Embetseksamen i Medisin, Odontologi og Ernæring Andre semester (cellebiologi) kull V04 Torsdag 12/1-2006, Kl. 09.00 15.00

Embetseksamen i Medisin, Odontologi og Ernæring Andre semester (cellebiologi) kull V04 Torsdag 12/1-2006, Kl. 09.00 15.00 Grunnet stadig økende andel eldre er det sterk vekst i antall demente i befolkningen. Foruten tallrike personlige tragedier betyr dette økende belastning på helsetjenesten og helsebudsjetter. Det forskes derfor intenst på årsaker til demens. En form for presenil demens kalt frontotemporal demens (FTD) viser kobling til gener på kromosom 3, 9 og 17. Koblingen til kromosom 3 ble først vist i en dansk slekt. Sykdommen, kalt FTD3, ble påvist hos mange familiemedlemmer i tre generasjoner. Slektstreet er vist i figuren, der mørk farge betyr sykdom og skråstrek at personen er død. Lokaliseringen av FTD3 til kromosom 3 ble gjort ved hjelp av mikrosatellittmarkører. 1. Hvilken arvegang har FTD3 i denne familien? Begrunn svaret. 2. Hva er en genetisk markør? 3. Hva er en mikrosatellittmarkør? 4. Markørene definerer haplotyper. Hva er en haplotype? Sekvensering av genene i dette området viste en G C mutasjon i genet som koder for et protein kalt CHMP2B. Alle de syke, men ingen av de friske familiemedlemmene hadde denne mutasjonen. Denne mutasjonen ble derfor antatt å forårsake sykdommen. I andre familier er det påvist en G T missense-mutasjon (D148Y) i det samme genet. 5. G C mutasjonen er lokalisert mot slutten av intron 5. Forklar hvordan en mutasjon i denne posisjonen kan påvirke mrna-sekvensen og dermed aminosyresekvensen i et protein. 6. Hva menes med uttrykket missense-mutasjon? Hva betyr uttrykket D148Y? (Det er ikke nødvendig å vite nøyaktig hva D og Y står for.) 7. Beskriv kort teknikken for DNA-sekvensering.

2 Ved northernblott-analyse ble det for CHMP2B funnet bånd av ulike lengder, forklart med ulike lengder av 5 -UTR og 3 -UTR. 8. Forklar prinsippet for northernblott-analyse. 9. Hva menes med 5 - og 3 -UTR? 10. Beskriv kort spleiseprosessen. CHMP2B-proteinets primærstruktur tyder på at det danner alfahelikser, som så danner coiled coils. 11. Hva menes med uttrykkene primær-, sekundær-, suprasekundær-, tertiær- og kvaternærstruktur? 12. Beskriv strukturen av en alfaheliks og bindingene som stabiliserer den. 13. Hva er grunnlaget for at noen alfahelikser danner coiled coils i vandige løsninger? CHMP2B-proteinet inngår i et større kompleks, kalt ESCRTIII (av endosomal sorting complex required for transport). Det er tre slike komplekser (ESCRT1- III), som alle består av flere ulike proteiner. 14. Hvordan kan dette forklare at gener som gir FTD er lokalisert til tre ulike kromosomer? ESCRT-kompleksene har betydning for transport av endosomet til riktig målmembran. 15. Beskriv kort prinsippene bak dannelse av endosomer og hvordan de finner riktig målmembran. FTD lokalisert til kromosom 17 er vist å skyldes mutasjoner i genet som koder for det mikrotubuliassosierte proteinet tau. 16. Beskriv kort oppbygging av mikrotubuli (det er ikke nødvendig å beskrive aksonemet i flimmerhår). Angi med stikkord hovedfunksjoner for ulike mikrotubuliassosierte proteiner. Ved FTD3 finner man ikke mikroskopisk synlige proteinavleiringer i hjernen. Slike avleiringer er et fremtredende tegn ved mange andre nevrodegenerative sykdommer, som Alzheimers, Parkinsons og Creutzfeldt-Jakobs sykdommer. 17. Beskriv kort de to hovedmekanismene for nedbrytning av proteiner inne i cellen. Mekanismene for celledød i CNS ved nevrodegenerative sykdommer er uklare, men man antar at apoptose spiller en fremtredende rolle.

3 18. Forklar hva caspaser er og beskriv to ulike måter disse kan aktiveres ved apoptose. 19. Forklar (kort) hvordan cytokrom c kan regulere cellens liv og død. Nerveceller dør gjennom hele livet, og ved demens er nervecelletapet større enn normalt. Ulike nervecellestimulerende vekstfaktorer motvirker nervecelledød. På forsøksdyr er det vist at lokal tilførsel av gliacellelinjederivert nevrotrop faktor (GDNF) kan stanse og reversere eksperimentelt utløst nervecelletap. 20. GDNF virker ved binding til en tyrosinkinase-reseptor. Beskriv hvordan en tyrosinkinase-reseptor kan aktivere forskjellige intracellulære signalveier som resulterer i endring av gentranskripsjon. I bestemte hjerneområder nydannes nerveceller (nevrogenese) fra lokale stamceller, og det antas at dette kan virke som en motvekt til nervecelletapet. I motsetning til de fleste andre nerveceller, som permanent har gått ut av cellesyklus, gjennomgår nervestamcellene stadig delinger. 21. Beskriv gjerne med en enkel figur - en aktiv syklinavhengig kinase (CDK). 22. Forklar hvordan degradering av nøkkelproteiner i cellesyklusmaskineriet kan regulere restriksjonspunktet (R-punktet) i G1. Ved enkelte nevrodegenerative lidelser er det forsøkt å transplantere nevronale stamceller til de skadete områdene i hjernen. 23. Hva kjennetegner en stamcelle? 24. Fra hvilket stadium i embryogenesen isoleres humane embryonale stamceller og fra hvilken del av embryoet? 25. Hvordan får man embryonale stamceller til å gjennomgå retningsbestemt differensiering i kultur? En del demenssykdommer har spesifikke virkninger på hukommelsen via degenerative effekter på de relativt få nervecellene i sentralnervesystemet som bruker acetylkolin som nevrotransmitter. Acetylkolin er ellers mest kjent som transmitter i den nevromuskulære synapsen i det perifere nervesystemet. 26. Beskriv den strukturelle organiseringen av en nevromuskulær synapse, gjerne ved hjelp av en figur. 27. Beskriv signaloverføring gjennom en slik synapse, med vekt på endringene av de ulike membranpotensialene som forekommer.

4 28. Beskriv kort hvilke strukturer i tverrstripede muskelceller som er viktige for at et signal mottatt i synapsen leder til kontraksjon av cellen (det er ikke nødvendig å beskrive selve kontraksjonen, dvs. strukturen av aktin- og myosin-filamentene eller myosinhodets bevegelser). Medikamentell behandling av sentralnervesystemet krever at medikamentene passerer gjennom en fysiologisk/anatomisk barriere, kalt blod-hjernebarrieren, som delvis er basert på tette blodårer og delvis er en tett gliacellebarriere. På grunn av barrieren blir de fleste vannløselige og/eller ladete forbindelser forhindret fra å komme inn i intercellulærvæsken i hjernen. 29. En av de spesialiserte celle-celle kontaktene kalles zonula occludens (tight junctions). Beskriv kort struktur og hovedfunksjoner. 30. Beskriv også kort funksjon og oppbygning av følgende to cellekontakter: a) zonula adherens b) desmosom (macula adherens) Med positron emisjonstomografi (PET) er det mulig å følge omsetningen av glukose i en fungerende hjerne. Slike målinger har vist at glukosekatabolismen er betydelig nedsatt i hjernen hos personer med demens i forhold til hva den er hos personer uten demens. For de følgende tre oppgavene (31-33) skal du angi om hvert av delutsagnene er korrekte eller ikke, samtidig som du kort begrunner svaret (i hver oppgave kan flere enn et delutsagn være korrekte). 31. Hjernens nedsatte evne til å katabolisere glukose a) kan skyldes at glukokinasen ikke er aktiv i hjernen hos individer med demens. b) har begrenset effekt på hjernecellenes ATP-forsyning fordi det bare er ATP dannet ved fosforylering på substratnivå som er affisert. c) har stor betydning for hjernecellenes ATP-forsyning fordi oksidativ fosforylering også blir hemmet. d) har begrenset effekt på hjernecellenes energiforsyning fordi ß-oksidasjonen overtar som energigenerator. Undersøkelser har vist at mange mennesker med demens har en høyere andel av palmitinsyre og stearinsyre i sine kroppslipider, og samtidig tilsvarende mindre andeler av linolsyre og linolensyre. 32a) Palmitin- og stearinsyre er monoumettede fettsyrer, og som begge kan syntetiseres i leveren.

5 b) Linolsyre og linolensyre er polyumettede fettsyrer, med kjedelengde på 20 karbonatomer, og kan begge syntetiseres i leveren. c) Ved å bytte ut en linolensyre i et triacylglyserolmolekyl med en stearinsyre vil triacylglyserolmolekyl få lavere smeltepunkt. d) Når en polyumettet fettsyre blir ß-oksidert, gir dette færre ATP-molekyler enn ved ß- oksidasjon av en mettet fettsyre med samme kjedelengde. Økt nivå av NH 3 i blodet er toksisk for sentralnervesystemet; overskudd av nitrogen blir følgelig ikke transportert i blodet som NH 3 (eller NH 4 + ). 33a) Glutamin-syntetase og glutaminase anvendes når overskudd av nitrogen skal transporteres fra perifere vev som for eksempel hjernen til leveren. b) Aminotransferaser og glutamat-dehydrogenase har en sentral funksjon hva angår detoksifisering av overskudd av nitrogen. c) Under sult vil hjernens glukoneogenese dekke hjernens glukosebehov. d) Glukoneogenese og ketogenese er metabolsk forskjellige prosesser, men er funksjonelt sett sammenkoblede.

6 Sensorveiledning til Embetseksamen i Medisin, Odontologi og Ernæring Torsdag 12/1-2006, Kl. 09.00 15.00 1. Hvilken arvegang har FTD3 i denne familien? Begrunn svaret. Arvegangen er autosomal dominant. Autosomal fordi genet sitter på kromosom 3. Kriterier for autosomal dominant arv er: Sykdommen finnes i hver generasjon stemmer her En affisert har 50% risiko for å få affisert avkom her: 10 affiserte:16 friske (ikke signifikant forskjellig fra 13:13) Ingen kjønnsforskjell i forekomst av tilstanden - her 6 kvinner og 5 menn 2. Hva er en genetisk markør? Et locus som har alleler som klart kan identifiseres. Det kan være et gen, et restriksjonsenzymsete eller karakteristika ved DNA som tillater ulike versjoner av et locus (eller dets produkt) å bli skilt fra hverandre og som kan følges i familier. 3. Hva er en mikrosatellittmarkør? Et polymorft locus som består av et varierende antall tandemrepeterte bi-, tri- eller tetranukleotideenheter. De forskjellige allelene har ulikt antall repitisjoner av nukleotideenheten. 4. Markørene definerer haplotyper. Hva er en haplotype? En gruppe tett koblede alleler som sitter på samme kromosomstreng og som vanligvis nedarves som en enhet. 5. G C mutasjonen er lokalisert mot slutten av intron 5. Forklar hvordan en mutasjon i en slik posisjon kan påvirke mrna-sekvensen og dermed aminosyresekvensen i et protein. En mutasjon mot slutten av et intron vil kunne ødelegge 3 -spleisesetet og gjøre at spleisingen ikke blir utført på korrekt sted. Ofte vil i stedet 3 -spleisesetet til neste intron brukes. Dermed mistes et ekson i det bearbeidete transkriptet (exon skipping). Alternativt brukes seter som tilfeldigvis har sekvenslikhet med det muterte 3 -spleisetet (såkalte kryptiske spleiseseter). Disse er oftest lokalisert i introner. Spleising til slike seter innebærer at man får med intronsekvenser i det ferdige mrna. Fordi disse delene av transkriptet ofte inneholder stopp-kodoner, fører dette vanligvis til produksjon av et for kort protein, hvor den C-terminale enden mangler. 6. Hva menes med uttrykket missense-mutasjon? Og hva angir i den forbindelse informasjonen D148Y? (Det er ikke nødvendig å vite nøyaktig hva D og Y står for.) Missense-mutasjon er en mutasjon som endrer kodonet slik at det koder for en ny aminosyre. Når vi beskriver slike mutasjoner, gjør vi det enten på nukleotidnivå eller (som her) på aminosyrenivå. Ved angivelse på aminosyrenivå står tallet for nummeret på

7 aminosyren i det translaterte produktet før eventuelle post-translasjonelle modifikasjoner. Bokstavene på hver side angir endringen i baser eller, som her, aminosyrer. I det aktuelle tilfellet angir således D148Y at aminosyre 148 er endret fra aspartat (D) til tyrosin (Y). Det forventes ikke at kandidaten kjenner de enkelte énbokstavsymbolene for aminosyrene, men det forventes at han/hun forstår at angivelsen her er på aminosyrenivå. 7. Beskriv kort teknikken for DNA-sekvensering. Det forventes at kandidatene beskriver hovedtrinnene i Sangers dideoksymetode. Metoden benytter: DNA-templat Primer Deoksyribonukleosid-trifosfater Dideoksyribonukleosid-trifosfater (ddntp); mangler hydroksyl-gruppe på 3 -Catomet. DNA-polymerase Buffer Reaksjonen settes opp i 4 rør med henholdsvis ddgtp, ddatp, ddttp, ddctp. Forlengelsen av den nysyntetiserte DNA-tråden stopper når en ddntp inkorporeres. Produktene fra de 4 reaksjonene separeres ved elektroforese. Fragmentene kan påvises ved hjelp av radioaktiv eller fluorescens-merking av en av deoksyribonukleosidtrifosfatene. I hver enkelt rad ( lane ) har vi bånd som slutter på en bestemt nukleotid. Ved å lese båndene fra bunnen av gelen og oppover vil man kunne bestemme DNAsekvensen i den nylagde DNA-tråden. DNA-sekvensering gjøres i dag automatisk i DNAsekvenseringsmaskiner. Hovedprinsippet er fortsatt bruk av dideoksymetoden. 8. Forklar prinsippet for northernblott-analyse. Northernblott-analyse benyttes til å studere tilstedeværelse av forskjellige RNA-molekyler i forskjellige celler og vev. Besvarelsen bør inneholde følgende punkter: RNA eller poly(a)-rna (mrna) isoleres fra vev eller celler RNA-molekylene separeres ved gelelektroforese på basis av størrelse under denaturerende betingelser RNA blir overført (transfer) fra gelen til en membran (for eksempel nylon eller nitrocellulose) Probe (RNA eller enkelttrådig DNA) lages og merkes. Proben er spesifikk for det RNA som skal undersøkes Hybridisering; proben baseparrer med spesifikt RNA på membranen Membranen blir vasket Analyse av resultater 9. Hva menes med 5 - og 3 -UTR? 5' UTR eller 5 ikke-translaterende del av mrna er den delen av mrna som strekker seg fra 5 -enden på mrna til kodon for start av translasjon (AUG). 3' UTR eller 3 ikke-translaterende del av mrna er den delen av mrna som strekker seg fra 3 -enden på mrna til det siste kodonet som benyttes i translasjonen.

8 10. Beskriv kort spleiseprosessen. Med spleising menes fjerning av intronsekvenser i eukaryote RNA-transkripter. Prosessen foregår i cellekjernen og utføres av spleisosomer, som består av protein- og RNA-komplekser. RNA-molekylene er relativt korte og betegnes U1, U2, osv. Noen av dem hjelper til med gjenkjenning av ekson/intron-overgangene. For hvert enkelt intron som fjernes gjenkjenner deler av spleisosomet først 5 -spleisesetet og en adenin i forgreningspunktet (branch point) et stykke fra 3 -spleisesetet i intronet. Prosessen begynner vanligvis med intron 1, der første trinn er kutting av esterbindingen i 5 - spleisesetet. Den frigjorte fosfatgruppen i 5 -enden av intronet danner i stedet esterbinding til adenosingruppen i forgreningspunktet (transesterifisering). Foruten C5 og C3 - fosfodiesterbindingene får adenosingruppen her en tredje fosfodiesterbinding (til C2 ) slik at det dannes en lasso (derav navnet forgreningspunkt). Dermed unngås at den reaktive fosfatgruppen fra 5 -spleisetet angriper andre steder i RNA. Reaksjonen gjør også at den frie 3 -enden av ekson 1 bringes i nær kontakt med intronets 3 - spleisete. Nå skjer en ny transesertifisering ved at 3 -spleisesetet blir kuttet og ekson 1 og 2 blir bundet direkte sammen. Tilsvarende fjernes påfølgende introner. 11. Hva menes med uttrykkene primær-, sekundær-, suprasekundær-, tertiær- og kvaternærstruktur? Primærstruktur - polypeptidets/proteinets aminosyresekvens. Sekundærstruktur - forekomsten av visse typer oppkveiling/folding av polypeptidkjeden, der de to viktigste er α-heliks og β-plate. Suprasekundærstruktur. Motiver og doméner er såkalte suprasekundærstrukturer, dvs nivåer av folding mellom sekundær- og tertiærstruktur. Med motiver menes bestemte mønstre av sekundærstrukturer, f. eks. αβα, β-sving-β. Med doméner menes deler av en polypeptidkjede som foldes relativt uavhengig av andre deler. Tertiærstruktur - foldingen av en polypeptidkjede. Kvaternærstruktur - den samlede romlige struktur av et protein som består av flere polypeptidkjeder (subenheter). 12. Beskriv strukturen av en alfaheliks og bindingene som stabiliserer den. Heliksstrukteren oppstår ved at peptidet danner en korketrekkerspiral med 3,6 aminosyrer per vinding. Disse er stabilisert via H-bindinger mellom peptidbindingens karbonyloksygen og amidhydrogen i aminosyrer som ligger overfor hverandre i påfølgende vindinger av spiralen. Selv om hver binding er svak vil de kollektivt gi god stabilisering av heliksen. 13. Hva er grunnlaget for at noen alfahelikser danner coiled coils i vandige løsninger? Coiled coils betyr her at to alfahelikser tvinner seg om hverandre. Alfahelikser som spontant gjør dette, har hydrofobe sidegrupper plassert i stripe etter hverandre langsmed spiralen (i posisjonene 0, 3 og/eller 4, osv. etter formelen 3,6 x N, der n er fortløpende hele tall). Ved å tvinne seg rundt hverandre med de hydrofobe sidegruppene inn i den doble spiralen unngås eksponering mellom vann og de hydrofobe gruppene. To typiske eksempler er intermediære filamenter (som keratinene) og halene i myosin-ii.

9 14. Hvordan kan dette forklare at gener som gir FTD er lokalisert til tre ulike kromosomer? I og med at ESCRT-maskineriet består av flere ulike proteiner, kan et av disse proteinene være kodet for av et gen på kromosom 3, et annet av et gen på kromosom 9 og et tredje av et gen på kromosom 17. 15. Beskriv kort prinsippene bak dannelse av endosomer og hvordan de finner riktig målmembran. NB! Under eksamen ble det klart at det var forvirring mht definisjon av endosomer, og det ble derfor gitt muntlig beskjed om å begrense oppgaven til første steg med opptak av materiale i endocytiske blærer. Blærene som snøres av fra yttermembranen er kledt på cytosolsiden av klatrin. Klatrinmolekylene samles i kurvliknende strukturer som får membranen til å danne en kappekledt grop (coated pit). (Samlingen av klatrinkappen er bl.a. regulert av små monomere GTPaser.) Adaptiner som inngår i kappen binder seg til klatrin og til cytosolhalen av transmembran- (TM-) proteiner, inklusive TM-reseptorer. TMreseptorene kan binde løselige ligander på utsiden av cellen. Det er flere ulike typer adaptiner, med evne til å binde ulike TM-reseptorer. Når klatrinkledte groper blir tilstrekkelige dype, samles en ring av proteiner, deriblant GTPasen dynamin, rundt halsen og hjelper til med å snøre av gropen slik at det dannes en blære. Kort etter avsnøring skrelles klatrinkappen av blæren. De avsnørte blærene tømmer innholdet i større blærer kalt tidlige endosomer. Overgangen fra tidlige til sene endosomer er uavklart, og skjer enten via transport av blærer eller som modning fra tidlige til sene endosomer. Disse inneholder sure hydrolaser sendt via blærer fra golgikomplekset. Blærene fraktes gjennom cytosol bundet til celleskjelettet. Før sammensmelting med målmembranen må det sikres at dette er korrekt mål. Gjenkjenningen mellom blære- og målcellemembran kontrolleres av TM-proteiner kalt SNAREr og målstyrings-gtpaser, kalt Rab-proteiner. Det er mange ulike typer SNAREr, assosiert med forskjellige membraner. De utgjør komplementære sett på blæremembranen (v-snarer for vesikkel) og målmembranen (t-snarer for target). Ved møte med korrekt målmembran danner komplementære v- og t-snarer et trans-snare-kompleks som låser membranene sammen. Første steg av feste mellom blære og målmembran kalles dokking. For tømming av blæreinnholdet må blære- og målmembran smelte sammen. Denne fusjonen krever eksklusjon av alt vann mellom de to membranene. Sammen med andre typer proteiner utgjør SNAREne en del av fusjonsmaskineriet. SNAREr er bl. a. mål for de potente nevrotoksinene botulin- og tetanustoksin, som forårsaker botulisme og stivkrampe. 16. Beskriv kort oppbygging av mikrotubuli (det er ikke nødvendig å beskrive aksonemet i flimmerhår). Angi med stikkord hovedfunksjoner for ulike mikrotubuliassosierte proteiner. Mikrotubuli (MT) er bygget opp av proteinet tubulin. Tubulinsubenheten er en heterodimer som består av to nært relaterte globulære proteiner kalt α-tubulin og β- tubulin. Hver av disse har en grop med bindingssete for GTP. GTP assosiert med β-

10 tubulin er hydrolyserbart. αβ-tubulindimerer leires etter hverandre i protofilamenter. (Tretten) protofilamenter leires så side om side slik at det dannes rørformede strukturer - mikrotubuli. I et MT vender alle αβ-tubulindimerene samme vei, hvilket medfører at røret har retning eller polaritet, med α-tubulin eksponert i den ene enden og β-tubulin i den andre. De to endene kalles hhv minus - og plussenden (har ingen ting med positiv eller negativ ladning å gjøre). Polymerisering/depolymerisering av MT skjer ved av- og påhekting av αβ-tubulindimerer til både pluss- og minusenden, men med raskest omsetning ved plussenden. Minusenden av MT er vanligvis bundet til spesialiserte strukturer kalt sentrosomet (ligger nær kjernen) og basallegemene (ved basis av flimmerhår/flageller). De frie αβ-tubulinenhetene har vanligvis bundet GTP til β-tubulindelen (dersom det er hydrolysert til GDP, skiftes det hurtig ut med GTP fra cytosol, hvor det normalt er stort GTPoverskudd). Etter inkorporering av αβ-tubulin i MT hydrolyseres GTP langsomt til GTP, hvilket svekker bindingen mellom dimerene i protofilamentene. Så lenge GDP-αβ-tubulindimerene ikke ligger i endene av MT, betyr svekkelsen lite for stabiliteten av MT. Men dersom påleiring av nye αβ-tubulinsubenheter skjer så langsomt at hydrolysen når helt til enden av MT, skjer rask nedbrytning av MT fra endene. Denne dynamiske ustabiliteten er en essensiell del av MTs funksjon, og bevirker at MT kontinuerlig brytes og bygges opp igjen, med mindre de stabiliseres av assosierte proteiner eller av farmaka. Stoffer som colchicin og relaterte molekyler stabiliserer αβ-tubulindimerene, mens f eks legemiddelet taxol stabiliserer MT i polymerisert form. I begge tilfelle er resultatet bl.a. hemning av celledeling.) Vekslingen mellom nedbrytning og oppbygging reguleres av mikrotubuliassosierte proteiner (MAPer), som bl.a. kan stabilisere endene av MT og dermed hindre nedbrytning. Andre MAPer stabiliserer αβ-tubulindimeren, hvilket gjør at vi kan ha store lagre av slike dimerer som ved behov raskt kan mobiliseres til polymerisering. Atter andre MAPer formidler binding mellom MT og andre proteiner, deriblant til andre deler av celleskjelettet. En viktig gruppe MAPer utgjøres av dyneiner og kinesiner. Dette er store proteinkomplekser som kan bevege seg langsetter MT, hhv i minusretning og plussretning (for de fleste typer kinesiner). Via haler binder motorproteinene ulike typer last, som så hurtig fraktes langsetter MT. Slik transport skjer i alle celler, men er ikke minst viktig de lange nerveutløperne (rask aksonal transport). 17. Beskriv kort de to hovedmekanismene for nedbrytning av proteiner inne i cellen. De to hovedmekanismene er 1) nedbryting vha proteasomer i cytosol og 2) degradering inne i lysosomer Proteasomene danner sylinderformede strukturer der proteasene vender inn mot lumen av sylinderen. Bare proteiner som entrer dette hulrommet blir brutt ned. Proteiner blinket ut for degradering merkes med det lille proteinet ubikvitin, som bindes til proteasomet og formidler transport inn i dets hulrom. Lysosomene er membranavgrensede blærer fylt med hydrolytiske enzymer med lavt ph-optimum (sure hydrolaser). De smelter sammen med og tømmer dermed de hydrolytiske enzymene inn i fagosomer/endosomer, slik at innholdet i disse brytes ned. Dette sikrer at bare makromolekyler som er fanget inn i fagosomer/endosomer blir brutt ned. 18. Forklar hva caspaser er, og beskriv to ulike måter disse kan aktiveres på ved apoptose. Del 1: Caspaser er proteaser som er effektorenzymer i apoptose (minimumssvar). De har fått dette navnet fordi de er cystein proteaser som kutter substratene ved Asp. Caspaser

11 syntetiseres som inaktive proenzymer, og aktivering av caspasene skjer i en proteasekaskade. Del 2: Caspase-kaskadene kan aktiveres på to måter: 1. Via dødsreseptorer (eks. Fas eller TNF). Dette er reseptorer som har dødsdoméner (DD) intracellulært. Ved binding av ligand blir det konformasjonsendringer i DD som fører til interaksjon mellom DD i dødsreseptorene og DD i andre intracellulære proteiner (f.eks. FADD). Dette fører til konformasjonsendringer i disse proteinene, som i sin tur aktiverer den første caspasen (caspase 8) i kaskaden. Det kreves ikke detaljert kunnskap om navn på proteinene som inngår i aktiveringen av caspaser/dødsreseptorer. 2. Via mitokondriene. Apoptose-signaler (eks. høy Ca++ eller ROS) vil via endringer i mitokondriemembranpotensialet, føre til at Bax danner porer i ytre mitokondriemembran. Cytokrom c vil da lekke fra mitokondriene og ut i cytoplasma. I cytoplasma vil cytokrom c i nærvær av ATP (og Apaf) aktivere caspase-kaskaden. (Bcl-2 som også ligger i ytre mitokondriemembran vil hemme Bax-indusert poredannelse). 19. Forklar (kort) hvordan cytokrom c kan regulere cellens liv og død. Cytokrom c er en del av elektrotransportkjeden som kreves for dannelse av ATP. En levende celle er avhengig av ATP, og cellen kan derfor ikke leve uten cytokrom c i mitokondrienes elektrontransportkjede. Apoptose er en fysiologisk og aktiv form for celledød som krever ATP. Ved apoptose bidrar bax til at cytokrom c lekker ut av mitokondriene og aktiverer caspasene i nærvær av ATP. Det kreves svært lite cytokrom c i cytosol for å aktivere caspasene, og det vil dermed fremdeles være nok cytokrom c til å generere ATP som kreves i prosessen. Ved stor grad av mitokondrieskade vil svært mye cytokrom c kunne lekke ut av mitokondriene. Da vil det ikke lenger kunne dannes ATP, og cellen dør ved nekrose. 20. GDNF virker ved binding til en tyrosinkinase-reseptor. Beskriv hvordan en tyrosinkinase-reseptor kan aktivere forskjellige signalveier som resulterer i modulering (dvs. endring) av gentranskripsjon. Tyrosinkinasen dimeriserer og autofosforyleres på tyrosingruppene i cytosoldelen av proteinet. De fosoforylerte tyrosinene kan rekruttere og aktivere flere signalsystemer, som ras-proteiner, løselige tyrosinkinaser (PTK) og Januskinaser (JAK). Ras-proteinene aktiveres ved hjelp av forskjellige adaptor- og exchange -proteiner som bl.a. assisterer dem i å binde og spalte GTP. Det aktive ras-proteinet vil i sin tur aktivere en kaskade av tyrosinkinaser. Kinasene i kaskaden går under ulike navn navn, som f. eks. MAP-kinase kinase kinase, som fosforylerer MAP-kinase kinase, som så fosforylerer MAP-kinase). Til slutt fosforyleres transkripsjonsfaktorer som i kjernen bindes til DNA og derved kan modulere transkripsjon av gener. De løselige tyrosinkinasene vil kunne spalte PIP 2 til DAG og IP 3 (to sekundære budbringere) som igjen kan aktivere to proteinkinaser (henholdsvis PKC og Ca-stimulert Cam-kinase) som til sist vil kunne fosforylere transkripsjonsfaktorer med det resultat at gentranskripsjon moduleres. JAK vil kunne fosforylere STAT (også regnet som transkripsjonsfaktorer) som transporteres til kjerne og har samme virkning på DNE som de to tidligere nevnte systemene.

12 Det forventes at kandidatene kan (med følgende prioritering) nevne ras-mediert, JAK/STAT- og PTK-mediert signalering (sistnevnte fremhevet som en del av forskjellige reseptorers cross-talk ), men ikke nødvendigvis at detaljene for hvert signalsystem kommer tydelig frem i besvarelsen. Ras-systemet er vektlagt hva angår proliferasjon og kreft. JAK/STAT-systemet er blitt relatert til insulin, leptin (appetittregulering) og cytokiner (infammasjon). Samtlige tre systemer har jeg vist er knyttet til effekten av veksthormon. 21. Beskriv gjerne med enkel figur - en aktiv cyklin-avhengig kinase (CDK). En aktiv CDK vil være i kompleks med et spesifikt cyklin og vil ikke være bundet til en CKI (inhibitor av CDK). I tillegg må en aktiv CDK være fosforylert på en spesfikk aminosyre (treonin), og være ufosforylert på to andre aminosyrer (tyrosin og treonin). 22. Forklar hvordan degradering av nøkkelproteiner i cellesyklusmaskineriet kan regulere restriksjonspunktet (R-punktet) i G1. Restriksjonspunktet i G1 er det punktet i G1 der cellen bestemmer om den skal gå inn i S- fase eller ikke. Molekylært passerer cellene R-punktet i G1 ved at prb fosforyleres. Fosforylert prb vil ikke lenger binde transkripsjonsfaktoren E2F, og E2F vil da være fri til å transkribere gener (f.eks. DNA polymerase, tymidin kinase, cyklin E og cyklin A) som er nødvendig for S-fase. prb fosforyleres av aktive CDKer. CDKer aktiveres ved binding av spesifikke cykliner i fravær av spesifikke CKIer. Aktivering av CDKene bestemmes dermed delvis av nivået av cykliner og av CKIer. Dersom cyklinet (cyklin D) som skal aktivere CDKene i G1 blir degradert, vil ikke CDK bli aktiv, og prb blir ikke fosforylert. Da vil ikke E2F bli fri til transkribere S-fase gener, og cellen forblir i G1 (passerer ikke R-punktet i G1). Dersom en spesifikk CKI (f.eks. p16 eller p21) blir degradert i G1, vil den tilsvarende CDK bli aktiv, og prb vil dermed kunne bli fosforylert. Dermed vil E2F bli fri til å transkribere S-fase gener, og cellen har passert R-punktet i G1. Nivået av cykliner og CKIer blir indirekte regulert via signalkaskader initiert av vekst-stimulerende og veksthemmende faktorer. 23. Hva kjennetegner en stamcelle?) Standard kriterier for å kalle en celle for en stamcelle er at den: 1) ikke selv er terminalt differensiert 2) kan dele seg så lenge organismen lever 3) når den deler seg, så kan en dattercelle fortsette som stamcelle eller slå inn på en differensieringsbane 24. Fra hvilket stadium i embryogenesen isoleres humane embryonale stamceller og fra hvilken del av embryoet? Humane embryonale stamceller isoleres fra blastocyststadiet (døgn 5-6). De isoleres fra den delen av blastocysten som kalles indre cellemasse (ICM). 25. Hvordan får man embryonale stamceller til å gjennomgå retningsbestemt differensiering i kultur?

13 ES-cellene dyrkes i kultur i definerte dyrkingsmedier der man kjenner alle komponentene i mediet. Den retningsbestemte differensieringen avgjøres av hvilke vekstfaktorer (og eventuelt andre ligander) som tilsettes mediet. Ofte dreier det seg om bare tre-fire ulike stoffer som tilsettes for å oppnå et bestemt resultat. 26. Beskriv den strukturelle organisasjonen av en nevromuskulær kolinerg synapse, gjerne ved hjelp av en figur. Minimumskrav er at kandidatene kjenner grunntrekkene i de tre delene av synapsen. De bør beskrive at den presynaptiske nervefiberen som kommer fra sentralnervesystemet legger seg inntil den postsynaptiske muskelcellens plasmamembran i et spesialisert område (benevnt den motoriske endeplaten). Strukturelt består den presynaptiske delen av utvidete nerveterminalutløpere som er fylt med cytoplasma, store opphopninger av sekretoriske blærer (vesikler), samt noen få mitokondrier. Vesiklene er samlet i områder der frisetning av transmitter foregår, rett overfor innfoldinger i den postsynaptiske muskelcellens membran der reseptoren som binder transmittermolekylene er anriket. Den synaptiske spalten skiller de to membranene fra hverandre og hindrer direkte elektrisk kontakt. 27. Beskriv signaloverføring gjennom en slik nevromuskulær kolinerg synapse, med vekt på endringene av membranpotensialer som forekommer. Minimumskrav er at kandidatene vet at overføringen begynner med at når et aksjonspotensial invaderer nerveterminalen fører dette til en depolarisering av den presynaptiske membranen. De spenningsavhengige kalsiumkanalene i denne membranen vil derfor åpnes, og kalsium strømmer etter sin elektrokjemiske gradient inn i terminalen. Inne i terminalen har transmitteren acetylkolin blitt syntetisert og lagret i sekretoriske blærer, og den undergruppen av slike blærer som er bundet til plasmamembranen vil respondere på det økte nivået av kalsiumioner med å fusjonere via SNARE-proteiner med membranen. Acetylkolin blir således frigjort ved eksocytose ut i den synaptiske spalten. De postsynaptiske transmitterreseptorene er acetylkolin-følsomme ionekanaler, som først og fremst slipper Na + -ioner gjennom når transmitteren bindes. Natriumionene vil i henhold til den elektrokjemiske gradienten for Na + strømme inn i muskelcellene, og den resulterende opphopning av positive ladninger på innsiden av membranen vil gi en depolarisering av muskelmembranpotensialet (denne endring er benevnt endeplatepotensialet). Dersom endeplatepotensialet når opp til terskelverdien for de spenningsregulerte Na + -kanalene som ligger i området rundt endeplaten, vil et aksjonspotensial spre seg utover muskelens overflate og inn i T-rørene, der signaloverføringen til muskelens kontraktile apparat finner sted. Den synaptiske overføring avsluttes med at transmitteren blir nedbrutt av acetylkolinesterase ute i den synaptiske spalten, og det resulterende kolinet blir spesifikt tatt tilbake inn i den presynaptiske terminalen for fornyet anvendelse. 28. Beskriv kort hvilke strukturer i tverrstripede muskelceller som er viktige for at et signal mottatt i synapsen leder til kontraksjon av cellen (det er ikke nødvendig å beskrive selve kontraksjonen, dvs. strukturen av aktin- og myosin-filamentene eller myosinhodets bevegelser).

14 Leddene på veien fra depolarisering i endeplaten til kontraksjon av muskelcellen er som følger: 1) depolarisering av endeplatepotensial 2) genererer aksjonspotensial 3) som sprer seg sidelengs i muskelcellembranen og inn i T-rørene 4) her påvirker potensialet spenningsensitive proteiner (innleiret i T-rørenes membran), som er direkte knyttet til Ca ++ -frigjøringskanaler innleiret i SER-membranen 5) hvilket medfører frigjøring av Ca ++ fra SER-lumen til cytosol 6) Ca ++ bindes av troponinkomplekset (troponin-c som er nær beslektet med det calmodulin) 7) hvilket medfører konformasjonsendring av troponinkomplekset som dermed trekker tropomyosin til side slik at myosinhodet får adgang til aktin, hvilket utløser vandring av myosin langs aktin og kontraksjon. Strukturene som skal beskrives er følgelig 1) T-rørene - transverselle rørformede innbuktninger av overflatemembranen inn i dypet av muskelcellen 2) Spenningstyrte proteiner i T-rørmembranen i kontakt med Ca ++ -frigjøringskanaler i SER-membranen 3) SER - glatt endoplasmatisk retikulum. En spesialisert variant i tverrstripede muskelceller kalles sarkoplasmatisk retikulum. Denne inneholder Ca ++ -pumper og Ca ++ - frigjøringskanaler. SER regulerer cytosolkonsentrasjonen av Ca ++ 29. En av de spesialiserte celle-celle kontaktene kalles zonula occludens (tight junctions). Beskriv kort struktur og hovedfunksjoner. Transmembranproteiner (krever ikke navn) danner en forsegling mellom celler. Hovedfunksjonene er å forhindre 1. lekkasje av molekyler mellom celler (vanligvis epitelceller) og 2) sidelengs flyting av membrankomponenter (mebranproteiner og - lipider) mellom basolaterale og apikale membrandoméne i (polariserte) epitelceller. 30. Beskriv også kort funksjon og oppbygning av følgende to cellekontakter: a) zonula adherens b) desmosom (macula adherens) a) Zonula adherens har form som et belte i hele cellens omkrets i et plan, og gjerne rett basalt for en zonula occludens. Funksjonen består i å binde to celler sammen i et område, og hindre at disse kan bli revet fra hverandre. Dette oppnås ved at bindingsproteinene er forankret til aktinfilamenter inne i cellene. Mange celler har et spesielt solid cytoskjelett- nettverk i dette planet (kalt terminalvev/terminalfletning, bestående av aktin, myosin og spectrin, men det kreves ikke beskrevet). b) Macula adherens, oftere kalt desmosom, er en punktformet kontakt mellom to celler. Funksjonen er igjen adhesjon, altså å hindre at cellene kan rives fra hverandre. Bindingsproteinene er av lignende type som i zonula occludens (cadheriner), men forankret i intermediære filamenter istedet for aktinfilamenter (i epitelceller ofte keratinfilamenter). Hjernens nedsatte evne til å katabolisere glukose 31a. Kan skyldes at glukokinasen ikke er aktiv i hjernen hos individer med demens. Feil. Glukokinasen finnes bare i leveren, nedsatt glukosekatabolisme i hjernen kan følgelig ikke skyldes manglende glukokinaseaktivitet.

15 b. Har begrenset effekt på hjernecellenes ATP-forsyning fordi det bare er ATP dannet ved fosforylering på substratnivå som er affisert. Feil. Hjernen forbrenner glukose fullstendig til CO2 og H2O. Nedsatt katabolisme av glukose vil følgelig ha som konsekvens at svikten i ATP-fosyningen blir større enn bare det som skyldes sviktende fosforylering på substratniva (dvs. i fosfoglyseratkinase- og pyruvatkinasereaksjonen). c. Har stor betydning for hjernecellenes ATP-forsyning fordi oksidativ fosforylering også blir hemmet. Riktig. Sviktende glukosekatabolisme vil i hjernen, som obligat aerobt organ, bety at forsyningen av acetyl-coa til sitronsyresyklus også svikter. Dermed blir det mangle på NADH og FADH2 til elektrontransportkjeden, og forsyningen av ATP fra oksidativ fosforylering vil bli affisert. d. Har meget begrenset effekt på hjernecellenes energiforsyning fordi ß-oksidasjonen overtar som energigenerator. Feil. Hjernen har ikke ß-oksidasjon av fettsyrer, så dette er ikke noen alternativ energikilde for hjernen. 32a. Palmitin- og stearinsyre er monoumettede fettsyrer som begges kan syntetiseres i leveren. Feil. Palmitin- og stearinsyre er mettede fettsyrer; men begge kan syntetiseres i leveren. b. Linol og linolensyre er polyumettede fettsyrer, med kjedelengde på 20 karbonatomer, som kan begge syntetiseres i leveren. Feil. Linol- (C18:2) og linolensyre (C18:3) er polyumettede fettsyrer som er 18 karbonatomer lange. De er begge essensielle fettsyrer og kan altså ikke syntetiseres i leveren. c. Ved å bytte ut en linolensyre i et triacylglyserolmolekyl med en stearinsyre vil triacylglyserolmolekylet få lavere smeltepunkt. Feil. Den mettede fettsyren, stearinsyre (C18:0) har høyere smeltepunkt enn den polyumettet fettsyren linolensyre (C18:3). Følgelig vil det nye triacylglyserolmolekylet også ha høyere smeltepunkt. d. Når en polyumettet fettsyre blir ß-oksidert gir dette færre ATP molekyler enn ved ß- oksidasjon av en mettet fettsyre med samme kjedelengde. Riktig. En polyumettet fettsyre inneholder færre H-atomer enn den tilsvarende mettede fettsyrene. Dette betyr at den polyumettede fettsyren har færre reduserende ekvivalenter å gi fra seg under sin ß-oksidasjon. Den polyumettede fettsyren gir derfor oppphav til færre ATP molekyler enn den tilsvarende mettede fettsyren. 33a. Glutamin syntetase og glutaminase anvendes når overskudd av nitrogen skal transporteres fra perfere vev (for eks. hjernen) til leveren. Riktig. Overskudd av nitrogen(som NH4 + ) anvendes i hjernen til syntese av glutamin (Gln), Glu+ NH 4 + + ATP Gln + ADP + P i. Gln transporteres via blodbanen til for

16 eks. leveren hvor glutaminase reverserer prosessen: Gln Glu + NH 4 +. NH 4 + kan der inngå i ureasyntesen. b. Aminotransferaser og glutamate dehydrogenase har en sentral funksjon hva angår detoksifisering av overskudd av nitrogen. Riktig. Aminotransferasene overfører aminosyrenes aminogruppe til α-ketoglutarat (aminosyre + α-kg α-ketosyre + glutamat). Aminosyren omdannes dermed til en α- ketosyre. Det resulterende karbonskjelettet blir deretter gjenstand for videre metabolisme. Glutamat (Glu) blir så oksidativt deaminert av glutamat dehydrogenase (Glu + NAD(P) + α -ketoglutarat + NAD(P)H + H + + NH 4 + ). Frigitt NH 4 + vil gå inn i ureasyntesen fordi glutamat-dehydrogenasereaksjonen bare foregår i mitokondrienes matriks. c. Under sult vil hjernens glukoneogenese dekke hjernens glukosebehov. Feil. Hjernen har ingen glukoneogenese glukoneogenese foregår bare i leveren (og i nyrebarken). d. Glukoneogenese og ketogenese er metabolsk forskjellige prosesser, men er funksjonelt sett sammenkoplede. Riktig. Glukoneogenese omhandler syntese av glukose fra aminosyrenes karbonskjeletter (i en liten grad også fra glyserol), mens ketogenesen er en del av fettsyrekatabolismen (syntese av ketonlegemer fra overskudd av acetyl-coa dannet fra ß-oksidasjon av fettsyrer). Prosessene er funksjonelt sammenkoblede fordi: Det bare er glukoneogene vev som utfører ketogenese (dvs lever og nyrebark). Ketogenesen oppstår som en konsekvens av økt ß- oksidasjon i disse vevene. Den økte ß-oksidasjonen i glukoneogene vev er nødvendig for å skaffe ATP til glukoneogenesen. Vev med aktiv glukoneogenese har ikke aktiv sitronsyresyklus, grunnet manglende oksaloacetat som acetylgruppe-akseptor. Følgelig må acetyl-coa som dannet fra ß-oksidasjonen omsettes utenfor sitronsyresyklus, dvs til ketonlegemer. Pyruvatkarboksylase krever acetyl-coa som obligatorisk allosterisk aktivator. Besvarelser som forklarer den metabolske forskjellen, samt har med minst 3 av de påfølgende punkter bør ansees som bestått.