2. Beskriv hvordan du ved hjelp av PCR etterfulgt av DNA-sekvensering kan påvise slike mutasjoner hos pasienter.

Ordinær eksamen, MEDSEM/ODSEM/ERNSEM2 høst 2008 Torsdag 15. januar 2009 kl. 09:00-15:00 Oppgavesettet består av 4 sider, samt vedlegg på 1 side Hjelpemidler: Norsk rettskrivingsordbok Oppgavesettet utgjør totalt 100 vekttall. Antall vekttall er vist i parentes foran hver spørsmålsgruppe. Nedsatt pyruvat dehydrogenase (PDH) aktivitet er en hyppig årsak til medfødt laktat acidose hos barn. Sykdommen kan være livstruende. Den kan også gi nevrologiske problemer med påvisbare strukturelle avvik i sentralnervesystemet, uten at det foreligger laktat acidose. Problemene skyldes ofte en mutasjon i PDHA1, genet som koder for α-subenheten i pyruvat dekarboksylasen i PDH-komplekset. PDHA1 er lokalisert på X-kromosomet. A. (27) 1. Hos pasienter med laktat acidose har det blitt observert punktmutasjoner og delesjoner i PDHA1. Forklar hvordan punktmutasjoner og delesjoner kan få funksjonelle konsekvenser. 2. Beskriv hvordan du ved hjelp av PCR etterfulgt av DNA-sekvensering kan påvise slike mutasjoner hos pasienter. 3. Selv om mutasjoner i PDHA1 gir en X-bundet recessivt nedarvet sykdom, kan en slik defekt også gi alvorlige symptomer hos enkelte jenter som er heterozygote for mutasjonen. Hvordan forklarer du dette? 4. Mutasjoner blir utsatt for negativ seleksjon dersom de gjør at individer med disse mutasjonene ikke kan få barn, eller får færre barn enn normalt. Hvor sterkt seleksjonen virker er blant annet avhengig av arvegangen til den aktuelle sykdommen. Vil seleksjonen vanligvis være sterkest ved autosomal recessiv eller ved autosomal dominant arvegang? Begrunn svaret. 5. En frisk person er bærer av en balansert translokasjon som er beskrevet: 46, XX, t(8;12)(q22.1;q13.3). Forklar kort hva som skjer ved synapse (parring) i meiosen mellom de kromosomene som er involvert i translokasjonen og hvilke gameter som kan bli dannet. Tegn gjerne en figur. 6. Skisser oppbygningen av et eukaryot gen som koder for et protein og forklar hvordan det transkriberes. 7. Gjør rede for spleisingen av et primærtranskript for mrna. 8. Gjør kort rede for de viktigste leddene i prosessen som sørger for at en polypeptidkjede som er kodet av det nukleære genomet blir lokalisert til mitokondriematriks. Side1 av 15

B. (30) PDH- kompleksets aktivitet reguleres blant annet ved fosforylering/defosforylering. Med denne mekanismen kan et hormon regulere mange enzymers aktivitet. 9. Hvilke aminosyresidekjeder i et protein kan fosforyleres av proteinkinaser, hvilken funksjonell gruppe på aminosyresidenkjeden er implisert, og hva slags kjemisk binding blir dannet ved fosforyleringsreaksjonen? 10. Beskriv signalveien som fører til dannelse av camp og aktivering av proteinkinase A(PKA). Bruk gjerne tegning. 11. Hvordan termineres en hormonrespons som har resultert i syntese av camp og aktivering av PKA? 12. Gi eksempler på enzymer i intermediærmetabolismen som aktiveres eller inaktiveres ved fosforylering katalysert av PKA. PDH-kompleksets aktivitet er viktig for den cellulære energiforsyningen. Flere transportveier gjennom cellemembranen er avhengige av ATP, mens andre ikke er det. 13. Angi de karakteristiske trekkene ved ATP-uavhengig og ATP-avhengig transmembrantransport, og beskriv ved eksempler på disse transportveiene. 14. Under normale forhold vil Na + /K + -pumpen (Na + /K + -ATPasen) bruke mye av cellens ATP. Hvorfor er denne pumpen så viktig for normal cellefunksjon? Svikt i PDH-kompleksets aktivitet kan gi nervecelleskader som fører til ulike typer av sentralt utløst ataksi (ukontrollerbare bevegelser). Generelt styres muskelaktivitet og bevegelse av motoriske nerveceller (motonevroner) som reguleres av eksitatoriske glutamaterge fibre og inhibitoriske GABAerge og glysinerge fibre. 15. Beskriv mekanismene som glutamat og GABA generelt anvender for å fremkalle endringer i postsynaptiske cellers membranpotensiale, og navngi de to hovedtyper av postsynaptiske responser. 16. Beskriv hvordan nerveceller avgjør om den innkommende informasjon fra både eksitatoriske og inhibitoriske synapser skal resultere i at et aksjonspotensial blir utløst, og diskuter mulige mekanismer som kan endre sannsynligheten for at dette skjer. De kolinerge motonevronenes efferente aksoner innerverer skjelettmuskelfibre i strukturer som kalles motoriske endeplater. 17. Beskriv hovedtrekkene i de molekylære og elektriske mekanismene som i tverrstripet muskulatur overfører responser fra den motoriske endeplaten til frisetning av Ca 2+ -ioner fra sarkoplasmatisk retikulum. Interaksjoner mellom aktin og myosin skal ikke beskrives. Side2 av 15

C. (14) PDH-komplekset katalyserer følgende reaksjon: Pyruvat + NAD + + CoA-SH Acetyl-CoA + NADH H + + CO 2 18. Forklar hvorfor manglende PDH aktivitet ofte gir laktat acidose (unormalt høy konsentrasjon av laktat i blodet), samt unormalt høye blodkonsentrasjoner av alanin og pyruvat. Tiamin (vitamin B 1 ) anvendes til biosyntese av tiaminpyrofosfat, et koenzym som brukes av pyruvat dekarboksylasen i PDH-komplekset. 19. Noen individer med nedsatt PDH-aktivitet kan behandles med store doser av tiamin (vitamin B 1 ), selv om det ikke foreligger noen B-vitamin mangel. Hvorfor er dette en effektiv behandling bare hos noen individer med nedsatt PDHaktivitet? 20. Hvorfor medfører nedsatt PDH-aktivitet oftest en mer alvorlig svikt i energiforsyningen for sentralnervesystemet enn den gjør for leveren? 21. Skisser den kjemo-osmotiske mekanismen for oksidativ fosforylering, og forklar effekten av en frikopler (for eks. 2,4-dinitrofenol). Bruk gjerne en tegning. Elektrontransportkjeden skal ikke beskrives. D. (10) I mange kreftceller er det glykolysen med dannelse av laktat i cytosol, og ikke oksidasjonen av pyruvat i mitokondriene, som bidrar til det meste av energiproduksjonen. Dette kan skyldes at mitokondriene i kreftcellene har fått endret funksjon. 22. Forklar kort hvordan cytokrom c kan sies å regulere cellens liv og død. E. (19) 23. Forklar hvordan mitokondriene kan bidra til apoptose i en normal celle og beskriv hva slags endringer i nivå av bestemte mitokondrieproteiner som ofte observeres i kreftceller. 24. Hvilke(t) av genene for henholdsvis p53, prb eller MLH1/MSH2 (DNA mismatch reparasjonsproteiner) kan direkte gi en celle en mutatorfenotype hvis det/de muteres? Begrunn svaret. Genene for de ulike subenhetene av PDH-komplekset finnes i det nukleære genomet, mens enzymkomplekset utøver sin funksjon i mitokondriene. 25. Mitokondrier formerer seg ved egen deling. Gjør kort rede for hvordan "gamle" mitokondrier brytes ned av cellen. 26. Vedlegg 1 viser bilder av tre ulike lysmikroskopiske preparater, farget med H+E. Hvilke vevstyper vises på bildene A, B og C? Side3 av 15

Celle-celle og celle-matriks interaksjoner er viktige prosesser under fosterutvikling. 27. Angi minst 3 ulike hovedgrupper av adhesjonsmolekyler og beskriv kort deres funksjoner. 28. Beskriv kort struktur og funksjoner av basalmembranen. Cellevandring bidrar til morfogenesen og er med på å etablere celle-celle interaksjoner som er nødvendig for riktig differensiering. 29. Beskriv de viktigste mekanismene som gjør celler i stand til å bevege seg gjennom ekstracellulær matriks. 30. Hox-genene er viktige for regionalisering av organer og strukturer under fosterutviklingen. a. Hvilken type protein koder Hox-gener for og hvordan bidrar disse proteinene til regionaliseringsprosessen? b. Vitamin A (retinsyre) er et kjent teratogen. Hva er mekanismen for hvordan vitamin A påvirker Hox-genenes ekspresjon? Side4 av 15

Side5 av 15

Ordinær eksamen, MEDSEM/ODSEM/ERNSEM2 høst 2008 Torsdag 15. januar 2009 kl. 09:00-15:00 Sensorveiledningen består av 11 sider (inkludert ett vedlegg) Hjelpemidler: Norsk rettskrivingsordbok Oppgavesettet utgjør totalt 100 vekttall. Antall vekttall er vist i parentes foran hver spørsmålsgruppe. Nedsatt pyruvat dehydrogenase (PDH) aktivitet er en hyppig årsak til medfødt laktat acidose hos barn. Sykdommen kan være livstruende. Den kan også gi nevrologiske problemer med påvisbare strukturelle avvik i sentralnervesystemet, uten at det foreligger laktat acidose. Problemene skyldes ofte en mutasjon i PDHA1, genet som koder for i α-underenheten i pyruvat dekarboksylasen i PDH- komplekset. PDHA1 er lokalisert på X-kromosomet. A. (27) 31. Hos pasienter med laktat acidose har det blitt observert punktmutasjoner og delesjoner i PDHA1. Forklar hvordan punktmutasjoner og delesjoner kan få funksjonelle konsekvenser. Svar: Missense-mutasjon gir utskiftning av én aminosyre med en annen; ellers uendret aminosyresammensetning. 3bp delesjoner vil resultere i at én aminosyre mangler i produktet. Endret primærsekvens vil kunne påvirke proteinets funksjon. Nonsensemutasjon kan gi introduksjon av prematurt stoppkodon, som resulterer i et kortere protein. Rammeskift-mutasjoner vil gi endret primærsekvens fra det punktet mutasjonen er lokalisert og vil ofte i tillegg innføre et stoppkodon i den nye leserammen. Spleisesete-mutasjoner ødelegger et spleisesete og gjør at spleisingen ikke blir utført på korrekt måte. Resultatet kan være at sekvensen fra et ekson uteblir i det bearbeidete transkriptet (exon skipping). Alternativt kan transkriptet spleises ved et sete som har likhet med et spleisete (kryptiske spleiseseter). Spleising til slike seter innebærer ofte at intronsekvenser inkluderes i det ferdige mrna. Fordi disse delene av transkriptet ofte inneholder stopp-kodoner, fører dette vanligvis til produksjon av et for kort protein. I tillegg kan mutasjoner i regulatoriske sekvenser påvirke mengden av genprodukt. Noen studenter vil også nevne at større delesjoner kan gi tap av f eks hele ekson. 32. Beskriv hvordan du ved hjelp av PCR etterfulgt av DNA-sekvensering kan påvise slike mutasjoner hos pasienter. Svar: Hovedprinsippene ved PCR: DNA denatureres ved oppvarming, spesifikke primere hybridiserer til de 2 DNA-trådene, og en polymerase syntetiserer nye DNA-tråder ved å inkorporere dntp. Disse tre trinnene foregår ved forskjellige temperaturer. Ved at denne prosessen gjentas mange ganger (ca. 30 ganger), kan DNA amplifiseres. Hovedprinsippene ved DNA-sekvensering: Det forventes at studentene beskriver hovedtrinnene i Sanger dideoxy-metoden og at de gjør rede for manuell og/eller automatisk DNA-sekvenering: Trenger enkelttrådig DNA (templat), primer, dntp, ddntp, DNA polymerase og Buffer. Reaksjonen settes opp i 4 rør med henholdsvis ddgtp, ddatp, ddttp, ddctp (eller i et rør hvis man benytter fire ddntp merket med 4 ulike fluorescerende forbindelser). Forlengelsen av den nysyntetiserte DNA-tråden stopper når en ddntp inkorporeres. Produktene fra de 4 reaksjonene separeres og påvises (f eks ved Side6 av 15

gelelektroforese og merkede ddntp). Ved å lese av signalene kan DNA-sekvensen i den nylagde DNA-tråden bestemmes. nkelte studenter kan gi en mer detaljert beskrivelse, men dette er ikke påkrevet. 33. Selv om mutasjoner i PDHA1 gir en X-bundet recessivt nedarvet sykdom, kan en slik defekt også gi alvorlige symptomer hos enkelte jenter som er heterozygote for mutasjonen. Hvordan forklarer du dette? Svar: Tidlig i fosterutviklingen blir et av kvinnens to X-kromosomer inaktivert. Hvilken av de to X-kromosomene som inaktiveres er tilfeldig i den enkelte celle, men inaktiveringen opprettholdes i mitotiske etterkommere av cellen. Ved skjev X-kromosom-inaktivering blant cellene i et vev kan majoriteten av cellene ha inaktivert X-kromosomet med normalvarianten av PDHA1-genet, slik at den mutante varianten dominerer i vevet. Dette har vært observert i hjernen hos noen bærere av PDHA1-mutasjoner. (Kanskje noen nevner at en PDHA1-mutasjonsbærer med Turner syndrom (45,X) vil ha symptomer). 34. Mutasjoner blir utsatt for negativ seleksjon dersom de gjør at individer med disse mutasjonene ikke kan få barn, eller får færre barn enn normalt. Hvor sterkt seleksjonen virker er blant annet avhengig av arvegangen til den aktuelle sykdommen. Vil seleksjonen vanligvis være sterkest ved autosomal recessiv eller ved autosomal dominant arvegang? Begrunn svaret. Svar: Seleksjonen vil være sterkest ved autosomal dominant arvegang. Seleksjonen vil her vanligvis virke på alle individer med mutasjonen. Ved autosomalt recessiv sykdom vil seleksjonen kun virke på homozygote syke, mens de friske bærerne (heterozygote) ikke vil bli selektert mot. Siden flertallet av personene som har mutasjonen vil være friske bærere, betyr det at flertallet av mutasjonene ikke vil bli selektert mot. (Studentene kan komme til å bruke betraktninger om Hardy-Weinberg likevekt for å begrunne dette; noe som ble gjort for å illustrere dette da det ble undervist). I tillegg til arvegang vil fitness, seleksjonskoeffisient og penetrans påvirke graden av seleksjon, men det forventes ikke at studentene går inn på dette. 35. En frisk person er bærer av en balansert translokasjon som er beskrevet: 46, XX, t(8;12)(q22.1;q13.3). Forklar kort hva som skjer ved synapse (parring) i meiosen mellom de kromosomene som er involvert i translokasjonen og hvilke gameter som kan bli dannet. Tegn gjerne en figur. Svar: Betegnelsen beskriver en kvinne som bærer translokasjonskromosomer inneholdende materiale fra to ikke-homologe kromosomer, i dette tilfellet kromosom 8 og 12. Translokasjonsbruddpunktene er lokalisert i kromosom 8q22.1 og 12q13.3. Ved homolog paring mellom translokasjonskromosomene og de normale kromosomene i 1. meiotiske deling vil det i denne personen dannes en tetravalent (se figuren under). Ved 2:2 segregasjon av kromosomene som er involvert i translokasjonen dannes de seks gametene som er vist i figuren. I tillegg kan det relativt ofte skje non-disjunction med 3:1 og 4:0 segregasjon av kromosomene. Side7 av 15

36. Skisser oppbygningen av et eukaryot gen som koder for et protein og forklar hvordan det transkriberes. Svar: Hovedstrukturen til proteinkodende gener hos eukaryoter består av promoter, transkripsjons-start, exoner, introner og transkripsjonsstopp. Innenfor exonsekvensene finner vi sekvenser som koder for 5' og 3' ikke-translaterende områder, samt sekvensene som gir opphav til den åpne leserammen som koder for selve proteinet. Transkripsjonen deles i 3 hovedfaser (initiering, elongering og terminering). Initiering: RNA polymerase II binder seg til promoter ved hjelp av transkripsjonsfaktorer. Det dobbelttrådige DNA åpnes. Elongering: RNA polymerase II starter ved transkripsjons-start og syntetiserer et enkelttrådig primærtranskript for mrna (5 - til 3 -retning) på grunnlag av DNAsekvensen som går i 3 - til 5 -retning. Terminering: Dette skjer ikke på et eksakt definert sted i eukaryote celler; terminerings-setet kan variere flere tusen baser for primærtranskript fra ett og samme gen. Stopper nedenfor et polyadenyleringssignal. 37. Gjør rede for spleisingen av et primærtranskript for mrna. Svar: Her forventes det at de fleste/alle beskriver spleising av et primærtranskript for mrna: Med spleising menes fjerning av intronsekvenser. Prosessen foregår i cellekjernen og utføres av spleisosomer, som består av protein- og RNA-komplekser. RNA-molekylene er relativt korte og betegnes U1, U2, osv. Noen av dem hjelper til med gjenkjenning av ekson/intron-overgangene. For hvert enkelt intron som fjernes gjenkjenner deler av spleisosomet først 5 -spleisesetet og en adenin i forgreningspunktet (branch point) et stykke fra 3 -spleisesetet i intronet. Prosessen begynner vanligvis med intron 1, der første trinn er kutting av esterbindingen i 5 - spleisesetet. Den frigjorte fosfatgruppen i 5 -enden av intronet danner i stedet esterbinding til adenosingruppen i forgreningspunktet. Foruten C5 og C3 - fosfodiesterbindingene får adenosingruppen her en tredje fosfodiesterbinding (til C2 ) slik at det dannes en lasso. Deretter skjer en ny reaksjon ved at 3 -spleisesetet blir kuttet og ekson 1 og 2 blir bundet direkte sammen. Tilsvarende fjernes påfølgende introner. Side8 av 15

38. Gjør kort rede for de viktigste leddene i prosessen som sørger for at en polypeptidkjede kodet av det nukleære genom blir lokalisert til mitokondriematriks. Svar: Nukleært kodede proteiner translateres av ribosomer i cytosol. Proteinets videre lokalisering etter translasjon bestemmes av motiver i proteinets primærsekvens; såkalte sorteringssignaler. Proteiner som skal til mitokondriematrix syntetiseres i cytosol, og foldes spontant eller under assistanse av chaperoner. De har et mitokondriesorteringssignal (som regel i den aminoterminale enden), som binder til en egen reseptor på mitokondrienes overflate. Transporten gjennom de to membraner i mitokondrieveggen skjer gjennom to translokasjonskanaler som er i kontakt med hverandre. Proteinene må rettes ut (defoldes) av chaperoner på cytosolsiden av mitokondrieveggen for å komme gjennom kanalen. Når hele proteinet er tredd gjennom til innsiden kappes signalsekvensen av, og mitokondrielle chaperoner sørger igjen for korrekt folding av proteinet. B. (30) PDH-kompleksets aktivitet reguleres blant annet ved fosforylering/defosforylering. Med denne mekanismen kan et hormon regulere mange enzymers aktivitet. 39. Hvilke aminosyresidekjeder i et protein kan fosforyleres av protein kinaser, hvilken funksjonell gruppe på aminosyresidenkjeden er implisert, og hva slags binding blir dannet ved fosforyleringsreaksjonen Svar: Serin, threonin og tyrosinsidekjeder kan bli fosforylert på en OH gruppe. Det dannes en esterbinding.. 40. Beskriv signalveien som fører til dannelse av camp og aktivering av proteinkinase A(PKA). Bruk gjerne tegning. Svar: Her forventes det at studenten tar utgangspunkt i f.eks glukagon eller adrenalin og beskriver hvordan binding av ligand til reseptor fører til aktivering av et heteromert G-protein med utbytting av GDP med GTP. Dette fører til at G-proteinet slipper taket i reseptor og dissossierer til en α- og en βγ-subenhet. α subenheten aktiverer adenylat cyclase som katalyserer dannelsen av camp fra ATP. 41. Hvordan termineres en hormonrespons som har resultert i syntese av camp og aktivering av proteinkinase A? Svar: Det er mange mekanismer som er med på å terminere signalet : a) Intrinsic hydrolyse av GTP b) camp fosfodiesterase som bryter ned camp c) Aktivering av fosfataser som fjerner påsatte fosfatgrupper d) Fosforylering av reseptor d) Internalisering av reseptor-ligand komplekset med enten degradering av hele komplekset eller kun liganden. 42. Gi eksempler på enzymer i intermediærmetabolismen som aktiveres eller inaktiveres ved fosforylering katalysert av PKA. Svar: Fosforylase kinase aktiveres ved fosforylering katalysert av PKA (i muskel vil man i tillegg ha full aktivering når Ca 2+ -Calmodulin er tilstede. Noen vil kanskje nevne at Fruktose 2,6 bisfofatase i lever blir aktivert ved fosforylering som følge av PKA aktivering. Av enzymer som blir inaktivert ved fosforylering kan nevnes glykogen Side9 av 15

syntase, pyruvat kinase, fosfofrukto kinase 2 (PFK2) og acetylcoa carboxylase og PDH komplekset. PDH-kompleksets aktivitet er viktig for den cellulære energiforsyningen. Flere transportveier gjennom cellemembranen er avhengig av ATP, mens andre ikke er det. 43. Angi de karakteristiske trekkene ved ATP-uavhengig og ATP-avhengig transmembran transport, og beskriv eksempler på disse transportveiene. Svar:ATP-uavhengig transmembrantransport foregår hovedsaklig via vannfylte kanaler eller bærerproteiner. Kanaltransport karakteriseres av at transporten foregår via diffusjon i vann og gir meget høy transporthastighet. Kanalene er enten åpne eller lukket, de har varierende åpningstid og åpningssannsynlighet, og de skiller mellom molekylene/ionene som skal transporteres ved å skille på størrelse/polaritet. Eksempel: K + -lekkasjekanaler. Bærerbasert transport foregår via binding til bærerproteiner som spesifikt binder og translokerer molekylene til den motsatte siden av membranen. Eksempel: insulinfølsomme glukosetransportører. I begge tilfeller anvendes vanligvis en konsentrasjonsgradient som drivkraft for det transporterte molekyl, i tilfelle ionetransport anvendes en elektrokjemisk gradient som direkte drivkraft for transporten. Ingen av disse mekanismer er direkte energikrevende, og ingen kan transportere mot gradienter. ATP-avhengig transmembrantransport foregår enten direkte via ATP-avhengige pumper eller indirekte ved at bærerbasert transport er koplet til en ATP-avhengig pumpe, der denne oftest representerer ionetransport, som Na + eller H +. I begge tilfeller blir transportens effektivitet begrenset av pumpens ATP-forbruk, mens spesifisiteten i den indirekte mekanismen blir bestemt av bærerproteinets egenskaper (som kan gi spesifisitet for eksempel til eksempel en metabolitt som glukose, eller en nevrotransmitter som glutamat). 44. Under normale forhold vil Na + /K + -pumpen (Na + /K + -ATPasen) forbruke mye av cellens ATP. Hvorfor er denne pumpen så viktig for normal cellefunksjon? Svar: Na + /K + -pumpen er viktig for opprettholdelse av membranpotensialet og det negativt ladete miljø på membranens innside, den holder konsentrasjonen av Na + -ioner i cytosol lav, og den motvirker det kontinuerlige tapet av K + -ioner som ellers foregår via K + - lekkasjekanaler). Konsekvens ved mangel på denne pumpen: cellene svulmer opp, membranpotensialet faller mot null, in extremis celledød. Svikt i PDH-kompleksets aktivitet kan gi nervecelleskader som fører til ulike typer av sentralt utløst ataksi (ukontrollerbare bevegelser). Generelt styres muskelaktivitet og bevegelse av motoriske nerveceller (motonevroner) som reguleres av eksitatoriske glutamaterge fibre og av inhibitoriske GABAerge og glysinerge fibre. 45. Beskriv mekanismene som glutamat og GABA generelt anvender for å fremkalle endringer i postsynaptiske cellers membranpotensiale, og navngi de to hovedtyper av postsynaptiske responser. Svar: Både glutamat og GABA-reseptorene er ligand-regulerte ionekanaler, dvs. at binding av ligandene til sine reseptorer vil åpne ionekanalene og tillate at de spesifikke ionene kan strømme gjennom membranene, drevet av sine elektrokjemiske drivkrefter. Den viktigste glutamatreseptoren er i hovedsak en natriumkanal, og membranpotensialet går derfor mot natriumionets Nernst-potensial, dvs. mot overskudd av positiv ladning på innsiden av membranen. Denne respons kalles et eksitatorisk postsynaptisk potensial (EPSP). Den viktigste GABA-reseptoren er en kloridkanal, og Side10 av 15

membranpotensialet går derfor mot kloridionets Nernst-potensial, dvs. mot en svak økning av negativ ladning på innsiden av membranen. Denne respons kalles et inhibitorisk postsynaptisk potensial (IPSP). (Beskrivelse av Nernsts ligning er ikke nødvendig for å bestå, men regnes som et pluss.) 46. Beskriv hvordan nerveceller avgjør om den totale innkommende informasjon fra både eksitatoriske og inhibitoriske synapser skal resultere i at et aksjonspotensial blir utløst, og diskuter mulige mekanismer som kan endre sannsynligheten for at dette skjer.. Svar: Det forventes kunnskap om at nerveceller utløser sine aksjonspotensialer i aksonhalsen (initialsegmentet, axonal hillock ). I dette området finnes en høy tetthet av spenningsregulerte ionekanaler, og hver gang membranpotensialet i dette lokale området overstiger terskelverdien til de spenningsregulerte natriumkanalene blir aksjonspotensialet utløst. En mer detaljert besvarelse bør beskrive at alle endringer i membranpotensialet som ved passiv ledning kommer inn i denne delen av cellen blir elektrisk summert med det foreliggende membranpotensialet. Resultatet fører rent molekylært til at den positivt ladete spenningssensoren (S4-transmembrandomenet i de spenningsregulerte ionekanalene) enten vil bli delvis skjøvet ut av cellen (dette skjer ved intracellular depolarisering, og øker sjansen for at kanalen åpner seg) eller at den delvis vil bli dratt inn i cytoplasma (dette skjer ved intracellular hyperpolarisering og senker sjansen for at kanalen åpner seg). Endring av sannsynlighet for at disse ting kan skje vil f.o.f. oppnåes ved at størrelsen og varighetene på EPSPene eller IPSPene blir variert (terskelverdien er vanligvis konstant). Dette kan igjen være et resultat av variasjoner i synaptisk aktivitet, fremkalt enten av øket presynaptisk transmitterfrisetning eller av øket mengde postsynaptisk strøm av ioner gjennom de ligandregulerte reseptorkanalene. Det siste kan oppnåes enten ved at reseptorkanalene binder mer transmitter over en lengre tidsperiode, at de øker sin ionepermeabilitet (mulig å oppnå ved posttranslasjonelle modifikasjoner av kanalproteinet, for eksempel fosforylering) eller at flere reseptorkanaler blir tilgjengelig i synapsen. Det siste er nevnt under forelesning som hovedårsak til langtidspotensiering slik den foregår i hjernesynapser). De kolinerge motonevronenes efferente aksoner innerverer skjelettmuskelfibre i strukturer som kalles motoriske endeplater. 47. Beskriv hovedtrekkene i de molekylære og elektriske mekanismer som i tverrstripet muskulatur overfører responser fra den motoriske endeplaten til frisetning av Ca 2+ -ioner fra sarkoplasmatisk retikulum. Interaksjoner mellom aktin og myosin skal ikke beskrives. Svar: Endeplatens respons på nevrotransmitteren ACh er et lokalt EPSP (i muskel benevnt endeplatepotensialet) som depolariserer den lokale muskelmembranen til langt over terskelverdien for de lokale spenningsregulerte natriumkanaler. Siden muskelcellenes membran har spenningsregulerte natriumkanaler spredt ut over hele overflaten blir det utløst et aksjonspotensial, og dette sprer seg utover hele membranen og inn i T-rørene. I disse rørene fremkaller aksjonspotensialet en kraftig konformasjonsendring av et spenningsfølsomt protein i T-rørenes membran som, via en sløyfe i cytosol, har direkte protein-protein kontakt med en Ca 2+ -kanal i membranen til Side11 av 15

det sarkoplasmatiske retikulum (SR). Interaksjonen mellom disse proteiner fører til at denne SR-kanalen åpnes, og Ca 2+ strømmer fra det store intracellulære Ca 2+ -lageret i SR inn i cytosol. C.(14) PDH-komplekset katalyserer følgende reaksjon: Pyruvat + NAD + + CoA-SH Acetyl-CoA + NADH H + + CO 2 48. Forklar hvorfor manglende PDH aktivitet ofte gir laktat acidose (unormalt høy konsentrasjon av laktat i blodet), samt unormalt høye blodkonsentrasjoner av alanin og pyruvat. Svar: Manglende PDH aktivitet innebærer at oksidasjonen av pyruvat til acetyl- CoA ikke foregår så raskt som energibehovet tilsier. Glykolysen fungerer som normalt, og pyruvat vil følgelig akkumulere i kroppens celler. Dette har som konsekvens at metabolismen søker andre ruter for eliminering av pyruvat; reduksjon til lakatat (ved LDH) eller ved transaminering til Ala (ved alanine aminotransferasen), laktat og alanin akkumulerer i slike mengder i vevene at disse molekylene også transporteres ut av cellene og akkumulerer i blodbanen. Det blir likevel intracellulært overskudd av pyruvat, noe som gir akkumulering av også pyruvat i blod. Tiamin (vitamin B 1 ) anvendes til biosyntese av tiaminpyrofosfat, et koenzym som brukes av pyruvat dekarboksylasen i PDH-komplekset. 49. Noen individer med nedsatt PDH-aktivitet kan behandles med store doser av tiamin (vitamin B 1 ), selv om det ikke foreligger noen B-vitamin mangel. Hvorfor er dette en effektiv behandling bare hos noen individer med nedsatt PDHaktivitet? Svar: Dersom det foreligger en mutasjon i bindingssetet for tiaminpyrofosfat kan dette gjøre at enzymet får nedsatt affinitet (høyere Km) for tiaminpyrofosfat, og dermed nedsatt katalytisk aktivitet. Tilførsel av tiamin vil øke vevskonsentrasjonen av tiaminpyrofosfat. Det kompenserer for den høyere Km-verdien, og gir økt enzymatisk aktivitet, men bare i disse tilfellene. Noen studenter kan tenkes å påpeke at syntesen av tiaminpyrofosfat fra tiamin er også enzymatisk. En defekt i dette enzymet vil i så fall affisere alle enzymer som bruker tiaminpyrofosfat som koenzym. 50. Forklar hvorfor nedsatt PDH-aktivitet oftest medfører en mer alvorlig svikt i energiforsyningen for sentralnervesystemet enn den gjør for leveren? Svar: Sentralnervesystemet er absolutt avhengig av glykolyse/sitronsyklus for energi, og er derfor også absolutt avhengig av normal PDH aktivitet dersom energiforsyningen skal bli normal. Leveren kan skaffe acetyl-coa til sitronsyklus fra andre kilder, for eks. ß oksidasjon av fettsyrer. Leveren er derfor ikkei like stor grad kritisk avhengig av glykolysen som kilde for acetyl-coa for sitronsyresyklus og ATP. 51. Skisser den kjemo-osmotiske mekanismen for oksidativ fosforylering, og forklar effekten av en frikopler (for eks. 2,4-dinitrofenol). Bruk gjerne en tegning. Elektrontransportkjeden skal ikke beskrives. Svar: Reoksidasjon av NADH H + (Kompleks I) og FADH 2 (Kompleks II) skaper spontan elektronflyt til Kompleks IV og molekylært O 2 (som reduseres til H 2 O). Energien i elektronflyten brukes til å drive protonpumper i Kompleks I, III of IV. Side12 av 15

Pumpene flytter H + fra mitokondriell matriks til intermembran rom. Det oppstår derfor proton (og elektrokjemisk) gradient over den indre mitokondrielle membranen. Denne membranen er bare permeabel for H + gjennom ATPasens protonkanal (Kompleks V). Protonene strømmer tilbake til matriks gjennom kanalen, drevet av gradientenergien. Dette skaper en roterende bevegelse i en av underenhetene i Kompleks 5, og denne kinetiske energien anvendes til å drive fosforylering av ADP+Pi til ATP. (Poenget om om rotasjon forventes ikke). En frikopler, for eks. 2,4-dinitrofenol, er en svak syre, som er dissosiert ved fyiologisk ph. Nær den indre mitokondrielle membranen er det my lavere ph, pga protongradienten over den indre mitokondrielle membranen. Ionisert 2,4-dinitrofenol, er for polar til å passere den indre mitokondrielle membranen, men i protonert tilstand blir molekylet så pass hydrofobt at det diffunderer over den indre mitokondrielle membranen. Følgelig vil 2,4-dinitrofenol protoneres av protoner fra mitokondrienes protongradient, og deretter diffundere over den indre mitokondrielle membranen, for så å dissosiere i den mer alkaliske mitokondrielle matriks. Nettoeffekten er forbruk av protongradienten, med påfølgende stimulering at elektrontransporten gjennom elektrontransportkjeden uten at det skjer fosforylering av ADP til ATP. Derfor frikoblingav elektrontransporten fra ADP fosforylering. Normalt er disse prosessene koblet, dvs. stimulert elektrontransport er koblet til fosforylering av ADP til ATP. D.(10) I mange kreftceller er det glykolysen med dannelse av laktat i cytosol, og ikke oksidasjonen av pyruvat i mitokondriene, som bidrar til det meste av energiproduksjonen. Dette kan skyldes at mitokondriene i kreftcellene har fått endret funksjon. 52. Forklar kort hvordan cytokrom c kan sies å regulere cellens liv og død. Svar: Cytokrom c er en del av elektrontransportkjeden i mitokondriene og er dermed nødvendig for cellens liv ved å bidra til dannelse av ATP. Hvis det blir stor mitokondrieskade, vil mye cytokrom c kunne lekke ut i cytosol slik at ikke lenger elektrontransportkjeden fungerer. ATP vil da ikke genereres, og cellen dør ved nekrose. Ved endringer i mitokondriemembranen som følge av et apoptose-signal vil kun små mengder cytokrom c lekke ut i cytosol. Det vil fremdeles være nok cytokrom c til å drive elektrontransportkjeden, og ATP vil fremdeles genereres. Imidlertid vil cytokrom c i nærvær av ATP i cytosol aktivere caspasene, og cellen dør ved apoptose. 53. Forklar hvordan mitokondriene kan bidra til apoptose i en normal celle, og beskriv hva slags endringer i nivå av bestemte mitokondrieproteiner som ofte ses i kreftceller. Svar: Et apoptose-signal som skyldes mangel på overlevelsesfaktorer eller endringer i intracellulære forhold i cellen (eks. DNA skade, ROS, høye nivåer av Ca++), vil kunne føre til mitokondrie-avhengig apoptose. Det innebærer blant annet endringer i mitokondriemembranpotensialet og forskyvning i balansen mellom de pro- og antiapoptotiske medlemmene av Bcl-2 familien, slik at Bax danner porer i ytre mitokondriemembran. Dermed vil cytokrom c lekke ut av mitokondriene og (i nærvær av Apaf-1 og ATP) aktivere caspase-kaskadene i cytosol. De aktiverte caspasene vil i sin tur spalte viktige proteiner i cellen, slik at cellen dør. I en kreftcelle vil det gjerne være redusert apoptose som følge av at for eksempel nivået av proto-onkogenet Bcl-2 er økt, eller at nivået av tumorsuppressor-genet Bax er redusert. Begge genproduktene finner vi lokalisert i ytre mitokondrie-membran. Side13 av 15

54. Hvilke(t) av genene for henholdsvis p53, prb eller MLH1/MSH2 (DNA mismatch reparasjonsproteiner) kan direkte gi en celle en mutatorfenotype hvis det/de muteres? Begrunn svaret. Svar: At cellen får en mutatorfenotype vil si at mutasjonsfrekvensen i den enkelte cellen øker som resultat av mutasjoner i gener som koder for proteiner direkte involvert i DNA reparasjon og/eller kromosomsegregering. Eksempler på slike gener vil være DNA mismatch reparasjonsgenene MLH1 og MSH2. Mutasjoner i genene for p53 eller prb vil ikke gi en mutatorfenotype, da slike mutasjoner bare indirekte (ved å øke celledeling og overlevelse) vil føre til økt sjanse for nye mutasjoner. Studenter som likevel argumenter for at mutasjoner i p53 vil gi en mutatorfenotype vil kunne få kreditt for dette, hvis de begrunner det med at p53 også kan transkribere gener som er involvert i DNA reparasjon, og dermed at tap av p53 kan redusere transkripsjon av disse DNA reparasjonsgenene. Hvis de begrunner det med at tap av p53 fører til økt celledeling og overlevelse og dermed indirekte gir økt mutasjonshastighet, kan det ikke regnes som et riktig svar. E.(19) Genene for de ulike subenhetene av PDH finnes i det nukleære genomet, mens enzymkomplekset utøver sin funksjon i mitokondriene. 55. Mitokondrier formerer seg ved egen deling. Gjør kort rede for hvordan "gamle" mitokondrier brytes ned av cellen. Svar: Mitokondrier brytes ned ved autofagi. Membrankledte store blærer omslutter mitokondriet og danner et autofagosom. Dette autofagosomet fusjonerer deretter med et lysosom, og de ulike sure hydrolaser i lysosomet bryter mitokondriet ned. Mekanismer for utvelgelse av mitokondrier som skal brytes ned er ikke forelest. 56. Vedlegg 1 viser bilder av tre ulike lysmikroskopiske preparater, farget med H+E. Hvilke vevstyper vises på bildene A, B og C? Svar: A: Enlaget sylinderepitel (øverst), løst bindevev (nederst). B: Enlaget, flerradet epitel med cilier (også kalt psevdolagdelt ciliert epitel). Også her er det løst bindevev under epitellaget. C: Hyalin brusk Celle-celle og celle-matriks interaksjoner er viktige prosesser under fosterutvikling. 57. Normal fosterutvikling er avhengig av ulike celle-celle og celle-matriks adhesjoner. Angi minst 3 ulike hovedgrupper av adhesjonsmolekyler og beskriv kort deres funksjoner. Svar: 1. Cadheriner. Heterogen gruppe. Formidler generelt celle-celle adhesjon i homofile bindinger. Vesentlige ved oppbygging og vedlikehold av vev. 2. Integriner. Stor og heterogen gruppe. Formidler både celle-celle og celle matriks interaksjoner i heterofile bindinger. (Fint, men ikke nødvendig, om studentene har med at både migrerende og stabile celler anvender integriner). 3. Immunglobulin familien. Heterogen gruppe. Involvert i celle-celle adhesjoner både i homofile og heterofile bindinger. 4. Selektiner. Flere varianter. Karbohydratbindende adhesjonsmolekyler i heterofile adhesjoner. (Ikke krav til bestått: Fint om studentene også nevner at flere av disse molekylene kan ansamles i store mengder i cellemembranen og danne mer sterke og stabile kontakter Side14 av 15

(f.eks desmosomer). Fint også dersom de skriver at molekylene også er viktige ved signaltransduksjon). 58. Beskriv kort struktur og funksjoner av basalmembranen. Svar:Basalmembran er en tynn overgangssone mellom organer/vev og omgivelsene. Hovedkomponenter er kollagen IV, laminin, proteoglykaner og (entaktin) nidogen. Hovedfunksjoner: feste til ECM, celle- og molekylfilter, bidrar til å forme vevet Cellevandring bidrar til morfogenesen og er med på å etablere celle-celleinteraksjoner som er nødvendig for riktig differensiering. 59. Forklar de viktigste mekanismene som gjør celler i stand til å bevege seg gjennom ekstracellulær matriks. Svar: Celler beveger seg i tre trinn: først endrer cellen form ved å skyte ut en utløper (lamellipodium eller filopodium) i den retningen cellen skal bevege seg. Dette skjer ved polymerising av parallelle aktinfilamenter som skyver plasmamembranen foran seg. (Det forventes ikke her besvart mekanismer for hvordan cellen velger retning for migrasjon). Deretter fester denne utløperen seg til fibre eller andre ekstracellulære strukturer ved fokale kontakter/fokale adhesjoner. Viktigst her er integriner som intracellulært forankres i aktinskjelettet. Det tredje elementet er at cellen forkortes på en slik måte at den dras mot utløperens forankring. Dette krever interaksjon mellom myosin og aktinfilamenter. I virkeligheten foregår disse tre trinnene samtidig. Det forventes ikke navngitt ulike aktinbindende proteiner (utover myosin) eller detaljert beskrivelse av aktinpolymerisering, nukleering og capping 60. Hox-genene er viktige for regionalisering av organer og strukturer under fosterutviklingen. a. Hvilken type protein koder Hox-gener for og hvordan bidrar disse proteinene til regionaliseringsprosessen? b. Vitamin A (retinsyre) er et kjent teratogen. Hva er mekanismen for hvordan vitamin A påvirker Hox-genenes ekspresjon? Svar: Hox-gener koder for overordnede transkripsjonsfaktorer (styrer transkripsjon av en rekke andre transkripsjonsfaktorer). De binder til spesifikke regulatoriske sekvenser og er derfor med på å bestemme hvilke gener som blir skrudd av eller på i forbindelse med celledifferensiering. A-vitamin (retinsyre) er kjent som en regulator av Hoxgenekspresjon, og for mye eller for lite A-vitamin i fosteret forstyrrer Hoxgenekspresjon med teratogene følger. Mekanismen for denne effekten er at retinsyre binder til kjernereseptorer (ligand-regulerte transkripsjonsfaktorer) som binder til spesifikke regulatoriske sekvenser viktige for regulering av Hox-genene. Side15 av 15