LTK.615 PAKNINGSVEDLEGG For in vitro-diagnostisk bruk PI-LT.615-NO-V4
Instruktiv informasjon Tilsiktet bruk Leucosep-rør er beregnet på innsamling og separasjon av perifere mononukleære blodceller (PBMC = peripheral blood mononuclear cell) fra helblod. Rørene forenkler separasjonen av PBMCer fra helblod ved hjelp av en polysukrose-basert gradientseparasjonsløsning før disse cellene brukes i ELISPOT-tester. Introduksjon ELISPOT-metoden anvender T-celler i PBMC-er som er blitt separert fra helblod. En måte å separere disse cellene på er å bruke en polysukrose-basert gradientseparasjonsløsning. Denne fremgangsmåten består av en rekke trinn som må utføres nøyaktig for å sikre optimale resultater. Det å bruke Leucosep-rør reduserer antall trinn, gjør prosedyren mer robust og forkorter tiden det tar å utføre separasjonsprosedyren. Metodens prinsipper Leucosep-rør er utviklet for å oppnå optimal PBMC-separasjon av humant helblod ved hjelp av densitetsgradientsentrifugering. Leucosep-rør har innebygd en porøs barriere i et gjennomsiktig polypropylenrør. Denne biologisk nøytrale barrieren består av polyetylen av høy kvalitetsgrad. Leucosep-røret eliminerer den tidkrevende og møysommelige leggingen av prøvematerialet lagvis over en polysukrose-basert gradientseparasjonsløsning. Antikoagulert helblod blandes med kulturmediet og fylles i Leucosep-røret. Den porøse barrieren forhindrer at blodet blandes med separasjonsmediet. Under sentrifugeringen skilles PBMC-ene fra uønskede erytrocytter på grunn av deres ulike tetthet, og samles i grensesjiktet over separasjonsmediet. Når separasjonen er fullført, forhindrer barrieren at PBMC-laget rekontamineres ved fjerning. Advarsler og forholdsregler 1. Kun for in vitro-diagnostisk bruk. 2. Kun for profesjonell bruk; utøvere må være opplært i denne prosedyren. 3. Blodprøver må anses å være potensielt farlige. Vis omtanke når materiale av human opprinnelse håndteres. 4. Helblodprøver og testkomponenter må, under bruk, lagring og fjerning, håndteres i henhold til prosedyrer angitt i gjeldende sikkerhetsretningslinjer eller -forskrifter vedrørende biologisk risikomateriale. 5. Alle avvik fra anbefalte prosedyrer for pipettering, vaskemetoder, sentrifugeringstid og/eller temperaturer kan endre renheten av de isolerte PBMC-ene og påvirke de påfølgende testresultatene. 6. Blod må ikke samles i celleforberedelsesrør (CPT, Becton Dickinson) eller EDTAblodprøvetakingsrør, da de er inkompatible med Leucosep-rør. 7. Prøver av helblod må ikke nedkjøles eller fryses. Blodprøvene må lagres og transporteres til laboratoriet ved temperaturer mellom 18 og 25 C, eller 10 25 C hvis prøvene skal behandles med T-Cell Xtend -reagensen. 8. Blod må ikke oppbevares mer enn 8 timer, eller over 32 timer hvis det senere skal behandles med T-Cell Xtend-reagensen. 9. Det må bare brukes engangsbeholdere for venøs blodprøvetaking. 10. Må ikke brukes etter utløpsdatoen. 11. Følg aseptisk teknikk ved bruk av dette produktet. 12. Leucosep-rør må ikke oppbevares i direkte lys. 13. Ikke bruk hvis Leucosep-rørene er skadet eller hvis den polysukrose-baserte gradientseparasjonsløsning er forringet, noe som indikeres av en tydelig gul farge eller partikkelmasse i den klare oppløsningen. Materialer levert Hver eske inneholder: 50 Leucosep-rør ferdigfylt med en polysukrose-basert gradientseparasjonsløsning. CD med pakningsvedlegg og sikkerhetsdataark. 2 PI-LT.615-NO-V4
Lagring og stabilitet Oppbevares ved 4 30 C uåpnet til utløpsdatoen angitt på esken. Oppbevar det åpnede produktet ved romtemperatur (18 25 C) og bruk det innen datoen som inntreffer først av 12 uker etter åpning av ytteremballasjen eller utløpsdatoen på esken. Nødvendig utstyr og materiell som ikke følger med 1. Hepariniserte blodprøvetakingsrør. 2. AIM V -og RPMI-cellekulturmedia. 3. 15 ml sentrifugerør. 4. En sentrifuge for fraksjonering av PBMC-er med kapasitet på minst 1000 RFC (g) og evne til å holde prøvene ved romtemperatur (18 25 C). 5. Skap med biosikkerhetsnivå 2 (BL 2) (anbefalt). 6. Pipetter og sterile pipettespisser. 7. ELISPOT-sett. 8. T-Cell Xtend-reagens kan være nødvendig hvis det brukes prøver eldre enn 8 timer. Prosedyre Merk: Følgende trinn må utføres etter prinsippene for god laboratoriepraksis: 1. Sørg for at et nødvendig antall Leucosep-rør er ved romtemperatur (18 25 C) før bruk. 2. Hvis den polysukrose-baserte gradientseparasjonsløsningen er oppsamlet over den porøse barrieren (fritten), må Leucosep-rørene sentrifuges ved 350 xg i ett minutt for å flytte den polysukrose-baserte gradientseparasjonsløsningen under fritten. 3. Vend helblodprøven og fortynn den i forholdet 5 deler blod til 3 deler AIM V- eller RPMIcellekulturmedium i et 15 ml sentrifugerør. Vend sentrifugerøret flere ganger for å blande. 4. Hell det fortynnede blodet direkte inn i Leucosep-røret og sentrifuger ved 1000 xg i 10 minutter ved 18 25 C uten brems. 5. Aspirer det grumsete PBMC-laget og tilbered opptil ~10 ml AIM V eller RPMI i et 15 ml sentrifugerør. Vend sentrifugerøret for å blande. 6. Sentrifuger ved 600 xg i 7 minutter. Kast supernatanten. 7. Løs opp cellepelleten igjen med AIM V eller RPMI, tilbered opptil ~10 ml AIM V eller RPMI, og sentrifuger ved 350 xg i 7 minutter til. 8. Kast supernatanten og løs opp cellepelleten igjen i AIM V-volumet (ikke RPMI) slik det kreves av ELISPOT-testen. 9. Hvis det er nødvendig med celler for antigen stimulering i en ELISPOT-test, fortynnes cellene deretter med AIM V (ikke RPMI). Begrensninger 1. I likhet med andre separasjonsmetoder, kan Leucosep-rør endre proporsjonen av enkelte PBMC-fraksjoner (for eksempel T- og B-celler) i forhold til helblod som ikke er separert. Det antas at denne endringen er relativt ubetydelig i normale tilfeller. Kvalitetskontroll Metoder for celletelling må, i henhold til det enkelte laboratoriums retningslinjer for utførelse av kvalitetskontroll, utformes og valideres for å sikre at det skaffes et tilstrekkelig antall PBMC-er for det relevante testsystemet. I tillegg må kvalitetskontrollen utøve positive og negative kontroller som er laget for å sikre T-cellenes forventede ytelse i det relevante testsystemet. 3 PI-LT.615-NO-V4
Ytelsesegenskaper Friskt blod Det ble skaffet 6 ml blod fra 15 donorer. Prøver fra hver donor ble behandlet innen 8 timer fra venepunktur. Prøvene ble behandlet ved å bruke Leucosep-rør fylt med polysukrose-baserte separasjonsmedia. Isolerte celler var levedyktige og funksjonelle i ELISPOT-testen. Blod lagret ved hjelp av T-Cell Xtend-reagensen Det ble skaffet blodprøver fra 205 donorer som ble brukt for å undersøke restitusjon av celler ved å bruke Leucosep-rør fylt med polysukrose-baserte separasjonsmedia. Det ble innhentet 6 ml blod per donor, og blodet ble behandlet i 29 32 timer etter venepunktur ved hjelp av T-Cell Xtendreagensen. Isolerte celler var levedyktige og funksjonelle i ELISPOT-testen. Vær oppmerksom på at det anbefales bruk av 6 ml blod per donor. Lavere blodvolum kan påvirke cellenes restitusjon. 4 PI-LT.615-NO-V4
Veiledning i å feilsøke innsamling og separasjon av PBMC-er for ELISPOT Problem Mulig årsak Mulig løsning Lav celleytelse Leukopeni Legg til et ekstra blodprøvetakingsrør Kontaminasjon av røde blodceller Intet definert eller særskilt mononukleært lag Feil blodprøvetaking Røret for blodprøvetaking er ikke ved normal romtemperatur (18 25 C) Blodlagring er ikke ved nødvendig temperatur Bruk av andre volumer eller fortynninger enn anbefalt Blodlagring er ikke ved nødvendig temperatur Røret for blodprøvetaking er ikke ved normal romtemperatur (18 25 C) Blod er ikke fortynnet Inversjon av blodprøve inne i Leucosep-rør Feil sentrifugering Prøveseparasjon ikke fullført Prøveseparasjon ikke fullført Sentrifugen er ikke ordentlig kalibrert Feil sentrifugering CPT-rør og blodprøvetakingsrør som inneholder EDTA er ikke kompatible med Leucosep-rør La røret for blodprøvetaking oppnå romtemperatur Påse at blodforsendelser holder 18 25 C, eller 10 25 C hvis TCell Xtend-reagensen brukes Påse at de relevante anvisningene følges Sørg for at blodet transporteres ved 18 25 C, eller 10 25 C hvis TCell Xtend-reagensen brukes La røret for blodprøvetaking oppnå romtemperatur Sørg for at blodet fortynnes i henhold til prosedyren Sørg for at Leucosep-rør holdes oppreist før sentrifugering Påse at anvisninger for sentrifugering følges Kontroller at sentrifugen er i stand til å holde 18 25 C Kontroller at sentrifugebremsen er avslått Øk sentrifugeringstrinnet med 10 min. Øk sentrifugeringstrinnet med 10 min. Få sentrifugen kalibrert Påse at anvisninger for sentrifugering følges Hyperlipemisk prøve Ugyldige resultater Ugyldige resultater kan forårsakes av en rekke feil ved håndtering av prøver Ta blodprøver fra fastende donor Se avsnittene over 5 PI-LT.615-NO-V4
Ordliste med symboler» Siste forbruksdag / utløpsdato (år-måned-dag) 3 Partinummer 4 Katalognummer OBS, se bruksanvisningen Ó Tilvirker i Tilstrekkelig til «n» tester 1 In vitro-diagnostisk utstyr j Temperaturbegrensning / lagre mellom ² Se bruksanvisningen TCell Xtend og Oxford Immunotec-logoen er varemerker for Oxford Immunotec Limited. AIM V er et varemerke for Invitrogen. CPT er et varemerke for Becton Dickinson. Bruken av TCell Xtend-reagensen er beskyttet av følgende patenter og pågående patenter: US9090871, EP2084508, JP5992393, CN101529221, AU2007-303994, CA2665205, IN2165/DELNP/2009. 2017, Oxford Immunotec Limited. Med enerett. Tilvirker: Oxford Immunotec Ltd 94C Innovation Drive, Milton Park, Abingdon Oxfordshire, OX14 4RZ, Storbritannia +44(0)1235 442780 www.oxfordimmunotec.com Oxford Immunotec Ltd. 94C Innovation Drive, Milton Park, Abingdon, Oxfordshire, OX14 4RZ, Storbritannia. Tlf: +44 (0)1235 442780 Faks: +44 (0)1235 442781 www.oxfordimmunotec.com 6 PI-LT.615-NO-V4