Axial 50 EC pinoksaden

Vurdering av plantevernmidlet Axial 50 EC pinoksaden vedrørende søknad om godkjenning Mattilsynet, seksjon nasjonale godkjenninger Saksbehandlere: Anne G. Kraggerud, Elisabeth Øya, Siri Nesbakken For Vitenskapskomiteen for mattrygghet, faggruppe 2 Oktober 2009

Axial 50 EC- pinoksaden Side 2 Innholdsfortegnelse 1. Sammendrag 1-1 1.1 Identitet og fysikalsk/kjemiske data 1-1 1.2 Toksiske effekter og skadepotensiale for menneske 1-2 1.3 Dokumentasjonens kvalitet 1-4 2. Status for preparatet 2-1 3. Agronomi 3-1 3.1 Bruk/virkning 3-1 3.2 Behandlingsmåte og dosering 3-1 3.3 Anbefaling fra Bioforsk Plantehelse 3-1 4. Identitet og fysikalsk/kjemiske data (virksomt stoff) 4-1 5. Toksisk effekt og skadepotensiale for menneske 5-1 5.1 Pinoksaden 5-1 5.1.1 Toksikokinetikk 5-1 5.1.2 Akutt toksisitet 5-2 5.1.3 Irritasjon/allergi 5-3 5.1.4 Gentoksisitet 5-3 5.1.5 Subkronisk toksisitet 5-4 5.1.6 Kronisk toksisitet og kreft 5-9 5.1.7 Reproduksjonstoksisitet 5-14 5.1.8 Teratogenese 5-17 5.1.9 Nevrotoksisitet 5-22 5.1.10 Spesielle forsøk 5-22 5.1.11 Humane data 5-23 5.1.12 Klassifisering og merking 5-23 5.1.13 Forslag til nasjonale normer 5-23 5.2 Metabolitter 5-23 5.3 Formuleringsstoffer 5-25 5.4 Preparat 5-25 5.4.1 Akutt toksisitet 5-26 5.4.2 Irritasjon/allergi 5-26 5.4.3 klassifisering og merking 5-26 5.4.4 Dermal absorpsjon 5-27 5.5 Eksponering ved bruk og arbeid med sprøytet kultur 5-28 6. Rester i produkter til mat eller fôr 6-1 7. Skjebne i miljøet og økotoksiske effekter 7-1 8. Økotoksikologi 8-1 9. Dokumentasjonens kvalitet 9-1 Referanser 9-1

Side 1-1 1. Sammendrag Axial 50 EC er et nytt preparat med nytt virksomt stoff, pinoksaden. Preparatet søkes godkjent mot floghavre og raigras brukt som fangvekst i bygg, vår- og høsthvete, rug og rughvete. Normert arealdose er 90 ml per dekar (tilsvarer 4,5 g virksomt stoff per dekar). Pinoksaden tilhører den kjemiske gruppen fenylpyrazolin som er ACCase-hemmer. Resistens for pinoksaden er ikke kjent, men det bør tas de vanlige forhåndsreglene mot resistensutvikling. Axial 50 EC er et spesialmiddel mot floghavre i korn. Preparatet påføres tidlig om våren med åkersprøyte på 3-5 bladstadiet til kornet. 1.1 Identitet og fysikalsk/kjemiske data Preparatnavn Axial 50 EC Virksomt stoff Formulering pinoksaden emulsjonskonsentrat Konsentrasjon av virksomt stoff 50 g/liter UPAC-navn 2,2-dimethyl-propionic acid 8-(2,6-diethyl-4-methyl-phenyl)-9-oxo-1,2,4,5-tetrahydro-9Hpyrazolo[1,2-d][1,4,5]oxadiazepin-7-yl ester CAS nummer 243973-20-8 Strukturformel Molekylvekt 400,5 Vannløselighet Høy 200 mg/l (25 C) Damptrykk Lavt 2,0 x 10-7 Pa (20 C) 4,6 x 10-7 Pa (25 C) Henrys kons. Lav 9,2 x 10-7 Pa m 3 /mol (25 C) log Pow Høy 3,2 (25 C)

Side 1-2 1.2 Toksiske effekter og skadepotensiale for menneske Pinoksaden Toksikokinetikk Absorpsjon: Absorpsjonen av pinoksaden var rask og høy. Over 90 % av stoffet ble absorbert fra mage/tarmkanalen i rotter og absorpsjonsgraden så ut til å være lik for lav og høy dose. Distribusjon: Det ble sett høyest innhold av rester i blod, lever og nyrer (34 og 18 ppm pinoksaden ekvivalenter i hhv lever og nyrer). Minst innhold av rester ble funnet i hjerne, bein, testikler, tymus, fett, eggstokker og livmor. Ingen forskjell mellom kjønnene ble funnet. Halveringstidene ble funnet å være 2-5 timer for lav dose og 5-7 timer for høy dose. Utskillelse: Ekskresjonen var rask og for det meste via urin (ca 65 % via urin i lavdosegruppene og 66-79 % via urin i høydosegruppene). 24-29 % av stoffet ble skilt ut via avføring i lavdosegruppene mens ca 26 % ble skilt ut via avføring i høydosegruppene. Metabolisme: 35 metabolitter ble funnet, hvor M2 (dannet ved hydrolysering) var den viktigste (60-90 %) Det ble ikke funnet igjen opprinnelig stoff i urin, galle eller avføring. Akutt toksisitet Pinoksaden er ikke farlig ved svelging eller hudkontakt, derimot er det helseskadelig ved innånding (Innfrir kravene til merking med Xn; R20). Irritasjon/allergi Pinoksaden ikke hudirriterende eller allergifremkallende ved hudkontakt, men det er vist øyeirriterende. (Innfrir kravene til merking med Xi; R36). Gentoksisitet Pinoksaden har gitt klastogen effekt i kinesisk hamster V79 celler in vitro, men da det ikke har vist lignende effekt in vivo er dataene ikke tilstrekkelige til å klassifisere stoffet som gentoksisk. Det hadde vært ønskelig om administrasjonen var gitt intraperitonealt for å maksimere opptaket, siden det er usikkert om pinoksaden i denne mikrokjernetesten har nådd beinmargen. Pinoksaden var ikke positiv verken i mikrokjernetesten eller UDS testen. Siden ingen av in vivo studiene i somatiske celler eksponert for pinoksaden (NOA 407855) gav positiv respons, er det unødvendig å gjøre in vivo studier i kjønnsceller. Det er ingen tegn til gentoksisk aktivitet av pinoksaden (NOA 407855) in vivo. Subkronisk/kronisk toksisitet I subkroniske forsøk i rotte er kritiske effekter tydelige histopatologiske skader i nyrene i tillegg til økt levervekt ved høye dosenivåer. Nyre og lever ble begge ansett som målorgan. I subkroniske forsøk med hund er kritiske effekter histopatologiske endringer i lever og endringer i klinisk-kjemiske parametre. Dette indikerer at lever er målorgan i hund. Mest følsomt organ varierer i hund og rotte og det kan tyde på ulik metabolisme av pinoksaden. I kroniske forsøk i rotte fører stoffet til økt dødelighet, redusert kroppsvekt og histopatologiske forandringer i nyrene. Målorganet er nyrene, hvilket baseres på histopatologiske forandringer relatert til utvidelse av tubuli og kronisk progressiv nefropati, samt forandringer i vanninntak og urinvolum. I kreftstudiet i mus var redusert kroppsvekt og økt dødelighet kritiske effekter. I forsøket der pinoksaden ble tilført med sonde var lunger hovedmålorgan. Dette hadde mest sannsynlig sammenheng med direkte sprøyting av teststoffet i lungene grunnet eksponeringsfeil. Kreftfremkallende potensial Det var en økning i antall tilfeller av leiomyosarcoma i magesekken hos hannrotter. Dette er en sjelden krefttype, og det er usikkert om denne økningen er relatert til behandlingen med pinoksaden. Det var en økning i bronkioalveolære svulster i mus 40 mg/kg kv/dag i forsøket der pinoksaden ble tilført med sonde. Funnene kan skyldes direkte kontakt med pinoksaden, men er mer sannsynlig en sekundær effekt av andre forandringer og skader på lungene. Reproduksjonstoksisitet og teratogenese Reproduksjonstoksisitet: Nyretoksisitet (økt organvekt, histopatologi (kronisk nefropati, tubulær atrofi, utvidelse av nyrebekken og kortikomedulær mineralisering, glykogenavsetning i lever og hemosiderose) og økt vanninntak og signifikant/skadelig økning i levervekt ble observert etter behandling med pinoksaden. Pinoksaden anses ikke reprotoksisk ut fra dette studiet.

Side 1-3 Teratogenese: Pinoksaden medførte mortoksisitet i form av redusert kroppsvekt, fôrinntak og ulike kliniske tegn i rotter dosert med 300 og 800 mg/kg kv/dag. Høydosen gav samtidig fostertoksisitet som bestod av små utviklingsforsinkelser. Disse ble indikert av redusert fostervekt og noe ufullstendig i forbeining av fosterskjelettet. Forandringene observert ved 300 mg/kg kv/dag ble begrenset til to skjelettvariasjoner. Tegn på fostertoksisitet ble sett ved tilstedeværelse av mortoksisitet. Pinoksaden medførte mortoksisitet i form av redusert vektøkning og vekttap i kaniner dosert med 30 og 100 mg/kg kv/dag. Fostertoksiske effekter inkluderte fosterdødelighet og resorpsjoner ved 100 mg/kg kv/dag og misdannelser av diafragma ved 30 og 100 mg/kg kv/dag. Basert på misdannelser, fosterdødelighet og resorpsjoner vurderes pinoksaden som mulig fosterskadelig. Nevrotoksisitet: Pinoksaden ansees ikke som nevrotoksisk. Dosevalget ansees som godt nok til å skille mellom potensielle nevrotoksiske skader og potensielle sekundære nevrotoksiske skader. Humane data Ikke rapportert Metabolitter Karakterisering av iboende egenskaper av metabolitter i grunnvann er mangelfull og klassifisering av M3 som giftig (kreft, kronisk giftighet eller repro) kan ikke utelukkes. En eventuell klassifisering av denne metabolitten som giftig vil kunne føre at virksomt stoff ikke godkjennes. Axial 50 EC Formuleringsstoffer Axial 50 EC inneholder over 10 % aromatiske hydrokarboner. Akutt giftighet, irritasjon, allergi Axial er ikke farlig ved innånding, svelging eller hudkontakt. Axial er hudirriterende for kanin og allergifremkallende ved hudkontakt for marsvin. Dermal absorpsjon Basert på resultater fra oven nevnte forsøk beregnes dermal absorpsjon for Axial 100 EC gjennom menneskehud in vivo som følger: Konsentrert preparat: 6,5 % Fortynnet løsning: 4 % Eksponering ved bruk og arbeid med sprøytet kultur Eksponering ved bruk: Beregnet eksponering for Axial 50 EC overskrider ikke foreslått AOEL for pinoksaden selv uten bruk av verneutstyr. Bruk av verneutstyr vil imidlertid kreves på grunn av merking av prepratet som irriterende. Eksponering ved opphold og/eller arbeid med sprøytet kultur: AOEL overskrides heller ikke ved opphold og/eller arbeid med sprøytet kultur selv uten bruk av verneutstyr. Bruk av hansker vil imidlertid kreves ved arbeid med sprøytet kultur da prepratet er allergifremkallende ved hudkontakt 1.3 Dokumentasjonens kvalitet Den foreliggende dokumentasjon er tilstrekkelig til å foreta en vurdering av virksomt stoff og preparat.

Axial 50 EC- pinoksaden Side 2-1 Saksnummer 07/7168 2. Status for preparatet Virksomt stoff Preparatnavn Tilvirker Importør Konsentrasjon av virksomt stoff Formulering Pakningsstørrelse Type preparat Type sak Pinoksaden Axial 50 EC Syngenta Crop Protection AG; Basel Syngenta Crop Protection AS 50 g/liter Emulsjonskonsentrat 1, 3 og 5 liter Ugrasmiddel, spesialmiddel mot floghavre Nytt preparat inneholdende nytt virksomt stoff Søknadsdato 16.2.2007 Forrige godkjenningsperiode utløp(er) -/- Sist vurdert -/- Krav -/- Omsetning -/- Status i EU Pinoksaden er nytt virksomt stoff i EU og er ikke behandlet ennå (pending). Pinoksaden er per dags dato ikke godkjent i Sverige eller Danmark.

Aksial 50 EC - pinoksaden Side 3-1 3. Agronomi Teksten i dette kapitlet er hentet fra Bioforsk Plantehelse sin agronomiske vurdering samt etikettforslag fra importør. Søkt bruksområde Virkeområde Virkemåte Virkemekanisme 3.1 Bruk/virkning Vår- og høsthvete, bygg, rug og rughvete. Floghavre og raigras brukt som fangvekst. I dokumentasjonen fra tilvirker opplyses at Axial 50 EC virker gjennom bladopptak og har systemisk virkning i planten. Pinoksaden tilhører den kjemiske gruppen fenylpyrazolin (ACCase-hemmer). Pinoksaden inhiberer Acetyl Co-A karboksylase (ACCase), et viktig enzym i fettsyresyntesen. Nytteorganismer/ Integrert plantevern Ikke relevant. Resistens Axial 50 EC er en ACCase-hemmer og utvikling av resistens for denne virkemekanismen er meget vanlig i grasarter. Dette gjelder særlig åkerkvein og åkerreverumpe som ikke er ugras hos oss i dag. Faren for resistensutvikling hos floghavre er antatt for å være mindre enn hos de nevnte artene. Hos biotyper av floghavre med nedsatt følsomhet mot andre ACCase-hemmere, fant en bare svak nedgang i følsomhet i noen få tilfeller. De aller fleste ACCase-hemmer tolerante biotyper var meget følsomme for Axial 50 EC. Produsenten angir resistensrisikoen for å være moderat, bl.a. fordi floghave produserer relativt få frø og har høg grad av selvpollinering. Likevel er risikoen bedømt av tilvirker til å være for høy til å være akseptabel uten restriksjoner i bruken. I Norge har vi relativt få tilfeller av store, tette bestand av floghavre og risikoen for resistensutvikling vil være lavere enn i områder med store populasjoner. Vi mener at det ikke er grunn for å føre opp vanlige resistensrisikosetninger på etiketten da det per i dag ikke er gode resistensbrytere på markedet. Likevel vil vi tilrå at det varsles om resistensfare på etiketten. 3.2 Behandlingsmåte og dosering Mot floghavre brukes 60-90 ml per dekar i 20-30 liter vann. Mot raigras etter bruk som fangvekst brukes 90-100 ml per dekar i 15-30 liter vann. Behandlingstidspunktet er om våren når vårkornet har 3-5 blad (BBCH 13-29) og for høstkorn om våren når korn og ugras er i god vekst. NAD Spredeutstyr Med bakgrunn i preparatets dosering i korn fastsettes normert arealdose (NAD) til 90 ml per dekar. Dette tilsvarer 4,5 g v.s./daa. Behandling foretas med åkersprøyte. 3.3 Anbefaling fra Bioforsk Plantehelse Axial 50 EC er et spesial preparat mot floghavre i korn, men virker også mot raigras. Floghavre er et konkurransekraftig og avlingsnedsettende ugras i korn og etablerte bestand er svært vanskelig å bekjempe uten kjemiske middel. Det er bare er et floghavremiddel for bruk i korn på det norske markedet per i dag, Puma Extra. Axial 50

Aksial 50 EC - pinoksaden Side 3-2 EC er et bedre middel enn Puma Extra. Selv om disse midlene er fra ulike middelgrupper er de begge ACCase-hemmere. Som resistensbrytere for hverandre har de derfor trolig begrenset verdi selv om klare tilfeller av kryssresistens ikke er rapportert. Bioforsk Plantehelse anbefaler godkjenning av Axial 50 EC pinoksaden.

Side 4-1 4. Identitet og fysikalsk/kjemiske data (virksomt stoff) IUPAC-navn 2,2-dimethyl-propionic acid 8-(2,6-diethyl-4-methyl-phenyl)-9-oxo-1,2,4,5-tetrahydro-9Hpyrazolo[1,2-d][1,4,5]oxadiazepin-7-yl ester CAS nummer 243973-20-8 Strukturformel Molekylvekt 400,5 Vannløselighet Høy 200 mg/l (25 C) Damptrykk Lavt 2,0 x 10-7 Pa (20 C) 4,6 x 10-7 Pa (25 C) Henrys kons. Lav 9,2 x 10-7 Pa m 3 /mol (25 C) log Pow Høy 3,2 (25 C)

Side 5-1 5. Toksisk effekt og skadepotensiale for menneske Vurderingen er basert på EU monografi fra 2005 og dokumentasjon fra tilvirker (Syngenta Crop Protection AG). 5.1 Pinoksaden 5.1.1 Toksikokinetikk Rotte, enkel dosering. Høy og lav dose. 2 doseringsgrupper med 4 rotter/kjønn/gruppe, i tillegg 2 doseringsgrupper med 5 hannrotter i hver gruppe (gallekanulerte)- 2 dosenivåer ble brukt; 0,5 mg/kg kv og 300 mg/kg kv Resultater: For de to ikke-gallekanulert gruppene ble omlag 66-79 % skilt ut via urinen, burvask og funnet igjen i vevene. For de gallekanulerte dyrene fant man at absorpsjonen var over 90 % basert på at under 10 % av dosen ble funnet igjen i avføring. Det så ut til at absorpsjonen var uavhengig av kjønn og dose. Rester i vev var under 0,1 % i alle grupper 7 dager etter dosering. For rottene som hadde fått lav dose økte innholdet av pinoksaden i blodet raskt hos både hunner og hanner. Maksimum gjennomsnittlig konsentrasjon i blod (0,15-0,17 ppm pinoksaden ekvivalenter) ble nådd innen 1 time etter dosering. Deretter sank konsentrasjonen raskt ned til limit of determination 8 og 24 timer etter dosering (for hhv hanner og hunner). Halveringstiden (eliminasjon) var 1 time til å begynne med og beregnes å øke til 6 timer på slutten av eliminasjonsfasen (lav dose) dersom man forutsetter 1. ordens kinetikk og bifasisk eliminasjon. For dyrene som hadde fått høy dose økte også konsentrasjonen av virksomt stoff i blodet raskt hos begge kjønn. Maksimum konsentrasjon (15-25 ppm) ble nådd mellom 0,25 og 12 timer etter dosering. Konsentrasjonen av v.s. i blod gikk ned til under LOQ etter 48 og 72 timer for hhv hanner og hunner. Halveringstiden var 1 time for den første eliminasjonsfasen og 6-7 timer i den andre fasen. Det ble sett en ikke-lineær økning i AUC (se tabell B6.2. s 88 i vedlegg T1), siden forholdet mellom AUC for høy og lav dose var mellom 1100-1500 mens dosen økte med en faktor på 600. Dette kan skyldes at stoffet ble absorbert og skilt ut veldig raskt i lavdosegruppene. Ved å sammenlikne AUC ser man at absorpsjonen er ganske lik for høy dose og lav dose (enkel dose) (se figur B.6.1. s 87 i vedlegg T1). Det kan tyde på at det var noe enterohepatisk resirkulering i høydosen. For rotter som hadde fått høy dose var halveringstiden i området 6-7 timer. Det ble sett rask ekskresjon av pinoksaden og mer enn 90 % av gjenfunnet dose ble skilt ut via urin og avføring innen 72 timer etter dosering. 7 dager etter dosering var utskillelsen omtrent fullstendig. Det meste av tilført pinoksaden ble skilt ut via urin(59-78 %) mens ca 25 % ble skilt ut via avføring (ikke gallekanulerte rotter) (se tabell B6.3 s 89 i vedlegg T1). Det så ikke ut til at utskillelsen ble påvirket av kjønn eller dose. Rester av pinoksaden var nærme grensen (over, ved eller under) for målbarhet for alle vev, begge dosenivå. Høyest nivå ble funnet i lever og nyre og var på 0,05-0,07 ppm (høy dose) (Mewes, 2000). Rotte, enkel og gjentatt dosering. Høy og lav dose. 4 doseringsgrupper med 12 rotter /gruppe/enkel dosering. I 2 av gruppene var det hannrotter (hhv lav og høy dose) og i de andre 2 gruppene var det hunnrotter (lav og høy dose). I tillegg var det en gruppe med 16 hunnrotter som fikk gjentatt dosering med lav dose i 14 dager. Lav dose var på 0,5 mg pinoksaden/kg mens høy dose var på 300 mg pinoksaden/kg. Oral dosering. Pinoksaden ble skilt ut med halveringstider på ca 7 timer (uavhengig av kjønn og dose) etter enkel dosering. Halveringstiden var generelt 2-3 timer lengre på høydosenivå. Restnivået i de fleste organer og vev etter gjentatt dosering var for det meste under LOQ, men var over for lever og nyre og så vidt over grensen for hjerte, lunge og muskler (se tabell B.6.5 og B.6.6. s 92 i vedlegg T1). Det ble sett omtrent fullstendig utskillelse av pinoksaden. Det meste av stoffet ble skilt ut via

Rotte, gjentatt dosering. Høy dose. Side 5-2 urinen innen 3 dager etter den siste dosen (dag 14). Det ble ikke sett noen tegn til akkumulering i de ulike vev (Mewes 2001). 16 hunnrotter mottok orale doser på 300 mg v.s. i 14 dager etter hverandre. Stoffet ble raskt og tilnærmet fullstendig absorbert fra mage-tarm kanalen. Konsentrasjonen av v.s. i blodet økte raskt og 2 dager etter dosering ble et platånivå nådd i blodet på ca 2 ppm pinoksaden ekv. (se figur B.6.3. s 97 i vedlegg T1). Etter siste dosering sank blodverdiene raskt og var ned på halvparten av maks konsentrasjon etter 15 timer. Maks konsentrasjon i vev ble nådd etter 7 dager. Høyest restnivå ble sett i lever og nyre (hhv 34 og 18 ppm pinoksaden ekvivalenter) Det ble sett lavere konsentrasjoner i blod, bukspyttkjertel og lunger. 7 dager etter siste dosering var mindre enn 0,01 % av tilført dose igjen i vevet. 94,7 % av tilført dose ble gjenfunnet i som ekskresjonsprodukter og burvask. Pinoksaden (inkludert metabolitter) skilles ut raskt og over 90 % av tilført stoff ble skilt ut innen 24 timer etter siste dosering. Det meste av tilført stoff ble skilt ut via urinen (69 %). Ca 26 % ble skilt ut via avføring. Urinanalyser viste at det var 1 hovedmetabolitt som utgjorde ca 94 % og en mindre metabolitt som utgjorde ca 3 % av alle metabolittene. Andre metabolitter i urinen var under 1 % (se tabell B.6.12 s 100 i vedlegg T1). Metabolitter i avføring hadde sammenliknbar profil (se tabell B.6.13 s 100 i vedlegg T1). Gjentatt dosering påvirket ikke metabolittmønsteret i urin eller avføring sammenliknet med enkel dosering. Det ble ikke sett noen tegn til bioakkumulering av pinoksaden (Hassler, 2003). Rotte, Metabolismeforsøk Prøver fra tidligere studie med samme høye og lave dose ble brukt til å identifisere metabolitter og ulike metabolismeveier. 35 metabolitter ble identifisert (se tabell B6.1.2 s 3 i vedlegg T2, addendum 1). Det ble ikke funnet noe igjen av morstoffet i verken urin, galle eller avføring. Hovedmetabolitten som ble funnet var M2, dannet ved hydrolysering, og denne utgjorde 62-70 % i lavdosegruppen og 77-91 % i høydosegruppen. En annen metabolitt som det ble dannet mye av var M4 (dannet ved hydroksylering), som utgjorde ca 13 % i lavdosegruppen og 7 % i høydosegruppen. De andre 33 metabolittene utgjorde mindre enn 1,2 % av tilført dose. Det ble sett ulike metabolismeveier som involverte bl.a. hydrolyse, hydroksylering og konjugering (se tabell B6.1.2. s 3 i vedlegg T2, addendum 1 til DAR). Metabolismeforsøket viste ingen store forskjeller mellom kjønn eller dosenivå (Rümbeli, 2003). Sammendrag (toksikokinetikk) Absorpsjon: Absorpsjonen av pinoksaden var rask og høy. Over 90 % av stoffet ble absorbert fra mage/tarmkanalen i rotter og absorpsjonsgraden så ut til å være lik for lav og høy dose. Distribusjon: Det ble sett høyest innhold av rester i blod, lever og nyrer (34 og 18 ppm pinoksaden ekvivalenter i hhv lever og nyrer). Minst innhold av rester ble funnet i hjerne, bein, testikler, tymus, fett, eggstokker og livmor. Ingen forskjell mellom kjønnene ble funnet. Halveringstidene ble funnet å være 2-5 timer for lav dose og 5-7 timer for høy dose. Utskillelse: Ekskresjonen var rask og for det meste via urin (ca 65 % via urin i lavdosegruppene og 66-79 % via urin i høydosegruppene). 24-29% av stoffet ble skilt ut via avføring i lavdosegruppene mens ca 26 % ble skilt ut via avføring i høydosegruppene. Metabolisme: 35 metabolitter ble funnet, hvor M2 (dannet ved hydrolysering) var den viktigste (60-90 %) Det ble ikke funnet igjen opprinnelig stoff i urin, galle eller avføring. 5.1.2 Akutt toksisitet Akutt oral LD50 i Hanlbm:WIST rotter er >5000 mg/kg kv (GLP/OECD 401)(Sommer, 2000). En hannrotte ble funnet død 5 dager etter eksponering for 5000 mg/kg kv. Patologiske undersøkelser viste rødlig tynntarm, tykktarm og blindtarm. Noe myk avføring hos to hanner og en hunn, og krummet holdning hos to hanner og to hunner, ble observert samme dag som behandling. Dag 1 etter behandling fremsto alle dyrene som normale.

Side 5-3 Akutt dermal LD50 i Hanlbm:WISTrotter er >2000 mg/kg kv. (GLP/OECD 402) (Sommer, 2001). Eksponering for 2000 mg/kg kv pinoksaden førte til svak reduksjon i kroppsvekt hos tre hunner den første uka etter behandling. Patologiske undersøkelser viste svakt granulert overflate i den høyre nyra hos en hann, og utvidet nyrebekken i en hunn. Inhalasjon Akutt LC50 ved inhalasjon i Hanlbm:WIST rotter er 4,6 mg/l luft (90% konfidensintervall 3,3-20,7 mg/l luft) for hanner og 6,2 mg/l luft for hunner (konfidentsintervall ikke bestemt). For begge kjønn samlet er LD50 5,2 mg/l luft (95% konfidensintervall 4,1-18,0 mg/l luft). (GLP/OECD 403) (Decker et al, 2001). Grupper på fem hanner og fem hunner ble eksponert for tre konsentrasjoner av teststoffet (2,2, 3,8 og 5,5 mg/l luft) gjennom nese. MMAD varierte fra 2,2 (±2,9) 2,7 (±3,0). Ved eksponering for 3,8 mg/l luft ble tre dyr (to hanner og en hunn) funnet døde tre dager etter eksponering. Etter eksponering for 5,5 mg/l døde fem dyr (tre hanner og to hunner). De tre hannene og en hunn ble funnet døde dagen etter eksponering, og den andre hunnen tre dager etter eksponering. Kliniske effekter inkludert tung pust, økt spyttutskillelse og krusete pels i alle eksponeringsgruppene. I høydose og mellomdosegruppene ble det observert nedsatt spontan aktivitet, og rastløshet ble observert i tre av fem dyr ved mellomdosen. Lut holdning ble observert i høy- og lavdosegruppa. Rødt sekret fra nesen ble observert hos en hunn fra lavdosegruppa og oppsvulmet buk ble funnet hos en overlevende hunn eksponert for 3,8 mg/ml luft. Fra dag 7 etter eksponering viste ingen overlevende individer kliniske symptomer. Overlevende fra alle tre doseringsgruppene viste markert midlertidig vektreduksjon. Obduksjonen viste rød misfarging av lungene i to av tre prematurt døde rotter eksponert for 3,8 mg/l og i fire av fem rotter eksponert for 5,5 mg/l, og ufullstendig lungekollaps i en overlevende rotte eksponert for 5,5 mg/l. Sammendrag (akutt toksisitet): Pinoksaden er ikke farlig ved svelging eller hudkontakt, derimot er det helseskadelig ved innånding (Innfrir kravene til merking med Xn; R20). Hudirritasjon Øyeirritasjon Allergi 5.1.3 Irritasjon/allergi Tre New Zealand White-kaniner ble brukt i forsøket. Eksponering i 4 timer. Gjennomsnittlig hudirritasjonsindeks var (24, 48 og 72 timer) 0 for erytem og 0 for ødem OECD 404/GLP/QA. (Arcelin, 2000). Tre New Zealand White-kaniner ble brukt i forsøket. Gjennomsnittlig øyeirritasjonsindeks var 1,0 for uklarheter i hornhinnen, 0,0 for skader i regnbuehinnen, 2,56 for ødem i bindehinnen (Xi; R36) og 1,22 for rødhet i bindehinnen. Alle forsøksdyrene var symptomfrie innen 28 dager etter behandling. OECD 405/GLP/QA. (Arcelin, 2000). Pinoksaden er vist ikke allergifremkallende i en Magnusson og Kligman maksimeringstest i marsvin. Det ble ikke observert noen form for hudreaksjoner. OECD 406/GLP/QA. (Arcelin, 2000). Sammendrag (irritasjon/allergi): Pinoksaden ikke hudirriterende eller allergifremkallende ved hudkontakt, men det er vist øyeirriterende. (Innfrir kravene til merking med Xi; R36). 5.1.4 Gentoksisitet Forsøkene er oppsummert i en tabell: In vitro: Forsøk Testorganisme Doser/ metabolsk aktivator Resultat Referanse/ retningslinje/ GLP

Punktmutasjoner i bakterier Ames/ reversjonstest Punktmutasjoner i pattedyrceller Fremovermutasjonstest Kromosomforstyrrelser in vitro (1) Klastogenisitetstest Kromosomforstyrrelser in vitro (2) DNA reparasjon Forsøk Testorganisme Doser/ metabolsk aktivator UDS test S.typhimurium TA98, TA100, TA102, TA1535,TA1537, E.coli WP2P uvra L5178Y Muse lymfomceller Kinesisk hamster V79 celler Kinesisk hamster V79 celler Rotte hepatocytter, Hanlbm:WIST hannrotter In vivo: DNA skade UDS test *4 Rotte hepatocytter, Alpk:APfSD hannrotter Klastogenisitetstest Kromosomforstyrrelser in vivo Mikrokjernetest *5 Beinmargceller fra NMRI mus 100-5000 μg/skål +/- S9 3 tester: 6,3-100/12,5-150 μg/ml *1 50-400 μg/ml 6,3-100 μg/ml +/- S9 25-125 μg/ml (-S9) 20-80 μg/ml (+S9) 30-100 μg/ml (-S9) 15-60 μg/ml (+S9) 2 tester: 9,38-300 µg/ml 18,75-300 µg/ml Resultat Negativt Side 5-4 Referanse/ retningslinje/ GLP Sokolowski, 2001/ OECD 471/ GLP Negativt Wollny, 2003/ OECD 476/ GLP Positivt *2 Positivt *3 Czich, 2001/ OECD 473/ GLP Schulz, 2002/ OECD 473/ GLP Negativt Schulz, 2001/ OECD 482/GLP 2000 mg/kg kv Negativt Clay, 2002a/ OECD 486/ GLP/QA 500, 1000, 2000 mg/kg kv Negativt Honarvar, 2001/ OECD 474 /GLP/QA *1: grunnet lav cellevekst i negativ- og løsemiddelkontroll i prøver tilsatt S9 ble denne delen av eksperimentet gjentatt. *2: det var klastogen effekt av pinoksaden (NOA407855, 97,2 % renhet) både med og uten S9. Effekten var signifikant fra og med 60 μg/ml med S9, og det var en doserelatert effekt uten S9 fra og med 80 μg/ml. *3: det var klastogen effekt av pinoksaden (NOA407855, 99,5 % renhet) både med og uten S9. Effekten var signifikant fra og med 80 μg/ml uten S9 og 45 μg/ml med S9. Det var også en reduksjon i mitotisk aktivitet. *4: Pinoksaden ble gitt oralt til to grupper med hannrotter. *5:10 ml/kg kv ble administrert oralt via magesonde. Virkningen av pinoksaden (NOA 407855) hadde ingen cytotoksisk effekt i beinmarg. Denne testen er upålitelig, siden det er usikkert om stoffet har nådd beinmargen. Sammendrag og konklusjon (gentoksisitet): Pinoksaden har gitt klastogen effekt i kinesisk hamster V79 celler in vitro, men da det ikke har vist lignende effekt in vivo er dataene ikke tilstrekkelige til å klassifisere stoffet som gentoksisk. Det hadde vært ønskelig om administrasjonen var gitt intraperitonealt for å maksimere opptaket, siden det er usikkert om pinoksaden i denne mikrokjernetesten har nådd beinmargen. Pinoksaden var ikke positiv verken i mikrokjernetesten eller UDS testen. Siden ingen av in vivo studiene i somatiske celler eksponert for pinoksaden (NOA 407855) gav positiv respons, ansås det unødvendig å gjøre in vivo studier i kjønnsceller. Det er ingen tegn til gentoksisk aktivitet av pinoksaden (NOA 407855) in vivo. 5.1.5 Subkronisk toksisitet

Side 5-5 Rotte, 4 uker Oral Supplerende forsøk for å bestemme doser til 90 dagers forsøk. Mottatt dose var 0, 300, 600 og 1000 mg/kg kv/dag til begge kjønn. Tilført daglig med sonde (fortynnet i destillert vann og 0.5% CMC og 0.1% Tween 80) til 5 albino Wistar rotter/kjønn/gruppe (OECD 407/GLP/QA). Avvik fra OECD 407: Ornitin dekarboaylase ble ikke bestemt i de klinisk biokjemiske undersøkelsene, og ingen NOAEL ble fastsatt etter første tolkning av forsøket. Resultater: Én høydosehann ble funnet død på studiedag 11. Dette dyret hadde hatt lut holdning og/eller strittende pels mellom dag 8-11. Fôrinntaket var signifikant redusert i høydosegruppen (begge kjønn) under den første studieuken, og det var en nedgang i fôrutnyttelsen til høydosehanner. Begge kjønn ( 600mg/kg kv/dag) hadde et økt vanninntak under hele behandlingsperioden. Behandlingsrelaterte hematologifunn ble observert i høydosehanner, som involverte økt antall leukocytter i blodet (leukocytose). I tilegg hadde to hanner i denne gruppen svak økning av antallet blodplater i blodet (thrombocytose). Begge kjønn utskilte et større volum av fortynnet urin, og ketonnivåene i urinen var statistisk signifikant høyere (hanner 600 mg/kg kv/dag og hunner 1000 mg/kg kv/dag). Pinoksaden resulterte i en redusert kroppsvektøkning i høydosehanner. Histopatologiske undersøkelser påviste at nyrene var målorganet ved høye dosenivåer. Nyretoksisiteten ble karakterisert av økt relativ nyrevekt, utvidelse av tubuli i nyrene og proksimal tubulær atrofi forbundet med nekrose av tubulære epitelceller. Det ble observert statistisk signifikant økning i relativ levervekt og forandringer i enkelte kliniske parametere, blant annet redusert plasma-albumin i hunner, i alle behandlede grupper. Det var noe økt glykogendeponering i lever. NOAEL: <300 mg/kg kv/dag for begge kjønn basert på tydelige histopatologiske skader i nyrene i tillegg til økt levervekt ved alle dosenivåer. (Bachmann, 2001). Rotte, 3 måneder Oral Mottatt dose var 0, 3, 10, 30, 100 eller 300 mg/kg kv/dag i hanner og hunner. Tilført daglig med sonde (fortynnet i destillert vann og 0.5% CMC og 0.1% Tween 80) til 10 rotter (albino Wistar rotter; Hanlbm:WIST/kjønn/gruppe. En satellittgruppe på 10 rotter/kjønn, hvor gruppene ble eksponert for 0, 100 og 300 mg/kg kv/dag, ble inkludert i studiet. OECD 408/GLP/QA. Resultater: Det var ingen behandlingsrelaterte dødsfall i løpet av forsøket. En hann (100 mg/kg kv/dag) og en hunn (300 mg/kg kv/dag) døde under blodprøvetaking. En hann i kontrollgruppen virket døende i uke 11 og ble av den grunn avlivet. Videre var det ingen behandlingsrelaterte effekter verken på kliniske funn eller kroppsvekt, og fôrinntak og fôrutnyttelsen heller ikke ble påvirket av eksponeringen. Det ble dokumentert et konsekvent høyere gjennomsnittlig vanninntak i høydosegruppen i begge kjønn gjennom behandlingsperioden. Gjennomsnittsinntaket mellom uke 1 og 13 var 19 % (hanner) og 28 % (hunner) høyere enn de respektive kontrollverdiene. Ingen signifikante forskjeller sammenlignet med kontrollverdier ble notert under restitusjonsperioden. Ingen skader på øyet ble observert. Det ble sett noen små forandringer i den hematologiske profilen signifikant statistisk sett, men de var ikke av toksikologisk betydning. I den høyeste dosegruppen for begge kjønn samt i den nest høyeste dosegruppen for hunner var det en antydning til ketonuri, hvilket kan være i samsvar med ketonmetabolismen til pinoksaden M2 og M4 metabolitter. I tillegg var urinen i disse gruppene mer sur enn i kontrollene. Store mengder urinutskillelse under behandlingsperioden ble observert hos begge kjønn i høydosegruppen. Etter restitusjon var urinparameterne i behandlede dyr lik kontrollverdiene. Klinisk kjemiske undersøkelser viste at det var forandringer i plasmaelektrolytter (urea, kreatinin, uorganisk fosfor, klorid, kalium, natrium, glukose, protein og albumin) i høydosegruppen. Nivået av uorganisk fosfor i blod var den mest sensitive parameteren og den eneste som vedvarte gjennom restitusjonsperioden hos begge kjønn i doser 30 mg/kg kv. Det var ingen behandlingsrelaterte makroskopiske eller mikroskopiske skader observert. En mild økning i levervekt i høydosegruppen ble betraktet som en mild fysiologisk adaptasjon og ikke tilstrekkelig nok til å representere en advers effekt av behandlingen da det heller ikke ble observert histopatologiske forandringer. Nyrene ble betraktet som hovedmålorgan på grunn av forandringene i vanninntak, klinisk kjemiske parametere og urinparameterne. NOAEL: 100 mg/kg kv/dag for begge kjønn basert på de små forandringene i klinisk kjemi, urinparametere og økt vanninntak ved 300 mg/kg kv/dag (Bachmann, 2001).

Side 5-6 Rotte, 3 måneder Oral/diett Fôrkonsentrasjoner på 0, 150, 1000, 5000 og 10000 ppm, som tilsvarer 0, 14.9, 97.5, 465.6 og 899.5 mg/kg kv/dag i hanner og 0, 16.0, 110.5, 526.8 og 964.9 mg/kg kv/dag i hunner, som ble eksponert i 90 dager (hovedstudie). Parallelt ble en interim gruppe (avlivet etter 28 dager) eksponert for dosenivåer på 0, 150, 1000, 5000 og 10000 ppm, som tilsvarer 0, 17.6, 118.9, 610.1 og 977.5 mg/kg kv/dag i hanner og 0, 17.7, 122.9, 545.0 og 1010.0 mg/kg kv/dag i hunner. Tilført via fôr til 12 rotter (Alpk:AP f SD Wistarderivert)/kjønn/dose i hovedstudiet og 5 rotter (Alpk:AP f SD Wistar-derivert)/kjønn/dose i interim forsøket. OECD 408/GLP/QA. Avvik fra OECD: dyrene ble ikke fastet før blodprøvetagningen. Ornitin dekarboaylase ble ikke målt i den kliniske biokjemiske undersøkelsen). Resultater: En hann i høydosegruppen døde på dag 24 i studiet. Det var ingen forutgående kliniske tegn eller abnormitet observert ved undersøkelser post mortem av dette dyret. Videre var det ingen behandlingsrelaterte effekter verken på kliniske funn eller FOB. 10000 ppm resulterte i signifikant lavere kroppsvekt og fôrinntak både i 28- dager og 90-dager forsøket. For hanner i høydosegruppen ble det observert en reduksjon i fôrutnyttelsen de første ukene i 90-dager studiet. Fôrutnyttelsen ved 5000 ppm var lik kontrollgruppen. Ved 5000 ppm ble det funnet en signifikant reduksjon i kroppsvekt både i 28- og 90-dager studiene, men kun de første par ukene. Imidlertid var kroppsvekten lik kontrollgruppen etter 90 dager. Pinoksaden resulterte også i redusert fôrinntak i de to høyeste dosegruppene (begge kjønn) i løpet av de første ukene av studiet. Det gjennomsnittlige vanninntaket var uforandret under 28 dager studiet, mens i hovedstudiet var det noe høyere for dyrene i høydosegruppen de første syv ukene (hanner) og de første to ukene (hunner). Majoriteten av disse forskjellene oppnådde statistisk signifikante verdier, men det ble funnet tydelige inter- og intra-gruppe variasjoner. Det var ingen observerbare forandringer i øyet etter eksponering for pinoksaden. Hunner i høydosegruppen hadde en statistisk signifikant reduksjon i gjennomsnittlig hemoglobinnivå, hematokritt og antall røde blodceller sammenlignet med kontrollgruppen etter 90 dager. Det var ingen effekt på gjennomsnittlig cellevolum, cellehemoglobin eller gjennomsnittlige cellehemoglobinkonsentrasjoner. Det var signifikante forskjeller i de samme parameterne for hanner, men ingen dose-respons sammenheng. Reticulocytter ble ikke målt. Etter 28 dager ble det observert signifikant reduksjon i gjennomsnittverdien av blodplater (hanner), hvite blodceller og nøytrofile i høydosegruppen. I tillegg var antall hvite blodceller og nøytrofile signifikant lavere for hanner i 5000 ppm gruppen. Hunner i 10000 ppm gruppen hadde en signifikant lavere verdi av gjennomsnittlig antall monocytter. Etter 90 dager var det en liten men signifikant økning i protrombintiden i begge kjønn i de to høyeste dosegruppene, og for hunner i høydosegruppen. Forskjellene var imidlertid små, og det ble ikke sett noen lignende effekter på den aktiverte partielle tromboplastintiden. Det ble observert signifikant behandlingsrelatert reduksjon i kolesterol hos begge kjønn. Tilvirker bemerker at plasma kolesterol nivåene var innenfor eller svært nærme det historiske kontrollverdiområdet. Urinvolumet til hunner i høydosegruppen var signifikant høyere etter 90 dager. Det ble ikke observert noen behandlingsrelaterte makroskopiske skader. Absolutt (hunner) og relativ (begge kjønn) levervekt i høydosegruppen var signifikant høyere etter 90 dager. Det ble også observert en økning i relativ levervekt i 5000 mg/kg kv/dag hunner. Det ble observert mikroskopiske forandringer i nyrer karakterisert av kortikal basofili, utvidelse av tubuli og/eller atrofi hos begge kjønn etter 28 dager i høydosegruppen (henholdsvis 3/5 og 1/5). Etter 90 dager var det en høyere innsidens av de samme symptomene samt tilstedeværelse av cyster. NOAEL: 5000 ppm. Denne dosen er ekvivalent til 466/527 mg/kg kv/dag i 90 dager forsøket, og 610/545 mg/kg kv/dag i 28 dager forsøket for hanner og hunner (Twomey, 2003). Forsøket anses kun som supplerende. Dette baseres på at pinoksaden var vist å ikke være stabilt i fôret, noe som påvirker påliteligheten av studiet. Hund, 3 måneder Hunner og hanner ble dosert med 0, 25, 100, 250 eller 500 mg/kg kv/dag, tilført oralt med kapsel til 4 beagle hunder/kjønn/gruppe. OECD guideline 409/GLP. Resultater: Kliniske effekter inkluderte økt spyttutskillelse ( 100 mg/kg kv/dag i begge kjønn) og brekninger (fra og med 100 mg/kg/dag i hanner og 500 mg/kg kv/dag i hunner). I høydosegruppen var det økt forekomst av blekhet og kalde ører og tunge i hunner, og flere hanner ble beskrevet som tynne og hadde tørre slimhinner. Lav puls ble observert i begge kjønn etter eksponering for 250 mg/kg kv/dag. En hunn i den samme dosegruppen hadde uklar hornhinne på høyre øyet. Det var en behandlingsrelatert nedgang i fôrinntak og vekt i de to høyeste dosegruppene. Alle

Side 5-7 hunnene dosert med 500 mg/kg kv/dag ble avlivet i uke 5 grunnet redusert inntak av fôr med påfølgende vekttap. Ingen kliniske effekter utover kalde ører/tunge og økt spyttutskillelse ble observert. En hann ble avlivet i uke 13 grunnet redusert forinntak og vekttap. Kliniske observasjoner hos dette individet inkluderte lav overflatetemperatur, dehydrering og blekt og magert utseende. Hos en hann dosert med 100 mg/kg kv ble det i uke 3 gjort flere klininske observasjoner, inkludert redusert aktivitet, dehydrering, lut holdning, svak og uregelmessig pusting og tynt og blekt utseende. Hunden tok heller ikke til seg fôr. Etter veterinærbehandling (inkludert antibiotika) og to dager uten dosering med pinoksaden opphørte symptomene, og hunden hadde ikke tilsvarende kliniske symptomer resten av studiet. Hematologiske undersøkelser viste minimale forskjeller i variasjonen av røde og hvite blodcelleparametere, men dette var enten begrenset til enkeltstående prøvetagningstidspunkt eller dosegrupper. Flere endinger i blodkjemi ble observert, inkludert redusert albuminnivå ( 100mg/kg/dag i hanner og 250 mg/kg/dag i hunner), redusert totalt protein (hovedsakelig hanner i høydosegruppa) og økning av alkaline fosfatase (signifikant 100 mg/kg/dag i hanner og alle dosegrupper i hunner) (se tabell under). Alanin aminotransferaseaktiviteten var høyere i hunner i høydosegruppa, og kalsiumnivået var lavere i hanner i de to høyeste dosegruppene. Selected Parameters for dogs following upto 90 days dosing with pinoxaden Parameter Males (mg/kg bw/day ) Females (mg/kg bw/day ) Mean bodyweights (kg) 0 25 100 250 500 0 25 100 250 500 Week 1 9.53 8.95 9.60 9.18 9.30 8.15 8.33 8.23 8.58 8.20 4 10.40 9.75 10.13 9.98 9.95 8.73 8.95 8.80 9.05 8.30 7 11.03 10.35 10.68 10.53 10.28 9.25 9.40 9.38 9.25 all dead 9 11.28 10.85 11.05 10.73 10.58 9.53 9.53 9.63 9.38 all dead 11 11.63 11.25 11.53 11.10 10.75 9.83 9.88 9.80 9.58 all dead 14 11.95 11.63 11.98 10.63* 12.10 10.00 9.98 10.10 9.58 all dead Food consumption (g/dog/day) 0 25 100 250 500 0 25 100 250 500 Week 1 349 337 329 330 297* 297 298 300 281 270 4 350 340 350 320 309 300 300 300 261 144** 7 350 350 350 341 322 300 300 300 263 all dead 9 350 350 350 350 315 300 300 300 256 all dead 11 350 350 350 283 276 296 300 300 300 all dead 14 350 350 350 308* 350 298 300 300 293 all dead Clinical Chemistry (adjusted means) b 0 25 100 250 500 0 25 100 250 500 Albumin (g/l) 4 29.9 30.2 25.2** 26.6* 26.4* 30.4 30.5 28.9 27.3* 24.8** 8 31.1 30.7 28.5* 27.0** 27.4** 32.1 31.0 30.1 27.0** all dead 13 31.2 29.9 28.7 26.7* 24.6** 32.3 31.2 29.7 25.9** all dead Total protein (g/l) 4 52.6 54.0 50.9 49.9 48.8* 49.8 53.5 52.5 49.6 45.5 8 55.4 53.1 53.0 51.1 49.9* 53.3 55.7 53.9 49.5 all dead 13 54.9 52.9 52.2 50.7 46.4** 55.5 55.9 55.4 49.1* all dead Cholesterol (mmol/l) 4 3.12 3.33 2.86 2.54 2.94 3.51 3.67 3.50 3.13 2.53* 8 3.33 3.29 2.91 2.38* 2.69 3.34 3.66 3.07 3.04 all dead 13 3.16 3.10 2.63 2.36* 2.84 3.62 3.50 3.00 3.24 all dead Triglycerides (mmol/l) 4 0.55 0.62 0.43 0.44 0.67 0.60 0.66 0.77* 0.81 0.57 8 0.53 0.45 0.60 0.47 0.74 0.57 0.63 0.72 0.65 all dead 13 0.43 0.35 0.41 0.45 0.63** 0.63 0.60 0.57 0.63 all dead ALP (IU/l) b 4 307 348 323 386 387 267 405 420 394 750** 8 286 324 426 527* 503* 261 506* 421 518** all dead 13 254 353 432* 426 577** 227 425 415* 512* all dead ALT (IU/l) 4 34.5 36.5 36.6 36.6 41.9 30.7 37.5 33.9 36.9 51.0** 8 37.6 40.8 44.3 42.0 40.3 33.4 36.9 39.8 34.3 all dead 13 36.1 49.9 50.3 53.4 40.0 34.4 41.0 40.3 35.5 all dead Forandring i organvekt ble observert i noen dosegrupper. Absolutt hjertevekt var signifikant lavere i hanner dosert med 250 mg/kg kv/dag. Relativ hjertevekt var lavere i hunner dosert med 100 eller 250 mg/kg kv/dag. Alle middelverdiene lå innenfor historiske kontrolldata. Økning i levervekt ble observert i hanner i høydosegruppa, men

Side 5-8 dette skyldtes i hovedsak ett individ. Mikroskopiske funn ble kun gjort i dyr avlivet før forsøksslutt, og inkluderte redusert glykogennivå i lever i dyr av begge kjønn og økt apoptose i lever og atrofi av brisselen i én hunn. NOAEL: 25 mg/kg/dag basert på endringer i kjemiske blodparametre og kliniske effekter ved høyere doser (Lees, 2003). Hund, 1 år Fire beagle hunder/kjønn/gruppe ble dosert med 0, 5, 25 eller 125 mg pinoksaden/kg kv/dag, tilført oralt med kapsel til 4 dyr/kjønn/gruppe. OECD guideline 452/GLP. Avvik fra OECD: høyeste dosenivå gav ikke klare toksiske effekter. Denne dosen var basert på resultater fra 90-dagersforsøket i beaglehunder. Ornitin dekarboaylase ble ikke målt. Resultater: Kliniske effekter observert i forsøket begrenset seg til svak økning i spyttutskillelse ved dosering i hunner og høyere forekomst av flytende avføring i hanner fra og med 25 mg/kg kv/dag. Ved 125 mg/kg kv/dag ble det i tillegg observert en økning i tilfeller av oppkast og slim i avføring. En hann dosert med 25 mg/kg kv/dag hadde antydning til grå stær og en hann dosert med 125 mg/kg kv/dag hadde flere diffuse uklarheter i linsen. Bakgrunnsdata viser at tilsvarende effekter kan oppstå spontant i testarten, og det var ingen sammenfallende histopatologiske forandringer. Behandlingsrelaterte hematologifunn ble observert i hunder dosert med 25 eller 125 mg/kg kv/dag. Antall røde blodceller i hunner var signifikant lavere og lå litt under historiske kontrollverdier ved 25 mg/kg kv/dag etter 26 og 52 uker, og ved 125 mg/kg kv/dag etter 26 uker. Signifikante forandringer ble også observert for antall eosinofile, antall store ufargede blodceller og hemoglobinnivå. Alle middelverdiene lå innenfor historiske kontrollverdier, og viste ingen klar dose-respons. Behandlingsrelaterte effekter på kjemiske parametere i blod ble observert ved 25 og 125 mg/kg kv/dag. Effekter inkluderte reduksjon i albuminnivået ved begge dosene, og reduksjon i totalt protein i høydosegruppa. Effektene på albuminnivå viste en dose-respons, men alle middelverdiene lå innenfor historiske kontrollverdier. Verdiene var generelt innenfor historisk kontroll. I høydosegruppa ble det i tillegg observert signifikant reduksjon i bilirubinnivå og økning i alanin aminotransferaseaktivitet i hanner, minimal reduksjon i plasma kloridnivå og høyere plasma gamma-glutamyl transferaseaktivitet i hunner og økt alkalisk fosfataseaktivitet i begge kjønn. Plasma keratin kinase var signifikant lavere i hunner i alle dosegrupper ved de fleste prøvetagningspunktene, men resultatet kan ha vært en konsekvens av unormalt høye verdier hos to av individene i kontrollgruppa. Alle verdiene lå innenfor historiske kontrollverdier, og det var ingen klar dose-respons. NOAEL: 25 mg/kg kv/dag, basert på kliniske, hematologiske og kjemiske funn ved 125 mg/kg kv/dag (Lees, 2003). Rotte, 4 uker dermal Ti HanBrl:WIST rotter/kjønn/gruppe ble eksponert for dosenivåer på 0, 10, 100 eller 1000 mg pinaxoden/kg kv/dag. Fortynnet i 1 % CMC i 1 % Tween 80. OECD 410/GLP/QA. Avvik fra OECD: Høyeste dose gav ingen klare toksiske effekter, men tilsvarer dosen som ikke trenger å overskrides ved limit-test. Kroppsvekten var lavere enn anbefalt ved starten av forsøket (150-200 g, burde vært 200-300 g). Hanner ble dosert på dag 1-4, 7-11, 14-18 og 21-28 og hunner på dag 1-3, 6-10, 13-17 og 20-28. Resultater: De siste 2-5 dagene av behandlingen ble det observert lett erytem i to hanner og to hunner dosert med 100 mg/kg kv/dag, og litt kraftigere erytem i to hunner dosert med 10 mg/kg kv/dag og to hunner dosert med 100 mg/kg kv/dag. Vanninntaket økte noe hos hanner i alle dosegruppene, men effekten var ikke doserelatert. Patologiske undersøkelser viste skorpedannelse på applikasjonsstedet hos én hunn dosert med 10 mg/kg kv/dag, effekten ble antatt å være forårsaket av applikasjonsprosedyren. Flere mikroskopiske funn ble gjort på applikasjonsstedet, inkludert betennelsesreaksjoner hovedsakelig av grad 1. Effekten var dose-relatert i hanner, mens det ble observert flest tilfeller ved 100 mg/kg kv/dag i hunner. Fortykninger i huden ble også observert. Det var ingen klar dose-respons, og antall tilfeller og alvorligheten var størst ved de to laveste dosene. Ulcerasjon ble funnet i to hunner i lavdosegruppa. En årsakssammenheng mellom funnene og pinoksaden kan ikke ekskluderes, men det var ingen konsistent dose-respons og alvorligheten av funnene var relativ lav. Ingen funn indikerte systemiske effekter av pinoksaden ved dermal eksponering. NOAEL (systemisk): Ingen systemiske effekter ble observert i forsøket, NOAEL settes derfor til 1000 mg/kg kv/dag i begge kjønn (Sommer, 2001).

Side 5-9 5.1.6 Kronisk toksisitet og kreft Rotte, 2 år Kombinert kronisk- og kreftforsøk. Dyrene ble eksponert for 0, 1, 10, 100, 250, 500 mg/kg kv/dag. Tilført daglig med sonde (fortynnet i destillert vann og 0.5% CMC og 0.1% Tween 80) til 90 rotter (albino Wistar rotter (HanIbm:WIST (SPF)))/kjønn/dose: 60 dyr/kjønn/dose til 2 år kreft-hovedstudie; en interimgruppe på 10 dyr/kjønn/dose til 1 år toksisitetsstudie; ytterligere en undergruppe på 20 dyr/kjønn/dose beregnet til hematologiske undersøkelser, hvorav 10 dyr/kjønn/dose av denne gruppen ble brukt til kliniske kjemiske undersøkelser. OECD 453/GLP/QA. Resultater: Det var høy spontan dødelighet hos hanner i høydosegruppen. Antall tilfeller økte kontinuerlig fra uke 32, og i uke 53 hadde 24 av 90 (27 %) dyr dødt sammenlignet med 3 av 90 (3 %) i kontrollgruppen. Dette medførte avlivning av denne gruppen i uke 61 på grunn av toksisitet som overskred den maksimale tolererbare dosen (MTD). Det var signifikant redusert overlevelse (38.33 %) hos hanner dosert med 250 mg/kg kv/dag sammenlignet med hanner i kontrollgruppen (71.67 %). Makro- og mikroskopiske undersøkelser avslørte forandringer i nyrenes morfologi og funksjon, som kan være årsaken til de nevnte dødsfallene. Hunner i høydosegruppen etter 24 måneders eksponering hadde en liten men ikke signifikant redusering (58.33 %) i overlevelse sammenlignet med hunner i kontroll (71.67 %). Økt forekomst av lut holdning og strittende pels hos hanner i dosegruppene 250 mg/kg kv/dag, hvilket var det eneste kliniske tegnet som ble observert. Ingen skader eller forandringer i øyet. Det var registrert en antydning til redusert kroppsvektsutvikling hos begge kjønn dosert med 250 og 500 mg/kg kv/dag. Denne nedgangen kom til syne i andre halvdel av det første året og fortsatte gjennom hele behandlingsperioden. Økt vanninntak gjennom hele behandlingsperioden på 24 måneder (60 uker for hanner dosert med 500 mg/kg kv/dag) for begge kjønn eksponert for 250 mg/kg kv/dag. Det økte vanninntaket ble forbundet med økt urinvolum i dyr dosert med >100 mg/kg kv/dag. Noe ketonuri ble observert i begge kjønn dosert med 250 mg/kg kv/dag gjennom hele behandlingsperioden samt lavere urin ph-verdi. Større andel av epitelceller ble sett i urinsediment hos 500 mg/kg kv/dag hunner det første året og i uke 53. Dette tyder på stoffrelaterte skader av urinsveissystemet og nyrene. Flere tilfeller av signifikant lavere fôrinntak ble tidvis observert hovedsakelig hos hanner dosert med 250 mg/kg kv/dag. Imidlertid viste det kalkulerte fôrinntaket i periodene fra uke 1-12, 1-54 og 1-102 ingen relevante forskjeller da de ble sammenlignet med kontrollverdiene. Histopatologiske undersøkelser utført etter avsluttet behandling viste kronisk progressiv nefropati i dyr dosert med 250 mg/kg kv/dag, tubulær atrofi i nyrene(hunner dosert med 250 mg/kg kv/dag) og utvidelse av tubuli (begge kjønn dosert med 100 mg/kg kv/dag). Alvorlighetsgraden og forekomsten av kronisk progressiv nefropati (CPN) i nyrene ble tydelig forsterket med økende doser av pinoksaden. Det var en sammenheng mellom osteo-renal syndrom og dyr med alvorlig nyreskade. Dette ble betraktet å være et resultat av sekundær hyperparathyroidism, som involverer hyperplasi i biskjoldbruskkjertel, fibrøs osteodystrofi (500 mg/kg kv/dag hunner og 250 mg/kg kv/dag hanner), metastatisk mineralisering (500 mg/kg kv/dag hunner, begge kjønn 250 mg/kg kv/dag) hvor tilstanden i de sistnevnte påvirket aorta, hjerte, nyrer, lunger og mage. Ytterligere funn som sannsynligvis er assosiert med nyreskade er redusert mineralisering i nyrebekkenet hos dyr dosert med 100 mg/kg kv/dag, utvidelse av nyrebekkenet hos hunner dosert med 500 mg/kg kv/dag i tillegg til nedgang i overgangsepitel hyperplasi i nyrebekkenet hos hunner etter eksponering for 100 mg/kg kv/dag. The clear cells i haleområdet av bitestikkel viste seg å ha en økt mineralisering etter 250 mg/kg kv/dag og redusert cytoplasmisk vakuoldannelse etter doser 100 mg/kg kv/dag. Det ble observert lavere hemoglobinkonsentrasjoner i 500 mg/kg kv/dag hanner og 250 mg/kg kv/dag hunner, og denne observasjonen ble forbundet med noe lavere antall reticulocytter i løpet av det første året. Høydosehunnene hadde et noe høyere antall blodplater. I hanner dosert med 250 mg/kg kv/dag ble det sett redusert hematokritt under det første behandlingsåret. Hunner i høydosegruppen og hanner dosert med 250 mg/kg kv/dag hadde et signifikant høyere plasmanivå av urea og kreatinin. Disse effektene ble observert bare på dosenivåer som viste signifikante histopatologiske forandringer i nyrene. Andre forandringer i klinisk kjemi verdier begrenset til hanner i høydosegruppen og hunner dosert med 250 mg/kg kv/dag, bestod av lavere plasma glukosekonsentrasjoner, høyere triglyseridnivåer, økt individuell plasma bilirubinnivåer og lavere albuminnivåer. Se side 171-176 i Vedlegg T1. Det var en økt forekomst av

Side 5-10 svulster i lever og livmor, imidlertid var antallet lite og innenfor historiske kontrollverdier. En økning i tilfeller av leiomyosarcoma i magesekken ble observert hos hanner (se tabell under). Tumour incidencerats from studies of 24 to 26 months duration Tumours Males (mg/kg bw/day ) Females (mg/kg bw/day ) 0 1 10 100 250 500 0 1 10 100 250 500 Stomach No 59 examined 60 60 59 60-60 60 59 60 60 59 Leiomyosarcoma 0 0 0 0 2-0 0 1 0 0 0 Liver No. examined 60 60 60 59 60-60 60 59 60 60 59 Hepatocellular adenoma 3 0 2 2 1-2 0 0 0 2 5 Uterus No. examined - - - - - - 60 59 60 59 60 59 Endometrial adenocarcinoma - - - - - - 1 0 0 2 3 4 Historical control data for selected neoplasms in Wistar rats from dietary studies of 24 to 26 months duration Organ/tissue/tumour data base number of sex total number of animals with lesions % range groups animals number % min. max. stomach: RCC STEIN 5 M 250 0 0.0 0.0 0.0 leiomyosarcoma RENI 48 M 2325 1 <0.1 0.0 2.0 liver: hepatocellular RCC STEIN 5 F 250 8 3.2 0.0 8.0 adenoma RENI 58 F 2786 41 1.5 0.0 15.0 uterus: endometrial RCC STEIN 5 F 246 11 4.5 0.0 8.2 adenocarcinoma RENI 58 F 2785 87 3.1 0.0 14.3 Ved høye dosenivåer i dette forsøket var nyrene målorganet, som da involverte kronisk progressiv nefropati med assosierte effekter relatert til nyretoksisitet. Kronisk progressiv nefropati oppstår normalt i rotter med en høy alder, men denne effekten ble forsterket på en dose-relatert måte. I dette 24 måneder kombinert kronisk- og kreftforsøket, hvor pinoksaden ble tilført med sonde, overskred høydosen (500 mg/kg kv/dag) MTD i hanner. Den overdrevne høye dødeligheten var primært relatert til nyretoksisitet. Hunner dosert med 500 mg/kg kv/dag og hanner dosert med 250 mg/kg kv/dag oppnådde en akseptabel MTD, hvilket var henholdsvis basert på -23 % og -13 % redusert kroppsvektøkning sammenlignet med kontroll. Pinoksaden ble ikke funnet å være kreftfremkallende i rotte. Men den høye dødeligheten i høydosegruppen er kritikkverdig, og gjør det vanskelig å tolke resultatene i dette forsøket. NOAEL: 10 mg/kg kv/dag basert på histopatologiske forandringer i nyrene etter eksponering for 100 mg/kg kv/dag og assosierte forandringer i vanninntak og i urinvolum (Bachmann, 2003). Mus, 18 mnd Hovedforsøk I: Kreftforsøk. 70 albinomus (Crl:CD-1(ICR) BR) /kjønn/gruppe ble dosert med 0, 5, 40, 300 eller 750 mg pinoksaden/kg kv/dag. Stoffet ble løst i 0,5 % CMC I vann/0,1 % Tween 80 og ble tilført med sonde. OECD 451/GLP/QA. Avvik: overlevelse i gruppene eksponert for 300 og 40 mg/kg pinoksaden var henholdsvis 47 %, sammenlignet med 83 % i kontrollgruppen. Overlevelsesraten ble regnet som stor nok til å vurdere den karsinogene effekten av pinoksaden. Blodutstryk ble tatt fra alle overlevende dyr etter ett år, og hematologiske undersøkelser ble utført på alle dyr som overlevde til forsøksslutt (18 mnd). Matinntak ble ikke registrert i uke -1. Resultater: Det var en doserelatert økning i dødelighet 40 mg/kg kv/dag(se tabell

Side 5-11 under). Der det var mulig å fastslå dødsårsaken, var effekter på lungene dominerende. Funn relatert til dødelighet inkluderte dannelse av hinneaktig eller granulært svakt basiske materiale i lungene, interstitial pneumonia, lungeødem, bronkio-alveolære karsionomer og skummende utskillelse fra bronkiene. Flere dødsfall, spesielt i de to høyeste dosegruppene, ble registrert som accidental (se tabell under). Dette var dyr som døde innen en time etter dosering. Etter 18 mnd var gjennomsnittlig kroppsvekt redusert med 11 % for hanner i høydosegruppen og 20 % og 7 % for hunner i dosert med henholdsvis 750 og 300 mg/kg kv/dag. Økningen i kroppsvekt mellom uke 1 og uke 78 var redusert med 51 % i hanner eksponert for 750 mg/kg kv/dag og 84 % og 38 % for hunner i dosert med henholdsvis 750 og 300 mg/kg/dag. Det var ingen behandlingsrelaterte effekter på fôrinntak, men fôrutnyttelsen var lavere i høydosegruppen i begge kjønn. Vanninntaket i høydosegruppene var høyere gjennom hele forsøksperioden. Effekter ble observert på levervekt ved de to høyeste dosene og relativ nyrevekt i hunner ved den høyeste dosen (se tabell under). Kliniske og hematologiske effekter er oppsummert i tabell under. Undersøkelser av øyet ble ikke gjennomført, heller ikke analyse av urin eller kjemiske blodparametre. Patologiske undersøkelser viste økning i skummende sekresjon fra bronkiene hos dyr som døde eller ble avlivet før forsøksslutt, og i noen dyr kollapset ikke lungene når brystkassen ble åpnet. Det var og en økning i tilfeller av fortykket tynntarm ved de to høyeste dosene (se tabell under). Parameter observert Doser (mg/kg kv/day) Hanner Hunner 0 5 40 300 750 0 5 40 300 750 Dødsfall totalt 12 15 30 37 37 17 11 22 24 26 (antall) accidental 1 0 3 14 8 0 0 0 6 9 lungerelaterte 1 4 6 17 23 1 1 5 10 15 Kliniske Toniske skjelvinger 0 2 3 3 10** 0 0 0 1 0 observasjoner Strittende hår 9 10 13 10 18 5 8 10 6 13 (antall dyr) Lut holdning 6 9 10 8 12 18 15 21 15 32 Kroppsvekt økning uke 1-78 (%) 33 30 29 26 16** 46 46 34* 27** 7.4** Hematologi Platetelling 1714 1603 1637 2053** 2196** 1634 1582 1494 1829* 1684 Organvekt Lever, absolutt (g) 2.16 2.32 2.06 2.38 2.66** 1.78 1.83 1.74 1.88 2.04** Lever, relativ (%) 50 54 49 57* 71** 49 47 49 56** 70** Nyre, absolutt (g) 0.794 0.794 0.774 0.767 0.717** 0.452 0.472 0.450 0.439 0.443 Nyre, relativ (%) 18.6 18.6 18.5 18.4 19.2 12.5 12.3 12.8 13.1 15.2** Lunger, sekresjon 0 1 3 11 9 0 0 0 5 6 Lunger, ingen kollaps 0 0 0 5 6 0 0 0 5 3 Makroskopiske funn (antall dyr) Tynntarm fortykket 0 0 0 1 5 1 0 1 3 2 Histopatologiske effekter på lungene inkluderte dannelse av hinneaktig eller granulært svakt basiske materiale i lungene, rapportert som alveolar/bronchiolar hyalinose. Denne effekten ble i hovedsak observert i dyr som døde underveis i studiet, og ble regnet som en av hovedfaktorene til at dyrene døde. I dyr som overlevde til forsøksslutt ble det gjort flere funn av kantete basiske formasjoner (krystallinske strukturer) og intraalveolære makrofager. Funnene av makrofager var ikke doserelatert, og verdiene for både kontroll- og eksponertgruppene lå langt over historiske kontrollverdier fra diettforsøk (6-7 %). (se tabell under). Flere inflammatoriske forandringer i den nasale kaviteten ble observert, og ble assosiert med skader på lungene. I lever var det en økning av glykogendeposisjon ved de to høyeste dosene i begge kjønn. Ved de samme konsentrasjonene ble det observert økt forekomst av fortykninger av epitelet i tynntarmen i begge kjønn, og bitestiklene i menn hadde redusert forekomst av vakuolisering av cytoplasma. En dose-relatert økning i blodstuvning ble sett i binyrene (hanner), nesehulen (hunner), nyrer, lever og lunge (begge kjønn), og dette kan ha bidratt til dødsfallene observert i forsøket. Finding Incidence of alveolar / bronchiolar hyalinosis and intra-alveolar macrophages (phagocytic cells) Males (mg/kg bw/day ) Females (mg/kg bw/day ) 0 5 40 300 750 0 5 40 300 750 OVERALL INCIDENCE (PREMATURE DECEDENTS +TERMINAL SACRIFICE)