsentrasjonene i IU/ml lagt til teksten. I avsnittet VURDERING AV ANALYTISK YTELSE, under undertittelen Lineært område, er de testede konsentrasjonene i IU/ml lagt til teksten. I avsnittet VURDERING AV ANALYTISK YTELSE, under undertittelen Lineært område, er figur 7 oppdatert for å gjenspeile linearitetsdataene i IU/ml. I avsnittet VURDERING AV ANALYTISK YTELSE, under undertittelen Metodesammenligning med COBAS AMPLICOR CMV MONITOR-testen og LightCycler CMV Quant-testen er tekst og figurer oppdatert for å gjenspeile dataene som er testet siden forrige revisjon av pakningsvedlegget. Kontakt din lokale Roche-representant om du har noen spørsmål. Doc Rev. 2.0 03/2011 Første utgivelse. 04898362055-03NO 29 Doc Rev. 3.0

Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ 08876 USA Medlem av Roche-gruppen Roche Diagnostics (Schweiz) AG Roche Diagnostics Industriestrasse 7 201, boulevard Armand-Frappier 6343 Rotkreuz, Switzerland H7V 4A2 Laval, Québec, Canada (For Technical Assistance call: Roche Diagnostics GmbH Pour toute assistance technique, Sandhofer Straße 116 appeler le: 1-877 273 3433) 68305 Mannheim, Germany Roche Diagnostics Roche Diagnostics SL 2, Avenue du Vercors Avda Generalitat, 171-173 38240 Meylan, France E-08174 Sant Cugat del Vallès Barcelona, Spain Distributore in Italia: Roche Diagnostics S.p.A. Roche Diagnostica Brasil Ltda. Viale G. B. Stucchi 110 Av. Engenheiro Billings, 1729 20052 Monza, Milano, Italy Jaguaré, Building 10 05321-010 São Paulo, SP Brazil Distribuidor em Portugal: Roche Sistemas de Diagnósticos Lda. Estrada Nacional, 249-1 2720-413 Amadora, Portugal ROCHE, AMPERASE, AMPLICOR, AMPLILINK, COBAS, COBAS P, AMPLIPREP og TAQMAN er varemerker for Roche. Alle andre produktnavn og varemerker tilhører de respektive eierne. Cyaninfargestoffene i dette produktet er underlagt patentrettighetene for GE Healthcare Bio-Sciences Corp. og Carnegie Mellon University og er lisensiert til Roche eksklusivt for innlemmelse i komponenter i kit for forskning og in vitro-diagnostikk-kit. Enhver bruk av slike kit til annet formål enn forskning eller in vitrodiagnostikk krever underlisenser fra GE Healthcare Bio-Sciences Corp., Piscataway, New Jersey, U.S.A. og Carnegie Mellon University, Pittsburgh, Pennsylvania, U.S.A. 2011 Roche Molecular Systems, Inc. Med enerett. 06/2011 (04898362001-03ENGL) Doc Rev. 3.0 04898362055-03 04898362055-03NO 30 Doc Rev. 3.0