96 TESTER 72741 SETT FOR KVALITATIV/KVANTITATIV PÅVISNING AV ANTI- TOXOPLASMA GONDII IgG I HUMANT SERUM ELLER PLASMA MED ENZYMIMMUNANALYSE Til in vitro-diagnostisering Alle produserte og markedsførte reagenser gjennomgår et fullstendig kvalitetssikringssystem fra mottakelsen av råvarene til markedsføringen av produktet. Hvert parti sendes til kvalitetskontroll og slippes kun ut på markedet hvis det oppfyller de fastsatte godkjennelseskriteriene. Registreringen av produksjonen og kontrollen av de enkelte partier oppbevares i vårt firma.
INNHOLDSFORTEGNELSE 1 - FORMÅL... 3 2 - KLINISK BETYDNING... 3 3 - ANALYSEPRINSIPP... 3 4 - SETTETS INNHOLD... 4 5 - FORHOLDSREGLER OG ADVARSLER... 6 6 - NØDVENDIG MATERIALE SOM IKKE LEVERES MED PRODUKTET... 8 7 - KLARGJØRING OG OPPBEVARING AV REAGENSER... 9 8 - PRØVER... 10 9 - ANALYSEPROSEDYRE... 11 10 - BEREGNING OG FORTOLKING AV RESULTATENE... 12 11 - TESTENS YTEEVNE OG BEGRENSNINGER... 15 12 - REFERANSER... 19
1- FORMÅL Platelia TM Toxo IgG TMB er et in-vitro diagnostiseringstestsett som brukes for kvalitativ og kvantitativ påvisning av anti-toxoplasma gondii IgG i humant serum eller plasma. 2- KLINISK INTERESSE T. gondii er et protozo som fremkaller infeksjon hos et stort antall pattedyr og fugler. Toksoplasmose, som ofte finnes hos mennesker og dyr, er for det meste skjult. Utbredelsen av denne infeksjonen i befolkningen, anerkjent bruk av serologiske tester, kan variere, avhengig av opprinnelseslandet og alderen. Toksoplasmose under graviditet er implisert i alvorlige tilfeller av medfødte feil (især svekkede hjernefunksjoner) og til tider dødfødte barn. Påvisning av Toxo IgGantistoff hos kvinner før en befruktning sikrer at fosteret beskyttes mot eventuell toksoplasmose under graviditeten. Tendens til alvorlig toksoplasmose-infeksjon er alminnelig hos personer som har blitt konstatert positive for AIDS (Acquired Immune Deficiency Syndrome), eller som på annet vis har et nedsatt immunforsvar. Disse infeksjonene skyldes hovedsakelig reaktivering av T. gondii-cyster som var til stede før HIV-infeksjonen. Spesifikk diagnostisering av T. gondii-infeksjon kan være komplisert, og parasitten selv blir sjelden isolert. Serologisk bekreftelse av T. gondii-antistoffer tyder på eksponering for parasitten og er blitt bredt akseptert som en metode til å bestemme immunstatus og mottakelighet for infeksjon. Screening av flere isotyper muliggjør enten datering av T. gondii og implementeringen av den rette behandlingen i tilfelle ny infeksjon, eller forslaget om profylaktiske anbefalinger: retningslinjer for hygiene og kosthold for gravide kvinner, kjemoprofylakse i grupper med nedsatt immunforsvar. 3- ANALYSEPRINSIPP Prinsippet for denne analysen er en enzymimmunanalyseteknikk med fast fase som kalles en indirekte ELISA. T. gondii-antigenet som brukes for å belegge
mikrotiterplaten, kommer fra tachyzoitultrasonat som er beriket med membranproteiner. Konjugatet består av et peroksidasemerket monoklonalt antistoff som er spesifikt mot humane gammakjeder. Første trinn Fortynnede prøver plasseres i brønner på mikrotiterplaten som er belagt med T. gondii-antigen. Under inkubasjonen i en time ved 37 C binder T. gondii-antistoffene i prøven seg til T. gondii-antigenet som brønnene på mikrotiterplaten er belagt med. Etter inkubasjonen fjernes de ubundne antistoffene og serumproteinene ved flere vask. Annet trinn Konjugatet (peroksidasemerket monoklonalt antistoff som er spesifikt mot humane gammakjeder tilsettes brønnene på mikrotiterplatene. I løpet av en annen inkubasjon på en time ved 37 C, binder de peroksidasemerkede monoklonale antistoffene seg til IgG antistoffets T. gondii-antigenkomplekser som er bundet til brønnene på mikrotiterplaten. Det ubundne konjugatet fjernes ved flere vask. Tredje trinn Forekomsten av immunkompleks (T. gondii Ag, anti-t. gondii IgG, anti IgG-konjugat) påvises ved tilsetningen av en oppløsning som inneholder et peroksidasesubstrat og et kromogen som igangsetter en fargeutviklingsreaksjon. Fjerde trinn Etter en halv times inkubasjon ved romtemperatur stanses den enzymatiske reaksjonen ved å tilsette en syre, H 2 SO 4 1N. Den optiske densitetsavlesningen som oppnås med et spektrofotometer som er innstilt på 450/620 nm, er proporsjonal med den mengden T. gondii IgG-antistoff som finnes i prøven. Avlesningen konverteres til IU/ml ved hjelp av en standardkurve. Kalibratorsera (R4a, R4b, R4c) er kalibrert i forhold til WHO-standarden (TOXM 185). 4- SETTETS INNHOLD Alle reagenser er utelukkende til in vitro-diagnostisering. Etikett Reagenstype Presentasjon R1 Microplate Mikrotiterplate: 12 strimler à 8 1 plate individuelle brønner belagt med T. gondiiantigener (RH-stamme)
R2 Concentrated Washing Solution Konsentert vaskeoppløsning (10x): TRIS-NaCl-buffer (ph 7,4) 1 % Tween 20. Konserveringsmiddel: 0,01 % Thimerosal R3 Calibrator 0 Kalibrator 0: Humant serum som ikke er reaktivt overfor T. gondii-antistoffer, hepatitt B-overflateantigen (HBs Ag), HIV1/HIV2-antistoffer (Human Immodeficiency Virus) og hepatitt C- antistoffer (HCV). Konserveringsmiddel: < 0,01 % Thimerosal R4a Calibrator 6 Kalibrator 6 IU/ml: TRIS-NaCl-buffer (ph 8 ± 0,2), humant serum som er reaktivt overfor T. gondii-antistoffer og ikke reaktivt overfor hepatitt B- overflateantigen (HBs Ag), HIV1/HIV2- antistoffer (Human Immodeficiency Virus) og hepatitt C-antistoffer (HCV), bovin serum albumin, glyserol, E102 og E122. Konserveringsmiddel: < 0,01 % Thimerosal og < 0,5 % Proclin 300. R4b Calibrator 60 Kalibrator 60 IU/ml: TRIS-NaCl-buffer (ph 8 ± 0,2), humant serum som er reaktivt overfor T. gondii-antistoffer og ikke reaktivt overfor hepatitt B- overflateantigen (HBs Ag), HIV1/HIV2- antistoffer (Human Immodeficiency Virus) og hepatitt C-antistoffer (HCV), bovin serum albumin, glyserol, E102 og E122. Konserveringsmiddel: < 0,01 % R4c R6 Calibrator 240 Conjugate (50x) Thimerosal og < 0,5 % Proclin 300. Kalibrator 240 IU/ml: TRIS-NaCl-buffer (ph 8 ± 0,2), humant serum som er reaktivt overfor T. gondii-antistoffer og ikke reaktivt overfor hepatitt B- overflateantigen (HBs Ag), HIV1/HIV2- antistoffer (Human Immodeficiency Virus) og hepatitt C-antistoffer (HCV), bovin serum albumin, glyserol, E102 og E122. Konserveringsmiddel: < 0,01 % Thimerosal og < 0,5 % Proclin 300. Konjugat: Pepperrotperoksidasemerket murint monoklonalt antistoff mot humane gammakjeder. Konsentrert (50x). R7 Diluent Prøve- og konjugatfortynner: TRIS-NaCl-buffer (ph 7,7 ± 0,15), bovint serum albumin, 0,1 % Tween 20 og fenolrød. 1 flaske 100 ml 1 flaske 1 ml 1 flaske 1 ml 1 flaske 1 ml 1 flaske 1 ml 1 flaske 0,6 ml 2 flasker 80 ml
R8 R9 R10 TMB Substrate Buffer Chomogen: TMB Solution Stopping Solution Konserveringsmiddel: < 0,01 % Thimerosal. Substratbuffer: Oppløsning av sitronsyre og natriumacetat med ph 4,0 som inneholder 0,015 % H 2 0 2 og 4 % DMSO. Kromogen: Oppløsning med tetrametylbenzidin (TMB) Stoppoppløsning: 1N-svolvelsyreoppløsning Selvklebende folie 4 1 flaske 60 ml 1 flaske 5 ml 1 flaske 28 ml 5-FORHOLDSREGLER OG ADVARSLER Forholdsregler Resultatenes pålitelighet avhenger av en korrekt implementering av følgende regler for god laboratoriepraksis: Unngå å anvende foreldede reagenser. Bland ikke reagenser fra forskjellige partier i samme test Merk: Det er mulig å bruke reagenser fra andre partier enn de som er levert med dette settet under forutsetning av at samme parti brukes for hele testforløpet: vaskeoppløsning (R2, etikettidentifikasjon: 10x blåfarget), substratbuffer (R8, etikettidentifikasjon: TMB-buffer, blåfarget), kromogen (R9, etikettidentifikasjon: TMBoppl., grønnfarget) og stoppoppløsning (R10, etikettidentifikasjon: 1 N rødfarget). Disse reagensene kan anvendes sammen med andre av våre produkter. Kontakt vår tekniske serviceavdeling for nærmere opplysninger. Det er nødvendig å vente 30 minutter før bruk slik at reagensene kan stabilisere seg ved romtemperatur. Rekonstituer reagensene forsiktig for å unngå kontaminering. Unngå å utføre testen i nærheten av reaktive damper (syre, alkaliske damper og aldehyddamper) eller støv som kan påvirke konjugatets enzymaktivitet. Benytt helst engangsmateriale, ellers kan det brukes glassutstyr som er vasket grundig og skylt med demineralisert vann. Unngå at mikrotiterplaten tørker mellom vask og fordelingen av reagens.
Enzymreaksjonen er meget følsom overfor metallioner. Unngå derfor at metallelementer kommer i berøring med de forskjellige konjugat- eller substratoppløsningene. Fargefremkalleoppløsningen (substratbuffer + kromogen) skal være fargeløs. Hvis en blå farge forekommer noen få minutter etter rekonstitueringen, kan reagensen ikke anvendes og skal utskiftes. Forberedelsen av denne oppløsningen kan utføres i en ny engangsplastikkbakke eller en glassbeholder som først er vasket med 1N HCl og deretter grundig skylt med destillert vann og tørket. Oppbevar oppløsningen på et mørkt sted. Bruk en ny pipettespiss til hver prøve. Grundig vask av mikrotiterplaten er et avgjørende trinn i prosedyren: Overhold det anbefalte antall vaskesykler og kontroller at alle brønner blir helt fylt og deretter helt tømt. Feil vask kan medføre unøyaktige resultater. Bruk aldri den samme beholderen til å fordele konjugat- og utviklingsoppløsning. Kontroller at pipettene og annet utstyr er i orden og fungerer korrekt. Analyseprosedyren må ikke endres. Helse- og sikkerhetsmessige forholdsregler Alle reagensene i settet er beregnet til in vitro-diagnosisering. Bruk engangshansker når reagenser håndteres. Ikke bruk pipetten med munnen. Humant kildemateriale som brukes til klargjøring av reagenser, er blitt testet og funnet ikke reaktivt overfor hepatitt B-overflateantigen (HBs Ag), antistoffer mot hepatitt C (HCV) og antistoffer mot HIV 1 og HIV 2 (Human Immunodeficiency Virus). Ettersom ingen metode kan gi full garanti for fravær av smittsomme stoffer, skal reagenser av human opprinnelse og pasientprøvene håndteres som potensielt smittefarlige. Betrakt alt materiale som har vært i direkte kontakt med prøver og reagenser av human opprinnelse samt vaskeoppløsninger, som smittefarlig materiale. Unngå å velte prøver eller oppløsninger eller prøver som inneholder prøvemateriale.
Hvis materiale søles, skal det rengjøres med klorin i en oppløsning på 10 %. Hvis den kontaminerte væsken er en syre, skal først det sølte materialet nøytraliseres med natriumbikarbonat, deretter rengjøres det med klorin og tørkes opp med sugende papir. Materialet som anvendes til rengjøringen, skal kastes og plasseres i en avfallsbeholder for farlig avfall. Prøver, reagenser av human opprinnelse og kontaminert materiale og produkter skal kastes etter desinfeksjon: - enten ved nedsenking i klorin med en endelig konsentrasjon på 5 % natriumhypokloritt i 30 minutter, - eller ved autoklavering ved 121 C i minst to timer. Autoklavering i minst én time ved 121 C er den beste metode for deaktivering av HIV- og HB-viruser. ADVARSEL: UNNGÅ Å PLASSERE OPPLØSNINGER SOM INNEHOLDER NATRIUMHYPOKLORITT I AUTOKLAVEN. ADVARSEL: Visse reagenser inneholder: *Proclin TM 300 < 0,5 %: IRRITERENDE PRODUKT R43: Kan gi overfølsomhet ved kontakt med huden. S28-37: Hvis stoff kommer på huden, skal det straks vaskes med store mengder vann og såpe. Bruk egnede beskyttelseshansker. Xi-irriterende Kjemikalier skal håndteres og kastes ifølge god laboratoriepraksis. Unngå at huden og slimhinner kommer i kontakt med substratbufferen, kromogenet og stoppoppløsningen (fare for forgiftning, irritasjon eller etsning). Sikkerhetsdataarket utleveres etter anmodning. 6-NØDVENDIG MATERIALE SOM IKKE LEVERES MED PRODUKTET Vortex-mikser. Mikrotiterplateleser utstyrt med filter på 450 nm og 620 nm (*).
Vannbad eller tilsvarende inkubator til mikrotiterplater med termostatinnstilling på 37 ± 1 C (*). Beholder til farlig biologisk avfall. Natriumhypokloritt og natriumbikarbonat. Destillert eller demineralisert vann. Gradert sylinderglass med kapasitet på hhv. 25, 50, 100 og 1000 ml. Engangslatexhansker. Vernebriller. Absorberende papir. Automatiske eller halvautomatiske, justerbare eller forhåndinnstillbare pipetter eller multipipetter til måling og fordeling av 10 1000 µl og 1,2 og 10 ml. Manuell, halvautomatisk eller automatisk mikrotiterplatevasker (*). Engangs reagensrør. (*) Kontakt oss hvis det ønskes nærmere opplysninger om utstyr som anbefales av vår tekniske avdeling. 7-REKONSTITUERING OG OPPBEVARING AV REAGENSER Settet skal oppbevares ved 2 8 C inntil utløpsdatoen på pakken. Merk: La reagensene stabilisere seg ved romtemperatur (18 30 C) før de brukes. 1) Bruksklare reagenser Reagens 1 (R1): mikrotiterplate Hver bakke inneholder 12 strimler à 8 individuelle brønner i en forseglet foliepose. Klipp posen opp med en saks eller skalpell 0,5 1 cm over linjen. Legg straks de ubrukte teststrimlene tilbake i posen. Etter åpning, er strimlene holdbare i én måned hvis posen lukkes omhyggelig, og oppbevares ved 2 8 C. Reagens 3 (R3), Reagens 4a (R4a), Reagens 4b (R4b), Reagens 4c (R4c), Reagens 10 (R10): Reagensene er holdbare inntil utløpsdatoen på etiketten hvis de oppbevares ved 2 8 C (også etter åpning). 2) Reagenser til rekonstituering Reagens 2 (R2): Konsentrert vaskeoppløsning 10 x
Oppløs reagensen i forholdet 1:10 i destillert vann for å oppnå en bruksklar oppløsning (R2d). Forbered 350 ml til en enkelt plate med 12 teststrimler med manuell avvasking. Holdbar i to uker etter fortynningen ved 2-8 C. Den konsentrerte oppløsningen kan oppbevares ved 2 25 C. Konjugatoppløsning: Reagens 6 (R6) + Reagens 7 (R7) Til en enkelt mikrotiterplate fortynnes 0,5 ml 50 x konjugatkonsentrat i 25 ml fortynner (R7) for å oppnå bruksoppløsningen. Blant nøye. Del disse mengdene med 10 for å oppnå den nødvendige mengden til en teststrimmel med 8 brønner. Bruk konjugatbruksoppløsningen (R6d) innen 60 minutter etter fremstilling. Fargefremkallingsoppløsning: Reagens 8 (R8) + Reagens 9 (R9) Oppløs kromogenet (R9) i forholdet 1:11 i buffersubstratet (R8) (f.eks.: 1 ml reagens R9 + 10 ml reagens R8). Reagensene kan oppbevares på et mørkt sted i opp til 6 timer ved romtemperatur (18 30 C) etter fortynning. 8-PRØVETAKING, -FORBEREDING OG -OPPBEVARING 1. Serum eller plasma (EDTA, sitrat og heparin) anbefales som prøvetyper. 2. Følg anbefalingene nedenfor for håndtering, behandling og oppbevaring av blodprøver: Innsamle alle blodprøver under overholdelse av de generelle forholdsregler for venepunktur. La serumprøvene koagulere fullstendig før de sentrifugeres. Sørg for at rørene alltid er lukkede. Skill serumet eller plasmaet fra koagelet eller de røde blodlegemene i et tett gjenlukket oppbevaringsrør etter sentrifugeringen. Prøvene kan oppbevares ved 2 8 C hvis screeningen utføres innen 7 dager. Hvis analysen ikke utføres innen 7 dager, eller prøvene skal sendes, skal de nedfryses til minst -20 C. Tin opp prøvene maksimalt tre ganger. Tidligere nedfrosne prøver skal blandes nøye etter opptining før testen utføres. 3. Prøver som inneholder opp til 90 g/l albumin, 100 mg/l bilirubin, lipemiske prøver med mengder som tilsvarer 36 g/l triolein (triglycerid) og hemolyserte prøver som inneholder opp til 10 g/l hemoglobin, påvirker ikke resultatene.
4. Prøvene skal ikke varmes. 9-ANALYSEPROSEDYRE Følg den angitte prosedyre nøye. Bruk kalibratorene til hver serie med bestemmelser for å bekrefte testresultatene. Anvend god laboratoriepraksis. 1. Fastsett prøvefordelingen og identifikasjonsoversikten nøye. 2. Klargjør den fortynnede vaskeoppløsningen (R2d) (se avsnitt 7). 3. Ta transportbakken og strimlene (R1) ut av beskyttelsesposen. 4. Vask mikrotiterplatestrimlene en enkelt gang med vaskebruksoppløsningen (R2d). Snu mikrotiterplaten og gi den lette slag med fingeren over absorberende papir for å fjerne resterende væske. 5. Fortynn testsera ved å tilsette 10 µl prøvemateriale til 1 ml fortynner (R7). Kalibratorer på 0, 6, 60 og 240 IU/ml (R3, R4a, R4b og R4c) fortynnes på samme måte for å oppnå en fortynning i forholdet 1:101. Bland de fortynnede prøvene på Vortex-mikseren. 6. Ved manuell utførelse av analysen, tilsettes 200 µl fortynnede kalibratorer og testprøver i brønnene slik: Brønn 1A: 200 µl kalibrator O IU/ml (R3) fortynnet 1:101 Brønn 1B: 200 µl kalibrator 6 IU/ml (R4a) fortynnet 1:101 Brønn 1C: 200 µl kalibrator 60 IU/ml (R4b) fortynnet 1:101 Brønn 1D: 200 µl kalibrator 240 IU/ml (R4c) fortynnet 1:101 Brønn 1E, 1F, 1G osv. 200 µl prøvemateriale fortynnet 1:101 7. Når det er mulig, dekkes mikrotiterplaten med klebefolie. Press folien fast over hele platen slik at den blitt tett. Inkuber deretter mikrotiterplaten i et termostatkontrollert vannbad eller en inkubator til mikrotiterplater ved 37 ± 1 C i 1 time ± 5 minutter. 8. Forbered konjugat bruksoppløsningen (R6d) 15 minutter før avslutningen av den første inkubasjonsperioden. Fortynn 0,5 ml 50 x konjugatkonsentrat (R6) i 25 ml fortynner (R7) til en mikrotiterplate. Bland grundig (se avsnitt 7). 9. Fjern klebefolien. Sug innholdet fra alle brønnene opp i en beholder for biologisk farlig avfall (som inneholder natriumhypokloritt). Vask mikrotiterplaten en enkelt
gang med vaskebruksoppløsningen (R2d). Snu mikrotiterplaten og gi den lette slag med fingeren over absorberende papir for å fjerne resterende væske (se avsnitt 10). 10. Fordel straks 200 µl konjugatbruksoppløsningen (R6d) i alle brønnene. Oppløsningen skal ristes forsiktig før bruk. 11. Tildekk mikrotiterplaten med klebefolie. Press folien fast over hele platen slik at den blitt tett. Inkuber deretter mikrotiterplaten i et termostatkontrollert vannbad eller en inkubator til mikrotiterplater ved 37 ± 1 C i 1 time ± 5 minutter. 12. Fjern klebefolien, tøm alle brønnene ved oppsuging, og vask fire ganger som beskrevet ovenfor. Snu mikrotiterplaten og gi den lette slag med fingeren over absorberende papir for å fjerne resterende væske. 13. Fordel straks og raskt 200 µl homogenisert fargefremkallingsoppløsning (R8 + R9) i hver brønn. La reaksjonen foregå i mørke i 30 minutter ved romtemperatur (18 30 C). Bruk ikke selvklebende folie under inkubasjonen. 14. Tilsett 100 µl stoppoppløsning (R10) i samme rekkefølge og med samme fordelingsfrekvens som for fargefremkallingsoppløsningen. 15. Tørk undersiden av platen forsiktig av. Les av den optiske densiteten ved 450/620 nm ved hjelp av en mikrotiterplateleser innen 30 minutter etter at reaksjonen stoppet (teststrimlene må aldri utsettes for lys før avlesningen). 16. Kontroller at alle resultater stemmer overens når det gjelder avlesningen, plate, prøvefordeling og identifikasjonsoversikt. 10-BEREGNING OG FORTOLKING AV RESULTATENE 1) Opplysninger om kalibrering Forekomsten og mengden av IgG-antistoffer til T. gondii i testprøven bestemmes ved å sammenligne den optiske densiteten (OD) i prøven med en standardserie. Kalibratorene på 6, 60, 240 IU/ml i settet er kalibrert etter WHO-standard (TOX M 185) serum. Visse uoverensstemmelser i titrene kan likevel observeres for det samme serumet når det testes med forskjellige serologiske teknikker. Denne forskjellen skyldes at T. gondii som brukes i de forskjellige teknikkene inneholder variable mengder oppløselig membranantigen.
2) Kvalitetskontroll Inkluder alle kalibratorene for hver testgjennomgang. Kriteriene nedenfor skal oppfylles for å kunne validere analysen. Verdier for optisk densitet: - OD R3 0,200 - OD R4c 1,000 Forhold: OD R4a / OD R3 2 Hvis spesifikasjonene ikke oppfylles, skal testen kjøres igjen. 3) Fastsettelse av standardkurven a) Tegning av standardkurven Bruk linjert papir til manuell datareduksjon og skriv opp OD-avlesningene for kalibratorene (R3, R4a, R4b og R4c) på den loddrette aksen (y-aksen). Sett inn den tilsvarende konsentrasjonen i IU/ml på den vannrette aksen (x-aksen). Trekk opp en kurve gjennom de fire punktene som passer best mulig. b) Beregning av konsentrasjonen i IU/ml Hvis OD-avlesningen av testprøven befinner seg i intervallet mellom OD R4a og OD R4c, skal den tilsvarende verdien finnes for testprøvens OD-avlesning på y-aksen, og en vannrett linje tegnes til standardkurven. Fra skjæringspunktet med standardkurven, trekkes en loddrett linje til x-aksen. Les av konsentrasjonen i U/ml ved skjæringspunktet med x-aksen. NB: Hvis OD-avlesningen for en testprøve som er fortynnet i forholdet 1:101 er større enn OD R4c, skal denne prøven fortynnes i forholdet 1:1010 i R7-oppløsning og analyseres igjen. De tilknyttede verdier (IU/ml) skal deretter ganges med faktor 10. 4) Fortolkning av resultatene Påvisning av IgG anti-t. gondii med Platelia Toxo IgG TMB viser pasientenes immunstatus. Titer < 6 IU/ml Ubetydelig forekomst av antistoff med denne teknikken = ingen immunitet. 6 IU/ml Titer 9 IU/ml
Ubetydelig forekomst av antistoff med denne teknikken = Resultatet av en enkelt serumprøve gir ikke tilstrekkelig bevis for å kunne fastsette pasientens immunstatus i forhold til T. gondii. Ifølge anbefalingene i Frankrike, skal det utføres nye tester av enda en prøve ved hjelp av to forskjellige teknikker. 9 IU/ml Titer 240 IU/ml Betydelig forekomst av antistoff = langvarig immunitet eller tidlig fase av serokonversjon. Titer > 240 IU/ml Utbredt forekomst av antistoff = nylig serokonversjon eller permanent høy immunstatus som kan observeres hos visse personer. Begrensninger for prosedyren Diagnostisering av nylig infeksjon med parasitten kan kun bekreftes på bakgrunn av en kombinasjon av kliniske observasjoner og serologiske data. Resultatet av en enkelt serumprøve gir ikke tilstrekkelig bevis for diagnostisering av en nylig infeksjon. Bare en markant stigning i titeren for anti-t. gondii IgG-antistoff i to serumprøver som er tatt med minst tre ukers intervall og testet i samme analyseserie, kan danne basis for en diagnostisering av en nylig infeksjon og kan betraktes som bevis for en nylig infeksjon av parasitten. Forekomsten av IgM-antistoff til T. gondii skal også evalueres som en del av den serologiske overvåking av personer som mistenkes for å ha en T. gondii-infeksjon ettersom forekomsten av anti-t. gondii IgGantistoff kan inntreffe litt senere enn anti-t. gondii IgM-antistoff. 5) Hjelp til feilsøking Reaksjoner som ikke bekreftes eller gjentas, skyldes ofte: Utilstrekkelig vask av mikrotiterplater. Kontaminering av negative prøver med serum eller plasma med høy antistofftiter. Kontaminering av fargefremkallingsoppløsningen med oksideringsmiddel (natriumhypokloritt, metallioner o.l.). Kontaminering av stoppoppløsningen. 6) Eksempel på beregning
Merk: Følgende data er gitt som eksempel og må ikke brukes i stedet for resultatene som brukeren har kommet frem til. Resultater Innhold i brønn OD 450 / 620 nm) Konsentrasjon (IU/ml) R3 (negativ) 0,121 0 R4a 0,615 6 R4b 1,466 60 R4c 2,099 240 Serum 1 (fortynning 1:101) 0,108 Negativ Serum 2 (fortynning 1:101) 0,675 7 IU/ml Serum 3 (fortynning 1:101) 0,808 12 IU/ml Serum 4 (fortynning 1:101) 2,080 231 IU/ml Serum 5 (fortynning 1:101) 1,283 43 IU/ml * Ved fortynning i forholdet 1:1010, er sluttkonsentrasjonen = IU/ml x 10 Validering av testen - Verdier for optisk densitet - Forhold OD R3 0,200 OD R4a / OD R3 2 OD R4c 1,000 11-TESTENS YTEEVNE OG BEGRENSNINGER Undersøkelsene ble utført på prøver innsamlet i tørrglass, SST-rør, rør med koagelaktivator eller rør med forskjellige antikoagulanter (EDTA, heparin og sitrat). 1. Yteevne Egenskapene når det gjelder yteevnen til Platelia TM Toxo IgG TMB-testen er sammenfattet nedenfor og er oppnådd ved hjelp av friske serumprøver fra gravide kvinner, pasienter med nedsatt immunforsvar eller normale, ambulante blodgivere og frosne serumprøver som er kjent som positive eller negative. Sammenlignende undersøkelser I alt ble 787 tilfeldig valgte prøver fra gravide kvinner analysert ved hjelp av Platelia TM Toxo IgG TMB-testen og med en annen EIA-test på markedet. Det ble benyttet en direkte agglutinasjonstest for å fjerne avvikende resultater. Tvilsomme resultater fra
23 prøver ble utelatt fra de etterfølgende beregninger for den relative spesifisitet og sensitivitet, og den relative overensstemmelse. Platelia TM Toxo IgG TMB Resultat Negativ Positiv I alt Annen EIA-test Negativt 488 0 488 Positivt 5 271 276 I alt 493 271 764 Resultater av den prospektive studie (sted 1) Relativ spesifisitet 488/488 100 % (99,0 100,0) Relativ sensitivitet 271/276 98,2 % (95,6 99,3) Relativ overensstemmelse 759/764-99,3 % (98,8 99,9) Spesifisitetsstudier Spesifisiteten av Platelia TM Toxo IgG TMB-testen ble evaluert på to uavhengige steder. Analysene som ble anvendt til serumbeskrivelsen, var EIA-analyser som fantes på markedet. Spesifisiteten for analysen ble bestemt ut fra denne beskrivelsen. Det ble benyttet en direkte agglutinasjonstest til å fjerne avvikende resultater. Tvilsomme resultater ble utelatt fra de etterfølgende beregningene for spesifisitet: - sted 1: 99,8 % (403/404) - sted 2: 100 % (488/488) I alt: 99,9 % (891/892) Undersøkelse av sensitiviteten Sensitiviteten av Platelia TM Toxo IgG TMB-testen ble evaluert på to uavhengige steder. Analysene som ble anvendt til seriumkarakterisering, var EIA-analyser som fantes på markedet. Spesifisiteten for analysen ble bestemt ut fra denne
karakteriseringen. Det ble benyttet en direkte agglutinasjonstest til å fjerne avvikende resultater. Tvilsomme resultater ble utelatt fra de etterfølgende beregningene for sensitivitet: - sted 1: 100 % (196/196) - sted 2: 98,2 % (271/276) I alt: 98,9 % (467/472) Paneler med serokonvertering (sted 1 og 2) eller post-infeksjon (sted1) fra: 84 serumprøver fra 33 gravide kvinner (sted1) 48 serumprøver fra 14 gravide kvinner (sted2) ble testet med Platelia TM Toxo IgG TMB. Analysene som ble anvendt til serumkarakterisering, var EIA-analyser som fantes på markedet. Det ble benyttet en direkte agglutinasjonstest til å fjerne avvikende resultater. På sted 1 ga Platelia TM Toxo IgG TMB-testen et positivt resultat på et tidligere tidspunkt enn med den andre EIA-testen i 5 tilfeller. På sted 2 ga den andre EIAtesten, forskjellige fra den forrige, et positivt resultat tidligere enn med Platelia TM Toxo IgG TMB-testen i 6 tilfeller. Utbredelse Utbredelsen av positive resultater for anti-t. gondii IgG-antistoffer i befolkningen varierer mye fra land til land. I området omkring Paris (Frankrike), utgjør de positive resultatene 67,6 % for en antatt sunn blodgivergruppe:
2. Presisjon Gjentakelse i samme analyse: 3 positive og 1 negativ prøve ble analysert 30 ganger i samme analyserserie. Reproduserbarhet mellom analyseserier: 3 positive og 1 negativ prøve ble analysert tre ganger på fem forskjellige dager av to forskjellige teknikere. Prøve Negativt Positiv 1 Positiv 2 Positiv 3 forhold Titer IU/ml Gjennomsnittsverdi 0,25 11 38 110 Standardavvik 0,02 0,83 1,35 9,53 Variasjonskoeffisient 6,29 7,57 3,55 8,64 Prøve Negativt Positiv 1 Positiv 2 Positiv 3 forhold Titer IU/ml Gjennomsnittsverdi 0,22 11,8 39,2 127,5 Standardavvik 0,08 1,65 5,14 14,13 Variasjonskoeffisient 34,11 13,90 13,10 11,08 3. Relevante interferenser 141 prøver ble undersøkt med følgende egenskaper som kunne resultere i uspesifikke reaksjoner. Spesifisitet = 99,29 % (140/141). Prøve var positiv Reaktiv Merknad for CMV IgG 5 1 Negativ ved annet forsøk CMV IgM 5 0 VZV IgM 10 0
VZV IgG 9 0 Mumps IgG 7 0 Mumps IgM 3 0 Rubeola IgG 7 0 Rubeola IgM 7 0 EBV IgG 8 0 EBV IgM 9 0 Rubella IgG 5 0 Rubella IgM 5 0 HSV IgG 5 0 HSV IgM 5 0 HIV 15 0 Myeloma 8 0 RF 15 0 ANA 10 0 HAMA 3 0 Totalt 141 1 12-REFERANSER 1. ANDERSON S.E. and REMINGTON J.S. : The diagnosis of toxoplasmosis. Southern Med. J. 1975; 68, 1433-1443. 2. BELANGER F., DEROUIN F., GRANGEOT-KEROS L., MEYER L. and the HEMOCO and SEROCO Study Groups: Incidence and risk factors of toxoplasmosis in a cohort of Human immuno-deficiency virus-infected patients (1988-1995). Clinical Infectious Diseases 1999; 28, 575-581. 3. BULLOCK S.L., and WALLS, K.W. : Evaluation of some of the parameters of the enzyme-linked immunospecific assay. J. Inf. Dis. (Suppl.) 136: 2, S279-S285. 4. DAFFOS, FORESTIER F., CAPELLA-PAVLOVSKY M., THULLIEZ P., AUFRANT C., VALENTI D. and COX L.: Prenatal management of 746 pregnancies at risk for congenital toxoplasmosis. New Eng. J. Med. 1988; 318, 271-275. 5. DECOSTER A., DARCY F., CARON A., VINATIER D., HOUZE DE L AULNOIS D., VITTU G., NIEL G., HEYER F., LECOLIER B., DELCROIX M., MONNIER J.C., DUHAMEL M. and CAPRON A.: Anti-P30 IgA antibodies as prenatal markers of congenital Toxoplasma infection. 1992; 87, 310-315. 6. DEROUIN F., LEPORT C., PUEYO S., MORLAT P., LETRILLART B., CHENE G., ECOBICHON J.L., LUFT B., AUBERTIN J., HAFNER R., VILDE J.L., SALAMON R. and ANRS 005/ACTG 154 Trial Group. Predictive value of Toxoplasma gondii antibody titres on the occurrence of toxoplasmic encephalitis in HIV infected
patients.aids 1996; 10, 1521-1527. 7. DESMONTS G., COUVREUR J., THULLIEZ Ph., SAINT JOIGNY G. and COLIN J. : Sérodiagnostic de la Toxoplasmose, des méthodes simples, pour des questions précises. Le concours médical 1985; 107-03, 227-234. 8. DUBEY J.P. and BEATTIE C.P.: Toxoplasmosis of animal and man. CRC Press (1988). 9. JENUM P.A., STRAY-PEDERSEN B., MELBY K.K., KAPPERUD G., WHITELAW A., ESKILD A. and ENG J. : Incidence of Toxoplasma gondii infection in 35 940 pregnant women in Norway and pregnancy outcome for infected women. J. Clin. Microbiol. 1998; 36, 2900-2906. 10. JENUM P.A. and STRAY-PEDERSEN B.: Development of specific immunoglobulins G, M, and A following Toxoplasma gondii infection in pregnant women in Norway and pregnancy outcome for infected women. J. Clin. Microbiol. 1998; 36, 2907-2913. 11. JENUM P.A., STRAY-PEDERSEN B. and GUNDERSEN A.G.: Improved Diagnosis of primary Toxoplasma gondii infection in early pregnancy by determination of anti-toxoplasma immunoglobulin G avidity. J. Clin. Microbiol. 1997; 35, 1972-1977. 12. LAPPALAINEN M., KOSKELA P., KOSKINIEMI M., AMMALA P., HILESMAA V., TERAMO K., RAIVIO K.O., REMINGTON J.S., HEDMAN K.: Toxoplasmosis acquired during pregnancy: improved serodiagnosis based on avidity of IgG. J. Infect. Dis. 1993; 41, 155-158. 13. LECOLIER B. and PUCHEU: Usefulness of IgG avidity analysis for the diagnosis of toxoplasmosis. Path. Biol. 1993; 42, 2 155-158. 14. LEBECH M., JOYNSON D.H.M., SEITZ H.M. THULLIEZ P., GILBERT R.E., DUTTON G.N., OVLISEN B. and PETERSEN E.: Classification system and case definition of Toxoplasma gondii infection in immunocompetent pregnant women and their congenitally infected offspring. Eur. J. Microbiol. Infect. Dis. 1996; 15, 799-805. 15. LUFT B.J. and REMINGTON J.S.: Toxoplasmic encephalitis. Clinical Infectious Diseases 1992; 15, 211-222. 16. NAESSENS A., HEUNINCKX W., FOULON W. and LAUWERS S.: Evaluation of seven commercially available enzyme immunoassays for immunoglobulin G and M antibody detection of Toxoplasma gondii. Immunol. Infect. Dis. 1993; 3, 258-262.
17. PETITHORY J.C., REITER-OWONA I., BERTHELOT F., MILGRAM M., DE LOYE J. and PETERSEN E.: Performance of European laboratories testing serum samples for Toxoplasma gondii. Eur. J. Microbiol. Infect. Dis. 1996; 15, 45-49. 18. REMINGTON J.S. and DESMONTS G.: Toxoplasmosis in infectious disease of the fetus and newborn infant. JS Remington and JO Klein, eds. WB Saunders Co., Philadelphia 1976; 191-332. 19. SABIN A.B., and FELDMAN H.A.: Dyes as microchemical indicators of a new immunity phenomenon affecting a protozoan parasite (Toxoplasma), Science 1948; 108: 660-663. 20. SANTORO F., AFCHAIN D., PIERCE J.R., CESBRON J.Y., OVLAQUE G. and CAPRON A.: Serodiagnosis of Toxoplasma infection using a purified parasite protein P30. Clin. Exp. Immunol. 1885; 62, 262-269. 21. SHARMA S.D., MULLENAX J., ARAUJO F.G., ERLICH H.A. and REMINGTON J.S.: Western Blot analysis of the antigens of Toxoplasma gondii recognized by human IgM and IgG antibodies. J. Immunol. 1983; 131: 977-983. 22. SULHANIAN A., NUGUES C., GARIN J.F., PELLOUX H., LONGUET P., SLIZEWICZ B. and DEROUIN F.: Serodiagnosis of toxoplasmosis in patients with acquired or reactivating toxoplasmosis and analysis of the specific IgA antibody response by ELISA, agglutination and immunoblotting. Immunol. Infect. Dis. 1993; 3, 63-69. 23. SULZER A.J. and HALL EC. : Indirect fluorescent antibody tests for parasitic diseases: IV Statistical study of variation in the indirect fluorescent antibody (IFA) test for toxoplasmosis. Amer. J. Epidemiol. 1967; 86: 401-407 24. WILSON M., REMINGTON J.S., CLAVET C., VARNEY G., PRESS C., WARE D. and the FDA TOXOPLASMOSIS AD HOC WORKING group : Evaluation of six commercial kits for detection of human immunoglobulin M. antibodies to Toxoplasma gondii. J. Clin. Microbiol. 1997; 35, 3112-3115. 25. WONG S.Y. and REMINGTON J.S.: Biology of Toxoplasma gondii. AIDS 1993; 7, 299-316.
OVERSIKT OVER ANALYSEPROSEDYREN 1. Innstill inkubatoren til 37 ± 1 C. 2. Fortynn kromogenet R9 i forholdet 1:11 i substratbufferen R8 (fargefremkallingsoppløsning). 3. Fortynn vaskeoppløsningen R2 som er konsentrert 10x, i forholdet 1:10 i destillert vann. 4. Vask alle brønnene en enkelt gang med fortynnet vaskeoppløsning (R2d). 5. Fortynn kalibratorene og prøvene i forholdet 1:101 i R7. 6. Fordel 200 µl fortynnede kalibratorer og prøver i brønnene ifølge planen nedenfor. 7. Inkuber i 1 time ved 37 C. 8. Forbered konjugat bruksoppløsningen (R6 + R7). 9. Sug innholdet opp og vask deretter 3 ganger med fortynnet vaskeoppløsning (R2d). 10. Fordel 200 µl konjugat bruksoppløsning i alle brønnene. 11. Inkuber i 1 time ved 37 C. 12. Sug innholdet opp og vask deretter 4 ganger med fortynnet vaskeoppløsning (R2d). 13. Fordel 200 µl enzymutviklingsoppløsning (R8 + R9) i alle brønnene. 14. Inkuber i 30 minutter ved romtemperatur (18 30 C) på et mørkt sted. 15. Fordel 100 µl stoppoppløsning (R10) i alle brønnene. 16. Les av absorberingene med et spektrofotometer ved 450/620 nm.
0459 Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 05/2006 Fax.: +33 (0) 1 47 41 91 33 code: 881002