CINtec PLUS Kit. Bruksanvisning

Bruksanvisning CINtec PLUS Kit CINtec PLUS Kit er en immunocytokjemi-analyse for simultan kvalitativ deteksjon av p16 INK4a og Ki-67-proteiner i livmorhalscytologi-klargjøringer. Det skal brukes som hjelpemiddel til identifisering av kvinner med høygradige cervikale intraepitellesjoner i en screeningpopulasjon, og i undergruppene av pasienter med Papcytologiresultat på ASC-US (atypiske skvamøse celler av ubestemt signifikans) eller LSIL (lavgradig, skvamøs intraepital lesjon) eller i pasienter med positive høyrisiko-hpv-testresultater. Roche mtm laboratories AG Sandhofer Straße 116 D-68305 Mannheim Germany www.cintec.info 9531 50 2 8 C

Innholdsfortegnelse I. Produktets navn... 2 II. Beregnet bruk... 2 III. Sammendrag og forklaring av enheten... 2 Bakgrunn... 2 Klinisk signifikans... 3 Prosedyreprinsipp... 5 IV. Reagenser... 5 Materialer som følger med... 5 Oppbevaring... 7 Nødvendige materialer og reagenser som ikke medfølger... 7 Nødvendig utstyr... 8 V. Advarsler og forholdsregler... 8 Advarsel... 8 Forsiktig... 9 VI. Prosedyrer... 9 Klargjøring av cytologiske prøver... 9 Varmefremkalt epitopgjenvinningsbehandling av prøver før farging... 11 Objektglassfargingsprosedyrer... 11 1. Klargjøring av reagens... 11 1.1 Epitope Retrieval Solution... 11 1.2 Wash Buffer... 12 1.3 Substrat-kromogenløsninger (DAB og Fast Red)... 12 1.4 Kontrastfarge... 13 1.5 Monteringsmedium... 13 2. Fargeprosedyre... 13 2.1 Rehydrering av prøver... 13 2.2 Epitopgjenvinning... 14 2.3 Fargingsprotokoller... 15 2.3.1 Fargingsprotokoll for automatiske fargingsinstrumenter (Dako, LabVision)... 15 2.3.2 Fargingsprotokoll for Shandon Coverplate System... 17 2.4 Kontrastfarging med hematoksylin... 18 2.5 Montering... 19 VII. Kvalitetskontroll... 20 Positiv kontroll... 20 Negativ kontroll... 20 Analysebekreftelse... 20 VIII. Tolkning av resultater... 20 IX. Begrensninger... 21 X. Ytelsesegenskaper... 22 XI. Feilsøking... 28 XII. Symboler... 32 XIII. Produsent... 32 XIV. Revisjonsstatus... 32 XV. Lovmerknad... 32 Vedlegg 1: Referanser... 33 Vedlegg 2: Tabeller... 35 REF 9531 1 / 44 2009-9531-001NO Rev 2.2

I. Produktets navn CINtec PLUS Kit II. Beregnet bruk Til in vitro diagnostisk bruk. CINtec PLUS Kit er en immunocytokjemi-analyse for simultan kvalitativ deteksjon av p16 INK4a og Ki-67-proteiner i livmorhalscytologi-klargjøringer. Det skal brukes som hjelpemiddel til identifisering av kvinner med høygradige cervikale intraepitel-lesjoner i en screeningpopulasjon, og i undergruppene av pasienter med Pap-cytologiresultat på ASC-US (atypiske skvamøse celler av ubestemt signifikans) eller LSIL (lavgradig, skvamøs intraepital lesjon) eller i pasienter med positive høyrisiko-hpv-testresultater. Pakken er beregnet på bruk i medisinske cytologilaboratorier. Tolkning av testresultatene kan kun gjøres av sertifisert personale i sammenheng med pasientens kliniske historie og tilleggsdiagnostiske tester som er utført. III. Sammendrag og forklaring av enheten Bakgrunn I eukaryotiske celler påvirkes fremdriften av celledelingssyklusen av et komplekst mønster av kontrollerte uttrykks- og post-omsettelige modifikasjoner (f.eks. fosforylering) av cellecyklus-regulerende proteiner. Proteinet p16 INK4a spiller en stor rolle i denne reguleringsmekanismen av den eukaryotiske cellecyklusen. Det er en del av retinoblastoma-proteinets (prb)-medierte kontroll av G1-S-faseovergang, og det utløser cellesyklusarrest i løpet av celledifferensieringsprosesser. Dermed gir p16 INK4a en anti-proliferativ effekt når uttrykt under vanlig cellecyklusprogresjon. I terminalt differensierte epitelceller er p16 INK4a -uttrykk nedregulert til nivåer som vanligvis ikke kan påvises av immunocytokjemi [gjennomgått i 31;35] Ki-67 er et proliferasjons-assosiert protein som kan detekterers i kjernen utelukkende i prolifererende celler. Detaljerte cellesyklusanalyser har vist at Ki-67- antigenet finnes på detekterbare nivåer i alle faser så vel som i mitose, mens hvilende celler i G 0 -fasen uttrykker ikke antigenet [gjennomgått i 3;26]. Da celler som overuttrykker p16 INK4a aktivt kan prolifereres bare etter at cellesykluskontrollmekanismen er svekket, kan uttrykket for både proliferasjonsmarkøren Ki-67 og p16 INK4a i den samme cellen gjensidig utelukke hverandre under normale fysiologiske forhold. Derfor kan samtidig uttrykk av Ki-67 og p16 INK4a i enkelte celler brukes som indikator for dereguleringen av cellesykluskontrollen i de respektive cellene. I cervikal neoplasi har p16 INK4a vist seg å være sterkt overuttrykt som konsekvens av den funksjonelle inaktiveringen av prb mediert av E7-onkoproteinet fra høyrisikotyper av humant papillomavirus (HR-HPV) [13;22]. Da E7 er nødvendig for å etablere og opprettholde en ondartet fenotype i HPV-assosiert pre-kreft- og kreftlesjoner, er overtrykk av p16 INK4a direkte knyttet til den onkogene aktiviteten til de forskjellige HR-HPV-typene og er dermed foreslått som en surrogatmarkør for å forvandle HPV-infeksjoner [gjennomgått i 6;31;35]. REF 9531 2 / 44 2009-9531-001NO Rev 2.2

Flere studier har analysert og demonstrert den kliniske anvendeligheten av p16 INK4a immunofarging i cervikal histologi [2;6;7;11-14;17;18;20-22;32] og cytologi [4-6;8-10;13;15;17;19;20;25;29;30;33;34;37]. Den konunktive tolkningen av objektglass farget for p16 INK4a ved hjelp av CINtec Histology Kit (Roche mtm laboratories AG) har i forskjellige studier vist segå øke både interobservatør-reliabiliteten ogden diagnostiske nøyaktigheten for deteksjonen av CIN2 og høyere gradslesjoner [2;11;14] betraktelig. Videre kan CIN1-lesjoner positive for p16 INK4a ha større sannsynlighet for utvikling til høygradslesjoner sammenlignet med de CIN1- lesjonene som testes negative for p16 INK4a [7;18]. I cervikal cytologi har immunfarging for p16 INK4a vist seg å gi et verdifullt verktøy for effektiv sortering av Pap-cytologitilfeller kategorisert som atypiske skvamøse celler av ubestemt signifikans (ASC-US) eller lavsgrads skvamøs intraepitellesjoner (LSIL), med sensitivitetsnivåer for deteksjonen av underliggende CIN2 og høyere lesjoner som ligner på de til HPV-testing, men som gir en signifikant høyere spesifisitet [5;9;10;15;19;25;29;30;33;34;37]. p16 INK4a -cytology er også foreslått som en verdifull tilleggsmarkør for sorteringen av kvinner som testes positive for HR-HPV i cervikal kreftscreening [4]. Virtuelt har alle høygrads-cervikale intraepitele lesjoner (dvs. CIN2 eller 3 og høyere) vist seg å overuttrykke p16 INK4a [2;6;11;13;17;20;32]. Da en stor andel epitelceller i CIN-lesjoner også viser proliferativ aktivitet, kan deteksjonen av cervikale epitelceller som samtidig uttrykker både p16 INK4a og Ki-67, brukes som indikator for forandret cellestatus. Derfor kan en tilnærming basert på evalueringen av cervikale cytologiprøver i forhold til forekomst av individuelle cervikalt epitelceller som viser et positivt dobbeltfargeresultat for p16 INK4a og Ki-67 gi både høye nivåer av sensitivitet og spesifisitet for forekomsten av prekreft- og kreftsykdom. Klinisk signifikans Tolkningen av klargjøring av cervikale cytologiobjektglass som er immun-farget for samtidig deteksjon av uttrykket av cellesyklus-regulerende protein p16 INK4a og proliferasjonsmarkøren Ki-67 har vist seg å identifisere kvinner med høygradig cervikal intraepitelt neoplasi (HGCIN) med høy sensitivitet og spesifisitet når brukt I en screeningpopulasjon som et tillegg til rutinemessig Pap-cytologitesting, I undergruppen av pasienter med Pap-cytologiresultater av ASC-US eller LSIL, eller I undergruppen av pasienter med negativ Pap-cytologi, men positive HPVtestresultater. Det er en stor utfordring for folkehelsen å identifisere kvinner effektivt i en rutinemessig cervikal screeningpopulasjon som har HGCIN. På grunn av lav prevalens av høygradig prekreft-lesjoner (vanligvis mindre enn 1 % av kvinner i en asymptomatisk screeningpopulasjon) er tilgjengeligheten av screening-tester og prosedyrer som identifiserer kvinner med etablert HGCIN med både høy sensitivitet og høy spesifisitet, av stor betydning [24]. REF 9531 3 / 44 2009-9531-001NO Rev 2.2

Gjennom de siste tiårene har Pap-cytologitesting for morfologiske abnormaliteter vist seg å være vellykket i reduseringen av cervikal kreft-forbundet morbiditet og dødelighet i de landene som har opprettet screeningprotokoller for livmorhalskreft. Til tross for den generelle suksessen, er det imidlertid utilfredsstillende lav sensitivitet for én enkelt Pap-cytologitest (vanligvis i området 50-70 % [16], som krever korte screening-intervaller for å kompensenre for den ganske lave sensitiviteten til et enkelt cytologitestresultat. Samtidig har spesifisiteten av Papcytologitestingen vist seg å være relativt høy, selv om den kan variere i betydelig grad basert på egensakpene til den enkelte screeningpopulasjonen, inkludert alder, HPV-prevalens, forskjeller i Pap-metoder (tradisjonelle celleprøver kontra væskebasert cytologi), teknologier som brukes (dvs. manuell tolkning kontra dataassisert cytologi/avbilding) og avhengig av de enkelte kontrollørenes erfaring. HPV-testing er foreslått som potensiell tilnærming for å forbedre gjeldende Papcytologibasert screening for livmorhalskreft og forløper-lesjoner [24]. Selv om testing for HPV har vist seg å gi høy sensitivitet for identifiseringen av kvinner med HGCIN, resulterer den høye prevalensen av de fleste forbigående infeksjoner med høyrisiko HPV-typer i generelt lave spesifisitetsnivåer. Da HPV-prevalensen varierer etter alder, har HPV-testing bare vært foreslått for en potensiell testing sammen med Pap-cytologitesting hos kvinnerfra og med 30 år. [1] I tillegg til å definere den optimale tilnærmingen for å implementere effektive primære screening-teknologier og algoritmer, er det flere interesseområder i livmorhalskreft-screening hvor eksisterende teknologier kan forbedres for å optimere nøyaktigheten av å identifisere HGCIN, eller der det for tiden ikke finnes noe verktøy i det hele tatt. Sorteringen av tvetydige (ASC-US, atypiske skvamøse celler av ubestemt signifikans) eller mildt abnormale (LSIL, lavgradig, skvamøs intraepitel lesjon) Pap-cytologiresultater tilhører denne kategorien, så vel som behandlingen av kvinner 30 år og eldre med screening-resultater fra Pap/HPV medtestingstilnærminger som ble kategorisert som negative for intraepitellesjoner eller ondartethet (NILM) på Pap, men positivt testet for høyrisiko-hpv. For sorteringen av ASC-US-cytologiske abnormaliteter viste en sorteringsstrategi som innlemmet HPV-deteksjon i ASC-US-populasjonen seg å være sensitiv for å detektere underliggende HGCIN. Spesifisitet er imidlertidig tydelig mindre enn optimale og viser seg å være aldersavhengig [27;36]. Videre, da det store flertallet av LSIL-tilfeller har vist seg å være positive for høyrisiko-typer HPV [23], ville sortering av LSIL Pap-cytologiresutolater med HPV være svært ineffektive. Da kolposkopitjenester er begrenset og kostnaden av disse tjenestene og etterfølgende behandling av lavgradige lesjoner er spesielt høye, er det kontinuerlig interesse i tilgjengeligheten av en sorteringstest for kvinner med ASC-US og LSIL med forbedrede utførelsesegenskaper, spesielt i forhold til spesifisitetsnivået som er gitt. Introduksjon av en biomarkørtest med høy sensitivitet og spesifisitet som kan identifisere pasienter som har etablert høygradig cervikal sykdom, ville være gunstig i behandlingen av kvinner med usikre og lavgradige cytologiske abnormaliteter. En slik test ville ha potensiale til å 1) gi bedre stratifisering av pasienter med ASC-US Pap-cytologiresultater og 2) åpne muligheten for å sortere LSIL Pap-cytologiresultatene på en effektiv måte. I likhet med situasjonen for sorteringen av LSIL Pap-cytologiresultater er ingen verktøy tilgjengelige for tiden for å bidra til sorteringsscreening-resultater som var negative ved Pap-cytologi, men som testet positivt for høyrisiko-hpv. Med ca. 5-7 % av Pap/HPV-testresultatene representerer dette en økende gruppe tilfeller som ville kreve en fullstendig kolposkopioppfølging for å benytte det høyere deteksjonspotensialet av HPV-testen fremfor Pap-cytologitesting. Men da REF 9531 4 / 44 2009-9531-001NO Rev 2.2

frekvensen av underliggende høygradig sykdom i denne gruppen med screeningtestresultater fortsatt kan forventes å være relativt lav, ville tilgjengeligheten av et effektivt sorteringsverktøy være meget ønskelig for å behandle effektivt kvinner med positive HPV-testresultater som ikke er avstemt med abnormalt Papcytologiresultater. Prosedyreprinsipp CINtec PLUS Kit inneholder et sett med reagenser for immuncytokjemisk deteksjon av p16 INK4a og Ki-67-antigener. Pakken er utformet til å utføre en totrinns immunocytokjemisk fargingsprosedyre for cytologiske prøver hentet fra livmorhalsen. For deteksjonen av antigenene brukes en primær monoklonal antistoffklon av mus E6H4 rettet mot humant p16 INK4a -protein og en primær monoklonal antistoffklon av kanin 274-11 AC3 rettet mot humant Ki-67-protein. Visualiseringsreagenser, klare til bruk, bestående av (i) en polymerreagens konjugert til pepperrot peroksidase og anti-mus Fab'-antistoff-fragmenter av geit, og (ii) en polymerreagens konjugert til alkalisk fosfatase og anti-kanin Fab'-antistofffragmenter av geit, brukes. Visualiseringsreagenser er underlagt solidfaseabsorpsjon for å eliminere kryssreaktivitet med humane immunoglobuliner. Kromogen-reaksjonene er basert på pepperrot peroksidase -mediert konvertering av et DAB-kromogen, og alkalisk fosfatase-mediert konvertering av Fast Red kromogen til synlige reaksjonsprodukter på de respektive antigenstedene. Etter motfarging må en totrinns-monteringsprotokoll anvendes: I et første trinn må en vannholdig montering av prøvene med et vannholdig monteringsmedium brukes med pakken. Deretter må objektglassene dekkes med glass ved hjelp av et permanent monteringsmedium. Resultatene kan evalueres med lysmikroskopiinspeksjon. IV. Reagenser Materialer som følger med Materialene som er oppgitt nedenfor er inkludert i hver pakke og er tilstrekkelig til å utføre 50 tester. Antallet tester er basert på bruken av 200 µl av reagensene per objektglass. 1 Peroxidase Blocking Reagent Peroxidase Blocking Reagent 11,5 ml klar til bruk 3 % hydrogenperoksid, som inneholder 15 mmol/l natriumazid (NaN 3 ). Sikkerhetsdatablad er tilgjengelig på forespørsel. REF 9531 5 / 44 2009-9531-001NO Rev 2.2

2 Primary Antibodies Solution Primary Antibodies Solution 11,5 ml klar til bruk Monoclonal mouse anti-human p16 INK4a antibody, Clone E6H4 og monoclonal rabbit anti-human Ki-67 antibody Clone 274-11 AC3, er levert i 50 mm Tris-buffer ph 7,2, som inneholder 15 mmol/l natriumazid (NaN 3 ) og stabiliserende protein. 3 Visualization Reagent HRP Visualization Reagent HRP 11,5 ml klar til bruk Polymerreagens konjugert med pepperrot peroksidase og affinitetsrenset anti-mus Fab' antistoff-fragmenter av geit, levert i stabiliseringsløsning bestående av konserveringsmidler og stabiliserende protein. Inneholder 5-bromo-5-nitro-1,3-dioksan som kan fremkalle en allergisk reaksjon. Sikkerhetsdatablad er tilgjengelig på forespørsel. 4 Visualization Reagent AP Visualization Reagent AP 11,5 ml klar til bruk Polymerreagens konjugert med alkalisk fosfatase og affinitetsrenset antikanin Fab' antistoff-fragmenter av geit, levert i stabiliseringsløsning bestående av konserveringsmidler og stabiliserende protein. Inneholder 5-bromo-5-nitro-1,3-dioksan som kan fremkalle en allergisk reaksjon. Sikkerhetsdatablad er tilgjengelig på forespørsel. 5 DAB Buffered Substrate DAB Buffered Substrate 16,0 ml, Substratbufferløsning, ph 7,5, som inneholder < 0,1 % hydrogenperoksid, stabilisatorer, forsterkere og en antimikrobiell agent. 6 DAB Chromogen DAB Chromogen 0,85 ml, 3,3 -diaminobenzidin-kromogenløsning. DAB er skadelig. Se følgende Risiko- og sikkerhetssetninger: R40 Begrenset bevis på en karsinogen effekt. R43 Kan føre til sensibilisering ved hudkontakt. R68 Mulig risiko for irreversible effekter. S35 Dette materialet og beholderen må avhendes på en trygg måte. S36/37 Bruk egnede verneklær og hansker. REF 9531 6 / 44 2009-9531-001NO Rev 2.2

MERK: Selv om diaminobenzidin er strukturelt relatert til benzidin, er det ingen tegn til karsinogenisitet av diaminobenzidin. Ta kontakt med lokale eller nasjonale myndigheter for forskrifter om avhending. Sikkerhetsdatablad er tilgjengelig på forespørsel. 7 Naphthol Phosphate Substrate Naphthol Phosphate Substrate 25,0 ml, Substratbuffer-løsning, ph 9,2 som inneholder Naftol AS-TR-fosfatsubstrat, stabilisatorer, forsterkere og en antimikrobiell agent. 8 Fast Red Chromogen Fast Red Chromogen 1,33 ml, Fast Redkromogenløsning. 9 Epitope Retrieval Solution 10 x Epitope Retrieval Solution 10 x 500 ml, 100 mm Tris, 10 mm EDTA, ph 9,0, som inneholder 15 mmol/l natriumazid (NaN 3 ). 10 CINtec PLUS Mount CINtec PLUS Mount 18,0 ml, vannbasert permanent monteringsmedium for den permanente konserveringen av objektglasspreparater farget med peroksidase og alkalisk fosfatasebaserte visualiseringssystemer. Inneholder 7,7 mmol natriumazid (NaN 3 ). Oppbevaring Oppbevares ved 2 8 C. Skal ikke brukes etter holdbarhetsdatoen. Ingen data er generert i forhold til oppbevaringen av reagensene under alle andre forhold enn de som er oppgitt over. Etter at pakken er åpnet, er komponentene stabile i 6 måneder hvis oppbevart ved 2 8 C. Løsninger må kastes hvis de virker grumsete. CINtec PLUS Mount-flasken (Flaske 10) skal fjernes fra esken etter at pakken er åpnet for første gang og kan oppbevares videre ved romtemperatur (2 30 C). Diluted Wash Buffer og fortynnet Epitope Retrieval Solution er stabile i 1 måned hvis oppbevart ved 2 8 C. Løsningene må ikke brukes hvis de virker grumsete. Nødvendige materialer og reagenser som ikke medfølger Wash Buffer som skal brukes med CINtec PLUS Kit er tilgjengelige under Katalognummer 8550 fra Roche mtm laboratories AG men er ikke inkludert i pakken. For detaljer om bestilling, se websiden www.cintec.info. REF 9531 7 / 44 2009-9531-001NO Rev 2.2

Alkoholfri hematoksylin for kontrastfarging: Destillert eller avionisert vann; Etanol, 99 % Xylen-basert monteringsmedium for tildekking med glass; Objektglass: SuperFrost PLUS, ThinPrep Microscopy Slides; BD SurePath PreCoat objektglass Xylen; Dekke av glass eller film; Prosesskontroller f.eks. ThinPrep objektglass produsert av restprøveflasken: Positiv kontroll: ThinPrep objektglass fra (samlede) prøve(r) med Pap-cytologiresultat bekreftet som høygradig, skvamøs intraepitellesjon (HSIL); Nødvendig utstyr Negativ kontroll: ThinPrep objektglass fra (samlede) prøve(r) med Pap-cytologiresultat bekreftet som Negativ for intraepitel lesjon eller ondartethet (NILM). Lysmikroskop (10-40x objektiv-forstørring); Varmebestandige fargingsglass (plast); Målesylindrer; Spruteflaske (som skal fylles med vaskebuffer); Tidsmåler (som kan måle 30 sekunders - 60 minutters intervaller); Vannbad med lokk (kan opprettholde Epitope Retrieval Solution ved 95 99 C); Termometer; V. Advarsler og forholdsregler Advarsel 1. Forsiktig! Noen av reagensene i denne pakken inneholder farlige kjemikalier. Ved håndtering av komponentene i denne pakken, følg forholdsregler for sikkerhet for håndtering av farlige laboratoriereagenser. 2. Komponentene 1, 2, 9 og 10 i dette produktet inneholder natriumazid (NaN 3 ), som er sterkt toksisk i ren form. Selv om natriumazid ikke er klassifisert som farlig, kan det ved produktkonsentrasjoner reagere med bly- og kobberrør og utvikle meget eksplosive ansamlinger av metallazider. Ved avhending, skyll rikelig med vann for å unngå azidoppsamling i rørene. 3. Komponenter 2, 3 og 4 inneholder materiale av animalsk opphav. Følg riktige håndteringsprosedyre slik den er aktuell for produkt som er laget av biologisk opphav. 4. Sikkerhetsdatablad for pakken er tilgjengelig på forespørsel. REF 9531 8 / 44 2009-9531-001NO Rev 2.2

5. Ved håndtering og avhending av cytologiske prøver, inkludert alle prøver før og etter fiksering, så vel som alle materialer som er utsatt for dem, følg forholdsreglene for sikkerhet for håndtering av potensielt smittefarlig materiale så vel som gjeldende krav til avfallsavhending. 6. Aldri pipetter reagenser med munnen. Unngå kontakt mellom hud/slimhinnene og reagenser og prøver. Hvis reagensene eller prøvene kommer i kontakt med huden eller slimhinnene, vask med rikelig med vann. 7. Visualiseringsreagensene DAB Chromogen og Fast Red Chromogen kan påvirkes negativt hvis de utsettes for for mye lys. Ikke oppbevar pakkekomponenter eller utfør farging i sterkt lys, f.eks. direkte sollys. 8. Bruk egnet personlig verneutstyr for å unngå kontakt med øyne og hud ved håndtering av noen av komponentene som er inkludert eller som skal brukes i sammenheng med CINtec PLUS Kit. Se Sikkerhetsdatabladet for mer informasjon. Forsiktig 1. Til in vitro diagnostisk bruk. 2. Kun til profesjonell bruk. 3. Minimer mikrobiell kontaminering av reagenser for å unngå ikke-spesifikk farging. 4. Andre inkubasjonstider, temperaturer eller metoder enn de som er spesifisert, kan gi feilaktige resultater. 5. Ikke bruk pakken hvis hvis emballasjen eller noen av komponentene i den er skadet. Dersom emballasjen kompromitteres eller komponentene skades, vennligst informer produsenten om dette umiddelbart. 6. Avhending av alle avfallsmaterialer må være i samsvar med lokale retningslinjer og forskrifter. 7. Alle reagenser er utviklet spesielt for bruk med denne testen. For at testen skal utføres som spesifisert, skal ingen substitusjoner gjøres. 8. Hvis uventet farging observeres som ikke kan forklares av variasjoner i laboratorieprosedyrer og det er mistanke om et problem med CINtec PLUS Kit, se straks websiden www.cintec.info for mer informasjon om teknisk støtte. 9. Hvis produktet svikter på grunn av problemer med håndtering eller ustabilitet, resulterer det ikke i tydelige tegn. Som kvalitetskontrolltiltak, skal derfor positive og negative kontroller kjøres samtidig med pasientprøver. VI. Prosedyrer Klargjøring av cytologiske prøver Cytologiske prøver må håndteres tilstrekkelig for å konservere prøvene for immunocytokjemiske prosedyrer. Alle prøver skal utsettes for standardmetoder for cellebehandling. REF 9531 9 / 44 2009-9531-001NO Rev 2.2

ThinPrep (Hologic Inc.) objektglass som er klargjort på en ThinPrep 2000 Processor (Hologic Inc.) i henhold til produsentens protokoll, BD SurePath (BD Diagnostics Tripath) objektglass klargjort i henhold til produsentens protokoll, så vel som manuelt klargjorte objektglass (tradisjonelle celleprøver) er egnet for bruk. Merknader: 1. ThinPrep klargjøring av prøve: Vær oppmerksom på at bruken av ThinPrep 3000 Processor anbefales ikke, da sprayfikseringsprosedyren til instrumentet kan føre til betydelig tap av celler. 2. BD SurePath klargjøring av prøve: Da det av og til er rapportert at oppbevaring av restcellemateriale etter berikningsprosessen i vann kan ha en negativ effekt på intensiteten til det immuncytokjemiske signalet, anbefaler vi sterkt at du følger instruksjonene som er skissert nedenfor når objektglassene klargjøres for CINtec PLUS testing for å unngå enhver risiko for signaltap: a. Klargjøring av objektglass direkte etter bearbeiding av Papobjektglasset i. Et nytt objektglass for hvert tilfelle kan klargjøres straks etter at Pap-fargingen av tilsvarende SurePath -objektglass er fullført. ii. Plasser et nytt sett med merkede objektglass i objektglasstativer. iii. På PrepStain med GYN-versjonen 1.1 eller 1.2, Klargjøring av objektglass, velger du programmet "Kun overføring. b. Klargjøring av objektglass fra den berikede cellepelleten etter klargjøring av Pap-objektglass på et senere tidspunkt i. Fjern rørstativene fra PrepStain System og legg til ca. 2 ml av SurePath Preservative Fluid til hvert rør. ii. Sett på dekselet på hvert rør og oppbevar ved romtemperatur i 4 uker eller avkjølt (2 8 C) i opptil 6 måneder. iii. Hvis et objektglass for CINtec PLUS skal lages på en lagret prøve, la prøven nå romtemperatur i 1 time. Start med det andre sentrifugeringstrinnet til GYN berikingsprosess og utfør resten av klargjøringsprosedyren. c. Klargjøring av objektglass fra rester av prøvematerialet som er igjen i den opprinnelige prøveflasken (ca. 2 ml) i. Tilsett 8 ml SurePath Preservative Fluid til restprøven i flasken med SurePath (ca. 2 ml). ii. Den fortynnede prøven skal behandles på PrepMate med standardteknikken og på PrepStain med GYN-versjonen 1.1 eller 1.2, Klargjøring av objektglass, programmet "Kun overføring". Straks etter klargjøring skal ThinPrep eller BD SurePath -objektglass fikseres i 99 % etanol i 10 minutter til 1 time og lufttørkes i 20 minutter til 16 timer (natten over).thinprep eller BD SurePath -cytologiklargjøring må ikke fikseres med cytologisk sprayfikseringsreagens som inneholder polyetylenglykol (f.eks. Merckofix, Merck). REF 9531 10 / 44 2009-9531-001NO Rev 2.2

Tradisjonelle celleprøver skal fikseres med cytologisk sprayfikseringsreagens som inneholder polyetylenglykol (f.eks. Merckofix, Merck) umiddelbart etter prøvetaking. Før du starter immunfargingsprosedyren, må alle prøver rehydreres ved hjelp av spesifikke protokoller beskrevet i Punkt 2.1. MERK: Etanol med minimalt med urenheter trengs for fiksering av ThinPrep væskebaserte cytologi-objektglass for å forhindre bakgrunnsfarging. Under klargjøringen av ThinPrep -objektglass som er beregnet å bli brukt for immunfarging, fornyes etanolbadet etter fiksering av hver 25 ThinPrep objektglass. Varmefremkalt epitopgjenvinningsbehandling av prøver før farging Varmefremkalt epitopgjenvinning (HIER) ved hjelp av Epitope Retrieval Solution inkludert i pakken er nødvendig for optimal analyseutførelse. Avvik fra den beskrevne prosedyren kan påvirke resultatene! For varmefremkalt epitopgjenvinning, må den cytologiske prøven varmes opp ved nedsenking i Epitope Retrieval Solution i et kalibrert vannbad som kan opprettholde Epitope Retrieval Solution ved en temperatur på 95 99 C. Laboratorier som ligger høyere til, skal bestemme best metode for å opprettholde nødvendig temperatur på vannbadet. Produsenten anbefaler ikke noe avvik fra prosedyren som er beskrevet her. Etter varmefremkalt epitopgjenvinning må den cytologiske prøven oppbevares ved romtemperatur i 20 minutter eller lenger, inntil temperaturen er avkjølt til 50 C eller lavere før videre bearbeiding. Farging av den cytologiske prøven må deretter utføres umiddelbart. Objektglassfargingsprosedyrer Pakken inneholder reagensvolum som er nok til å utføre 50 tester. Antallet tester er basert på bruken av 200 µl av reagensene per objektglass. 200 µl per objektglass anbefales for å bearbeide ThinPrep eller BD SurePath cytologiske klargjøringer på Dako eller LabVision Autostainer-instrumenter (to dråpesoner per objektglass med 100 µl hver) eller ved å bruke Shandon Coverplate System (Thermo Fisher Scientific Inc.). 200 µl per objektglass anbefales også å behandle tradisjonelle celleprøver ved hjelp av Shandon Coverplate System. For å sikre fullstendig dekning av tradisjonelle celleprøver med Dako- eller LabVision Autostainer-instrumenter, anbefales imidlertid 300 µl per objektglass (100 µl for alle tre tilgjengelige dråpesoner). 1. Klargjøring av reagens Det anbefales at du klargjør følgende reagenser, bortsett fra Fast Red arbeidsløsningen, før du starter fargeprosedyren. Alle reagenser skal nå romtemperatur (20 25 C) før immunfarging. 1.1 Epitope Retrieval Solution Klargjør volumet med Epitope Retrieval Solution som må til for fargeprosedyren som er planlagt ved fortynning av en mengde av Flaske 9 (Epitope Retrieval Solution 10 x) 1:10 med destillert eller avionisert vann. REF 9531 11 / 44 2009-9531-001NO Rev 2.2

Etter fortynning kan Epitope Retrieval Solution oppbevares ved 2 8 C i opptil en måned. Den fortynnede løsningen må kastes hvis den ser grumsete ut. MERK: Bruk av vann med forhøyede nivåer av ioner for fortynning av epitopgjenvinningsløsningen kan redusere testens fargeytelse betydelig. Pass på at vannet som brukes er riktig destillert eller avioniset (dvs. forsikre deg om at ionutvekslingssøylen for produksjon av avionisert vann er kontrollert i rutinemessig vedlikehold). Ikke bruk vann fra kranen! 1.2 Wash Buffer Bruk Wash Buffer (10 x), katalognummer 8550, levert av Roche mtm laboratories AG sammen med CINtec PLUS Kit. For detaljer om bestilling, se websiden www.cintec.info. Klargjør et volum av Wash Buffer som må til for vasketrinnene i fargeprosedyren som er planlagt ved fortynning av en mengde av Wash Buffer (10 x) 1:10 med destillert eller avionisert vann. Etter fortynning kan Wash Buffer oppbevares ved 2 8 C i opptil en måned. Den fortynnede løsningen må kastes hvis den ser grumsete ut. 1.3 Substrat-kromogenløsninger (DAB og Fast Red) Sørg for at både kromogenene og substratene har nådd romtemperatur (20 25 C). Tilsetning av store mengder kromogen til substratet vil resultere i at det positive signalet svekkes. A) Klargjøring av DAB-arbeidsløsningen før fargekjøringen DAB-arbeidsløsningen er stabil i 8 timer etter klargjøring. Klargjør DAB-arbeidsløsningen som følger: i) Overfør 1 ml av DAB Substrate Solution (Flaske 5) i et rent reagensrør; ii) Tilsett én dråpe (25 30 µl) av DAB Chromogen (Flaske 6) og bland forsiktig ved å snu røret opp ned (ikke roter); iii) Når du bruker den automatiske fargemaskinen, overføres DABarbeidsløsningen i en reagensflaske for fargemaskinen før fargekjøringen startes, og legges deretter på riktig plass i den automatiske fargemaskinen. B) Klargjøring av arbeidsløsningen Fast Red like før bruk Klargjør arbeidsløsningen Fast Red like før bruk, da det ellers kan bli redusert fargeintensitet og dermed tap av sensitivitet. Ikke roter arbeidsløsningen Fast Red, da dette kan resultere i utviklingen av bunnfall. Klargjør arbeidsløsningen Fast Red som følger: i) Overfør 1 ml av Naphthol Phosphate Substrate Solution (Flaske 7) i et rent reagensrør; ii) Tilsett én dråpe (40 45 µl) av Fast Red Chromogen (Flaske 8) og bland forsiktig ved å snu røret opp ned (ikke roter); iii) Når du bruker den automatiske fargemaskinen, klargjøres arbeidsløsningen Fast Red når forespurt av programvaren. Overfør deretter arbeidsløsningen i en reagensflaske for den automatiske fargemaskinen og legg den på riktig plass. Ikke utsett trinnet "substratparti" under kjøringen med den automatiske fargemaskinen for å minimere risikoen for å tørke artefakter. REF 9531 12 / 44 2009-9531-001NO Rev 2.2

1.4 Kontrastfarge DAB og Fast Red fargereaksjonene resulterer i vannløselig farget sluttprodukt (DAB: brun; Fast Red: rød). MERK: Alkoholfri hematoksylin må brukes for kontrastfarging, da bruken av alkohol kan påvirke intensiteten negativt av signalet som genereres av Fast Red, eller fjerne det helt. Hvis brukt, følg instruksjonene som er gitt av leverandøren av hemotoksylin for å utføre kontrastfarging. 1.5 Monteringsmedium For montering av objektglassprøver etter farging, trengs en totrinnsmonteringsprosedyre som beskrevet nedenfor. Først CINtec PLUS Mount (flaske 10), et vannholdig, permanent monteringsmedium, påføres manuelt i et tynt lag og får tørke ("væske-dekke ). I et nytt trinn påføres glassdekke på den tørkede flaten av det vannbaserte monteringsmediet med xylen-basert monteringsmedium. La CINtec PLUS Mount nå romtemperatur før bruk og oppbevar ved romtemperatur for senere bruk. 2. Fargeprosedyre CINtec PLUS Kit er validert for bruk på automatiske fargeinstrumenter (f.eks., LabVision Autostainer 480 eller Dako Autostainer PLUS) i henhold til malen som er skissert nedenfor (se Punkt 2.3.1), så vel som for Shandon Coverplate System (se Punkt 2.3.2). Før farging, skal prøvene og reagensene klargjøres som oppgitt i Punkt 1.1-1.3 og 2.1. Alle reagenser skal nå romtemperatur (20 25 C) før immunfargingsprosedyren utføres. På samme måte skal alle trinn utføres ved romtemperatur. Ikke la prøver tørke under fargingsprosedyren. Tørkede prøver kan vise økt ikke-spesifikk farging. Hvis det brukes mer langvarige inkubasjoner, legges prøvene i et fuktig miljø. 2.1 Rehydrering av prøver For alle cytologiske prøver er et rehydreringstrinn nødvendig før farging. Dette trinnet skal utføres ved romtemperatur (20-25 C). A) ThinPrep væskebaserte cytologiobjektglass og tradisjonelle celleprøver Legg objektglassene i destillert eller avionisert vann og inkuber i 10 (±3) minutter: Begynn fargeprosedyrene som skissert i Punkt 2.2, Trinn 1: Epitopgjenvinning. B) BD SurePath cytologiobjektglass Alkoholfikserte BD SurePath cytologiobjektglass må gjennomgå en spesiell rehydreringsprosedyre for å gjøre spesielt belagte objektglass av glass kompatible med flytende dekkmedium. Påse at objektglassene er lufttørket helt; Legg objektglassene i et nytt bad med 100 % xyeln (bruk xylen-resistente glass); dypp objektglassene et par ganger og inkuber i 2 minutter; Overfør objektglassene i et nytt bad med 99 % etanol og inkuber i 2 minutter; REF 9531 13 / 44 2009-9531-001NO Rev 2.2

Overfør objektglassene i et nytt bad med 70 % etanol og inkuber i 2 minutter; Overfør objektglassene i destillert eller avionisert vann og inkuber i 2 minutter Merk: Bytt ut badene som er brukt til dehydreringen etter behandling av 50 objektglass eller én gang i uken hvis et mindre antall objektglass behandles. 2.2 Epitopgjenvinning A) ThinPrep væskebaserte cytologiobjektglass og tradisjonelle celleprøver Fyll varmebestandige fargeglass (plast) med den fortynnede Epitope Retrieval Solution (se Prosedyre, Punkt 1.1); Plasser fargeglass som inneholder Epitope Retrieval Solution i vannbad og varm vannbadet og Epitope Retrieval Solution til 95 99 C. Temperaturen må måles inne i fargeglassene. Det er viktig å justere nivået av vannet i vannbadet for å sikre at glassene er senket 80 % i vannet. Dekk til glassene med lokk for å stabilisere temperaturen og unngå fordampning; Når en temperatur på 95 99 C er nådd, senkes de rehydrerte cytologiobjektglassene i de forvarmede Epitope Retrieval Solution i fargingsglassene, vil dette trinnet senke temperaturen i glassene til under 90 C. Hold temperatursonden i glassene og sett lokkene godt på fargingsglassene. Still temperaturen på vannbadet og Epitope Retrieval Solution i glassene tilbake til 95 99 C; Sjekk temperaturen på Epitope Retrieval Solution i glassene; Inkuber i 10 (±1) minutter ved 95 99 C; begynn å telle ned først etter at det er bekreftet at temperaturen på Epitope Retrieval Solution i glassene har nådd 95 99 C; Ta hele glasset med objektglassene ut av vannbadet; Ta av lokket på fargeglassene og la objektglassene avkjøles i Epitope Retrieval Solution i 20 (±1) minutter ved romtemperatur til den har nådd 50 C eller lavere; Legg objektglassene i et fargingsglass fylt med Wash Buffer (se Prosedyre, Punkt 1.2) og inkuber i 5 (±1) minutter før obojektglassene lastes på det programmerte automatiske fargeinstrumentet. Når du bruker Shandon Coverplate System, monter objektglassene og dekkplatene i henhold til protokoll REF 2010-953-009NO (fås fra Roche mtm laboratories AG). B) BD SurePath cytologiobjektglass Fyll varmebestandige fargingsglass (plast) med den fortynnede Epitope Retrieval Solution (se Prosedyre, Punkt 1.1). Vær oppmerksom på at når du bruker glass som ikke er laget av varmebestandig plast, men f.eks. metalleller varmebestandig glass, må tidspunktet for epitopgjenvinningen endres på individuell basis; Senk objektglassene i den kalde Epitope Retrieval Solution; sett på lokket på fargingsglasset; REF 9531 14 / 44 2009-9531-001NO Rev 2.2

Legg fargingsglasset i kaldt vannbad og la temperaturen på vannbadet og Epitope Retrieval Solution nå 95 99 C og inkuber i 15 minutter så snart temperaturen er nådd; vær oppmerksom på at tidsperioden for oppvarming av løsningen til 95 99 C ikke skal være lenger enn maks. 40 minutter; Ta hele glasset med objektglassene ut av vannbadet; Ta av lokket av fargeglassene og la objektglassene avkjøles i Epitope Retrieval Solution i 20 (±1) minutter ved romtemperatur til den har nådd 50 C eller lavere; Legg objektglassene i et fargingsglass fylt med Wash Buffer (se Prosedyre, Punkt 1.2) og inkuber i 5 (±1) minutter før obojektglassene lastes på det programmerte automatiske fargeinstrumentet. Når du bruker Shandon Coverplate System, monter objektglassene og dekkplatene i henhold til protokoll REF 2010-953-009NO (fås fra Roche mtm laboratories AG). MERK: Epitope Retrieval Solution er utformet kun for engangsbruk. Ikke bruk på nytt. 2.3 Fargingsprotokoller 2.3.1 Fargingsprotokoll for automatiske fargingsinstrumenter (Dako, LabVision) Før den første påføringen av CINtec PLUS Kit på et automatisk fargeinstrument, må en ny mal settes opp og CINtec PLUS Kit -reagenser må tilsettes "Reagenslisten" for den automatiske fargemaskinen. Se brukerhåndboken for den konkrete automatiske fargemaskinen. Bruken av 200 µl per objektglass anbefales for å behandle ThinPrep - eller BD SurePath cytologiske preparater. For tradisjonelle celleprøver på Dako- eller LabVision Autostainer-instrumenter, kan det være behov for 300 µl av reagenser per objektglass. REF 9531 15 / 44 2009-9531-001NO Rev 2.2

Følgende er en beskrivelse av programkjøringen: Program Trinn ThinPrep cytologiske preparater og tradisjonelle celleprøver 1 skyll* skyll* 2 Peroxidase-Blocking Reagent 5 minutter 3 skyll* skyll* 4 Primary Antibodies Solution 30 minutter 5 skyll* skyll* 6 Visualization Reagent HRP 15 minutter 7 skyll* skyll* 8 skyll* skyll* 9 skyll* skyll* 10 Visualization Reagent AP 15 minutter 11 skyll* skyll* 12 skyll* skyll* 13 skyll* skyll* BD Surepath cytologiske preparater Peroxidase-Blocking Reagent 5 minutter Primary Antibodies Solution 30 minutter Visualization Reagent HRP 15 minutter Visualization Reagent AP 15 minutter 14 bytt bytt 15 Substrat -trinn: DAB 10 minutter Substrat -trinn: DAB 10 minutter 16 skyll med destillert eller avionisert skyll med destillert eller avionisert vann vann 17 skyll* skyll* 18 Substrat-parti"-trinn: Fast Red 15 minutter 19 skyll* skyll* Substrat-parti"-trinn: Fast Red 15 minutter 20 --- For LabVision Autostainer: Substrat-parti"-trinn: Fast Red 15 minutter For Dako Autostainer: Substrat -trinn: Fast Red 15 minutter 21 ---- skyll* 22 skyll med destillert eller avionisert skyll med destillert eller avionisert vann vann 23 bytt bytt *bruk Wash Buffer for de respektive skylletrinnene. REF 9531 16 / 44 2009-9531-001NO Rev 2.2

MERK: Hvis den automatiske fargemaskinen som brukes til fargingsprosedyren skyller objektglass med buffer, må objektglassene skylles med destillert eller avionisert vann når de er fjernet fra den automatiske fargemaskinen. Gjør følgende etter programmering: Overfør reagensene fra pakkeflaskene til reagensflaskene på den automatiske fargemaskinen. Bruk kartet generert av den automatiske fargemaskinen for programtider og reagensvolumer; Sett reagensflaskene fra den automatiske fargemaskinen inn i reagensstativet på fargemaskinen i henhold til Reagens-oppsettkartet". Legg objektglassene på den automatiske fargemaskinen i henhold til Objektglass-oppsettkartet" og skyll objektglassene med Wash Buffer for å unngå at prøven tørker ut. 2.3.2 Fargingsprotokoll for Shandon Coverplate System Monter objektglassene, det ene etter det andre, med dekkglass i henhold til Protokoll REF 2010-953-009NO (fås fra Roche mtm laboratories AG) og legg dem i vertikal posisjon i objektglasstativet. Sjekk riktig montering av Shandon Coverplate System ved å fylle reagensbeholderen med destillert eller avionisert vann (2 ml) og inkuber i 5 minutter for at vannet skal renne helt gjennom åpningen. Det monterte objektglass-dekkplatesystemet er vanntett når vannet renner langsomt gjennom åpningen mellom objektglasset og dekkplaten. 1. Ekvilibrering: Fyll reagensbeholderen med Wash Buffer (2 ml) og inkuber i 5 minutter for at vaskebufferen skal kunne renne helt gjennom åpningen; gjenta dette trinnet én gang; 2. Bruk 200 µl Peroxidase Blocking Reagent. Inkuber i 5 minutter; 3. Fyll reagensbeholderen med vaskebuffer (2 ml) og inkuber i 5 minutter for at Wash Buffer skal renne helt gjennom åpningen; 4. Bruk 200 µl Primary Antibodies Solution (p16 INK4a /Ki-67). Inkuber i 30 minutter; 5. Fyll reagensbeholderen med Wash Buffer (2 ml) og inkuber i 5 minutter for at Wash Buffer skal renne helt gjennom åpningen; 6. Bruk 200 µl Visualization Reagent HRP. Inkuber i 15 minutter; 7. Fyll reagensbeholderen med Wash Buffer (2 ml) og inkuber i 5 minutter for at Wash Buffer skal renne helt gjennom åpningen; Gjenta dette trinnet to ganger; 8. Bruk 200 µl Visualization Reagent AP. Inkuber i 15 minutter; REF 9531 17 / 44 2009-9531-001NO Rev 2.2

9. Fyll reagensbeholderen med Wash Buffer (2 ml) og inkuber i 5 minutter for at vaskebufferen skal renne helt gjennom åpningen; Gjenta dette trinnet to ganger; 10. Bruk 200 μl DAB Substrat-kromogenarbeidsløsningen som er klargjort i henhold til prosedyren som er beskrevet i Punkt 1.3 overfor. Inkuber i 10 minutter; 11. Fyll reagensbeholderen med destillert eller avionisert vann (2 ml) og inkuber i 5 minutter for at vannet skal renne helt gjennom åpningen; 12. Fyll reagensbeholderen med Wash Buffer (2 ml) og inkuber i 5 minutter for at vaskebufferen skal renne helt gjennom åpningen; 13. Bruk 200 μl Fast Red Substrat-kromogenløsningen som er klargjort i henhold til prosedyren som er beskrevet i Punkt 1.3 overfor. Inkuber i 15 minutter; Merk: For BD SurePath objektglassklargjøringer må dette trinnet gjentas én gang. 14. Fyll reagensbeholderen med destillert eller avionisert vann (2 ml) og inkuber i 5 minutter for at vannet skal renne helt gjennom åpningen; Gjenta dette trinnet én gang; For å ta ut objektglassene, trekk forsiktig hele objektglass/dekkglassenheten ut fra objektglass-stativet med tommelen og pekefingeren bakerst og løft deretter objektglasset forsiktig av dekkplaten. Ideelt sett utføres denne prsoessen senket i vann. Legg objektglassene i destillert eller avionisert vann og fortsett med kontrastfarging. 2.4 Kontrastfarging med hematoksylin Senk objektglassene i et bad med alkoholfri hematoksylin. Inkuber i 2-10 minutter, avhengig av styrken på den alkoholfrie hematoksylin som brukes; MERK: Bruken av alkoholfri hematoksylin er absolutt obligatorisk. For bluing, legg objektglass i vannbad med vann fra kranen eller alkalisk løsning, f.eks. en svak ammoniakkløsning (NH 4 OH, 0,08 % i avionisert vann) og inkuber i 30 sekunder - 2 minutter; For å sikre at all rest-hematoksylin er utskilt, bytt ut vann fra kranen i glasset flere ganger (3 5x) med friskt vann fra kranen inntil ingen fargerester kan observeres lenger; Inkuber objektglassene kort i et bad med destillert eller avionisert vann. REF 9531 18 / 44 2009-9531-001NO Rev 2.2

MERK: Avhengig av inkubasjonstiden og styrken på det benyttede hematoxylinet, vil kontrastfarging resultere i en svak til mørk blå farge på cellekjernene. For mye eller ufullstendig kontrastfarging kan virke forstyrrende på den riktige tolkningen av resultater. 2.5 Montering For å opprettholde optimal sensitivitet og forhindre falming av Fast Red Chromogen kreves en to-trinns monteringsprosedyre. Etter kontrastfarging og bluing, vil objektglassene monteres etter en totrinnsprotokoll. Trinn A og B må deretter utføres: A) Væske-dekkplate Inkuber objektglassene i destillert eller avioniert vann i minst 1 min; Fjern objektglassene fra destillert elle avionisert vann uten videre tørking: Slå av overflødig væske uten å tillate tørking av prøver. Tørk forsiktig av undersiden av objektglassene med tørkepapir for å fjerne vann; Påfør 4 dråper med CINtec PLUS Mount (1 dråpe tilsvarer 35 40 µl av dette vannbaserte monteringsmediet) per henholdsvis LBS-objektglass og 8 dråper per tradisjonell celleprøve. Unngå at det dannes luftbobler. For å unngå at det utvikles bittesmå bobler, kan den første dråpen tørkes opp av tørkepapir før CINtec PLUS Mount påføres prøven; Vipp objektglasset forsiktig og roter det for å danne et tynt lag monteringsmedium og dekke prøven helt (IKKE påfør glass- eller filmdekke ennå!); sjekk fordelingen av monteringsmediet på objektglasset ved visuell inspeksjon; Før tørking, legg objektglass horisontalt: a. Inkuber ThinPrep eller BD SurePath -prøver ved 37-60 C i 1 time, eller natten over ved romtemperatur; b. Inkuber tradisjonelle celleprøver ved 37 C i 4 timer, eller ved 60 C i 1 time, eller natten over ved romtemperatur; B) Dekke av glass eller film Etter tørking av den vannbaserte monteringen, inkuberes objektglassene i xylen i minst 1 minutt og opptil maks. 20 minutter. Dekk deretter til objektglassene med et xylen-basert monteringsmedium. MERK: Objektglass må ikke dehydreres ved stigende alkoholserie før de dekkes med glass eller film. La den xylen-baserte monteringsmediet tørke ved romtemperatur; MERK: For å minimere falming, beskytt objektglassene fra lys og oppbevar dem i romtemperatur (20 25 C). REF 9531 19 / 44 2009-9531-001NO Rev 2.2

VII. Kvalitetskontroll Avvik fra anbefalte prosedyrer for fiksering og videre behandling av de cervikalt cytologiske prøvene kan gi betydelig variasjon i resultater, og nødvendiggjøre vanlig utførelse av interne kontroller. Positiv kontroll Prøver som behandles på samme måte som pasientprøven(e) skal brukes som positive kontroller. Positive kontroller indikerer riktig klargjorte prøver og riktige fargingsteknikker. Én positiv kontroll skal inkluderes i hver fargekjøring. Kjente positive kontroller skal bare brukes ved overvåking av korrekt utførelse av behandlede vev og testreagenser og ikke som hjelp til å bestemme spesifikk diagnose av pasientprøver. Hvis de positive vevskontrollene ikke viser egnet positiv farging, bør resultater med testprøvene anses som ugyldige. Negativ kontroll Bruk en negativ kontroll behandlet identisk med pasientprøven(e) med hver fargekjøring for å verifisere fargeprosedyrens spesifisitet og gi en indikasjon på bakgrunnsfargingen. Et mangfold av forskjellige celletyper som finnes i representative cervikale cytologiprøver og som er kjent som negative for uttrykket av p16 INK4a - og Ki-67-antigenene (f.eks. overflatiske celler) kan fungere som ekstra intern negativ kontroll for å evaluere all bakgrunnsfarging (dette skal bekreftes av brukeren). Analysebekreftelse Før den første bruken av et antistoff eller fargesystem i en diagnostisk prosedyre, skal brukeren bekrefte antistoffets spesifisitet ved å teste det i en rekke interne prøver med kjent immuncytokjemiske utførelsesegenskaper som representerer kjente positive og negative prøver. Se kvalitetskontrollprosedyrene som tidligere er skissert i denne delen av produktinnlegget og kvalitetskontrollkravene til CAP sertifiseringsprogram for immuncytokjemi og/eller CLSI (NCCLS) kvalitetssikring for immuncytokjemi, Godkjente retningslinjer. VIII. Tolkning av resultater CINtec PLUS-prosedyren fører til to egne fargede reaksjonsprodukter: et brunt bunnfall på p16 INK4a -antigenstedene, og rødt bunnfall på Ki-67-antigenstedene. Brun farging av celler (cytoplasme og/eller kjerner) indikerer p16 INK4a -overutrykk. Rødfarging av celler (kjerner) indikerer uttrykk av Ki-67. Celler farget for begge antigener viser brun cytoplasmisk farging med typisk uttalte røde kjerner. En kvalifisert patolog/cytolog med erfaring i immuncytokjemiske prosedyrer og opplært i tolkningen av CINtec PLUS-fargede objektglass må evaluere positive og negative kontroller før resultatene tolkes. Tolkning av resultater må skje innenfor sammenhengen med pasientens historie og andre diagnostiske tester av en sertifisert profesjonell. For tolkningen av cervikale cytologiobjektglass farget med CINtec PLUS Kit skal objektglass evalueres i forhold til forekomsten av cervikale etpitelceller som viser både cytoplasmisk brun og kjerne-rød farging som tyder på simultan p16- og Ki-67- uttrykk. Forekomsten av én eller flere cervikale epitelceller med medlokalisering av brun cytoplasmisk immunfarging OG rød kjerneimmun-farging i samme celle anses som et positivt CINtec PLUS-testresultat. REF 9531 20 / 44 2009-9531-001NO Rev 2.2

Hvis det ikke er noen cervikal epitelcelle som viser samtidig brun cytoplasmisk immunfarging OG rød kjerneimmunfarging, vurderes CINtec PLUS -testresultatet som negativt. Merk at forekomsten av cervikale epitelceller som ikke viser enkelt immunreaktivitet bare for én av de to markørene (som f.eks. brun farging for bare p16, eller rød farging for bare Ki-67) ikke anses som et positivt testresultat for CINtec PLUS Kit, selv når begge potensielle typer cervikale celler viser enkeltimmunreaktivitet bare finnes i samme cytologi-objektglass. Hvis det forekommer celler som viser morfologiske tegn til alvorlig dyskaryose, men ingen dobbeltfarging for p16 og Ki-67, bør ikke morfologiske tolkningskriterier ses bort fra. IX. Begrensninger Kun til profesjonell bruk. Spesiell opplæring kreves for utførelsen av immuncytokjemiske prosedyrer. Den kliniske tolkningen av en positiv eller negativ tolkning skal evalueres i sammenheng av klinisk presentasjon og cytologiske kriterier. Den kliniske tolkningen av en positiv eller negativ farging må suppleres av moroflogiske studier ved hjelp av riktige positive og negative kontroller i tillegg til andre diagnostiske tester. Det er en kvalifisert patologs/cytologs ansvar, som er kjent med riktig bruk av antistoffer, reagenser og metoder, å tolke alle trinnene som brukes til å klargjøre og tolke den endelige klargjøringen av immuncytokjemien. Fargingsresultatene i immuncytokjemien påvirkes sterkt av kvaliteten på cellene som er farget. Følgelig bidrar den egnede behandlingen av protokolltrinnene for fiksering, vask, tørking eller oppvarming av objektglassene, så vel som unngåelsen av bruken av reagensene som er kontaminert med bakterier til å bidra betydelig til det generelle resultatet av fargingsprosedyren. Avvik fra protokollen kan føre til artefakter, antistoff-oppfanging eller falskt-negative resultater. Inkonsistente resultater kan skyldes variasjoner i fiksering eller ikkeadekvat prøvetaking. For mye eller ufullstendig kontrastfarging kan virke forstyrrende på den riktige tolkningen av resultater. Produsenten gir disse antistoffene/reagensene ved optimal fortynning til bruk i henhold til instruksjonene som er gitt heri, for immuncytokjemitesting på klargjorte væskebaserte cytologiobjektglass (LBC) eller tradisjonelle celleprøver. Ethvert avvik fra anbefalte testprosedyrer kan gjøre erklærte forventede resultater ugyldige. Behørige kontroller må benyttes og dokumenteres. Brukere som avviker fra de anbefalte testprosedyrene, må i disse tilfellene selv bære ansvaret for tolkingen av pasientresultater. Falskt positive resultater kan ses på grunn av immunologisk binding av proteiner eller substratreaksjonsprodukter. De kan være forårsaket av pseudoperoxidase-aktivitet (erytrocytter) og endogen peroxidase (eksempel cytokrom C). Ikke bytt ut pakkereagenser med reagenser som har forskjellige serienumre eller med reagenser fra andre produsenter. REF 9531 21 / 44 2009-9531-001NO Rev 2.2

X. Ytelsesegenskaper Klinisk utførelse Den kliniske utførelsen av CINtec PLUS Kit er evaluert i tre atskilte kliniske studier: a. PALMS-studien Primary ASC-US LSIL Marker Study b. EEMAPS-studien European Equivocal or Mildly Abnormal Pap Cytology Study c. The Wolfsburg Trial en delstudie under Wolfsburg Pap/HPV cotestingsprosjekt Studiebeskrivelser: a. PALMS Primary ASC-US LSIL Marker Study PALMS-studien ble utført som en prospektiv, flernasjonal, flersenter, diagnostisk klinisk studie. Studien ble utformet for å påvise egnetheten av CINtec PLUS Kit som hjelpemiddel til å identifisere kvinner med høygradig cervikal intraepitel neoplasi (dvs. CIN2 og høyere, CIN2+) (a) hos kvinner som deltok ved rutinemessig cervikal kreft-screening, (b) i undergruppen av pasienter med et Papcytologiresultat på ASC-US (atypiske skvamøse celler med ubestemt signfikans) eller (c) i undergruppen av pasienter med et Pap-cytologiresultat av LSIL (lavgradig skvamøs intraepitel lesjon). Hovedmålene ved studien har vært 1. å evaluere sensitiviteten og spesifisiteten til CINtec PLUS Kit for å identifisere høygradig cervikal intraepitel enoplasi (CIN2+) i en primær setting med cervikal kreft-screening: hos kvinner med Pap-cytologiresultat på ASC-US: hos kvinner med Pap-cytologiresultat på LSIL. 2. Å sammenligne sensitiviteten og spesifisiteten til CINtec PLUS Kit for å identifisere høygradig cervikal intraepitel neoplasi (CIN2+) til Papcytologitesting (screening) og HPV-testing (ASC-US-og LSIL-sortering; screening). Studien ble utført på totalt 27 349 kvinner som deltok i rutinemessig cervikal kreftscreening i fem europeiske land (Belgia, Frankrike, Tyskland, Italia og Spania), og de som var registrert i studien i etterkant etter å ha gitt sitt skriftlige, informerte samtykke. Under screening-konsultasjonen, ble to cervikale prøver tatt fra alle kvinner som deltok: En første cervikal prøve ble tatt ved hjelp av en kost-type prøvetakingsenhhet og brukes for å utføre en Pap-cytologitest, enten ved å klargjøre en celleprøve på objektglass av glass for radisjonell celleprøveanalyse, eller ved å overføre det cervikale materialet i en væskebasert cytologioppsamlingsflaske (ThinPrep Pap Test, Hologic, Marlborough, MA; eller SurePath, BD Diagnostics, Burlington, NC) for påfølgende objektglassklargjøring for Pap-testtaking. Et nytt objektglass ble klargjort fra alle prøver, enten fra restmateriale på prøvetakingsenheten som var brukt for den første klargjøringen av en tradisjonell celleprøve ("delt prøve"-teknikk) eller fra restmaterialer av den respektive væskebaserte cytologiflasken, og ble følgelig brukt for p16ki-67 dobbeltfarget cytologitesting. REF 9531 22 / 44 2009-9531-001NO Rev 2.2

En ny cervikal prøve ble tatt fra hver studiedeltaker ved hjelp av DNAPap Cervical Sampler (Qiagen, Hilden, Tyskland), en prøvetakingsenhet av børstetype kombinert med et innsamlingsmedium, spesielt utformet for innsamling av prøver for HPV-testing. Disse prøvene ble følgelig brukt for å fastsette forekomsten av HR-HPV-infeksjonene ved hjelp av digene HC2 High-Risk HPV DNA Test (Qiagen). Celleprøvetesting ble utført lokalt i totalt 16 europeiske cytologilaboratorier og ved hjelp av Bethesda-klassifiseringssystem [28]. Dobbelt-farget cytologitesting ble utført sentralt i henhold til protokollene i bruksanvisningen for CINtec PLUS Kit (Roche mtm laboratories AG). For tolking ble objektglassene screenet for forekomsten av dobbelt-fargede cervikale celler av individuelle medlemmer av et uavhengig team av 8 cytoteknologer med objektglasstolking som oppdrag under de kliniske studiene. Alle positive dobbeltfargede cytologiresultater ble gjennomgått og bekreftet av medlemmer av et team med 5 europeiske patologer. HPV-testing ble utført av totalt 6 uavhengige kliniske laboratorier i Frankrike, Tyskland og Italia. Hvert positive testresultat, dvs. enten et prøvecelle-cytologiresultat på ASC-US eller høyere (ASC-US+), og/eller et positivt CINtec PLUS-testresultat, og/eller et positivt HR-HPV-testresultat (hos kvinner 30 år eller eldre), utløste en henvisning til kolposkopi. Under kolposkopi ble biopsier samlet som klinisk indikert. Histologidiagnoser ble fastslått på H&E-fargede, formalinfikserte, paraffininnstøpte vevsnitt. Det lokale patologiresultatet for hvert tilfelle ble sammenlignet med resultatet av en uavhengig europeisk kvalitetskontroll-patolog. Ethvert avvik mellom lokale og første kvalitetskontrollresultater så vel som en CIN2- eller høyere grads (CIN2+)-diagnose resultaterte i en fullstendig kvalitetskontroll av et panel av europeiske patologer ansett som eksperter i gynekologisk patologi. De to av tre flertallsdiagnosene, eller adjudiserte diagnosene for tilfeller der ingen flertall er oppnådd før, ble brukt som Gull-standard for studieformål. Histologiresultater ble bekreftet av en uavhengig evaluering av p16 IHC-fargingsmønsteret på konsekutive snitt klagjort fra vevsblokker og immunfarget ved hjelp av CINtec Histology Kit (Roche mtm laboratories AG, REF 9511). Bare i de tilfellene der p16- fargingsmønsteret ikke støttet den histologiske diagnosen fastsatt på H&Eobjektglass, ble en separat adjudisering av 3 kvalitetskontrollpatologer utført både på H&E og p16-fargede vevssnitt. Alle data fra PALMS-studien er rapportert etter statistisk korrigering for verifiseringsskjevhet som følge av noe forskjell i kolposkopiske oppfølgingsprosedyrer go dermed sykdomsfastsettelse for positive resultater av de tre individuelle testene, dvs. celleprøve-cytologi, CINtec PLUS, eller HPV-testing. b. EEMAPS European Equivocal or Mildly Abnormal Pap Cytology Study EEMAPS-studien var en flernasjonal, flersenter, kasuskontroll-klinisk studie som brukte retrospektivt innhentede, væskebaserte cervikale cytologiklargjøringer (ThinPrep, Hologic ).Studien var tenkt å bevise anvendeligheten av CINtec PLUS -testen som hjelpemiddel til å identifisere kvinner med underliggende CIN2+ i undergruppen av pasienter med et celleprøve-cytologiresultat kategorisert som enten ASC-US eller LSIL i henhold til Bethesda-klassifiseringssystemet [28] og der det fantes restmateriale i den væskebaserte ThinPrep -cytologiflasken. Tilfeller ble valgt som tilsvarende histologivevsprøver forelå for, som var skaffet under diagnostiske oppfølgingsprosedyrer utført innen en periode på 6 måneder etter REF 9531 23 / 44 2009-9531-001NO Rev 2.2

henvisnings-celleprøvecytologien. Histologiske vevsprøver bestående av en distribusjon av cervikale punsjebiopsier, konusbiopsier og endocervikale utskrapningsprøver. Hovedmålene med studien var 1. å evaluere sensitiviteten og spesifisiteten til CINtec PLUS Kit for å identifisere CIN2+ hos kvinner med celleprøve-cytologiresultat på ASC-US eller LSIL; 2. å sammenligne sensitiviteten og spesifisiteten av å detektere CIN2+ ved hjelp av CINtec PLUS Kit med sensitiviteten og spesifisiteten av å bruke digene HC2 High-Risk HPV DNA Test (Qiagen) for kvinner med prøvecelle-cytologiresultat på ASC-US eller LSIL. HPV-testing ble utført sentralisert i et kvalifisert klinisk laboratorium, akkreditert i Tyskland og i henhold til produsentens instruksjoner. For p16/ki-67 dobbelt-farget cytologi, ble restmateriale av de væskebaserte ThinPrep -cytologiflaskene brukt til å klargjøre ferske objektglass ved hjelp av en T2000 ThinPrep Processor (Hologic ). Objektglass ble følgelig immunfarget etter protokollen som er skissert i bruksanvisningene for CINtec PLUS Kit. Objektglass ble screenet av én enkelt cytoteknolog for forekomsten av dobbeltfarget cervikale celler. Alle tilfeller identifisert av den cytoteknologiske gjennomgangen som én eller flere dobbeltfargede celle(r) ble underlagt bekreftelse av en patologgjennomgang for endelige dobbeltfargede cytologiresultater. Den histologiske diagnosen fastsatt på gjen-kuttede vevsblokkprøver ble brukt som gullstandard (dvs. diagnostiske nøyaktighetskrtierier) for studien som resultatene av den dobbelt-fargede cytologien og HPV-testene ble sammenlignet med. En flertalls-diagnose ble fastsatt for hvert tilfelle av to eller flere kvalitetskontrollpatologer av et team på fem patologer. Kontrollørene var blinde for det opprinnelige histopatologiresultatet av det lokale studiesenteret som prøvene var hentet fra, og for alle andre testresultater. En kombinert gjennomgang av H&Efargede objektglass og etterfølgende objektglass farget for p16 med CINtec Histology Kit (Roche mtm laboratories AG) ble utført av kvalitetskontrollpatologer i denne bestemte studien. Totalt 776 tilfeller, derav 361 tilfeller på ASC-US og 415 tilfeller på LSIL var tilgjengelige for analysen. c. The Wolfsburg Study en delstudie under Wolfsburg Pap/HPV cotestingsprosjekt Studiens generelle mål var å undersøke den kliniske anvendeligheten av CINtec PLUS Kit som screening-test så vel som en reflekstest til Pap negative-, HPVpositive testresultater hos kvinner fra 30 år og eldre. Evalueringen av utførelsesegenskapene til CINtec PLUS Kit for identifiseringen av kvinner med etablerte høygradige cervikale intraepitel-lesjoner (HGCIN) ble utført som en integrert delstudie av Wolfsburg Pap/HPV-cotestprosjektet. Målene med studien var 1. For å evaluere sensitiviteten og spesifisiteten på dobbelt-farget cytologi for å identifisere HGCIN i en cervikal kreft-screeningsammenheng; 2. For å sammenligne sensitiviteten og spesifisiteten på dobbelt-farget cytologi for å identifisere HGCIN i en cervikal kreft-screeningsammenheng med sensitiviteten og spesifisiteten av henholdsvis væskebasert celleprøvecytologitesting og HPV-testing; REF 9531 24 / 44 2009-9531-001NO Rev 2.2

3. For å evaluere den diagnostiske utførelsen av dobbelt-farget cytologi i sorteringen av celleprøve-negative, HP-positive screening-testresultater. Studien ble utført som en flersenter, retrospektiv diagnostisk studie med prospektivt samlede studieprøver. Kvinner fra 30 år med undertegnet, skriftlig informert samtykke ble registrert i Wolfsburg-screeningprosjektet. Ved screeningkonsultasjonen, ble en første cervikal prøve tatt med enten spatel/børste eller en prøvetakingsenhet av kosttype og lagt direkte over i en ThinPrep Pap test (Hologic ) -prøvetakingsflaske. Følgelig ble en annen cervikal prøve tatt ved hjelp av DNAPap Cervical Sampler (Qiagen) og den respektive prøvetakingsflasken for påfølgende HPV-testing ved hjelp av digene HC2 High-Risk HPV DNA Test (Qiagen). Celleprøvecytologi (ThinPrep Pap test) ble utført sentralt i et uavhengig laboratorium rett etter registreringsbesøket. Den første objektglassprøven klargjort fra den væskebaserte cytologiflasken ble brukt for celleprøvetesting. HPV-testing ble utført i et sentralt, klinisk laboratorium i Wolfsburg. Kvinner ble henvist til kolposkopi basert på deres celleprøvecytologi og HPVtestresultater bare etter kravene til Wolfsburg Pap/HPV-coteststudiealgoritmen: Kvinner som var positive både for celleprøvecytologi (celleprøve IIw; med München-betegnelse), nesten tilsvarende ASC-US), brukt som terskelen) og HPV-testing ble henvist til umiddelbar kolposkopi; Kvinner med enten et positivt celleprøve-, men negativt HPV-resultat, eller negativt celleprøve- men positivt HPV-resultat, ble henvist til kolposkopi bare når enten celleprøve- eller HPV-testresultatene var konsekvent positive under en eller flere gjentatte testprosedyrer i løpet av de påfølgende 6-12 månedene, eller lenger; Kvinner med negative testresultater både for celleprøvecytologi og HPVtesting måtte ikke gjenta testing for livmorhalskreft over en 5-årsperiode. Den p16/ki-67 dobbelt-fargede cytologitestingen ble utført retrospektivt etter 1-2 års oppbevaring av ThinPrep -flaskene. Objektglassene var klargjort og immunfarget sentralt i sponsorens laboratorie. Objektglass ble screenet for forekomsten av dobbelt-fargede livmorhalsceller av individuelle medlemmer av et team på 8 uavhengige cytoteknologer innleid for å tolke objektglassene under PALMS- og Wolfsburg-studiene. Alle positive dobbelt-fargede cytologiresultater ble gjennomgått og bekreftet av én enkelt uavhengig patolog. Histologidiagnoser på biopsimaterialer var gull-standard. Alle lokale histologiresultater ble bekreftet av medlemmer av en uavhengig kvalitetskontrollkomité bestående av 6 europeiske aptologer, maskert til klinisk sentertolkning og alle andre testresultater. Kvalitetskontrollprosessen ble utført i analogi til prosessen fastsatt for PALMS-studien (se overfor). For en tverrsnittanalyse av screeningpopulasjonen hos kvinner fra 30 år og eldre, var 4246 tilfeller vilkårlig utvalgt fra totalt 7976 kvinner registrert i Wolfsburgprosjektet i 2007 og 2008 og med tilstrekkelig restcellemateriale igjen i den væskebaserte cytologiflasken. For å evaluere anvendeligheten av CINtec PLUStesting i sorteringen av kvinner testet celleprøve-negative, men HPV-positive, var alle tilfeller med slike testresultater (n=427) av gruppen på 7976 kvinner inkludert i analysen. REF 9531 25 / 44 2009-9531-001NO Rev 2.2

Resultater: ALLE TABELLER OG FIGUR 1 VISES I VEDLEGG 2! KLINISK UTFØRELSE AV CINtec PLUS-TEST I SCREENING FOR LIVMORHALSKREFT Tabell 1 viser at positivitetsrater for CINtec PLUS ble påvist ved sammenlignbare nivåer som celleprøve-abnormalitetsrater (terskel på ASC-US eller høyere; ASC- US+), og ca. halvparten av positivitetsratene for HR-HPV-testing, uavhengig av aldersgrupper. I Tabell 2 rapporteres sensitivitets- og spesifisitetsrater for CINtec PLUS-testing i screeningpopulasjon som bekreftet i PALMS-studiene. Sensitiviteten av CINtec PLUS-testing for CIN2+ over alle aldre var 90,1 konfidensintervall 85,3-93,5), signifikant høyere enn sensitiviteten av celleprøvecytolog-testing (66,4 %; 95 % konfidensintervall 59,5-72,6; Økning på 36 %, p<0,0005). Sensitiviteten av HPV-testing for deteksjon av CIN2+ ble funnet ved 96,4 konfidensintervall 93,1-98,3). Spesifisiteten av CINtec PLUS-testing (95,3; 95 % konfidensintervall 95,0-95,6) ble funnet å være på samme høye nivå som spesifisiteten til celleprøvecytologitestinng (95,4 %; 95 % konfidensintervall 95,2-95,7), mens spesifisiteten av HPV-testing var 90,2 konfidensintervall 88,1-92,4) i alle aldersgrupper. Forskjellene i spesifisitetsratene mellom CINtec PLUS- eller celleprøvecytologi kontra HPV-testing var statistisk signifikant (p< 0,0005), med rater på falskt-positive resultater som var dobbelt så høye for HPV-testing i alle aldersgrupper så vel som i aldersgruppene på <30 år kontra 30 år. Resultatene for evalueringen av sensitivitet og spesifisitet for henholdsvis CINtec PLUS kontra celleprøvecytologi og HPV-testing i Wolfsburg Study vises i Tabell 3. De høye nivåene av sensitivitet og spesifisitet av CINtec PLUS for deteksjonen av høygradig CIN som funnet i PALMS-studien (se Tabell 2) er uavhengig bekreftket av resultatene fra Wolfsburg-studien hos kvinner fra og med 30 år. KLINISK UTFØRELSE AV CINtec PLUS-TEST I SORTERINGEN AV KVINNER MED ASC-U CELLEPRØVECYTOLOGI FOR Å BESTEMME BEHOVET FOR HENVISNG TIL KOLPOSKOPI Sensitivitet og spesifisitet av CINtec PLUS for å påvise biopsi-bekreftet CIN2+ på tidspunktet for kolposkopi i sorteringen av ASC-US-cytologitilfeller hos kvinner i alle aldre ble funnet i PALMS ved henholdsvis 94,6 % (n=17/18) og 77, 5 % (Tabell 4), og i EEMAPS ved henholdsvis 92,2 % (n=71/77) og 80,6 % (Tabell 5). HPV-testing ga sammenlignbare sensitivitetsnivåer (100 % (n=18/18) i PALMS) og 90,9 % (n=70/77) i EEMAPS), men på signifikant lavere spesifisitetsnivåer (60,7 % i PALMS og 36,3 % i EEMAPS). Denne forbedringen i spesifisitet er enda høyere i den yngre aldersgruppen (dvs. kvinner under 30 år) som illusrert i Tabell 5, men også i den eldre aldersgruppen ( 30 år) er spesifisitet av CINtec PLUS dobbelt så høy, sammenlignet med HPV-testing (85,5 % kontra 43,6 %). Da positivitetsrater for CINtec PLUS i ASC-US-kategorien i den prospektive PALMS-studien ble påvist som 25,6 % kontra 41,9 % for HPV-testing, kan testing med CINtec PLUS gi mulighet for en mer effektiv ASC-US-sortering, og gi sammenlignbar sensitivitet for underliggende høygradig CIN til tross for en lavere rate av kvinner henvist til kolposkopi. REF 9531 26 / 44 2009-9531-001NO Rev 2.2

KLINISK UTFØRELSE AV CINtec PLUS-TEST I SORTERINGEN AV KVINNER MED LSIL CELLEPRØVECYTOLOGI FOR Å BESTEMME BEHOVET FOR HENVISNING TIL KOLPOSKOPI Positivitetsrater av CINtec PLUS-testing i cytologitilfeller kategorisert som LSIL i PALMS- og EEMAPS-studiene vises i Tabell 6 og Tabell 7 og sammenlignet med HPV-testpositivitetsrater. Positivitetsraten på 52,4 % (PALMS) og 52,3 % (EEMAPS) for CINtec PLUS-testing i LSIL er betydelig lavere enn raten på 83,9 % (PALMS) og 86,2 % (EEMAPS) positive HR-HPV-testresultater, og viste potensialet på CINtec PLUS-testing som et effektivt sorteringsverktøy for LSIL-celleprøvecytologiresultater. Sensitivitet og spesifisitet av CINtec PLUS for å påvise biopsi-bekreftet CIN2+ på tidspunktet for kolposkopi i sorteringen av LSIL-cytologitilfeller hos kvinner i alle aldre ble funnet i PALMS ved henholdsvis 85,4 % (n=54/63) og 53,9 % (Tabell 6), og i EEMAPS ved henholdsvis 94,2 % (n=129/137) og 68,0 % (Tabell 7). KLINISK UTFØRELSE AV CINtec PLUS-TEST I SORTERINGEN AV KVINNER MED NEGATIV CELLEPRØVE-CYTOLOGI OG POSITIVE HPV- TESTRESULTATER FOR Å BESTEMME BEHOVET FOR HENVISNING TIL KOLPOSKOPI Figur 1 viser positivitetsraten for CINtec PLUS i sorteringen av tilfeller testet negative på celleprøve, men positive for HR-HPV. Ca. en fjerdedel (n=109; 25,5 %) av celleprøvenegative, HPV-positive tilfeller viste cervikal(e) epitelcelle(r) dobbeltfarget for p16 og Ki-67, mens 318 av 427 tilfeller (74,5 %) testet negative. Over 90 % av underliggende CIN2+ ble påvist i gruppen av CINtec PLUS-positive tilfeller, dvs. 34 av 37 biopsi-bekreftede tilfeller av CIN2+ som var identifisert under oppfølging (gjennomsnittlig oppfølgingstid på 12,5 måneder). REF 9531 27 / 44 2009-9531-001NO Rev 2.2

XI. Feilsøking Problem Mulig årsak Foreslått handling 1. Ingen farging av objektglass 2. Svak farging av objektglass 1a. Avvik fra bruksanvisninger; 1a. Les bruksanvisningene nøye og hold deg til prosedyrene som fremgår av dem; 1b. Reagensflaskene ble ikke lagt riktig inn i reagensstativene; 1b. Sjekk Reagenskartet for å bekrefte riktig plassering av reagensflaskene; 1c. Ikke nok reagens i flasken; 1c. Pass på at nok reagens er lastet i flaskene før kjøringen startes. Se Reagenskart for nødvendige mengder; 1d. Mangler Wash Buffer for Dako eller LabVision automatiske fargemaskiner; 2a. Utilstrekkelig gjenvinning av epitop; 2b. Utilstrekkelige reagensinkubasjonstider; 1d. Sjekk at det er nok buffer; Hvis ikke, fyll beholderen med buffer og fyll pumpen; Sjekk om det gjennomsiktige plastrøret rundt sprøyten (til venstre for den bevegelige armen) inneholder luftbobler - i så fall kan problemet løses ved å fjerne boblene; 2a. Bruk nylig klargjort Epitope Retrieval Solution og / eller pass på at epitopgjenvinningsløsning når 95-99 C i hele 10 minutter og får avkjøles i - ytterligere 20 minutter; Pass på at ikke vann søles over i de varmebestandige fargeglassene under prosedyren for epitopgjenvinning. Se gjennom 2.2 for anbefalinger; 2b. Gå gjennom 2.3.1 / 2.3.2 Anbefalinger for fargingsprotokoll; 2c. Utilstrekkelig fikseringsmetode; 2c. Pass på at cytologiklargjøringer er fiksert som skissert i Punkt VII eller at ingen alternativ fiksering ble benyttet; 2d. Vann som er brukt til å fortynne epitop-gjenvinningsløsningen inneholder for høy ionkonsentrasjon; 2e. Mangler Wash Buffer for Dako eller LabVision automatiske fargemaskiner; 2f. Fortynning av pakkekomponenter med vaskebuffer på grunn av utilstrekkelig ventetid etter vasketrinnene for Shandon Coverplate System; 2d. Pass på at ionutvekslingssøylen for produksjon av avionisert vann er kontrollertl under rutinemessig vedlikehold; 2e. Se feilsøking, Punkt 1d; 2f. Vent i 5 minutter etter tilsetting av Wash buffer i trakten på Shandon Coverplate System og sjekk at ingen rester Wash Buffer blir liggende i trakten som kan forårsake en fortynning av følgende reagens; REF 9531 28 / 44 2009-9531-001NO Rev 2.2

3. Ingen eller svak Ki-67-farging (rød) på positive kontrollobjektgla ss 3a. Bruk av alkohol som inneholder Hematoksylin (f.eks. Harris ); 3b. Objektglass ble dehydrert med stigende serier med alkohol før de dekkes med glass eller film; 3c. Fast Red arbeidslsning var ikke klargjort i henhold til anbefalingene; 3a. Fast Red er løselig i EtOH, og bruken av alkoholfri Hematoksylin er derfor obligatorisk for å unngå falming av Fast Red fargestoffet (Ki-67-signal); 3b. Følg 2-trinnsprotokollen for montering ved hjelp av CINtec PLUS Mount, etterfulgt av permanent tildekking med glass eller film; Se 2.5 for anbefalinger; 3c. Klargjør Fast Red arbeidsløsning straks før bruk; påfør løsningen på objektglassene innen 15 minutter, da en reduksjon i signalintensitet og testsensitivitet ellers kan forekomme; REF 9531 29 / 44 2009-9531-001NO Rev 2.2

4. For mye bakgrunnsfargin g av objektglass 4a. Ufullstendig fjerning av sprayfikseringsreagens (polyetylenglykol) ved bruk av tradisjonelle celleprøver; 4b. Utilstrekkelig skylling av objektglass; 4c. Tørking av prøve under fargingsprosedyren; 4a. Følg prosedyren som skissert i Punkt 2.1.; 4b. Bruk fersk løsning i bufferbad og vaskeflasker; For den automatiske fargemaskinen, pass på at instrumentet er riktig fylt før det kjøres, og at tilstrekkelige mengder med buffer er tilgjengelige for hele kjøringen; bruk ferske løsninger med bufre og reagenser; 4c. Når du bruker den automatiske fargemaskinen, pass på at det er nok reagens og at dekselet på instrumentet er lukket under kjøringen. Ikke utsett objektglass for høye temperaturer eller for et miljø som er for tørt; Vurder om det programmerte reagensvolumet og dispenseringsstedet (dråpesone) var nok til å dekke alle områder på et objektglass som inneholder cellematerialer; Sjekk at det er nok buffer. Hvis ikke, fyll beholderen med buffer og fyll pumpen; Sjekk om det gjennomsiktige plastrøret rundt sprøyten (til venstre for den bevegelige armen) inneholder luftbobler - i så fall kan problemet løses ved å fjerne boblene; Unngå utsettelse av Fast Red arbeidsløsningsinkubasjonen under kjøring av den automatiske fkargemaskinen for å minimere risikoen for å tørke artefakter; REF 9531 30 / 44 2009-9531-001NO Rev 2.2

4d. Utilstrekkelig fikseringsmetode; 4d. Bruk bare fiksering som er anbefalt her. Feilaktig fikserte celler kan vise for mye bakgrunnsfarging; 4e. Ikke-spesifikk binding av reagenser til celler; 4e. Sjekk fikseringsmetoden som brukes for prøven; 5. For sterk spesifikk farging 6. Evaluering av dobbeltimmunreaktive celler ikke mulig 7. Glass eller filmdekke er ikke tilstrekkelig 8. Flekkete eller sporadisk fargemønster etter bruk av Shandon Coverplatesystem 9. Sprekkdannelse etter at objektglassene er montert med xylen-basert monteringsmedi um 4f. Tørking av prøver under oppsett av den automatiske fargemaskinen; 4g. Tørking av prøver under sammensetting av Shandon Coverplate system; 4f. Hold prøvene dekket med reagens (buffer) når kjøringen startes; 4g. Fyll en enkel bolle med destillert eller avionisert vann. Ta ett objektglass ut av Epitope Retrieval Solution og sett inn objektglasset og dekkplaten nedsenket i bollen (under vann); 5a. Utilstrekkelig fikseringsmetode; 5a. Sørg for riktig fiksering og fikseringsmetode; 5b. Forlengede reagensinkubasjonstider; 5b. Se gjennom og følg fargingsprotokollen som er oppgitt i Punktene 2.3.1 / 2.3.2 overfor; 5c. Utilstrekkelig vaskeløsning; 5c. Bruk Wash Buffer (katalognummer 8550); 6a. Hematoksylin-kontrastfarge for sterk; 7a. Glass- eller filmdekke kan ikke påføres riktig; 8a. Luftbobler integrert mellom objektglass og dekkplate; 9a. Utilstrekkelig tørking av CINtec PLUS Mount før montering av objektglassene med xylen-basert monteringsmedium; 6a. Reduser inkubasjonstiden for hematoksylin og/eller bluing i vann fra kranen eller ammoniakkvann; 7a. Unngå utvikling av luftbobler ved påføring av CINtec PLUS Mount (vannbasert dekke); Hold deg til anbefalt tørketid for væskedekke; 8a. Montering av objektglass og dekkplate må utføres i henhold til Protokoll REF 2010-953-009EN (fås fra Roche mtm laboratories AG); Luftbobler på objektglasset må fjernes før innsetting; 9a. Tørre objektglass som er dekket med CINtec PLUS Mount natten over ved romtemperatur eller i minst 4 t ved 37 C. CINtec PLUS Mount må tørkes helt. REF 9531 31 / 44 2009-9531-001NO Rev 2.2

XII. Symboler Symbol: Forklaring: Katalognummer Partikode In vitro-diagnostisk medisinsk enhet Produsent Inneholder nok til <n> tester Se bruksanvisningen Brukes før Temperaturgrense XIII. Produsent Produsert av: Roche mtm laboratories AG Sandhofer Straße 116 D-68305 Mannheim Germany www.cintec.info XIV. Revisjonsstatus Gjeldende bruksansvisning utgjør versjon 2.2, utgitt i januar 2013. XV. Lovmerknad Merkevarene SuperFrost, Eukitt, Merckofix, Autostainer, SurePath, ThinPrep, Shandon Coverplate og Hologic som omtales i denne teksten tilhører deres respektive eiere. Ingen av eierne av disse merkevarene er tilknyttet Roche mtm laboratories AG. Varemerkene CINtec, mtm laboratories og E6H4 tilhører utelukkende Roche mtm laboratories AG og kan ikke brukes uten skriftlig forhåndsgodkjenning fra Roche mtm laboratories AG. CINtec PLUS Kit er basert på egen teknologi eid av Roche mtm laboratories AG som er beskyttet av nasjonal og internasjonall eiendomsrett, inkludert europeisk patent EP 1 092 155 (inkl. DE, UK, FR, ES, IT), EP 1 416 278 (inkl. DE, UK, FR, ES, IT), EP 0 665 886, amerikansk patent US 6,709,832, US 7,425,617, US 7,691,632 og amerikansk patentsøknad US 2009/0176204; så vel som andre nasjonale patenter. REF 9531 32 / 44 2009-9531-001NO Rev 2.2

Vedlegg 1: Referanser 1. Arbyn M, Sasieni P, Meijer CLJM, et al. Clinical applications of HPV testing: a summary of meta-analyses. Vaccine 2006;24(Suppl 3):S78-89. 2. Bergeron C, Ordi J, Schmidt D, Trunk MJ, Keller T, Ridder R. Conjunctive p16 INK4a testing significantly increases accuracy in diagnosing high-grade cervical intraepithelial neoplasia. Am J Clin Pathol. 2010;133:395-406. 3. Brown DC, Gatter KC. Ki-67 protein: the immaculate deception? Histopathology 2002;40:2-11. 4. Carozzi F, Confortini M, Dalla Palma P, et al. Use of p16ink4a over-expression to increase the specificity of human papillomavirus testing: a nested substudy of the NTCC randomised controlled trial. Lancet Oncol. 2008;9:937-45. 5. Chen SF, Yang SF, Chu TY, et al. Which test is a better strategy to determine the outcome of atypical glandular cell-categorized Pap smears? Immunocytochemical p16 INK4a expression or human papillomavirus test a retrospective cohort study. Gynecol Oncol. 2005;99:578-84. 6. Cuschieri K, Wentzensen N. Human papillomavirus mrna and p16 detection as biomarkers for the improved diagnosis of cervical neoplasia. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2008;17:2536-45. 7. Del Pino M, Garcia S, Fusté V, et al. Value of p16 INK4a as a marker of progression/ regression in cervical intraepithelial neoplasia grade 1. Am J Obstet Gynecol. 2009;201. 8. Denton K, Bergeron C, Klement P, et al. The sensitivity and specificity of p16ink4a Cytology versus HPV Testing for Detecting High-Grade Cervical Disease in the Triage of ASC-US and LSIL Pap Cytology Results. Am J Clin Pathol. 2010;134:12-21. 9. Guo M, Hu L, Baliga M, et al. The predictive value of p16 INK4a and hybrid capture 2 human papillomavirus testing for high-grade cervical intraepithelial neoplasia. Am J Clin Pathol. 2004;122:894-901. 10. Holladay EB, Logan S, Arnold J, et al. A comparison of the clinical utility of p16 INK4a immunolocalization with the presence of human papillomavirus by hybrid capture 2 for the detection of cervical dysplasia/neoplasia. Cancer Cytopathol. 2006;108:451-61. 11. Horn LC, Reichert A, Oster A, et al. Immunostaining for p16 INK4a used as a conjunctive tool improves interobserver agreement of the histological diagnosis of cervical intraepithelial neoplasia. Am J Surg Pathol. 2008;32:502-12. 12. Ishikawa M, Fujii T, Saito M, et al. Overexpression of p16 INK4a as an indicator for human papillomavirus oncogenic activity in cervical squamous neoplasia. Int J Gynecol Cancer 2006;16:347-53. 13. Klaes R, Friedrich T, Spitkovsky D, et al. Overexpression of p16 INK4a as a specific marker for dysplasia and neoplastic epithelial cells of the cervix uteri. Int J Cancer 2001;92:276-84. 14. Klaes R, Benner A, Friedrich T, et al. p16 INK4a immunohistochemistry improves interobserver agreement in the diagnosis of cervical intraepithelial neoplasia. Am J Surg Pathol. 2002; 26:1389-99. 15. Meyer JL, Hanlon DW, Andersen BT, et al. Evaluation of p16 INK4a expression in ThinPrep cervical specimens with the CINtec p16 INK4a assay. Cancer Cytopathol. 2007;111:83-92. 16. Nanda K, McCrory DC, Myers ER, et al. Accuracy of the Papanicolaou test in screening for and follow-up of cervical cytologic abnormalities: a systematic review. Ann Intern Med. 2000;132:810-9. 17. Negri G, Egarter-Vigl E, Kasal A, et al. p16 INK4a is a useful marker for the diagnosis of adenocarcinoma of the cervix uteri and its precursors: an immunohistochemical study with immuncytochemical correlations. Am J Surg Pathol. 2003; 27:187-93. 18. Negri G, Vittadello F, Romano F, et al. p16 INK4a expression and progression risk of lowgrade intraepithelial neoplasia of the cervix uteri. Virchows Arch. 2004;445:616-20. REF 9531 33 / 44 2009-9531-001NO Rev 2.2

19. Nieh S, Chen SF, Chu TY, et al. Is p16 INK4a expression more useful than human papillomavirus test to determine the outcome of atypical squamous cells of undertemined significance-categorized Pap smears? A comparative analysis using abnormal cervical smears with follow-up biopsies. Gynecol Oncol. 2005;97:35-40. 20. Ordi J, Garcia S, del Pino M, et al. p16 INK4a immunostaining identifies occult CIN lesions in HPV-positive women. Int J Gynecol Pathol. 2008;28:90-7. 21. Redman R, Rufforny I, Liu C, et al. The utility of p16 INK4a in discriminating between cervical intraepithelial neoplasia 1 and nonneoplastic equivocal lesions of the cervix. Arch Pathol Lab Med. 2008;132:795-9. 22. Sano T, Oyama T, Kashiwabara K, et al. Expression status of p16 protein is associated with human papillomavirus oncogenic potential in cervical and genital lesions. Am J Pathol. 1998 ;153:1741-8. 23. Schiffman M, Solomon D. Findings to date from the ASCUS-LSIL Triage Study (ALTS). Arch Pathol Lab Med. 2003 Aug;127(8):946-9. 24. Schiffman M, Castle PE, Jeronimo J, et al. Human papillomavirus and cervical cancer. Lancet 2007;370:890-907. 25. Schlederman D, Andersen BT, Bisgaard K, et al. Are adjunctive markers useful in routine cervical cancer screening? Application of p16 INK4a and HPV-PCR on ThinPrep samples with histological follow-up. Diagn Cytopathol. 2008;36:453-9. 26. Scholzen T, Gerdes J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. J Cell Physiol. 2000;182:311-22. 27. Solomon D, Schiffman M, Tarone R. Comparison of three management strategies for patients with atypical squamous cells of undetermined significance: baseline results from a randomized trial. J Natl Cancer Inst. 2001;93:293-9. 28. Solomon D, Davey D, Kurman R, et al.. The 2001 Bethesda system. Terminology for reporting results of cervical cytology. JAMA. 2002;287:2114-9. 29. Szarewski A, Ambroisine L, Cadman L, et al. Comparison of predictors for high-grade cervical intraepithelial neoplasia in women with abnormal smears. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2008;17:3033-42. 30. Trunk MJ, Dallenbach-Hellweg G, Ridder R, et al. Morphologic characteristics of p16 INK4a -positive cells in cervical cytology samples. Acta Cytol. 2004;48:771-82. 31. von Knebel Doeberitz M. New markers for cervical dysplasia to visualise the genomic chaos created by aberrant oncogenic papillomavirus infections. Eur J Cancer. 2002; 38:2229-42. 32. Wang SS, Trunk M, Schiffman M, et al. Validation of p16 INK4a as a marker of oncogenic human papillomavirus infection in cervical biopsies from a population-based cohort in Costa Rica. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2004;13:1355-60. 33. Wentzensen N, Bergeron C, Cas F, et al. Evaluation of a nuclear score for p16 INK4a stained cervical squamous cells in liquid-based cytology samples. Cancer Cytopathol. 2005;105:461-7. 34. Wentzensen N, Bergeron C, Cas F, et al. Triage of women with ASCUS and LSIL cytology. Use of qualitative assessment of p16 INK4a positive cells to identify patients with high-grade cervical intraepithelial neoplasia. Cancer Cytopathol. 2007;111:58-66. 35. Wentzensen N, von Knebel Doeberitz M. Biomarkers in cervical cancer screening. Dis Markers. 2007;23:315-30. 36. Wright JD, Rader JS, Davila R, et al. Human papillomavirus triage for young women with atypical squamous cells of undetermined significance. Obstet Gynecol. 2006;107:822-9. 37. Yoshida T, Fukuda T, Sano T, et al. Usefulness of liquid-based cytology specimens for the immunocytochemical study of p16 expression and human papillomavirus testing: a comparative study using simultaneously sampled histology materials. Cancer Cytopathol. 2004;102:100-8. REF 9531 34 / 44 2009-9531-001NO Rev 2.2

Vedlegg 2: Tabeller Ordliste for Tabeller og Figur 1 Kvinne, xx xx år: Frauen im Alter von xx xx Jahren / Femmes agées de xx-xx ans / Donne di età compresa tra xx e xx anni / Mujeres de xx-xx años Celleprøve-cytologi: Pap-Zytologie / Frottis / Celleprøve-test / Citología Pap ASC-US eller høyere: ASC-US oder höher / ASC-US ou grade supérieur / ASC-US o superiore / ASCUS o superior Sensitivitet: Sensitivität / Sensibilité / Sensibilità / Sensibilidad Spesifisitet: Spezifität / Spécificité / Specificità / Especificidad CI: Konfidensintervall / Konfidenzintervall / Intervalle de Confiance / Intervallo di Confidenza / Intervalo de Confianza Henvisning til kolposkopi: Überweisung zur Kolposkopie / Orientation vers une colposcopie / Richiesta di colposcopia / Derivación a colposcopia HGCIN: Høygradig cervikal intraepitel neoplasi / Hochgradige zervikale intraepitheliale Läsionen / Lésions cervicales intraépithéliales de haut grade / Lesioni intraepiteliali cervicali di alto grado accertate / Lesiones cervicales intraepiteliales de alto grado REF 9531 35 / 44 2009-9531-001NO Rev 2.2

Tabell 1: PALMS-studien: CINtec PLUS test positivitetsrater i screeningpopulasjon, sammenlignet med resultater fra henholdsvis celleprøve-cytologi (dvs. ASC-US eller høyere resultat) og HC2 høyrisiko-hpv DNA-testing. Celleprøvecytologi, ASC-US eller høyere CINtec PLUS Positiv HR-HPV -positiv n % n % n % Kvinner 18-65 år n= 27 248 Kvinner 18-29 år n= 6 798 Kvinner 30-65 år n= 20 450 1 407 5,2 % 1 462 5,4 % 2 918 10,7 % 563 8,3 % 605 8,9 % 1 376 20,2 % 844 4,1 % 857 4,2 % 1 542 7,5 % REF 9531 36 / 44 2009-9531-001NO Rev 2.2

Tabell 2: PALMS-studien: Sensitivitets- og spesifisitetsrater for CINtec PLUS in Screeningpopulasjon. Resultater for celleprøve-cytologi og HC2 høyrisiko-hpv DNA-testing vises for sammenligning. CIN2+ -sensitivitet konfidensintervall) CIN2+ -sensitivitet konfidensintervall) CIN3+ -sensitivitet konfidensintervall) Kvinner 18-65 år (n= 25 577; 205 CIN 2+, 111 CIN 3+) Celleprøve-cytologi 66,4 (59,5-72,6) 95,4 (95,2-95,7) 71,3 (61,9-79,1) CINtec PLUS 90,1 (85,3-93,5) 95,3 (95,0-95,6) 90,4 (83,5-94,6) HR-HPV 96,4 (93,1-98,3) 90,2 (88,1-92,4) 98,9 (94,8-99,7) Kvinner 18-29 år (n= 6 372; 82 CIN 2+, 41 CIN 3+) Celleprøve-cytologi 67,7 (56,5-77,2) 92,8 (92,1-93,4) 74,4 (58,2-85,9) CINtec PLUS 93,3 (85,8-96,9) 92,3 (91,6-93,0) 93,2 (80,8-97,8) HR-HPV 97,4 (91,3-99,5) 81,4 (77,3-85,7) 97,1 (86,6-99,4) Kvinner 30-65 år (n= 19 205; 123 CIN 2+, 70 CIN 3+) Celleprøve-cytologi 64,9 (56,0-72,9) 96,3 (96,0-96,6) 69,1 (57,1-78,9) CINtec PLUS 87,8 (80,8-92,5) 96,3 (96,0-96,6) 88,5 (78,7-94,1) HR-HPV 95,6 (89,0-98,3) 93,1 (92,7-93,5) 100 (94,9-100) REF 9531 37 / 44 2009-9531-001NO Rev 2.2

Tabell 3: Wolfsburg-studien: Sensitivitets- og spesifisitetsrater for CINtec PLUS i Screening av kvinner fra og med 30 år. Resultater for celleprøve-cytologi og HC2 høyrisiko- HPV DNA-testing vises for sammenligning. CIN2+ Sensitivitet konfidensinterv all) CIN2+ Spesifisitet konfidensintervall) CIN3+ Sensitivitet konfidensintervall ) CIN3+ Spesifisitet konfidensintervall) Kvinner fra og med 30 år (n=4246; 40 CIN2+, 28 CIN3+) Celleprøvecytologi 65,0 (48,3-79,4) CINtec PLUS 92,5 (79,6-98,4) HR-HPV 100 (91,2-100) 98,7 (98,3-99,0) 97,5 (97,0-97,9) 94,1 (93,3-94,8) 67,9 (47,6-84,1) 100 (87,7-100) 100 (87,7-100) 98,5 (98,1-98,9) 97,3 (96,7-97,7) 93,8 (93,0-94,5) REF 9531 38 / 44 2009-9531-001NO Rev 2.2

Tabell 4: PALMS-studien: Testpositivitet (kolposkopihenvisningsrate), sensitivitets- og spesifisitetsrater for CINtec PLUS i sorteringen av ASC-US celleprøvecytologiresultater. Resultater for HC2 høyrisiko-hpv DNA-testing vises for sammenligning. Henvisning til kolposkopi % (n) CIN2+ Sensitivitet konfidensintervall) CIN2+ Spesifisitet konfidensintervall) CIN3+ Sensitivitet konfidensintervall) Kvinner 18-65 år, ASC-US (n=575; 18 CIN 2+, 14 CIN 3+) CINtec PLUS 25,6 (147) 94,6 (70,2-99,2) 77,5 (73,7-80,9) 100 (76,8-100) HR-HPV 41,9 (241) 100 (81,5-100) 60,7 (56,5-64,7) 100 (76,8-100) Kvinner 18-29 år, ASC-US (n=219; 10 CIN 2+, 8 CIN 3+) CINtec PLUS 32,0 (70) 100 (69,2-100) 73,0 (66,2-78,8) 100 (63,1-100) HR-HPV 57,5 (126) 100 (69,2-100) 45,5 (38,8-52,5) 100 (63,1-100) Kvinner 30-65 år, ASC-US (n=356; 8 CIN 2+, 6 CIN 3+) CINtec PLUS 21,6 (77) 87,2 (45,7-98,2) 80,3 (75,6-84,2) 100 (54,1-100) HR-HPV 32,3 (115) 100 (63,1-100) 69,7 (64,6-74,3) 100 (54,1-100) REF 9531 39 / 44 2009-9531-001NO Rev 2.2

Tabell 5: EEMAPS-studien: Testpositivitet (kolposkopihenvisningsrate), sensitivitets- og spesifisitetsrater for CINtec PLUS i sorteringen av ASC-US celleprøvecytologiresultater. Resultater for HC2 høyrisiko-hpv DNA-testing vises for sammenligning. Henvisning til kolposkopi % CIN2+ Sensitivitet konfidensintervall) CIN2+ Spesifisitet konfidensintervall) CIN3+ Sensitivitet konfidensintervall ) Kvinner fra 18-65 år, celleprøve-cytologi ASC-US (n= 361; 77 CIN2+, 51 CIN3+) CINtec PLUS 34,8 92,2 (83,8-97,1) HR-HPV 69,6 90,9 (82,2-96,3) 80,6 (75,6-85,1) 36,3 (30,7-42,2) 92,2 (81,1-97,8) 90,2 (78,6-96,7) Kvinner fra 18-29 år, celleprøve-cytologi ASC-US (n= 136; 31 CIN2+, 20 CIN3+) CINtec PLUS 43,1 96,8 (83,3-99,9) HR-HPV 81,8 100 (88,8-100) 72,4 (62,8-80,7) 23,8 (16,0-33,1) 100 (83,2-100) 100 (83,2-100) Kvinner fra 30-65 år, celleprøve-cytologi ASC-US (n= 225; 46 CIN2+, 31 CIN3+) CINtec PLUS 29,8 89,1 (76,4-96,4) HR-HPV 62,2 84,8 (71,1-93,7) 85,5 (79,4-90,3) 43,6 (36,2-51,2) 87,1 (70,2-96,4) 83,9 (66,3-94,5) REF 9531 40 / 44 2009-9531-001NO Rev 2.2

Tabell 6: PALMS-studien: Testpositivitet (kolposkopihenvisningsrate), sensitivitets- og spesifisitetsrater for CINtec PLUS i sorteringen av LSIL celleprøvecytologiresultater. Resultater for HC2 høyrisiko-hpv DNA-testing vises for sammenligning. Henvisning til kolposkopi % (n) CIN2+ Sensitivitet konfidensintervall) CIN2+ Spesifisitet konfidensintervall) CIN3+ Sensitivitet konfidensintervall ) Kvinner 18-65 år, LSIL (n= 529; 63 CIN 2+, 25 CIN 3+) CINtec PLUS 52,4 (277) 85,4 (74,5-92,2) 53,9 (49,1-58,6) 88,0 (68,7-96,0) HR-HPV 83,9 (444) 98,1 (87,9-99,7) 18,8 (15,4-22,7) 100 (86,3-100) Kvinner 18-29 år, LSIL (n= 250; 26 CIN 2+, 8 CIN 3+) CINtec PLUS 54,8 (137) 84,2 (65,1-93,9) 50,5 (43,6-57,3) 87,9 (47,4-98,3) HR-HPV 88,0 (220) 95,3 (73,7-99,3) 13,3 (9,3-18,7) 100 (63,1-100) Kvinner 30-65 år, LSIL (n= 279; 37 CIN2+, 17 CIN3+) CINtec PLUS 50,2 (140) 86,0 (70,7-94,0) 56,9 (50,2-63,3) 87,8 (62,4-96,9) HR-HPV 80,3 (224) 100 (90,5-100) 23,6 (18,5-29,5) 100 (80,5-100) REF 9531 41 / 44 2009-9531-001NO Rev 2.2

Tabell 7: EEMAPS-studien: Testpositivitet (kolposkopihenvisningsrate), sensitivitets- og spesifisitetsrater for CINtec PLUS i sorteringen av LSIL celleprøvecytologiresultater. Resultater for HC2 høyrisiko-hpv DNA-testing vises for sammenligning. Henvisning til kolposkopi % CIN2+ Sensitivitet konfidensintervall) CIN2+ Spesifisitet konfidensintervall) CIN3+ Sensitivitet konfidensintervall) Kvinner 18-65 år, celleprøve-cytologi-lsil (n= 415; 137 CIN2+, 72 CIN3+) CINtec PLUS 52,3 94,2 (88,8-97,4) HR-HPV 86,2 96,4 (91,7-98,8) 68,0 (62,2-73,4) 19,1 (14,6-24,2) 95,8 (88,3-99,1) 95,8 (88,3-99,1) Kvinner 18-29 år, celleprøve-cytologi-lsil (n= 142; 55 CIN2+, 32 CIN3+) CINtec PLUS 60,6 96,4 (87,5-99,6) HR-HPV 87,3 94,5 (84,9-98,9) 62,1 (51,0-72,3) 17,2 (10,0-26,8) 96,9 (83,8-99,9) 93,8 (79,2-99,2) Kvinner 30-65 år, celleprøve-cytologi-lsil (n=273; 82 CIN2+, 40 CIN3+) CINtec PLUS 48,4 92,7 (84,8-97,3) HR-HPV 85,3 97,6 (91,5-99,7) 70,7 (63,7-77,0) 19,9 (14,5-26,3) 95,0 (83,1-99,4) 97,5 (86,8-99,9) REF 9531 42 / 44 2009-9531-001NO Rev 2.2

Figur 1: Wolfsburg-studien:Prosessdiagram som viser fordelingen av tilfeller med biopsibekreftet CIN2+ hos kvinnerfra 30 år og eldre og testet celleprøve-negativt, HPVpositivt, i henholdsvis CINtec PLUS-positive kontra negative grupper. 25,5 % 74,5 % 68,8 % 31,2 % 99,1 % 0,9 % REF 9531 43 / 44 2009-9531-001NO Rev 2.2

Tabell 8: Wolfsburg-studien: Sensitivitets- og spesifisitetsrater (for biopsi-bekreftet CIN2+) for CINtec PLUS i sorteringen av celleprøvenegative, HPV-positive testresultater. Tallene er basert på evalueringen av 147 tilfeller med kolposkopiske biopsier tatt under en gjennomsnittlig oppfølgingsperiode på 12,5 måneder. CIN2+ Sensitivitet konfidensinterv all) CIN2+ Spesifisitet konfidensintervall) CIN3+ Sensitivitet konfidensintervall) Kvinner 30 år og eldre, celleprøve-cytologi normal, HPV-test positiv (n=147, 37 CIN2+, 28 CIN3+) CINtec PLUS 91,9 (78,1-98,3) 84,5 (76,4-90,7) 96,4 (81,7-99,9) CIN3+ Spesifisitet konfidensintervall) 79,8 (71,5-86,6) REF 9531 44 / 44 2009-9531-001NO Rev 2.2