1 Sitronsyresyklus (TCA), elektrontransportkjeden og oksidativ fosforylering Medisin stadium IA, Tonje S. Steigedal
2 SIR HANS KREBS and OTTO WARBURG Lindau, 1966 Nobel Prize Awards SIR HANS KREBS Professor i biokjemi (University of Sheffield, 1945-1954). Vant nobelprisen i medisin/fysiologi i 1953. Oppdaget mekanismen for hvordan energi omdannes fra oksidasjon av næringsstoffer i levende celler. Oppdagelsen fikk navnet Krebs syklus eller sitronsyresyklus.
3 Sitronsyresyklus Når cellene har tilstrekkelig tilgang på oksygen, vil ikke pyruvat dannet i glykolysen omdannes til laktat, men vil i stedet omdannes til Acetyl-CoA og kanaliseres inn i sitronsyresyklus (Krebs syklus). Oksideres og mister e - Dette gir en fullstendig nedbrytning av pyruvat til H 2 O og CO 2. Denne aerobe prosessen kalles respirasjon. e - (energien) konserveres som:
4 Oksidativ nedbrytning av pyruvat skjer i mitokondriene
5 Under normale aerobe forhold vil det meste av pyruvat dannet i glykolysen transporteres (aktivt) inn i mitokondriene, og oksideres videre gjennom sitronsyresyklus. Det er imidlertid bare acetylgruppen i pyruvat, som går inn i TCA, og denne må først kobles på Coenzym A (CoA), og danne acetyl-coa (=aktivert acetat). Acetylgrupper fra fettsyrer og de fleste aminosyrer kanaliseres også inn i sitronsyresyklus via acetyl- CoA. Totalreaksjon for omdanning av pyruvat til Acetyl-CoA ved pyruvat dehydrogenase
6 Pyruvat dehydrogenase (PDH) PDH er det største multienzymkomplekset som er kjent, og består av: Pyruvat dekarboksylase (E1) (x30) (E1 kalles i noen lærebøker for pyruvat dehydrogenase) Dihydrolipoamid acetyltransferase (E2) (x60) Dihydrolipoamid dehydrogenase (E3) (x12) I tillegg inneholder komplekset 5 kofaktorer (prostetisk gruppe/koenzym) Fire av disse kofaktorene stammer fra vitaminer. Subenhetene er ordnet slik at mellomproduktene i katalysen kan dirigeres fra reaksjon til reaksjon, uten å forlate enzymets overflate. Elektronmikrografi av pyruvat dehydrogenasekompleks fra E. coli
7 Pyruvat dehydrogenase (PDH) Kjernekompleks: 60 kopier av E 2 (rød) Periferi av kompleks: 30 kopier av E 1 (tetramer med 2 2 subenheter lilla) 12 kopier of E 3 (homodimer - gul) E1 = Pyruvate dekarboksylase (dehydrogenase) E2 = Dihydrolipoyl transacetylase E3 = Dihydrolipoyl dehydrogenase
8 Pyruvat dehydrogenase (PDH) Dekarboksylering Reaktiv thiol-gruppe (-SH) Bindingen mellom CoA og acetylgruppen fra pyruvat kalles en tioester-binding, og er svært energirik - vi sier at den er aktivert. Dette gjør at acetylgruppen kan doneres til en rekke ulike akseptormolekyler. Både arvelige defekter i enzymkomplekset, og vitaminmangel (f. eks fra høyt alkoholinntak) kan føre til tap av PDH funksjon. Enzym Prostetisk gruppe Koenzym Vitamin prekursor E1 Tiamin pyrofosfat (TPP) Tiamin (Vit. B 1 ) E2 Lipoat (lipoamid) CoA-SH Pantotensyre (Vit. B 5 ) E3 FAD Riboflavin (Vit. B 2 ) NAD + Niacin (Vit. B 3 )
9 dimethylisoalloxazine H 3 C C H C C N C O C NH 2 e + 2 H + H 3 C C H C C H N C O C NH H 3 C C C H C N CH 2 C N C O H 3 C C C H C N CH 2 C N H C O HC OH HC OH HC HC OH FAD FADH 2 OH O O Adenine HC HC OH OH O O Adenine H 2 C O P O P O Ribose H 2 C O P O P O Ribose O- O- O- O- FAD (Flavin Adenin Dinukleotid) er derivert fra vitaminet riboflavin (Vit. B 2 ). Det er ringsystemet i dimetylisoalloxazin som gjennomgår oksidason/reduksjon. FAD er en prostetisk gruppe, permanent bundet til E3. (En prostetisk gruppe er en del av et protein som ikke består av aminosyrer).
10 Regulering av pyruvat dehydrogenase Begge produktene i enzymreaksjonen Acetyl- CoA, og NADH, virker inhiberende på enzymaktiviteten. Aktiviteten reguleres imidlertid også via fosforylering av enzymkomplekset. Fosforyleringen skjer i E1-komplekset, og styres av: Pyruvat dehydrogenase kinase -hemmer -Aktiveres av acetyl-coa, ATP og NADH -Hemmes av pyruvat, CoA og NAD + Pyruvat dehydrogenase fosfatase -aktiverer -Aktiveres av Ca 2+. I skjelettmuskulatur frigjøres Ca 2+ ved trening -Dette aktiverer pyruvat dehydrogenase og energiproduksjonen
11 Under faste vil: Nivået av pyruvat dehydrogenase kinase øke i de fleste vev (blant annet skjelettmuskulatur) samtidig som pyruvat dehydrogenase-nivået synker. Dette hindrer musklene i å forbruke glukose og prekursorer for glukoneogenese. Metabolismen dreies derfor mot fettforbrenning. Nedbrytning av muskelprotein for å drive glukoneogenesen nedsettes. Tilgjengelig glukose spares for bruk i hjernen.
12 Acetyl-Coenzym A er et nøkkelintermediat i metabolismen Acetyl-CoAer et energirikt tioester som produseres fra nedbrytning av både fettsyrer og andre lipider, aminosyrer, karbohydrater mm. Det er derfor det viktigste skjæringspunktet i katabolske og anabolske reaksjoner. I animalske celler, i motsetning til planter, kan ikke acetyl-coa omdannes til karbohydrater. Glukose CO 2 Kolesterol og steroider CoA-SH Aktivert gruppe for overføring av energi Heme Acetyl- CoA Fettsyrer Ketogene aminosyrer Ketonlegemer
13 Sitronsyresyklus (TCA-syklus) Acetyl-CoA donerer acetylgruppen inn i sitronsyresyklus, hvor energien i molekylet trekkes ut via en rekke oksidasjons- og dekarboksyleringsreaksjoner (frigjør CO 2 ). Energien som frigjøres, fanges hovedsakelig opp i form av de reduserte kofaktorene NADH og FADH 2. Disse benyttes til dannelse av ATP via såkalt oksidativ fosforylering.
14 I sitronsyresyklus doneres 2 karbonatomer inn fra acetyl-coa, og to karbonatomer spaltes av i form av CO 2 i hver runde. Karbonatomene som frigjøres i form av CO 2 er ikke de samme som blir donert av acetyl- CoA.
15 1 Sitrat syntase starter syklusen Binding av oksaleddiksyre induserer en stor konformasjonsendring i enzymet (grønn=før binding). Dette åpner et bindingssete for acetyl- CoA. Begge molekylene begraves inne i enzymet, og beskyttes mot det ytre løsningen. Dette favoriserer kondensasjonen. Sterkt negativ G 0 gjør at dette er en exergon reaksjon som dras mot dannelse av citrat. Dette er viktig for flyten i syklusen.
16 2 Aconitase omorganiserer sitratmolekylet Sitronsyren (sitrat) binder til et jernsvovelkompleks som sitter dypt nede i en kløft på enzymet. Ved substratbinding lukkes enzymet, og Fe 4 S 4 -komplekset deltar i a) fjerning av vann b) tilbakeaddering av vann for å danne isositronsyre (isositrat). Reaksjonen er spontan til tross for positiv G 0 pga at isocitrat dras inn i neste reaksjon.
17 3 Isositrat dehydrogenase fjerner første CO 2 NAD + Dette trinnet er en oksidativ dekarboksylering. Isositrat oksideres til -ketoglutarat, samtidig som CO 2 spaltes av. Når isositrat oksideres, blir samtidig kofaktoren NAD + redusert til NADH + H +. Det finnes to former av dette enzymet i alle celler, og den ene av disse krever NAD + som e - akseptor og den andre formen krever NADP +.
18 4 -ketoglutarat dehydrogenase fjerner andre CO 2 -ketoglutarat dehydrogenase er svært likt pyruvat dehydrogenase, og består at tre subenheter E1, E2 og E3. Det har også samme kofaktorer, TPP, lipoat, FAD, NAD + og CoA. Selve reaksjonen er nesten identisk bortsett fra at subenheten E1 binder -ketoglutarat i stedet for pyruvat. Dette trinnet er også en oksidativ dekarboksylering, hvor NAD + samtidig reduseres til NADH. Energirik tioesterbinding
19 5 Succinyl-CoA syntetase danner GTP Energien i tioesterbindingen dannet i forrige trinn er tilstrekkelig til å danne ett molekyl GTP fra GDP. Reaksjonen er reversibel, og enzymet har sitt navn fra den omvendte reaksjonen. Merk at en syntetase foretar kondensasjonsreaksjoner ved bruk av ATP eller GTP, mens en syntase (eks. sitrat syntase) ikke trenger en slik energikilde. Substratnivå fosforylering
20 6 Succinat dehydrogenase danner FADH 2 Indre mitokondri e- membran Succinat (ravsyre-) dehydrogenase er det eneste enzymet i Krebs-syklus som ligger bundet i den indre mitokondriemembranen viktig i elektrontransportkjeden (kompleks II). Det består av 4 subenheter. A inneholder FAD som oksiderer succinat, B inneholder 3 FeS-kompleks, som transporterer elektronene fra FADH 2 til Ubiquinon (Coenzym Q 10 ). Ubiquinon transporterer så e - videre til den endelige e - akseptoren - O 2 (vil bli behandlet under oksidativ fosforylering). Subenhet C og D forankrer Kontroversielt i klinisk enzymet i den indre sammenheng. mitokondriemembranen.
21 7 Fumarase adderer H 2 O Enzymet består av to like subenheter (homodimer), som hver kan binde ett molekyl fumarat. Fumarat hydreres (vann adderes) til L-malat.
22 8 Malat dehydrogenase danner NADH NAD + Enzymet katalyserer det siste trinnet i sitronsyresyklus. Oksaleddiksyre som dannes blir imidlertid fort omsatt videre i en ny runde i TCA, og nivået av oksaleddiksyre i cellen er derfor svært lavt ( likevekten dras mot høyre)
23 TCA oppsummert Merk: De to karbonatomene som kommer ut som CO 2 er ikke de samme som kom inn via Acetyl-CoA. (I succinat og fumarat kan ikke lengre de opprinnelige C-atomene fra acetyl-coa identifiseres pga at de er symmetriske molekyler.) Utbytte av 1 runde: 1 FADH 2, 3 NADH (4 medregnet pyruvat Acetyl-CoA) og 1 GTP (ATP)
24 * Regulering av TCA Viktigste reguleringsmåter: 1. Tilgjengelighet av substrat 2. Produktinhibering 3. Allosterisk feedback inhibering
25 Regulering av TCA 1. Tilgjengelighet av substrat- avhengig av metabolsk tilstand (f.eks sitrat syntase) 2. Produkt inhibering (P) og allosterisk feedback inhibering a) Alle dehydrogenaser [NADH]/[NAD + ] kan inhiberes av massevirkning av NADH i konkurranse med NAD + for å binde seg til enzymet (NAD + er substrat for 3 ulike enzymer) - P b) Sitrat syntase & -ketoglutarat dehydrogenase Produkt inhibering av citrat og succinyl-coa, - P c) Sitrat syntase, Isositrat & -Ketoglutarat dehydrogenase Allosterisk feedback inhibering av NADH og/eller ATP d) Pyruvat dehydrogenase Acetyl CoA konkurrerer med CoA for å binde seg til E2 P
26 Mellomprodukter i sitronsyresyklus brukes som utgangspunkt for mange syntesereaksjoner. For at syklusen ikke skal stoppe opp, kan mellomprodukter fylles på på to steder - malat og oksalacetat. Slike påfyllingsreaksjoner kalles anaplerotiske reaksjoner. Anaplerotiske reaksjoner
27 Hvorfor kan ikke cellene bryte ned pyrodruesyre direkte til CO 2 uten å måtte bygge opp et mer komplisert molekyl (sitronsyre) før endelig nedbrytning? Mulig rute O CH 3 C C O OH O CH 3 C H O CH 3 C OH CH 4 Pyruvat Acetaldehyd Eddiksyre Metan CO 2 CO 2 I praksis ville dette ha blitt et problem, da cellene ikke lett kan omsette metan videre. Dessuten er eddiksyre et relativt stabilt molekyl, som ikke lett omsettes i cellene. Løsningen blir derfor å aktivere eddiksyremolekylet (Acetyl-CoA) og derfra kondensere det til et annet molekyl (oksaleddiksyre), slik at sistnevnte tjener som bærer av eddiksyremolekylet mens det brytes ned i en syklisk prosess. Dessuten vil en slik syklus tjene som mottakssentral for produkter dannet fra andre katabolske prosesser.
28 Cellulær respirasjon I oksidativ fosforylering konvergerer degradering av karbohydrater, aminosyrer og fett. Oksideres og mister e - Mesteparten av all ATP som dannes av organismer blir syntetisert via: Oksidativ fosforylering (dyr, mikroorganismer) Fotosyntese (planter) Ved cellulær respirasjon blir O 2 redusert til H 2 O vha elektroner donert fra NADH og FADH 2. e - (energien) konserveres som:
29 Transport av elektroner kan utføre arbeid Når vi kobler et batteri til en motor, vil strømmen av elektroner fra den ene polen til den andre polen kunne få motoren til å utføre arbeid. Tilsvarende vil elektroner som doneres fra ett molekyl til et molekyl med høyere elektronaffinitet (mer stabilt), avgi energi. Denne energien kan benyttes av cellene til å utføre arbeid. Det er dette prinsippet som benyttes for å syntetisere ATP fra de reduserte elektronbærerne NADH og FADH 2. Elektronene vandrer mot forbindelser som har høyere standard reduksjonspotensiale.
30 Mitokondriet Mitokondriet er omgitt av to membraner. Ytre membran er fritt permeabel for små molekyler og ioner (< 5000 Da) via porin. Indre membran har mye større areal enn ytre, foldet i kristae. To funksjonelle rom: indre (matriks) og ytre. Indre membran er ikke permeabel for andre forbindelser enn de som har egne transportører. Proteinene som utfører oksidativ fosforylering sitter i indre membran a) Elektrontransportkjeden b) ATP syntasen
31 e - overføres fra NADH til flavin mononukleotid (FMN), og via FeS bærere til coenzymq (Q) (Kompleks I) e - fra FADH 2 går inn i elektrontransportkjeden på et lavere energinivå (i forhold til kompleks I). e - overføres til cytokromc i kompleks III, og overføres til kompleks IV. e - brukes til slutt til å redusere O 2 til H 2 O H + kan bare nå inn i matrix via proton-spesifikke kanaler (F o ). Protongradienten som oppstår tilfører nødvendig energi for å danne ATP, og er katalysert av F 1 komplekset som er assosiert med F o.
32 Elektronenes vandringsretning Elektronene vandrer mot høyere standard reduksjonspotentiale NADH Q cyt b cyt c 1 cyt c cyt a cyt a 3 O 2
33 Kompleks I: NADH-ubiquinon oksydoreduktase Dette er et stort proteinkompleks med 42 subenheter. Enzymet har to oppgaver: 1. Overføre et hydridion fra NADH og ett proton fra matrix, til ubiquinon dannelse av ubiquinol (QH 2 ). 2. Bruke energien som frigjøres til å pumpe 4 protoner ut til intermembranrommet.
34 Fra ubiquinon (Q) til Ubiquinol (QH 2 ) Komplett reduksjon av ubiquinon til ubiquinol krever to elektroner og to protoner. Ubiquinon er et lite, fettløselig molekyl, som kan flyte fritt inne i mitokondriemembranen, og transportere elektroner mellom de ulike kompleksene.
35 Kompleks II: Succinat dehydrogenase Det eneste proteinet i Krebs syklus som sitter i mitokondriemembranen. Elektroner tatt opp fra succinat passerer via FADH 2 og 3 FeSkompleks til ubiquinon. Merk at elektroner overført til kompleks II ikke kan bidra til protonpumping i kompleks I. A/B: Forlenging til matrix C/D: Transmembran enhet
36 Kompleks III: Cytokrom bc 1 -komplekset To e - overføres fra ubiquinol (QH 2 ) til to ulike FeS kompleks inne i proteinet. Derfra følger en komplisert overføring via cytokrom b og cytokrom c 1, før de to elektronene overføres til to molekyler cytokrom c, som sitter løst bundet på overflaten ut mot intermembranrommet. Cytokrom C Under denne prosessen pumper kompleks III 4 protoner ut til intermembranrommet. 4H +
37 Kompleks IV: Cytokrom oksydase Dette er det siste trinnet i elektrontransportkjeden. Her overføres to e - fra cytokrom c til to kopperioner bundet til proteinet. Deretter passerer elektronene cytokrom a, og til slutt cytokrom a3 bundet til enda et kopperion. Elektronene tas derfra opp av molekylært oksygen. For hver 4 elektroner som passerer kompleks IV, brukes 4 protoner fra matrix til å danne 2 molekyler vann, samtidig som 4 protoner pumpes ut i intermembranrommet.
38 Oppsummering av elektrontransportkjeden For hvert elektronpar som doneres inn via NADH, pumpes 10 protoner ut. For elektronpar som doneres inn direkte til kompleks II fra succinat-trinnet i Krebs-syklus, pumpes 6 protoner ut.
39 Akkumulering av protoner genererer en kjemiosmotisk gradient Både forskjellen i protonkonsentrasjonen og ladningsforskjellen bidrar til denne gradienten, og utgjør en kraft som er i stand til å utføre arbeid.
40 Kjemiosmotisk modell H + ute = 10X H + inne Elektronenes vandring gjennom elektrontransportkjeden har medført: Frigjøring av energi ved overføring av elektroner til O 2 Transport av protoner ut av matriks Overskudd av elektrokjemisk energi til å drive syntese av ATP.
41 Kjemiosmotisk modell Ifølge denne modellen ligger den elektrokjemiske energien i proton-gradienten og ladningsforskjellen over mitokondriemembranen. ATP syntesen drives av denne protondrivkraften. Disse er koblet sammen slik at ATP syntesen er avhengig av proton drivkraften og proton drivkraften (protongradient + ladningsforskjell) er avhengig av ATP syntesen.
42 Gradienten er koblet til ATP-syntese
43 ATP syntase (kompleks V) Stort membranintegrert protein. Består av to deler; F o og F 1. F o er en transmembran kanal hvor protoner passerer gjennom. F 1 er et perifert protein på membranens innside. F 1 utfører ATP syntesen. F 1 F 0
44 F0 F 1 er en kompleks ATPase Når protoner strømmer gjennom F 0 -delen, roterer denne og hele - skaftet. Dette får de tre aktive setene på -enhetene til å endre konformasjon etter tur. ADP + P i ATP + H 2 O G 0 0 kj/mol (!) F 1 F 0 1.Høy ADP/Pi-binding. 2.Kraftig binding av ATP (forskyver likevekten mot ATP). 3.Svak binding av ATP (ATP frigjøres). Det dannes 3 ATP pr runde.
45 Mange stoffer kan koble ut elektrontransporten (Inhiberer overføring av e - til jern-svovel senter i kompleks I) (Hemmer oksidasjon av ubiquinol i kompleks III) (Bindes til redusert Fe 2+ i komplex IV)
46 Energiutbytte i TCA/elektrontransportkjeden 1 glukosemolekyl: NADH 2 e- via ETC I, III, IV 10 H + pumpes ut ~ 2.5 ATP FADH 2 2 e- via ETC II, III, IV 6 H + pumpes ut ~ 1.5 ATP 1 NADH 2.5 ATP (2x4x2.5 20 ATP) 1 FADH 2 1.5 ATP (2x1x1.5 3 ATP) 1 GTP 1 ATP (2x1x1 2 ATP) 25 ATP
47 Malat-aspartat shuttle (Lever og hjerte) Totalt energiutbytte fra glukosenedbrytning varierer etter hvilken måte redusert NADH fra glykolysen transporteres inn i mitokondriene. To mulige shuttle - mekanismer: malat-aspartat glycerol-fosfat Elektroner fra NADH i cytosol overføres til matrix via malat-aspartat shuttle. NADH gjendannes i matrix.
48 Glycerol-fosfat shuttle (Muskel og hjerne) Elektroner fra NADH i cytosol overføres glycerol- 3-fosfat vha glycerol-3- fosfat dehydrogenase (cytoplasma). Glycerol-3-fosfat reoksideres til dihydroksyacetonfosfat av samme enzym (mitokondriemembran). I denne reaksjonen overføres elektronene til FADH 2 og taes med inn i elektrontransportkjeden.
49 Nettoreaksjon fra NADH/FADH 2 til O 2 NADH + H + + 1/2 O 2 H 2 O + NAD + G o = - 220 kj/mol FADH 2 + 1/2 O 2 H 2 O + FAD G o = - 150 kj/mol Sterkt eksergone reaksjoner Energien brukes til å pumpe protoner ut av matriks Overføring av to elektroner fra NADH til O 2 medfører utpumping av 10 protoner => dannelse av 2,5 ATP Overføring av to elektroner fra FADH 2 til O 2 medfører utpumping av 6 protoner => dannelse av 1,5 ATP
50
51 Regulering av oksidativ fosforylering ATP produksjonen reguleres hele tiden for å møte cellens behov. Akseptor kontroll: respirasjonen reguleres av tilgangen på ADP. Massevirkningsforholdet dvs forholdet ATP / (ADP + Pi) regulerer Dette forholdet er normalt svært høyt dvs nesten alt er ATP. Når cellens aktivitet medfører forbruk av ATP økes tilgangen på ADP og dermed øker respirasjonen. Svært rask regulering sørger for nærmest konstante nivåer av ATP i enhver celle.
52 ATP kontrollerer sin egen syntese ATP/ADP ratioen kontrollerer alle viktige reguleringspunkter i katabolismen. ATP kontrollerer dermed sin egen syntese.
53 Kreftceller omdanner glukose til laktat uavhengig av O 2 - tilgang (Otto Warburg i 1924). Warburg effekten Hva er grunnen til at kreftceller foretrekker å drive aerob glykolyse? Van der Heiden, Science, 2009
54 Warburg effekten Årsak: Glukoseopptak/glykolyse ~10x raskere i kreftceller sammenlignet med normale celler. En del glykolytiske enzymer er overprodusert i kreftceller.
55 Klinisk betydning: Warburg effekten 1) Mål for terapi: a) Hemmere av hexokinase (2- deoxyglukose, lonidamin og 3- brompyruvat) b) Hemmer av tyrosin kinase (Imatinib) lavere syntese av hexokinase CT PET m/isotop merket glukoseanalog Fusjonert bilde (m/ farge) 2) Diagnostikk: Positron emisjons tomografi (PET) kan brukes til å detektere tumorer vha isotopmerket glukoseanalog PET scanning kan detektere områder med høy glykolyseaktivitet.
56 Oppsummering: Hva bør du kunne etter denne ukas forelesninger? Relevante læringsmål, Biokjemi: 2.1.1.8 beskrive nedbrytingen av glykogen, disakkarider, monosakkarider og fettsyrer, og forklare hvordan slik nedbryting er koplet til dannelse av ATP 2.1.1.9 beskrive syntesen av glukose og glykogen Glykolyse/Glukoneogenese/Glykogensyntese/nedbrytning/TCA/ Oksidativ fosforylering 1. Fokuser på å forstå hva som skjer og hvorfor Tips: Det er lettere å forstå når man vet litt detaljer 2. Regulering av disse prosessene 3. Sett kunnskapen inn i et klinisk perspektiv