Axial 50 EC pinoksaden

Transkript

1 Vurdering av plantevernmidlet Axial 50 EC pinoksaden vedrørende søknad om godkjenning Mattilsynet, seksjon nasjonale godkjenninger Saksbehandlere: Anne G. Kraggerud, Elisabeth Øya, Siri Nesbakken For Vitenskapskomiteen for mattrygghet, faggruppe 2 Oktober 2009

2 Axial 50 EC- pinoksaden Side 2 Innholdsfortegnelse 1. Sammendrag Identitet og fysikalsk/kjemiske data Toksiske effekter og skadepotensiale for menneske Dokumentasjonens kvalitet Status for preparatet Agronomi Bruk/virkning Behandlingsmåte og dosering Anbefaling fra Bioforsk Plantehelse Identitet og fysikalsk/kjemiske data (virksomt stoff) Toksisk effekt og skadepotensiale for menneske Pinoksaden Toksikokinetikk Akutt toksisitet Irritasjon/allergi Gentoksisitet Subkronisk toksisitet Kronisk toksisitet og kreft Reproduksjonstoksisitet Teratogenese Nevrotoksisitet Spesielle forsøk Humane data Klassifisering og merking Forslag til nasjonale normer Metabolitter Formuleringsstoffer Preparat Akutt toksisitet Irritasjon/allergi klassifisering og merking Dermal absorpsjon Eksponering ved bruk og arbeid med sprøytet kultur Rester i produkter til mat eller fôr Skjebne i miljøet og økotoksiske effekter Økotoksikologi Dokumentasjonens kvalitet 9-1 Referanser 9-1

3 Side Sammendrag Axial 50 EC er et nytt preparat med nytt virksomt stoff, pinoksaden. Preparatet søkes godkjent mot floghavre og raigras brukt som fangvekst i bygg, vår- og høsthvete, rug og rughvete. Normert arealdose er 90 ml per dekar (tilsvarer 4,5 g virksomt stoff per dekar). Pinoksaden tilhører den kjemiske gruppen fenylpyrazolin som er ACCase-hemmer. Resistens for pinoksaden er ikke kjent, men det bør tas de vanlige forhåndsreglene mot resistensutvikling. Axial 50 EC er et spesialmiddel mot floghavre i korn. Preparatet påføres tidlig om våren med åkersprøyte på 3-5 bladstadiet til kornet. 1.1 Identitet og fysikalsk/kjemiske data Preparatnavn Axial 50 EC Virksomt stoff Formulering pinoksaden emulsjonskonsentrat Konsentrasjon av virksomt stoff 50 g/liter UPAC-navn 2,2-dimethyl-propionic acid 8-(2,6-diethyl-4-methyl-phenyl)-9-oxo-1,2,4,5-tetrahydro-9Hpyrazolo[1,2-d][1,4,5]oxadiazepin-7-yl ester CAS nummer Strukturformel Molekylvekt 400,5 Vannløselighet Høy 200 mg/l (25 C) Damptrykk Lavt 2,0 x 10-7 Pa (20 C) 4,6 x 10-7 Pa (25 C) Henrys kons. Lav 9,2 x 10-7 Pa m 3 /mol (25 C) log Pow Høy 3,2 (25 C)

4 Side Toksiske effekter og skadepotensiale for menneske Pinoksaden Toksikokinetikk Absorpsjon: Absorpsjonen av pinoksaden var rask og høy. Over 90 % av stoffet ble absorbert fra mage/tarmkanalen i rotter og absorpsjonsgraden så ut til å være lik for lav og høy dose. Distribusjon: Det ble sett høyest innhold av rester i blod, lever og nyrer (34 og 18 ppm pinoksaden ekvivalenter i hhv lever og nyrer). Minst innhold av rester ble funnet i hjerne, bein, testikler, tymus, fett, eggstokker og livmor. Ingen forskjell mellom kjønnene ble funnet. Halveringstidene ble funnet å være 2-5 timer for lav dose og 5-7 timer for høy dose. Utskillelse: Ekskresjonen var rask og for det meste via urin (ca 65 % via urin i lavdosegruppene og % via urin i høydosegruppene) % av stoffet ble skilt ut via avføring i lavdosegruppene mens ca 26 % ble skilt ut via avføring i høydosegruppene. Metabolisme: 35 metabolitter ble funnet, hvor M2 (dannet ved hydrolysering) var den viktigste (60-90 %) Det ble ikke funnet igjen opprinnelig stoff i urin, galle eller avføring. Akutt toksisitet Pinoksaden er ikke farlig ved svelging eller hudkontakt, derimot er det helseskadelig ved innånding (Innfrir kravene til merking med Xn; R20). Irritasjon/allergi Pinoksaden ikke hudirriterende eller allergifremkallende ved hudkontakt, men det er vist øyeirriterende. (Innfrir kravene til merking med Xi; R36). Gentoksisitet Pinoksaden har gitt klastogen effekt i kinesisk hamster V79 celler in vitro, men da det ikke har vist lignende effekt in vivo er dataene ikke tilstrekkelige til å klassifisere stoffet som gentoksisk. Det hadde vært ønskelig om administrasjonen var gitt intraperitonealt for å maksimere opptaket, siden det er usikkert om pinoksaden i denne mikrokjernetesten har nådd beinmargen. Pinoksaden var ikke positiv verken i mikrokjernetesten eller UDS testen. Siden ingen av in vivo studiene i somatiske celler eksponert for pinoksaden (NOA ) gav positiv respons, er det unødvendig å gjøre in vivo studier i kjønnsceller. Det er ingen tegn til gentoksisk aktivitet av pinoksaden (NOA ) in vivo. Subkronisk/kronisk toksisitet I subkroniske forsøk i rotte er kritiske effekter tydelige histopatologiske skader i nyrene i tillegg til økt levervekt ved høye dosenivåer. Nyre og lever ble begge ansett som målorgan. I subkroniske forsøk med hund er kritiske effekter histopatologiske endringer i lever og endringer i klinisk-kjemiske parametre. Dette indikerer at lever er målorgan i hund. Mest følsomt organ varierer i hund og rotte og det kan tyde på ulik metabolisme av pinoksaden. I kroniske forsøk i rotte fører stoffet til økt dødelighet, redusert kroppsvekt og histopatologiske forandringer i nyrene. Målorganet er nyrene, hvilket baseres på histopatologiske forandringer relatert til utvidelse av tubuli og kronisk progressiv nefropati, samt forandringer i vanninntak og urinvolum. I kreftstudiet i mus var redusert kroppsvekt og økt dødelighet kritiske effekter. I forsøket der pinoksaden ble tilført med sonde var lunger hovedmålorgan. Dette hadde mest sannsynlig sammenheng med direkte sprøyting av teststoffet i lungene grunnet eksponeringsfeil. Kreftfremkallende potensial Det var en økning i antall tilfeller av leiomyosarcoma i magesekken hos hannrotter. Dette er en sjelden krefttype, og det er usikkert om denne økningen er relatert til behandlingen med pinoksaden. Det var en økning i bronkioalveolære svulster i mus 40 mg/kg kv/dag i forsøket der pinoksaden ble tilført med sonde. Funnene kan skyldes direkte kontakt med pinoksaden, men er mer sannsynlig en sekundær effekt av andre forandringer og skader på lungene. Reproduksjonstoksisitet og teratogenese Reproduksjonstoksisitet: Nyretoksisitet (økt organvekt, histopatologi (kronisk nefropati, tubulær atrofi, utvidelse av nyrebekken og kortikomedulær mineralisering, glykogenavsetning i lever og hemosiderose) og økt vanninntak og signifikant/skadelig økning i levervekt ble observert etter behandling med pinoksaden. Pinoksaden anses ikke reprotoksisk ut fra dette studiet.

5 Side 1-3 Teratogenese: Pinoksaden medførte mortoksisitet i form av redusert kroppsvekt, fôrinntak og ulike kliniske tegn i rotter dosert med 300 og 800 mg/kg kv/dag. Høydosen gav samtidig fostertoksisitet som bestod av små utviklingsforsinkelser. Disse ble indikert av redusert fostervekt og noe ufullstendig i forbeining av fosterskjelettet. Forandringene observert ved 300 mg/kg kv/dag ble begrenset til to skjelettvariasjoner. Tegn på fostertoksisitet ble sett ved tilstedeværelse av mortoksisitet. Pinoksaden medførte mortoksisitet i form av redusert vektøkning og vekttap i kaniner dosert med 30 og 100 mg/kg kv/dag. Fostertoksiske effekter inkluderte fosterdødelighet og resorpsjoner ved 100 mg/kg kv/dag og misdannelser av diafragma ved 30 og 100 mg/kg kv/dag. Basert på misdannelser, fosterdødelighet og resorpsjoner vurderes pinoksaden som mulig fosterskadelig. Nevrotoksisitet: Pinoksaden ansees ikke som nevrotoksisk. Dosevalget ansees som godt nok til å skille mellom potensielle nevrotoksiske skader og potensielle sekundære nevrotoksiske skader. Humane data Ikke rapportert Metabolitter Karakterisering av iboende egenskaper av metabolitter i grunnvann er mangelfull og klassifisering av M3 som giftig (kreft, kronisk giftighet eller repro) kan ikke utelukkes. En eventuell klassifisering av denne metabolitten som giftig vil kunne føre at virksomt stoff ikke godkjennes. Axial 50 EC Formuleringsstoffer Axial 50 EC inneholder over 10 % aromatiske hydrokarboner. Akutt giftighet, irritasjon, allergi Axial er ikke farlig ved innånding, svelging eller hudkontakt. Axial er hudirriterende for kanin og allergifremkallende ved hudkontakt for marsvin. Dermal absorpsjon Basert på resultater fra oven nevnte forsøk beregnes dermal absorpsjon for Axial 100 EC gjennom menneskehud in vivo som følger: Konsentrert preparat: 6,5 % Fortynnet løsning: 4 % Eksponering ved bruk og arbeid med sprøytet kultur Eksponering ved bruk: Beregnet eksponering for Axial 50 EC overskrider ikke foreslått AOEL for pinoksaden selv uten bruk av verneutstyr. Bruk av verneutstyr vil imidlertid kreves på grunn av merking av prepratet som irriterende. Eksponering ved opphold og/eller arbeid med sprøytet kultur: AOEL overskrides heller ikke ved opphold og/eller arbeid med sprøytet kultur selv uten bruk av verneutstyr. Bruk av hansker vil imidlertid kreves ved arbeid med sprøytet kultur da prepratet er allergifremkallende ved hudkontakt 1.3 Dokumentasjonens kvalitet Den foreliggende dokumentasjon er tilstrekkelig til å foreta en vurdering av virksomt stoff og preparat.

6 Axial 50 EC- pinoksaden Side 2-1 Saksnummer 07/ Status for preparatet Virksomt stoff Preparatnavn Tilvirker Importør Konsentrasjon av virksomt stoff Formulering Pakningsstørrelse Type preparat Type sak Pinoksaden Axial 50 EC Syngenta Crop Protection AG; Basel Syngenta Crop Protection AS 50 g/liter Emulsjonskonsentrat 1, 3 og 5 liter Ugrasmiddel, spesialmiddel mot floghavre Nytt preparat inneholdende nytt virksomt stoff Søknadsdato Forrige godkjenningsperiode utløp(er) -/- Sist vurdert -/- Krav -/- Omsetning -/- Status i EU Pinoksaden er nytt virksomt stoff i EU og er ikke behandlet ennå (pending). Pinoksaden er per dags dato ikke godkjent i Sverige eller Danmark.

7 Aksial 50 EC - pinoksaden Side Agronomi Teksten i dette kapitlet er hentet fra Bioforsk Plantehelse sin agronomiske vurdering samt etikettforslag fra importør. Søkt bruksområde Virkeområde Virkemåte Virkemekanisme 3.1 Bruk/virkning Vår- og høsthvete, bygg, rug og rughvete. Floghavre og raigras brukt som fangvekst. I dokumentasjonen fra tilvirker opplyses at Axial 50 EC virker gjennom bladopptak og har systemisk virkning i planten. Pinoksaden tilhører den kjemiske gruppen fenylpyrazolin (ACCase-hemmer). Pinoksaden inhiberer Acetyl Co-A karboksylase (ACCase), et viktig enzym i fettsyresyntesen. Nytteorganismer/ Integrert plantevern Ikke relevant. Resistens Axial 50 EC er en ACCase-hemmer og utvikling av resistens for denne virkemekanismen er meget vanlig i grasarter. Dette gjelder særlig åkerkvein og åkerreverumpe som ikke er ugras hos oss i dag. Faren for resistensutvikling hos floghavre er antatt for å være mindre enn hos de nevnte artene. Hos biotyper av floghavre med nedsatt følsomhet mot andre ACCase-hemmere, fant en bare svak nedgang i følsomhet i noen få tilfeller. De aller fleste ACCase-hemmer tolerante biotyper var meget følsomme for Axial 50 EC. Produsenten angir resistensrisikoen for å være moderat, bl.a. fordi floghave produserer relativt få frø og har høg grad av selvpollinering. Likevel er risikoen bedømt av tilvirker til å være for høy til å være akseptabel uten restriksjoner i bruken. I Norge har vi relativt få tilfeller av store, tette bestand av floghavre og risikoen for resistensutvikling vil være lavere enn i områder med store populasjoner. Vi mener at det ikke er grunn for å føre opp vanlige resistensrisikosetninger på etiketten da det per i dag ikke er gode resistensbrytere på markedet. Likevel vil vi tilrå at det varsles om resistensfare på etiketten. 3.2 Behandlingsmåte og dosering Mot floghavre brukes ml per dekar i liter vann. Mot raigras etter bruk som fangvekst brukes ml per dekar i liter vann. Behandlingstidspunktet er om våren når vårkornet har 3-5 blad (BBCH 13-29) og for høstkorn om våren når korn og ugras er i god vekst. NAD Spredeutstyr Med bakgrunn i preparatets dosering i korn fastsettes normert arealdose (NAD) til 90 ml per dekar. Dette tilsvarer 4,5 g v.s./daa. Behandling foretas med åkersprøyte. 3.3 Anbefaling fra Bioforsk Plantehelse Axial 50 EC er et spesial preparat mot floghavre i korn, men virker også mot raigras. Floghavre er et konkurransekraftig og avlingsnedsettende ugras i korn og etablerte bestand er svært vanskelig å bekjempe uten kjemiske middel. Det er bare er et floghavremiddel for bruk i korn på det norske markedet per i dag, Puma Extra. Axial 50

8 Aksial 50 EC - pinoksaden Side 3-2 EC er et bedre middel enn Puma Extra. Selv om disse midlene er fra ulike middelgrupper er de begge ACCase-hemmere. Som resistensbrytere for hverandre har de derfor trolig begrenset verdi selv om klare tilfeller av kryssresistens ikke er rapportert. Bioforsk Plantehelse anbefaler godkjenning av Axial 50 EC pinoksaden.

9 Side Identitet og fysikalsk/kjemiske data (virksomt stoff) IUPAC-navn 2,2-dimethyl-propionic acid 8-(2,6-diethyl-4-methyl-phenyl)-9-oxo-1,2,4,5-tetrahydro-9Hpyrazolo[1,2-d][1,4,5]oxadiazepin-7-yl ester CAS nummer Strukturformel Molekylvekt 400,5 Vannløselighet Høy 200 mg/l (25 C) Damptrykk Lavt 2,0 x 10-7 Pa (20 C) 4,6 x 10-7 Pa (25 C) Henrys kons. Lav 9,2 x 10-7 Pa m 3 /mol (25 C) log Pow Høy 3,2 (25 C)

10 Side Toksisk effekt og skadepotensiale for menneske Vurderingen er basert på EU monografi fra 2005 og dokumentasjon fra tilvirker (Syngenta Crop Protection AG). 5.1 Pinoksaden Toksikokinetikk Rotte, enkel dosering. Høy og lav dose. 2 doseringsgrupper med 4 rotter/kjønn/gruppe, i tillegg 2 doseringsgrupper med 5 hannrotter i hver gruppe (gallekanulerte)- 2 dosenivåer ble brukt; 0,5 mg/kg kv og 300 mg/kg kv Resultater: For de to ikke-gallekanulert gruppene ble omlag % skilt ut via urinen, burvask og funnet igjen i vevene. For de gallekanulerte dyrene fant man at absorpsjonen var over 90 % basert på at under 10 % av dosen ble funnet igjen i avføring. Det så ut til at absorpsjonen var uavhengig av kjønn og dose. Rester i vev var under 0,1 % i alle grupper 7 dager etter dosering. For rottene som hadde fått lav dose økte innholdet av pinoksaden i blodet raskt hos både hunner og hanner. Maksimum gjennomsnittlig konsentrasjon i blod (0,15-0,17 ppm pinoksaden ekvivalenter) ble nådd innen 1 time etter dosering. Deretter sank konsentrasjonen raskt ned til limit of determination 8 og 24 timer etter dosering (for hhv hanner og hunner). Halveringstiden (eliminasjon) var 1 time til å begynne med og beregnes å øke til 6 timer på slutten av eliminasjonsfasen (lav dose) dersom man forutsetter 1. ordens kinetikk og bifasisk eliminasjon. For dyrene som hadde fått høy dose økte også konsentrasjonen av virksomt stoff i blodet raskt hos begge kjønn. Maksimum konsentrasjon (15-25 ppm) ble nådd mellom 0,25 og 12 timer etter dosering. Konsentrasjonen av v.s. i blod gikk ned til under LOQ etter 48 og 72 timer for hhv hanner og hunner. Halveringstiden var 1 time for den første eliminasjonsfasen og 6-7 timer i den andre fasen. Det ble sett en ikke-lineær økning i AUC (se tabell B6.2. s 88 i vedlegg T1), siden forholdet mellom AUC for høy og lav dose var mellom mens dosen økte med en faktor på 600. Dette kan skyldes at stoffet ble absorbert og skilt ut veldig raskt i lavdosegruppene. Ved å sammenlikne AUC ser man at absorpsjonen er ganske lik for høy dose og lav dose (enkel dose) (se figur B.6.1. s 87 i vedlegg T1). Det kan tyde på at det var noe enterohepatisk resirkulering i høydosen. For rotter som hadde fått høy dose var halveringstiden i området 6-7 timer. Det ble sett rask ekskresjon av pinoksaden og mer enn 90 % av gjenfunnet dose ble skilt ut via urin og avføring innen 72 timer etter dosering. 7 dager etter dosering var utskillelsen omtrent fullstendig. Det meste av tilført pinoksaden ble skilt ut via urin(59-78 %) mens ca 25 % ble skilt ut via avføring (ikke gallekanulerte rotter) (se tabell B6.3 s 89 i vedlegg T1). Det så ikke ut til at utskillelsen ble påvirket av kjønn eller dose. Rester av pinoksaden var nærme grensen (over, ved eller under) for målbarhet for alle vev, begge dosenivå. Høyest nivå ble funnet i lever og nyre og var på 0,05-0,07 ppm (høy dose) (Mewes, 2000). Rotte, enkel og gjentatt dosering. Høy og lav dose. 4 doseringsgrupper med 12 rotter /gruppe/enkel dosering. I 2 av gruppene var det hannrotter (hhv lav og høy dose) og i de andre 2 gruppene var det hunnrotter (lav og høy dose). I tillegg var det en gruppe med 16 hunnrotter som fikk gjentatt dosering med lav dose i 14 dager. Lav dose var på 0,5 mg pinoksaden/kg mens høy dose var på 300 mg pinoksaden/kg. Oral dosering. Pinoksaden ble skilt ut med halveringstider på ca 7 timer (uavhengig av kjønn og dose) etter enkel dosering. Halveringstiden var generelt 2-3 timer lengre på høydosenivå. Restnivået i de fleste organer og vev etter gjentatt dosering var for det meste under LOQ, men var over for lever og nyre og så vidt over grensen for hjerte, lunge og muskler (se tabell B.6.5 og B.6.6. s 92 i vedlegg T1). Det ble sett omtrent fullstendig utskillelse av pinoksaden. Det meste av stoffet ble skilt ut via

11 Rotte, gjentatt dosering. Høy dose. Side 5-2 urinen innen 3 dager etter den siste dosen (dag 14). Det ble ikke sett noen tegn til akkumulering i de ulike vev (Mewes 2001). 16 hunnrotter mottok orale doser på 300 mg v.s. i 14 dager etter hverandre. Stoffet ble raskt og tilnærmet fullstendig absorbert fra mage-tarm kanalen. Konsentrasjonen av v.s. i blodet økte raskt og 2 dager etter dosering ble et platånivå nådd i blodet på ca 2 ppm pinoksaden ekv. (se figur B.6.3. s 97 i vedlegg T1). Etter siste dosering sank blodverdiene raskt og var ned på halvparten av maks konsentrasjon etter 15 timer. Maks konsentrasjon i vev ble nådd etter 7 dager. Høyest restnivå ble sett i lever og nyre (hhv 34 og 18 ppm pinoksaden ekvivalenter) Det ble sett lavere konsentrasjoner i blod, bukspyttkjertel og lunger. 7 dager etter siste dosering var mindre enn 0,01 % av tilført dose igjen i vevet. 94,7 % av tilført dose ble gjenfunnet i som ekskresjonsprodukter og burvask. Pinoksaden (inkludert metabolitter) skilles ut raskt og over 90 % av tilført stoff ble skilt ut innen 24 timer etter siste dosering. Det meste av tilført stoff ble skilt ut via urinen (69 %). Ca 26 % ble skilt ut via avføring. Urinanalyser viste at det var 1 hovedmetabolitt som utgjorde ca 94 % og en mindre metabolitt som utgjorde ca 3 % av alle metabolittene. Andre metabolitter i urinen var under 1 % (se tabell B.6.12 s 100 i vedlegg T1). Metabolitter i avføring hadde sammenliknbar profil (se tabell B.6.13 s 100 i vedlegg T1). Gjentatt dosering påvirket ikke metabolittmønsteret i urin eller avføring sammenliknet med enkel dosering. Det ble ikke sett noen tegn til bioakkumulering av pinoksaden (Hassler, 2003). Rotte, Metabolismeforsøk Prøver fra tidligere studie med samme høye og lave dose ble brukt til å identifisere metabolitter og ulike metabolismeveier. 35 metabolitter ble identifisert (se tabell B6.1.2 s 3 i vedlegg T2, addendum 1). Det ble ikke funnet noe igjen av morstoffet i verken urin, galle eller avføring. Hovedmetabolitten som ble funnet var M2, dannet ved hydrolysering, og denne utgjorde % i lavdosegruppen og % i høydosegruppen. En annen metabolitt som det ble dannet mye av var M4 (dannet ved hydroksylering), som utgjorde ca 13 % i lavdosegruppen og 7 % i høydosegruppen. De andre 33 metabolittene utgjorde mindre enn 1,2 % av tilført dose. Det ble sett ulike metabolismeveier som involverte bl.a. hydrolyse, hydroksylering og konjugering (se tabell B s 3 i vedlegg T2, addendum 1 til DAR). Metabolismeforsøket viste ingen store forskjeller mellom kjønn eller dosenivå (Rümbeli, 2003). Sammendrag (toksikokinetikk) Absorpsjon: Absorpsjonen av pinoksaden var rask og høy. Over 90 % av stoffet ble absorbert fra mage/tarmkanalen i rotter og absorpsjonsgraden så ut til å være lik for lav og høy dose. Distribusjon: Det ble sett høyest innhold av rester i blod, lever og nyrer (34 og 18 ppm pinoksaden ekvivalenter i hhv lever og nyrer). Minst innhold av rester ble funnet i hjerne, bein, testikler, tymus, fett, eggstokker og livmor. Ingen forskjell mellom kjønnene ble funnet. Halveringstidene ble funnet å være 2-5 timer for lav dose og 5-7 timer for høy dose. Utskillelse: Ekskresjonen var rask og for det meste via urin (ca 65 % via urin i lavdosegruppene og % via urin i høydosegruppene) % av stoffet ble skilt ut via avføring i lavdosegruppene mens ca 26 % ble skilt ut via avføring i høydosegruppene. Metabolisme: 35 metabolitter ble funnet, hvor M2 (dannet ved hydrolysering) var den viktigste (60-90 %) Det ble ikke funnet igjen opprinnelig stoff i urin, galle eller avføring Akutt toksisitet Akutt oral LD50 i Hanlbm:WIST rotter er >5000 mg/kg kv (GLP/OECD 401)(Sommer, 2000). En hannrotte ble funnet død 5 dager etter eksponering for 5000 mg/kg kv. Patologiske undersøkelser viste rødlig tynntarm, tykktarm og blindtarm. Noe myk avføring hos to hanner og en hunn, og krummet holdning hos to hanner og to hunner, ble observert samme dag som behandling. Dag 1 etter behandling fremsto alle dyrene som normale.

12 Side 5-3 Akutt dermal LD50 i Hanlbm:WISTrotter er >2000 mg/kg kv. (GLP/OECD 402) (Sommer, 2001). Eksponering for 2000 mg/kg kv pinoksaden førte til svak reduksjon i kroppsvekt hos tre hunner den første uka etter behandling. Patologiske undersøkelser viste svakt granulert overflate i den høyre nyra hos en hann, og utvidet nyrebekken i en hunn. Inhalasjon Akutt LC50 ved inhalasjon i Hanlbm:WIST rotter er 4,6 mg/l luft (90% konfidensintervall 3,3-20,7 mg/l luft) for hanner og 6,2 mg/l luft for hunner (konfidentsintervall ikke bestemt). For begge kjønn samlet er LD50 5,2 mg/l luft (95% konfidensintervall 4,1-18,0 mg/l luft). (GLP/OECD 403) (Decker et al, 2001). Grupper på fem hanner og fem hunner ble eksponert for tre konsentrasjoner av teststoffet (2,2, 3,8 og 5,5 mg/l luft) gjennom nese. MMAD varierte fra 2,2 (±2,9) 2,7 (±3,0). Ved eksponering for 3,8 mg/l luft ble tre dyr (to hanner og en hunn) funnet døde tre dager etter eksponering. Etter eksponering for 5,5 mg/l døde fem dyr (tre hanner og to hunner). De tre hannene og en hunn ble funnet døde dagen etter eksponering, og den andre hunnen tre dager etter eksponering. Kliniske effekter inkludert tung pust, økt spyttutskillelse og krusete pels i alle eksponeringsgruppene. I høydose og mellomdosegruppene ble det observert nedsatt spontan aktivitet, og rastløshet ble observert i tre av fem dyr ved mellomdosen. Lut holdning ble observert i høy- og lavdosegruppa. Rødt sekret fra nesen ble observert hos en hunn fra lavdosegruppa og oppsvulmet buk ble funnet hos en overlevende hunn eksponert for 3,8 mg/ml luft. Fra dag 7 etter eksponering viste ingen overlevende individer kliniske symptomer. Overlevende fra alle tre doseringsgruppene viste markert midlertidig vektreduksjon. Obduksjonen viste rød misfarging av lungene i to av tre prematurt døde rotter eksponert for 3,8 mg/l og i fire av fem rotter eksponert for 5,5 mg/l, og ufullstendig lungekollaps i en overlevende rotte eksponert for 5,5 mg/l. Sammendrag (akutt toksisitet): Pinoksaden er ikke farlig ved svelging eller hudkontakt, derimot er det helseskadelig ved innånding (Innfrir kravene til merking med Xn; R20). Hudirritasjon Øyeirritasjon Allergi Irritasjon/allergi Tre New Zealand White-kaniner ble brukt i forsøket. Eksponering i 4 timer. Gjennomsnittlig hudirritasjonsindeks var (24, 48 og 72 timer) 0 for erytem og 0 for ødem OECD 404/GLP/QA. (Arcelin, 2000). Tre New Zealand White-kaniner ble brukt i forsøket. Gjennomsnittlig øyeirritasjonsindeks var 1,0 for uklarheter i hornhinnen, 0,0 for skader i regnbuehinnen, 2,56 for ødem i bindehinnen (Xi; R36) og 1,22 for rødhet i bindehinnen. Alle forsøksdyrene var symptomfrie innen 28 dager etter behandling. OECD 405/GLP/QA. (Arcelin, 2000). Pinoksaden er vist ikke allergifremkallende i en Magnusson og Kligman maksimeringstest i marsvin. Det ble ikke observert noen form for hudreaksjoner. OECD 406/GLP/QA. (Arcelin, 2000). Sammendrag (irritasjon/allergi): Pinoksaden ikke hudirriterende eller allergifremkallende ved hudkontakt, men det er vist øyeirriterende. (Innfrir kravene til merking med Xi; R36) Gentoksisitet Forsøkene er oppsummert i en tabell: In vitro: Forsøk Testorganisme Doser/ metabolsk aktivator Resultat Referanse/ retningslinje/ GLP

13 Punktmutasjoner i bakterier Ames/ reversjonstest Punktmutasjoner i pattedyrceller Fremovermutasjonstest Kromosomforstyrrelser in vitro (1) Klastogenisitetstest Kromosomforstyrrelser in vitro (2) DNA reparasjon Forsøk Testorganisme Doser/ metabolsk aktivator UDS test S.typhimurium TA98, TA100, TA102, TA1535,TA1537, E.coli WP2P uvra L5178Y Muse lymfomceller Kinesisk hamster V79 celler Kinesisk hamster V79 celler Rotte hepatocytter, Hanlbm:WIST hannrotter In vivo: DNA skade UDS test *4 Rotte hepatocytter, Alpk:APfSD hannrotter Klastogenisitetstest Kromosomforstyrrelser in vivo Mikrokjernetest *5 Beinmargceller fra NMRI mus μg/skål +/- S9 3 tester: 6,3-100/12,5-150 μg/ml * μg/ml 6,3-100 μg/ml +/- S μg/ml (-S9) μg/ml (+S9) μg/ml (-S9) μg/ml (+S9) 2 tester: 9, µg/ml 18, µg/ml Resultat Negativt Side 5-4 Referanse/ retningslinje/ GLP Sokolowski, 2001/ OECD 471/ GLP Negativt Wollny, 2003/ OECD 476/ GLP Positivt *2 Positivt *3 Czich, 2001/ OECD 473/ GLP Schulz, 2002/ OECD 473/ GLP Negativt Schulz, 2001/ OECD 482/GLP 2000 mg/kg kv Negativt Clay, 2002a/ OECD 486/ GLP/QA 500, 1000, 2000 mg/kg kv Negativt Honarvar, 2001/ OECD 474 /GLP/QA *1: grunnet lav cellevekst i negativ- og løsemiddelkontroll i prøver tilsatt S9 ble denne delen av eksperimentet gjentatt. *2: det var klastogen effekt av pinoksaden (NOA407855, 97,2 % renhet) både med og uten S9. Effekten var signifikant fra og med 60 μg/ml med S9, og det var en doserelatert effekt uten S9 fra og med 80 μg/ml. *3: det var klastogen effekt av pinoksaden (NOA407855, 99,5 % renhet) både med og uten S9. Effekten var signifikant fra og med 80 μg/ml uten S9 og 45 μg/ml med S9. Det var også en reduksjon i mitotisk aktivitet. *4: Pinoksaden ble gitt oralt til to grupper med hannrotter. *5:10 ml/kg kv ble administrert oralt via magesonde. Virkningen av pinoksaden (NOA ) hadde ingen cytotoksisk effekt i beinmarg. Denne testen er upålitelig, siden det er usikkert om stoffet har nådd beinmargen. Sammendrag og konklusjon (gentoksisitet): Pinoksaden har gitt klastogen effekt i kinesisk hamster V79 celler in vitro, men da det ikke har vist lignende effekt in vivo er dataene ikke tilstrekkelige til å klassifisere stoffet som gentoksisk. Det hadde vært ønskelig om administrasjonen var gitt intraperitonealt for å maksimere opptaket, siden det er usikkert om pinoksaden i denne mikrokjernetesten har nådd beinmargen. Pinoksaden var ikke positiv verken i mikrokjernetesten eller UDS testen. Siden ingen av in vivo studiene i somatiske celler eksponert for pinoksaden (NOA ) gav positiv respons, ansås det unødvendig å gjøre in vivo studier i kjønnsceller. Det er ingen tegn til gentoksisk aktivitet av pinoksaden (NOA ) in vivo Subkronisk toksisitet

14 Side 5-5 Rotte, 4 uker Oral Supplerende forsøk for å bestemme doser til 90 dagers forsøk. Mottatt dose var 0, 300, 600 og 1000 mg/kg kv/dag til begge kjønn. Tilført daglig med sonde (fortynnet i destillert vann og 0.5% CMC og 0.1% Tween 80) til 5 albino Wistar rotter/kjønn/gruppe (OECD 407/GLP/QA). Avvik fra OECD 407: Ornitin dekarboaylase ble ikke bestemt i de klinisk biokjemiske undersøkelsene, og ingen NOAEL ble fastsatt etter første tolkning av forsøket. Resultater: Én høydosehann ble funnet død på studiedag 11. Dette dyret hadde hatt lut holdning og/eller strittende pels mellom dag Fôrinntaket var signifikant redusert i høydosegruppen (begge kjønn) under den første studieuken, og det var en nedgang i fôrutnyttelsen til høydosehanner. Begge kjønn ( 600mg/kg kv/dag) hadde et økt vanninntak under hele behandlingsperioden. Behandlingsrelaterte hematologifunn ble observert i høydosehanner, som involverte økt antall leukocytter i blodet (leukocytose). I tilegg hadde to hanner i denne gruppen svak økning av antallet blodplater i blodet (thrombocytose). Begge kjønn utskilte et større volum av fortynnet urin, og ketonnivåene i urinen var statistisk signifikant høyere (hanner 600 mg/kg kv/dag og hunner 1000 mg/kg kv/dag). Pinoksaden resulterte i en redusert kroppsvektøkning i høydosehanner. Histopatologiske undersøkelser påviste at nyrene var målorganet ved høye dosenivåer. Nyretoksisiteten ble karakterisert av økt relativ nyrevekt, utvidelse av tubuli i nyrene og proksimal tubulær atrofi forbundet med nekrose av tubulære epitelceller. Det ble observert statistisk signifikant økning i relativ levervekt og forandringer i enkelte kliniske parametere, blant annet redusert plasma-albumin i hunner, i alle behandlede grupper. Det var noe økt glykogendeponering i lever. NOAEL: <300 mg/kg kv/dag for begge kjønn basert på tydelige histopatologiske skader i nyrene i tillegg til økt levervekt ved alle dosenivåer. (Bachmann, 2001). Rotte, 3 måneder Oral Mottatt dose var 0, 3, 10, 30, 100 eller 300 mg/kg kv/dag i hanner og hunner. Tilført daglig med sonde (fortynnet i destillert vann og 0.5% CMC og 0.1% Tween 80) til 10 rotter (albino Wistar rotter; Hanlbm:WIST/kjønn/gruppe. En satellittgruppe på 10 rotter/kjønn, hvor gruppene ble eksponert for 0, 100 og 300 mg/kg kv/dag, ble inkludert i studiet. OECD 408/GLP/QA. Resultater: Det var ingen behandlingsrelaterte dødsfall i løpet av forsøket. En hann (100 mg/kg kv/dag) og en hunn (300 mg/kg kv/dag) døde under blodprøvetaking. En hann i kontrollgruppen virket døende i uke 11 og ble av den grunn avlivet. Videre var det ingen behandlingsrelaterte effekter verken på kliniske funn eller kroppsvekt, og fôrinntak og fôrutnyttelsen heller ikke ble påvirket av eksponeringen. Det ble dokumentert et konsekvent høyere gjennomsnittlig vanninntak i høydosegruppen i begge kjønn gjennom behandlingsperioden. Gjennomsnittsinntaket mellom uke 1 og 13 var 19 % (hanner) og 28 % (hunner) høyere enn de respektive kontrollverdiene. Ingen signifikante forskjeller sammenlignet med kontrollverdier ble notert under restitusjonsperioden. Ingen skader på øyet ble observert. Det ble sett noen små forandringer i den hematologiske profilen signifikant statistisk sett, men de var ikke av toksikologisk betydning. I den høyeste dosegruppen for begge kjønn samt i den nest høyeste dosegruppen for hunner var det en antydning til ketonuri, hvilket kan være i samsvar med ketonmetabolismen til pinoksaden M2 og M4 metabolitter. I tillegg var urinen i disse gruppene mer sur enn i kontrollene. Store mengder urinutskillelse under behandlingsperioden ble observert hos begge kjønn i høydosegruppen. Etter restitusjon var urinparameterne i behandlede dyr lik kontrollverdiene. Klinisk kjemiske undersøkelser viste at det var forandringer i plasmaelektrolytter (urea, kreatinin, uorganisk fosfor, klorid, kalium, natrium, glukose, protein og albumin) i høydosegruppen. Nivået av uorganisk fosfor i blod var den mest sensitive parameteren og den eneste som vedvarte gjennom restitusjonsperioden hos begge kjønn i doser 30 mg/kg kv. Det var ingen behandlingsrelaterte makroskopiske eller mikroskopiske skader observert. En mild økning i levervekt i høydosegruppen ble betraktet som en mild fysiologisk adaptasjon og ikke tilstrekkelig nok til å representere en advers effekt av behandlingen da det heller ikke ble observert histopatologiske forandringer. Nyrene ble betraktet som hovedmålorgan på grunn av forandringene i vanninntak, klinisk kjemiske parametere og urinparameterne. NOAEL: 100 mg/kg kv/dag for begge kjønn basert på de små forandringene i klinisk kjemi, urinparametere og økt vanninntak ved 300 mg/kg kv/dag (Bachmann, 2001).

15 Side 5-6 Rotte, 3 måneder Oral/diett Fôrkonsentrasjoner på 0, 150, 1000, 5000 og ppm, som tilsvarer 0, 14.9, 97.5, og mg/kg kv/dag i hanner og 0, 16.0, 110.5, og mg/kg kv/dag i hunner, som ble eksponert i 90 dager (hovedstudie). Parallelt ble en interim gruppe (avlivet etter 28 dager) eksponert for dosenivåer på 0, 150, 1000, 5000 og ppm, som tilsvarer 0, 17.6, 118.9, og mg/kg kv/dag i hanner og 0, 17.7, 122.9, og mg/kg kv/dag i hunner. Tilført via fôr til 12 rotter (Alpk:AP f SD Wistarderivert)/kjønn/dose i hovedstudiet og 5 rotter (Alpk:AP f SD Wistar-derivert)/kjønn/dose i interim forsøket. OECD 408/GLP/QA. Avvik fra OECD: dyrene ble ikke fastet før blodprøvetagningen. Ornitin dekarboaylase ble ikke målt i den kliniske biokjemiske undersøkelsen). Resultater: En hann i høydosegruppen døde på dag 24 i studiet. Det var ingen forutgående kliniske tegn eller abnormitet observert ved undersøkelser post mortem av dette dyret. Videre var det ingen behandlingsrelaterte effekter verken på kliniske funn eller FOB ppm resulterte i signifikant lavere kroppsvekt og fôrinntak både i 28- dager og 90-dager forsøket. For hanner i høydosegruppen ble det observert en reduksjon i fôrutnyttelsen de første ukene i 90-dager studiet. Fôrutnyttelsen ved 5000 ppm var lik kontrollgruppen. Ved 5000 ppm ble det funnet en signifikant reduksjon i kroppsvekt både i 28- og 90-dager studiene, men kun de første par ukene. Imidlertid var kroppsvekten lik kontrollgruppen etter 90 dager. Pinoksaden resulterte også i redusert fôrinntak i de to høyeste dosegruppene (begge kjønn) i løpet av de første ukene av studiet. Det gjennomsnittlige vanninntaket var uforandret under 28 dager studiet, mens i hovedstudiet var det noe høyere for dyrene i høydosegruppen de første syv ukene (hanner) og de første to ukene (hunner). Majoriteten av disse forskjellene oppnådde statistisk signifikante verdier, men det ble funnet tydelige inter- og intra-gruppe variasjoner. Det var ingen observerbare forandringer i øyet etter eksponering for pinoksaden. Hunner i høydosegruppen hadde en statistisk signifikant reduksjon i gjennomsnittlig hemoglobinnivå, hematokritt og antall røde blodceller sammenlignet med kontrollgruppen etter 90 dager. Det var ingen effekt på gjennomsnittlig cellevolum, cellehemoglobin eller gjennomsnittlige cellehemoglobinkonsentrasjoner. Det var signifikante forskjeller i de samme parameterne for hanner, men ingen dose-respons sammenheng. Reticulocytter ble ikke målt. Etter 28 dager ble det observert signifikant reduksjon i gjennomsnittverdien av blodplater (hanner), hvite blodceller og nøytrofile i høydosegruppen. I tillegg var antall hvite blodceller og nøytrofile signifikant lavere for hanner i 5000 ppm gruppen. Hunner i ppm gruppen hadde en signifikant lavere verdi av gjennomsnittlig antall monocytter. Etter 90 dager var det en liten men signifikant økning i protrombintiden i begge kjønn i de to høyeste dosegruppene, og for hunner i høydosegruppen. Forskjellene var imidlertid små, og det ble ikke sett noen lignende effekter på den aktiverte partielle tromboplastintiden. Det ble observert signifikant behandlingsrelatert reduksjon i kolesterol hos begge kjønn. Tilvirker bemerker at plasma kolesterol nivåene var innenfor eller svært nærme det historiske kontrollverdiområdet. Urinvolumet til hunner i høydosegruppen var signifikant høyere etter 90 dager. Det ble ikke observert noen behandlingsrelaterte makroskopiske skader. Absolutt (hunner) og relativ (begge kjønn) levervekt i høydosegruppen var signifikant høyere etter 90 dager. Det ble også observert en økning i relativ levervekt i 5000 mg/kg kv/dag hunner. Det ble observert mikroskopiske forandringer i nyrer karakterisert av kortikal basofili, utvidelse av tubuli og/eller atrofi hos begge kjønn etter 28 dager i høydosegruppen (henholdsvis 3/5 og 1/5). Etter 90 dager var det en høyere innsidens av de samme symptomene samt tilstedeværelse av cyster. NOAEL: 5000 ppm. Denne dosen er ekvivalent til 466/527 mg/kg kv/dag i 90 dager forsøket, og 610/545 mg/kg kv/dag i 28 dager forsøket for hanner og hunner (Twomey, 2003). Forsøket anses kun som supplerende. Dette baseres på at pinoksaden var vist å ikke være stabilt i fôret, noe som påvirker påliteligheten av studiet. Hund, 3 måneder Hunner og hanner ble dosert med 0, 25, 100, 250 eller 500 mg/kg kv/dag, tilført oralt med kapsel til 4 beagle hunder/kjønn/gruppe. OECD guideline 409/GLP. Resultater: Kliniske effekter inkluderte økt spyttutskillelse ( 100 mg/kg kv/dag i begge kjønn) og brekninger (fra og med 100 mg/kg/dag i hanner og 500 mg/kg kv/dag i hunner). I høydosegruppen var det økt forekomst av blekhet og kalde ører og tunge i hunner, og flere hanner ble beskrevet som tynne og hadde tørre slimhinner. Lav puls ble observert i begge kjønn etter eksponering for 250 mg/kg kv/dag. En hunn i den samme dosegruppen hadde uklar hornhinne på høyre øyet. Det var en behandlingsrelatert nedgang i fôrinntak og vekt i de to høyeste dosegruppene. Alle

16 Side 5-7 hunnene dosert med 500 mg/kg kv/dag ble avlivet i uke 5 grunnet redusert inntak av fôr med påfølgende vekttap. Ingen kliniske effekter utover kalde ører/tunge og økt spyttutskillelse ble observert. En hann ble avlivet i uke 13 grunnet redusert forinntak og vekttap. Kliniske observasjoner hos dette individet inkluderte lav overflatetemperatur, dehydrering og blekt og magert utseende. Hos en hann dosert med 100 mg/kg kv ble det i uke 3 gjort flere klininske observasjoner, inkludert redusert aktivitet, dehydrering, lut holdning, svak og uregelmessig pusting og tynt og blekt utseende. Hunden tok heller ikke til seg fôr. Etter veterinærbehandling (inkludert antibiotika) og to dager uten dosering med pinoksaden opphørte symptomene, og hunden hadde ikke tilsvarende kliniske symptomer resten av studiet. Hematologiske undersøkelser viste minimale forskjeller i variasjonen av røde og hvite blodcelleparametere, men dette var enten begrenset til enkeltstående prøvetagningstidspunkt eller dosegrupper. Flere endinger i blodkjemi ble observert, inkludert redusert albuminnivå ( 100mg/kg/dag i hanner og 250 mg/kg/dag i hunner), redusert totalt protein (hovedsakelig hanner i høydosegruppa) og økning av alkaline fosfatase (signifikant 100 mg/kg/dag i hanner og alle dosegrupper i hunner) (se tabell under). Alanin aminotransferaseaktiviteten var høyere i hunner i høydosegruppa, og kalsiumnivået var lavere i hanner i de to høyeste dosegruppene. Selected Parameters for dogs following upto 90 days dosing with pinoxaden Parameter Males (mg/kg bw/day ) Females (mg/kg bw/day ) Mean bodyweights (kg) Week all dead all dead all dead * all dead Food consumption (g/dog/day) Week * ** all dead all dead all dead * all dead Clinical Chemistry (adjusted means) b Albumin (g/l) ** 26.6* 26.4* * 24.8** * 27.0** 27.4** ** all dead * 24.6** ** all dead Total protein (g/l) * * all dead ** * all dead Cholesterol (mmol/l) * * all dead * all dead Triglycerides (mmol/l) * all dead ** all dead ALP (IU/l) b ** * 503* * ** all dead * ** * 512* all dead ALT (IU/l) ** all dead all dead Forandring i organvekt ble observert i noen dosegrupper. Absolutt hjertevekt var signifikant lavere i hanner dosert med 250 mg/kg kv/dag. Relativ hjertevekt var lavere i hunner dosert med 100 eller 250 mg/kg kv/dag. Alle middelverdiene lå innenfor historiske kontrolldata. Økning i levervekt ble observert i hanner i høydosegruppa, men

17 Side 5-8 dette skyldtes i hovedsak ett individ. Mikroskopiske funn ble kun gjort i dyr avlivet før forsøksslutt, og inkluderte redusert glykogennivå i lever i dyr av begge kjønn og økt apoptose i lever og atrofi av brisselen i én hunn. NOAEL: 25 mg/kg/dag basert på endringer i kjemiske blodparametre og kliniske effekter ved høyere doser (Lees, 2003). Hund, 1 år Fire beagle hunder/kjønn/gruppe ble dosert med 0, 5, 25 eller 125 mg pinoksaden/kg kv/dag, tilført oralt med kapsel til 4 dyr/kjønn/gruppe. OECD guideline 452/GLP. Avvik fra OECD: høyeste dosenivå gav ikke klare toksiske effekter. Denne dosen var basert på resultater fra 90-dagersforsøket i beaglehunder. Ornitin dekarboaylase ble ikke målt. Resultater: Kliniske effekter observert i forsøket begrenset seg til svak økning i spyttutskillelse ved dosering i hunner og høyere forekomst av flytende avføring i hanner fra og med 25 mg/kg kv/dag. Ved 125 mg/kg kv/dag ble det i tillegg observert en økning i tilfeller av oppkast og slim i avføring. En hann dosert med 25 mg/kg kv/dag hadde antydning til grå stær og en hann dosert med 125 mg/kg kv/dag hadde flere diffuse uklarheter i linsen. Bakgrunnsdata viser at tilsvarende effekter kan oppstå spontant i testarten, og det var ingen sammenfallende histopatologiske forandringer. Behandlingsrelaterte hematologifunn ble observert i hunder dosert med 25 eller 125 mg/kg kv/dag. Antall røde blodceller i hunner var signifikant lavere og lå litt under historiske kontrollverdier ved 25 mg/kg kv/dag etter 26 og 52 uker, og ved 125 mg/kg kv/dag etter 26 uker. Signifikante forandringer ble også observert for antall eosinofile, antall store ufargede blodceller og hemoglobinnivå. Alle middelverdiene lå innenfor historiske kontrollverdier, og viste ingen klar dose-respons. Behandlingsrelaterte effekter på kjemiske parametere i blod ble observert ved 25 og 125 mg/kg kv/dag. Effekter inkluderte reduksjon i albuminnivået ved begge dosene, og reduksjon i totalt protein i høydosegruppa. Effektene på albuminnivå viste en dose-respons, men alle middelverdiene lå innenfor historiske kontrollverdier. Verdiene var generelt innenfor historisk kontroll. I høydosegruppa ble det i tillegg observert signifikant reduksjon i bilirubinnivå og økning i alanin aminotransferaseaktivitet i hanner, minimal reduksjon i plasma kloridnivå og høyere plasma gamma-glutamyl transferaseaktivitet i hunner og økt alkalisk fosfataseaktivitet i begge kjønn. Plasma keratin kinase var signifikant lavere i hunner i alle dosegrupper ved de fleste prøvetagningspunktene, men resultatet kan ha vært en konsekvens av unormalt høye verdier hos to av individene i kontrollgruppa. Alle verdiene lå innenfor historiske kontrollverdier, og det var ingen klar dose-respons. NOAEL: 25 mg/kg kv/dag, basert på kliniske, hematologiske og kjemiske funn ved 125 mg/kg kv/dag (Lees, 2003). Rotte, 4 uker dermal Ti HanBrl:WIST rotter/kjønn/gruppe ble eksponert for dosenivåer på 0, 10, 100 eller 1000 mg pinaxoden/kg kv/dag. Fortynnet i 1 % CMC i 1 % Tween 80. OECD 410/GLP/QA. Avvik fra OECD: Høyeste dose gav ingen klare toksiske effekter, men tilsvarer dosen som ikke trenger å overskrides ved limit-test. Kroppsvekten var lavere enn anbefalt ved starten av forsøket ( g, burde vært g). Hanner ble dosert på dag 1-4, 7-11, og og hunner på dag 1-3, 6-10, og Resultater: De siste 2-5 dagene av behandlingen ble det observert lett erytem i to hanner og to hunner dosert med 100 mg/kg kv/dag, og litt kraftigere erytem i to hunner dosert med 10 mg/kg kv/dag og to hunner dosert med 100 mg/kg kv/dag. Vanninntaket økte noe hos hanner i alle dosegruppene, men effekten var ikke doserelatert. Patologiske undersøkelser viste skorpedannelse på applikasjonsstedet hos én hunn dosert med 10 mg/kg kv/dag, effekten ble antatt å være forårsaket av applikasjonsprosedyren. Flere mikroskopiske funn ble gjort på applikasjonsstedet, inkludert betennelsesreaksjoner hovedsakelig av grad 1. Effekten var dose-relatert i hanner, mens det ble observert flest tilfeller ved 100 mg/kg kv/dag i hunner. Fortykninger i huden ble også observert. Det var ingen klar dose-respons, og antall tilfeller og alvorligheten var størst ved de to laveste dosene. Ulcerasjon ble funnet i to hunner i lavdosegruppa. En årsakssammenheng mellom funnene og pinoksaden kan ikke ekskluderes, men det var ingen konsistent dose-respons og alvorligheten av funnene var relativ lav. Ingen funn indikerte systemiske effekter av pinoksaden ved dermal eksponering. NOAEL (systemisk): Ingen systemiske effekter ble observert i forsøket, NOAEL settes derfor til 1000 mg/kg kv/dag i begge kjønn (Sommer, 2001).

18 Side Kronisk toksisitet og kreft Rotte, 2 år Kombinert kronisk- og kreftforsøk. Dyrene ble eksponert for 0, 1, 10, 100, 250, 500 mg/kg kv/dag. Tilført daglig med sonde (fortynnet i destillert vann og 0.5% CMC og 0.1% Tween 80) til 90 rotter (albino Wistar rotter (HanIbm:WIST (SPF)))/kjønn/dose: 60 dyr/kjønn/dose til 2 år kreft-hovedstudie; en interimgruppe på 10 dyr/kjønn/dose til 1 år toksisitetsstudie; ytterligere en undergruppe på 20 dyr/kjønn/dose beregnet til hematologiske undersøkelser, hvorav 10 dyr/kjønn/dose av denne gruppen ble brukt til kliniske kjemiske undersøkelser. OECD 453/GLP/QA. Resultater: Det var høy spontan dødelighet hos hanner i høydosegruppen. Antall tilfeller økte kontinuerlig fra uke 32, og i uke 53 hadde 24 av 90 (27 %) dyr dødt sammenlignet med 3 av 90 (3 %) i kontrollgruppen. Dette medførte avlivning av denne gruppen i uke 61 på grunn av toksisitet som overskred den maksimale tolererbare dosen (MTD). Det var signifikant redusert overlevelse (38.33 %) hos hanner dosert med 250 mg/kg kv/dag sammenlignet med hanner i kontrollgruppen (71.67 %). Makro- og mikroskopiske undersøkelser avslørte forandringer i nyrenes morfologi og funksjon, som kan være årsaken til de nevnte dødsfallene. Hunner i høydosegruppen etter 24 måneders eksponering hadde en liten men ikke signifikant redusering (58.33 %) i overlevelse sammenlignet med hunner i kontroll (71.67 %). Økt forekomst av lut holdning og strittende pels hos hanner i dosegruppene 250 mg/kg kv/dag, hvilket var det eneste kliniske tegnet som ble observert. Ingen skader eller forandringer i øyet. Det var registrert en antydning til redusert kroppsvektsutvikling hos begge kjønn dosert med 250 og 500 mg/kg kv/dag. Denne nedgangen kom til syne i andre halvdel av det første året og fortsatte gjennom hele behandlingsperioden. Økt vanninntak gjennom hele behandlingsperioden på 24 måneder (60 uker for hanner dosert med 500 mg/kg kv/dag) for begge kjønn eksponert for 250 mg/kg kv/dag. Det økte vanninntaket ble forbundet med økt urinvolum i dyr dosert med >100 mg/kg kv/dag. Noe ketonuri ble observert i begge kjønn dosert med 250 mg/kg kv/dag gjennom hele behandlingsperioden samt lavere urin ph-verdi. Større andel av epitelceller ble sett i urinsediment hos 500 mg/kg kv/dag hunner det første året og i uke 53. Dette tyder på stoffrelaterte skader av urinsveissystemet og nyrene. Flere tilfeller av signifikant lavere fôrinntak ble tidvis observert hovedsakelig hos hanner dosert med 250 mg/kg kv/dag. Imidlertid viste det kalkulerte fôrinntaket i periodene fra uke 1-12, 1-54 og ingen relevante forskjeller da de ble sammenlignet med kontrollverdiene. Histopatologiske undersøkelser utført etter avsluttet behandling viste kronisk progressiv nefropati i dyr dosert med 250 mg/kg kv/dag, tubulær atrofi i nyrene(hunner dosert med 250 mg/kg kv/dag) og utvidelse av tubuli (begge kjønn dosert med 100 mg/kg kv/dag). Alvorlighetsgraden og forekomsten av kronisk progressiv nefropati (CPN) i nyrene ble tydelig forsterket med økende doser av pinoksaden. Det var en sammenheng mellom osteo-renal syndrom og dyr med alvorlig nyreskade. Dette ble betraktet å være et resultat av sekundær hyperparathyroidism, som involverer hyperplasi i biskjoldbruskkjertel, fibrøs osteodystrofi (500 mg/kg kv/dag hunner og 250 mg/kg kv/dag hanner), metastatisk mineralisering (500 mg/kg kv/dag hunner, begge kjønn 250 mg/kg kv/dag) hvor tilstanden i de sistnevnte påvirket aorta, hjerte, nyrer, lunger og mage. Ytterligere funn som sannsynligvis er assosiert med nyreskade er redusert mineralisering i nyrebekkenet hos dyr dosert med 100 mg/kg kv/dag, utvidelse av nyrebekkenet hos hunner dosert med 500 mg/kg kv/dag i tillegg til nedgang i overgangsepitel hyperplasi i nyrebekkenet hos hunner etter eksponering for 100 mg/kg kv/dag. The clear cells i haleområdet av bitestikkel viste seg å ha en økt mineralisering etter 250 mg/kg kv/dag og redusert cytoplasmisk vakuoldannelse etter doser 100 mg/kg kv/dag. Det ble observert lavere hemoglobinkonsentrasjoner i 500 mg/kg kv/dag hanner og 250 mg/kg kv/dag hunner, og denne observasjonen ble forbundet med noe lavere antall reticulocytter i løpet av det første året. Høydosehunnene hadde et noe høyere antall blodplater. I hanner dosert med 250 mg/kg kv/dag ble det sett redusert hematokritt under det første behandlingsåret. Hunner i høydosegruppen og hanner dosert med 250 mg/kg kv/dag hadde et signifikant høyere plasmanivå av urea og kreatinin. Disse effektene ble observert bare på dosenivåer som viste signifikante histopatologiske forandringer i nyrene. Andre forandringer i klinisk kjemi verdier begrenset til hanner i høydosegruppen og hunner dosert med 250 mg/kg kv/dag, bestod av lavere plasma glukosekonsentrasjoner, høyere triglyseridnivåer, økt individuell plasma bilirubinnivåer og lavere albuminnivåer. Se side i Vedlegg T1. Det var en økt forekomst av

19 Side 5-10 svulster i lever og livmor, imidlertid var antallet lite og innenfor historiske kontrollverdier. En økning i tilfeller av leiomyosarcoma i magesekken ble observert hos hanner (se tabell under). Tumour incidencerats from studies of 24 to 26 months duration Tumours Males (mg/kg bw/day ) Females (mg/kg bw/day ) Stomach No 59 examined Leiomyosarcoma Liver No. examined Hepatocellular adenoma Uterus No. examined Endometrial adenocarcinoma Historical control data for selected neoplasms in Wistar rats from dietary studies of 24 to 26 months duration Organ/tissue/tumour data base number of sex total number of animals with lesions % range groups animals number % min. max. stomach: RCC STEIN 5 M leiomyosarcoma RENI 48 M < liver: hepatocellular RCC STEIN 5 F adenoma RENI 58 F uterus: endometrial RCC STEIN 5 F adenocarcinoma RENI 58 F Ved høye dosenivåer i dette forsøket var nyrene målorganet, som da involverte kronisk progressiv nefropati med assosierte effekter relatert til nyretoksisitet. Kronisk progressiv nefropati oppstår normalt i rotter med en høy alder, men denne effekten ble forsterket på en dose-relatert måte. I dette 24 måneder kombinert kronisk- og kreftforsøket, hvor pinoksaden ble tilført med sonde, overskred høydosen (500 mg/kg kv/dag) MTD i hanner. Den overdrevne høye dødeligheten var primært relatert til nyretoksisitet. Hunner dosert med 500 mg/kg kv/dag og hanner dosert med 250 mg/kg kv/dag oppnådde en akseptabel MTD, hvilket var henholdsvis basert på -23 % og -13 % redusert kroppsvektøkning sammenlignet med kontroll. Pinoksaden ble ikke funnet å være kreftfremkallende i rotte. Men den høye dødeligheten i høydosegruppen er kritikkverdig, og gjør det vanskelig å tolke resultatene i dette forsøket. NOAEL: 10 mg/kg kv/dag basert på histopatologiske forandringer i nyrene etter eksponering for 100 mg/kg kv/dag og assosierte forandringer i vanninntak og i urinvolum (Bachmann, 2003). Mus, 18 mnd Hovedforsøk I: Kreftforsøk. 70 albinomus (Crl:CD-1(ICR) BR) /kjønn/gruppe ble dosert med 0, 5, 40, 300 eller 750 mg pinoksaden/kg kv/dag. Stoffet ble løst i 0,5 % CMC I vann/0,1 % Tween 80 og ble tilført med sonde. OECD 451/GLP/QA. Avvik: overlevelse i gruppene eksponert for 300 og 40 mg/kg pinoksaden var henholdsvis 47 %, sammenlignet med 83 % i kontrollgruppen. Overlevelsesraten ble regnet som stor nok til å vurdere den karsinogene effekten av pinoksaden. Blodutstryk ble tatt fra alle overlevende dyr etter ett år, og hematologiske undersøkelser ble utført på alle dyr som overlevde til forsøksslutt (18 mnd). Matinntak ble ikke registrert i uke -1. Resultater: Det var en doserelatert økning i dødelighet 40 mg/kg kv/dag(se tabell

20 Side 5-11 under). Der det var mulig å fastslå dødsårsaken, var effekter på lungene dominerende. Funn relatert til dødelighet inkluderte dannelse av hinneaktig eller granulært svakt basiske materiale i lungene, interstitial pneumonia, lungeødem, bronkio-alveolære karsionomer og skummende utskillelse fra bronkiene. Flere dødsfall, spesielt i de to høyeste dosegruppene, ble registrert som accidental (se tabell under). Dette var dyr som døde innen en time etter dosering. Etter 18 mnd var gjennomsnittlig kroppsvekt redusert med 11 % for hanner i høydosegruppen og 20 % og 7 % for hunner i dosert med henholdsvis 750 og 300 mg/kg kv/dag. Økningen i kroppsvekt mellom uke 1 og uke 78 var redusert med 51 % i hanner eksponert for 750 mg/kg kv/dag og 84 % og 38 % for hunner i dosert med henholdsvis 750 og 300 mg/kg/dag. Det var ingen behandlingsrelaterte effekter på fôrinntak, men fôrutnyttelsen var lavere i høydosegruppen i begge kjønn. Vanninntaket i høydosegruppene var høyere gjennom hele forsøksperioden. Effekter ble observert på levervekt ved de to høyeste dosene og relativ nyrevekt i hunner ved den høyeste dosen (se tabell under). Kliniske og hematologiske effekter er oppsummert i tabell under. Undersøkelser av øyet ble ikke gjennomført, heller ikke analyse av urin eller kjemiske blodparametre. Patologiske undersøkelser viste økning i skummende sekresjon fra bronkiene hos dyr som døde eller ble avlivet før forsøksslutt, og i noen dyr kollapset ikke lungene når brystkassen ble åpnet. Det var og en økning i tilfeller av fortykket tynntarm ved de to høyeste dosene (se tabell under). Parameter observert Doser (mg/kg kv/day) Hanner Hunner Dødsfall totalt (antall) accidental lungerelaterte Kliniske Toniske skjelvinger ** observasjoner Strittende hår (antall dyr) Lut holdning Kroppsvekt økning uke 1-78 (%) ** * 27** 7.4** Hematologi Platetelling ** 2196** * 1684 Organvekt Lever, absolutt (g) ** ** Lever, relativ (%) * 71** ** 70** Nyre, absolutt (g) ** Nyre, relativ (%) ** Lunger, sekresjon Lunger, ingen kollaps Makroskopiske funn (antall dyr) Tynntarm fortykket Histopatologiske effekter på lungene inkluderte dannelse av hinneaktig eller granulært svakt basiske materiale i lungene, rapportert som alveolar/bronchiolar hyalinose. Denne effekten ble i hovedsak observert i dyr som døde underveis i studiet, og ble regnet som en av hovedfaktorene til at dyrene døde. I dyr som overlevde til forsøksslutt ble det gjort flere funn av kantete basiske formasjoner (krystallinske strukturer) og intraalveolære makrofager. Funnene av makrofager var ikke doserelatert, og verdiene for både kontroll- og eksponertgruppene lå langt over historiske kontrollverdier fra diettforsøk (6-7 %). (se tabell under). Flere inflammatoriske forandringer i den nasale kaviteten ble observert, og ble assosiert med skader på lungene. I lever var det en økning av glykogendeposisjon ved de to høyeste dosene i begge kjønn. Ved de samme konsentrasjonene ble det observert økt forekomst av fortykninger av epitelet i tynntarmen i begge kjønn, og bitestiklene i menn hadde redusert forekomst av vakuolisering av cytoplasma. En dose-relatert økning i blodstuvning ble sett i binyrene (hanner), nesehulen (hunner), nyrer, lever og lunge (begge kjønn), og dette kan ha bidratt til dødsfallene observert i forsøket. Finding Incidence of alveolar / bronchiolar hyalinosis and intra-alveolar macrophages (phagocytic cells) Males (mg/kg bw/day ) Females (mg/kg bw/day ) OVERALL INCIDENCE (PREMATURE DECEDENTS +TERMINAL SACRIFICE)

21 Side 5-12 Hyalinosis Phagocytic cells a Total affected 25/70 37/70 24/70 20/70 26/70 27/70 28/70 30/70 21/70 31/70 % Incidence 36% 53% 34% 29% 37% 39% 40% 43% 30% 44% a without simultaneous hyalinosis (To avoid counting animals twice, mice with concurrent phagocytic cells and hyalinosis were not added to the phagocytic cell totals. Low numbers of animals had these findings concurrently in any particular dose group (Males: none; Females: 1, 1, 3, 3, 2). I hanner var det en signifikant økning i lungeadenom ved 750 mg/kg kv/dag, og for karsinom ved 750, 300 og 40 mg/kg kv/dag. Funnene lå nær inntil eller noe over maksimalverdiene for historiske kontrollverdier. Funnene kan skyldes direkte kontakt med pinoksaden i lungene, men er mer sannsynlig en sekundær effekt av andre forandringer og skader på lungene. Tumour type Incidence of primary bronchiolo-alveolar tumours Males (mg/kg bw/day ) Females (mg/kg bw/day ) Lungs examined Adenomas Carcinomas * 9 * Combined * All statistical analyses were conducted with correction for survival: = Statistically significant positive trend (2p< 0.05, Peto test) *= Statistically significant pairwise comparison to control (2p< 0.05, Peto test) NOAEL: 40 mg/kg kv/dag ble NOAEL satt til 5 mg/kg kv/dag i begge kjønn basert på økt dødelighet. NOAEL for neoplastiske funn i lungene var 5 mg/kg kv/dag. (Gerspach, 2003) Spesielle forsøk 1 Spesielle forsøk 2 Mus, 18 mnd Et utvidet studie ble gjennomført for å undersøke effekter av direkte administrering av pinoksaden eller løsningsmiddelet alene på muselunger. Lunger fra nylig avlivede hannrotter ble eksponert i 1 eller 10 minutter til teststoffet. Makroskopiske funn ble kun gjort i lunger eksponert for pinoksaden. Disse var bleke, og var vanskelige å infusere med formol salin. Pinoksadenløsningen var også fysisk vanskelig å føre inn i lungene. Tilsvarende mikroskopiske funn ble gjort i lunger eksponert for pinoksaden og til løsningsmiddel alene, og inkluderte redusert eosinofil farging av alveolene og lysering av intravaskulære røde blodceller. Forandringene var kvalitativt like de observert i 18 mnd studiet, men mindre alvorlige (Lees, 2004). Et tredje studie ble utført for å undersøke hypotesen om at direkte eksponering av lungene til teststoffet førte til de observerte histopatologiske effektene i 18 mnd studiet. Kun løsningsmiddelet ble testet. Stoff ble dosert i mage (normal dosering), lavt i spiserøret og høyt i spiserøret. En enkel dosering, dyr avlivet etter 0,5, 24 eller 72 timer. Histopatologiske undersøkelser viste at administrering høyt i spiserøret førte til introduksjon av stoffet direkte i lungene. I kontrolldyr eller dyr dosert lavt i spiserør eller mage ble det observert svake blødninger i 2 av 20 dyr. Flere forandringer ble registrert i dyr dosert høyt i spiserøret, inkludert blødninger, fokal betennelse, betennelse i spiserøret, lungehinnebetennelse og mindre hyalinforandringer (7 av 21 dyr, hvorav 2 hadde mer enn en skade). De mest alvorlige effektene ble observert i dyr som døde før forsøksslutt (Oppeneer og Jarvi, 2004). Et nytt 18 måneders karsinogenitetsstudie i mus der dyrene ble eksponert gjennom dietten ble utført. 70 albinomus (Crl:CD-1(ICR) BR)/kjønn/dose Ble eksponert for dosenivåer på 0, 150, 500, 1500 og 4000 ppm, tilsvarende mottatt dose var 0, 16,3, 60,7, 181,2, 573,7 mg/kg kv/dag i hanner og 0, 20,2, 75,7, 216,5 og 706,4 mg/kg kv/dag i hunner. OECD 451/GLP/QA. Avvik: dyr i høydosegruppen ble avlivet i uke 40. Hematologiundersøkelser ble utført på alle dyr ved forsøksslutt, og blodutstryk ble tatt fra alle overlevende dyr etter ett år.

22 Side 5-13 Resultater: Det var ingen statistisk signifikante endringer i dødelighet, resultater er vist i tabell. Kliniske observasjoner var enten uspesifikke eller typiske for dyr i den aktuelle aldersgruppa (grå hår, skadet hale og lignende) eller de ble registrert hos dyr som senere døde eller ble avlivet. I høydosegruppen var gjennomsnittlig vekt signifikant lavere etter 2 uker i hunner og 3 uker i hanner. Etter 39 uker var kroppsvekten 13 % lavere enn kontroll i hunner og 14 % i hanner, tilsvarende reduksjon i kroppsvektøkning gjennom forsøksperioden var henholdsvis 33 og 31 %. Gruppen ble terminert i uke 40. Eksponering for 1500 ppm pinoksaden førte til en signifikant reduksjon i kroppsvekt fra uke i uke 81 var nedgangen rundt 9 % i begge kjønn, tilsvarende reduksjon i vektøkning var 19 %. Eksponering for 500 ppm førte til en reduksjon i kroppsvekt på 5 % hos hunner fra og med uke 35. Reduksjonen i vektøkning var på rundt 9 %, effekten var statistisk signifikant på enkelte tidspunkt. Det ble ikke observert noen effekter hos hanner i samme dosegruppe, og ikke i noe kjønn i lavdosegruppen. Fôrinntaket var høyere i høydosegruppen mellom uke og i hanner og uke 11 i hunner. Ved 1500 ppm var det en reduksjon i fôrinntak i enkelte uker i begge kjønn. Ved 500 ppm var det en økning i fôrinntak i begge kjønn i enkelte uker fram til uke 13, mens det mot slutten av studiet var en reduksjon på enkelte tidspunkt hos hunner. I lavdosegruppen var inntaket lavere enn kontroll ved flere tidspunkt i begge kjønn. Fôrutnyttelsen var dårligere ved eksponering for 4000 ppm i begge kjønn og ved eksponering for 1500 ppm i hanner. Hjertevekt var lavere ved 1500 ppm i begge kjønn. Ved 500 ppm var hjertevekten lavere i hunner. Forskjellene var små og doseresponsen var liten i hunner. Livmor- og livmorhalsvekt var lavere ved 1500 og 500 ppm. Milten veide signifikant mindre i hanner ved 150 og 1500 ppm. Etter ekskludering av to kontrollhanner med spesielt tung milt var ikke effekten lenger signifikant. Relativt miltvekt var lavere i hunner ved 1500 ppm, også her hadde effekten sammenheng med høy vekt i enkelte kontrolldyr (3 stk). Det ble ikke sett signifikant effekt på absolutt miltvekt i hunner, og alle verdier var innenfor historiske kontrollverdier. Generelt er det stor individuell variasjon i miltvekt i denne musearten. Signifikante endringer i hjerne- og binyrevekt ble observert i intermediære dosegrupper. Histopatologiske undersøkelser viste reduksjon av cellulære endringer i den kortikale delen av binyrene i de to høyeste dosegruppene (begge kjønn). Antall tilfeller av nyrebekkenbetennelse/betennelse i øvre del av urinrør var redusert i menn i høydosegruppen. Tubulær basofili var redusert i de to høyeste dosegruppene (hanner). Det var ingen signifikante forskjeller i antall svulster, verken samlet eller ved inndeling i ulike typer. Et lite antall ble observert i alle grupper inkludert kontroll (se tabell under). Finding Incidence of lung tumours overall incidence (premature decedents +terminal sacrifice) Males (mg/kg bw/day ) Females (mg/kg bw/day ) Examined Adenoma (benign) adenocarcinoma NOAEL: 500 ppm (60,7 mg/kg kv/dag) i hanner og 150 ppm (20,2 mg/kg kv/dag) i hunner. Basert på effekter på kroppsvekt i hanner og hunner ved henholdsvis 1500 og 500 ppm. Den høyeste dosegruppen ble avlivet tidlig, mens den nest høyeste dosen ikke gav klare toksiske effekter. Pinoksaden er tidligere vist å være ustabilt i fôr. Forsøket ble derfor ansett som kun supplerende (Pinto, 2005). Sammendrag subkronisk og kronisk toksisitet og kreft: I subkroniske forsøk i rotte er kritiske effekter tydelige histopatologiske skader i nyrene i tillegg til økt levervekt ved høye dosenivåer. Nyre og lever ble begge ansett som målorgan. I subkroniske forsøk med hund er kritiske effekter histopatologiske endringer i lever og endringer i klinisk-kjemiske parametre. Dette indikerer at lever er målorgan i hund. Ulikt målorgan i hund og rotte kan tyde på ulik metabolisme av pinoksaden. I kroniske forsøk i rotte fører stoffet til økt dødelighet, redusert kroppsvekt og histopatologiske forandringer i nyrene. Målorganet er nyrene, hvilket baseres på histopatologiske forandringer relatert til utvidelse av tubuli og kronisk progressiv nefropati, samt assosiert med forandringer i vanninntak og urinvolum.

23 Side 5-14 I 18 måneders studie i mus var redusert kroppsvekt og økt dødelighet kritiske effekter. I forsøket der pinoksaden ble tilført med sonde var lunger hovedmålorgan. Dette hadde mest sannsynlig sammenheng med direkte sprøyting av teststoffet i lungene grunnet eksponeringsfeil. Diettforsøket i mus kan ikke brukes til å fastsette NOAEL, da den høyeste dosegruppen ble avlivet tidlig, mens den nest høyeste dosen ikke gav klare toksiske effekter. I tillegg viser tidligere forsøk at pinoksaden er ustabilt i fôr. NOAEL-verdier: De orale NOAEL verdiene lå på 25 mg/kg kv/dag for hunder, og på 100 mg/kg kv/dag for rotter i subkroniske forsøk. Hund ser ut til å være mer følsom enn rotte basert på subkroniske forsøk. I kroniske forsøk var NOAEL 10 mg/kg kv/dag for rotte. Kreft: Det var en økning i antall tilfeller av leiomyosarcoma magesekken hos hannrotter. Dette er en sjelden krefttype, og det er usikkert om denne økningen er relatert til behandlingen med pinoksaden. Det var en økning i bronkioalveolære svulster i mus 40 mg/kg kv/dag i forsøket der pinoksaden ble tilført med sonde. Funnene kan skyldes direkte kontakt med pinoksaden, men er mer sannsynlig en sekundær effekt av andre forandringer og skader på lungene Reproduksjonstoksisitet Rotte, 2- generasjonsforsøk Mottatt dose var 0, 10, 50, 250 og 500 mg/kg kv/dag over to generasjoner. Tilført daglig med sonde (fortynnet i 0.5% CMC og 0.1% Tween 80) til 30 Wistar rotter (Hanlbm:WIST)/kjønn/dose. OECD guideline 416/GLP (Eventuelt avvik: hunnene ble plassert sammen med en hann inntil graviditeten inntraff eller etter 14 dager hadde gått)/qa. Resultater: Høydosehanner i F0 foreldre generasjonen hadde en nedsatt kroppsvektøkning, og den samlede vektøkningen var redusert med 8 % (ikke statistisk signifikant). Det eneste behandlingsrelaterte kliniske tegnet observert var spyttavsonding sett før parring (begge kjønn) og etter parring (hanner)i dyr dosert med 250 mg/kg kv/dag. Histopatologiske observasjoner av nyrer påviste kronisk nefropati og tubulær atrofi (høydosegruppene av F0 og F1 foreldre), utvidelse av nyrebekken (F0 foreldre høydosehanner) i tillegg til en nedgang i kortikomedulær mineralisering i hunner (500 mg/kg kv/dag F0 og 250 mg/kg kv/dag F1 foreldre). Økning i glykogenlagring i lever hos hunner dosert med 250 mg/kg kv/dag (F0 og F1 foreldre). Det var nedsatt hemosiderose i milten i høydosegruppen (F0 og F1). Begge foreldre (F0 og F1) generasjonene hadde en signifikant økning i vanninntak ved alle målingsintervallene (begge kjønn, 500 mg/kg kv/dag) (se tabell under). I F0 foreldre hanner dosert med 250 mg/kg kv/dag hadde et økt vanninntak, og det samme hadde F1 foreldre generasjonen (begge kjønn). Det var ingen tegn til relaterte histopatologiske forandringer i nyrene etter eksponering for 250 mg/kg kv/dag pinoksaden. Water consumption for rats treated with pinoxaden (NOA ). Parameter Males (mg/kg bw/day ) Females (mg/kg bw/day ) Water consumption (g/rat/day) Week (F0 generation) ** * 23 26* ** ** ** ** ** 31** * 35** ** Week (F1 generation) * ** * 25** * 41** ** 29** ** * **

24 *= p<0.05, ** = p<0.01 Side * 40** * 46** Det var en signifikant økning i absolutt og relativ lever- og nyrevekt i begge generasjoner (500 mg/kg kv/dag F0 og F1) (se tabell under). Begge kjønn (250 mg/kg kv/dag) hadde en signifikant økning i absolutt og relativ levervekt, hvor økningen er antatt å være skadelig (>110 % av kontroll) i hunner (F0 og F1). Etter dosering med 10 og 50 mg/kg kv/dag den eneste skadelige effekten som ble funnet var en økning i absolutt og relativ levervekt i F1 hunner (henholdsvis 120 og 110 % av kontroll). Selected organ weight data for rats treated with pinoxaden (NOA ). Parameter (F0 generation) Males (mg/kg bw/day) Females (mg/kg bw/day) Liver Absolute (g) ** 16.89** ** 12.64** 13.28** Relative (%) ** 40.4** * 45.6** 49.0** Kidneys Absolute (g) ** 2.989** * Relative (%) ** 7.19** * Spleen Absolute (g) * * 0.640* Relative (%) * ** * Heart Absolute (g) Relative (%) ** Ovaries Absolute (g) * Relative (%) * Pituitary Absolute (g) Relative (%) * Parameter (F1 generation) Males (mg/kg bw/day ) Females (mg/kg bw/day ) Liver Absolute (g) * ** * **12.407** ** Relative (%) ** 40.0** ** 45.4** 49.3** Kidneys Absolute (g) ** 2.777** 2.762** * 2.087** Relative (%) * 6.30** 6.61** Brain Absolute (g) * Relative (%) Spleen Absolute (g) ** * Relative (%) * Heart Absolute (g) ** 1.015** 1.014** Relative (%) ** Thyroid and Absolute (g) ** 0.029** 0.030** Parathyroids Relative (%) * 0.12** *= p<0.05, ** = p<0.01 Parameter (F1 pups) Males (mg/kg bw/day ) Females (mg/kg bw/day ) Liver Absolute (g) * 2.312** * 2.269* Relative (%) * 46.1 Kidneys Absolute (g) Relative (%) * Brain Absolute (g) ** * Relative (%) ** * Spleen Absolute (g) * Relative (%) Thymus Absolute (g) Relative (%) * 4.35 *= p<0.05, ** = p<0.01 Mean pup weights (g) - F1 pups.

25 Side 5-16 Lactation day F1 Litters (mg/kg bw/day) Males Females a * 4b * ** ** ** ** ** ** Lactation day combined (mg/kg bw/day) a b ** ** ** a Before standardization (culling) b After standardization (culling) *= p<0.05, ** = p<0.01 Mean pup weights (g)- F2 pups Lactation day F2 Litters (mg/kg bw/day) Males Females a b * * Lactation day combined (mg/kg bw/day) a b * * a Before standardization (culling) b After standardization (culling) *= p<0.05, ** = p<0.01 Ingen behandlingsrelaterte mikroskopiske forandringer ble observert etter histopatologisk undersøkelse av de reproduktive organene i F0 og F1 foreldre generasjonen. Høydoseungene av F1 og F2 generasjonene hadde en nedgang i kroppsvekt under diing (se tabell over). Det ble sett forandringer i absolutt og relativ hjerne, lever og nyrevekt i F1 og F2 avkom. Høydosegruppen av F1 avkom hadde en nedgang i absolutt hjerne- og levervekt (begge kjønn), og i tillegg hadde denne hannene i denne dosegruppen en økt relativ nyrevekt og begge kjønn hadde en økt relativ hjernevekt. Begge kjønn (avkom) dosert med 250 mg/kg kv/dag hadde en redusert absolutt levervekt. Hunner dosert med 250 mg/kg kv/dag hadde en nedgang i relativ levervekt, i tillegg til en økning i den relative vekten av thymus. F2 høydoseavkom (hanner) hadde en signifikant reduksjon i absolutt levervekt, samtidig med en signifikant økning i relativ nyre- og hjernevekt. Både F1 og F2 avkom hadde noe nedgang i glykogenavsettelse i lever hos hanner. Det tyder på at dette funnet ikke er forbundet med en spesifikk målorganeffekt, men i stedet er assosiert med den behandlingsrelaterte effekten pinoksaden hadde på kroppsvekt (se tabell over).

26 Side 5-17 NOAEL(foreldre): <10 mg/kg kv/dag basert på økt levervekt (ca 120 % av kontrollvekt) i F1 hunner. NOAEL(avkom): 250 mg/kg kv/dag basert på redusering i kroppsvektsøkning i F1 og F2 avkom under dieperioden. NOAEL(reproduktiv): 500 mg/kg kv/dag (høyeste dose). Ingen effekter observert. (Khalil, 2003). Rotte Oral Teratogenese Dosenivåer på 0, 3, 30, 300 eller 800 mg/kg kv/dag ble gitt fra dag 6 til 20 av drektigheten. Tilført med sonde (fortynnet i 0.5% CMC og 0.1% Tween 80) til 24 albino Wistarrotter (Hanlbm:WIST (SPF))/dose. OECD guideline 414/GLP/QA. Resultater: En av høydosemødrene ble avlivet på dag 17 på grunn av respiratoriske lyder, kortpusthet, lut holdning, redusert aktivitet og strittende pels. Post mortum eksaminering av denne hunnen avslørte mottled lunger. Strittende hår ble sett i 2-7 dager hos de fleste dyrene dosert med 800 mg/kg kv/dag. Respiratoriske lyder ble observert i en dag i to dyr dosert med 300 mg/kg kv/dag. Fra dag 6 i svangerskapet var kroppsvektøkningen signifikant redusert for høydosedyrene (mellom dag 6 og dag 20 var forskjellen 67 %). Dyr dosert med 300 mg/kg kv/dag fikk også en reduksjon i kroppsvektøkningen fra dag 11 i svangerskapet (88 % av kontroll mellom dag 6-20). Fôrinntak var signifikant redusert gjennom hele behandlingsperioden for dyr dosert med 300 mg/kg kv/dag. Gravid uterus-, kadavervekt og netto vektforandring fra dag 6 post coitum ble signifikant redusert i høydosemødre. Ved avlivning på dag 21 av svangerskapet var det 22, 20, 21, 23 og 17 gravide hunner med levende fostre i henholdsvis gruppe 1-5. Fostre som hadde blitt eksponert for 800 mg/kg kv/dag hadde en signifikant lavere kroppsvekt. Det ble observert bare ett tilfelle av ytre misdannelser etter dosering med 30 mg/kg kv/dag pinoksaden, hvilket var et runt foster med blek kropp. I høydosegruppen hadde to fostre en forkortelse av halsvenen og i leveren til tre fostre ble det observert ekstra leverlapper. Prosentandelen av fostre per kull som ble påvirket av disse små variasjonene (henholdsvis 2.16 % og 3.33 %) var statistisk signifikant sammenlignet med de aktuelle/parallelle/tilhørende kontrollene ( 0 tilfeller). Disse verdiene var akkurat utenfor historisk kontrollrekkevidden (henholdsvis 0-0,9 og 0-2,2 %). Et avvik i hjertes morfologi oppstod i ett foster, men denne uregelmessigheten ble betraktet å være lik det historisk kontrollfunnet forstørret ventrikulært kammer som var blitt observert i % av kullene. Utvidelse av nyrebekkenet i tre fostre, hvor ett av disse fostrene hadde utvidet urinleder. Thymic remnants i nakken ble observert i fostre dosert med 30 og 300 mg/kg kv/dag (innenfor historisk kontrollverdi), men ikke i høydosegruppen. Fostre eksponert for 30 mg/kg kv/dag hadde ekstra leverlapper i leveren, og i ett foster dosert med 3 mg/kg kv/dag ble det bekreftet en utvidelse av nyrebekkenet. Misdannelser av indre organer hos fostre i høydosegruppen var statistisk signifikante, men tilfellene i alle gruppene fulgte ikke et tydelig dose-respons mønster (henholdsvis 0, 1, 3, 1 og 7 i 0, 3, 30, 300 og 800 mg/kg kv/dag). Det oppstod skjelettvariasjoner i nesten alle fostre i alle dosegrupper inkludert kontrollen (se tabell 6.65 i vedlegg T1 side 212). NOAEL(mødre og avkom): 30 mg/kg kv/dag, basert på redusert kroppsvekt (mødre) (se side 209 i vedlegg T1) og skjelettabnormalier (avkom) (se tabell 6.65 i vedlegg T1 side 212) i 300 mg/kg kv/dag (Khalil, 2003). Pinoksaden ble ikke forbundet med alvorlige misdannelser eller andre avvik/uregelmessigheter i fostre. Et økt antall tilfeller av et begrenset antall av mindre skjelettvariasjoner ble oppdaget i høydosegruppen. De samme variasjonene ble observert i 300 mg/kg kv/dag gruppen, men da i mindre grad. Kanin 1 Dosenivåer på 0, 3, 10, 30 aller 100 mg/kg kv/dag ble gitt fra dag 7 til 28 av drektigheten. Dosene ble bestemt ut i fra et tidligere dosebestemmende studie der doser på mg/kg kv/dag ble testet. Doser 150 mg/kg kv/dag førte overskridelse av maksimal tolererbar dose. Reduksjon i vekt og vektøkning ble observert 30 mg/kg kv/dag (Altmann 2003a). Tilført med sonde til 24 kaniner (Russiske kaniner, Chbb:HM) /gruppe. OECD guideline 414/GLP/QA. Resultater mortoksisitet: På dag 20 etter befruktning ble en hunn dosert med 10 mg/kg kv/dag avlivet på grunn av dårlig helsetilstand. Observerte kliniske effekter var redusert aktivitet og blodig utskillelse fra vagina, og obduksjonen viste flytende innhold i mage og brysthule og

27 Side 5-18 rødlig lunge. Gjennomsnittlig kroppsvekt i høydosegruppa var redusert fra dag 7, effekten var signifikant på enkelte tidspunkter. Vektøkningen i den samme gruppen var redusert med 68 % i løpet av forsøksperioden. Det var ingen effekt på livmorvekt. Matinntaket var signifikant redusert gjennom hele forsøket i høydosegruppa og på dag i gruppene eksponert for 10 eller 30 mg/kg kv/dag. Resultater utviklingstoksikologi: Ved forsøksslutt (dag 29 av graviditeten) var det 22, 23, 20, 21, og 20 kaniner med levedyktige fostre ved forsøksslutt etter dosering med henholdsvis 0, 3, 10, 30 eller 100 mg pinoksaden/kg kv/dag. Det var ingen behandlingsrelaterte effekter på kullstørrelse, pre- eller postimplantasjonstap eller resorpsjoner. Gjennomsnittlig fostervekt var signifikant redusert i høydosegruppen (begge kjønn) Ett dødt foster ble observert etter dosering til 10 og 100 mg/kg kv/dag, begge var uten synlige ytre skader. Et foster i kontrollgruppen hadde exencephaly og et i lavdosegruppen var småvokst. Ett foster ved 30 mg/kg kv/dag hadde blek kropp. Avvikende posisjon på forlabben ble observert i alle dosegrupper med unntak av høydosen, flest tilfeller ble observert i lavdosegruppen (3 fostre, mot 1 i de andre dosegruppene). Avvikende posisjon på baklabb og bakbein ble observert i lavdosegruppen (1 foster). Brokk i mellomgulvet ble observert i to fostre i gruppen dosert med 100 mg/kg kv/dag (en av hvert kjønn) og i ett foster dosert med 30 mg/kg kv/dag (hunn). I tillegg hadde et foster fra høydosegruppen rift i mellomgulvet (hann). Alle hunnene som fikk fostre med skader i mellomgulvet var inseminert med sæd fra samme hann. Slektskapet mellom forsøksdyrene var ukjent. Historiske kontroller viser at det har oppstått 5 tilfeller av brokk i mellomgulvet i løpet av 27 studier i samme kaninart gjennomført mellom år 1989 og Andre funn inkluderte mikrocefali og fravær av galleblære ved 3 mg/kg kv/dag og små galleblærer i alle grupper (2, 2, 3, 2 og 2 fostre ved henholdsvis 0, 3, 10, 30, og 100 mg/kg kv/dag). Misdannelser av skjelett ble observert i ett foster fra kontrollgruppen og i ett foster fra hver av gruppene dosert med 30 og 100 mg/kg kv/dag, og inkluderte delvis fravær av pannebein (kontroll, 30 og 100 mg/kg kv/dag), mellomisseben (30 mg/kg kv/dag), issebein (kontroll) eller bakhodebein (30 mg/kg kv/dag). Mindre avvik på skjelett/brusk ble observert i 6, 11, 4, 10 og 10 kull (7, 15, 5, 13, 15 fostre) etter dosering med henholdsvis 0, 3, 10, 30 eller 100 mg pinoksaden/kg kv/dag. I høydosegruppen var asymmetriske/sammenvokst skjelett dominerende. Andre observasjoner inkluderte manglende forbeining av kragebein og økt/redusert antall ribbein og sammengrodde ribbein. (se tabell under)

28 Side 5-19 NOAEL (mødre) 30 mg/kg kv/dag basert på effekter på kroppsvakt og matinntak ved 100 mg/kg kv/dag. NOAEL (avkom) 10 mg/kg kv/dag basert på misdannelser av diafragma ved 30 og 100 mg/kg kv/dag (Altmann, 2003b). Spesielle forsøk 1 Foregående forsøk viste skade på mellomgulvet(brokk, rift) i tre fostre fra 3 forskjellige kull ved 100 mg/kg kv/dag og ett foster fra gruppen dosert med 30 mg/kg kv/dag. Alle kullene var inseminert med sæd fra samme donorhann. Den aktuelle hannen gav sæd til hunner i alle dosegrupper inkludert kontroll, og var en av totalt 9 hanner benyttet i forsøket. Hensikten med dette studiet var å undersøke eventuell genetiske innflytelse på skadene ved å teste om effektene var reproduserbare når samme donorhann ble benyttet i et nytt forsøk. To grupper ble inkludert (24 dyr/dose), kontroll og 100 mg pinoksaden/kg kv/dag. Hunnene ble levert fra samme oppdretter som hannen, men ett år etter. Det var derfor ikke nært slektskap mellom hannen og noen av hunnene. Ikke standardforsøk men fulgte hovedtrekk i OECD 414/GLP/QA. Eksponering av 100 mg/kg kv/dag førte til maternell toksisitet med effekt på kroppsvekt og ett tilfelle av abort. I tillegg var det to døde og ett misdannet foster. Antall gravide dyr i kontroll- og eksponertgruppen var henholdsvis 20 og 19 (dag 29), og antall levedyktige

29 Side 5-20 kull henholdsvis 19 og 17. Ett tilfelle av resorpsjon ble observert både i eksponert og kontrollgruppen. Spina bifida ble observert i ett foster i eksponertgruppen. Tilsvarende effekt er ikke observert i andre studier med pinoksaden, og oppstår spontant i 0,02 % av fostre i kaninstammen. Det ble ikke gjort noen funn av skader på mellomgulvet. Undersøkelse av skjelett ble ikke utført. (Altmann, 2003c). Spesielle forsøk 2 Hensikten med dette studiet var å videre undersøke om skadene på mellomgulvet observert i det første studiet kunne ha sammenheng med genetiske faktorer. De samme donorhannene som i det første forsøket ble brukt, med unntak av hannen som fikk avkom med mellomgulvskader. To grupper ble inkludert (24 dyr/dose), kontroll og 100 mg pinoksaden/kg kv/dag. Ikke standardforsøk men fulgte hovedtrekk i OECD 414/GLP/QA. Eksponering for 100 mg/kg kv/dag førte til maternell toksisitet med effekt på kroppsvekt, fôrinntak og to tilfeller av abort. En kanin ble funnet død på dag 23, obduksjonen viste flekket lunge og gass/flytende innhold i mage, brysthule og tarm. Ett dyr ble avlivet på dag 15 med skader på halsvirvelen, bøyd hode og redusert aktivitet og ett dyr ble avlivet på dag 27 atter spontanabort. Antall gravide dyr i kontroll- og eksponertgruppen var henholdsvis 19 og 14 (dag 29), og antall levedyktige kull henholdsvis 19 og 11. Det lave antallet i eksponertgruppen skyldtes færre graviditeter, to dødsfall, to aborter, økt resorpsjon og postimplantasjonstap. De makroskopiske effektene ble antatt å ha oppstått etter at dyret døde. Det ble ikke gjort noen funn av skader på mellomgulvet. Undersøkelse av skjelett ble ikke utført. (Altmann, 2003d). Data fra keisersnitt. Observation Dose mg/kg bw/day Number of animals pregnant Number of viable litters Died/dosing accident 0 1 Total implant loss 0 3 (number of dams) Number aborted 0 1 Post implantation loss (% * per dam) Number of abortion 0 5 sites/dam Early resorption/dam Mean live litter size Sex ratio (% males per * litter) * p<0.05 Kanin 2 Studiet var en repetisjon av det første studiet (Altmann 2003b), med samme doser og samme kaninart. (OECD 414/GLP/QA). Mortoksisitet: En kanin i høydosegruppen ble avlivet på dag 26 på grunn av stort vekttap og redusert aktivitet. Ved obduksjon ble det funnet blødning i mage og blodig mageinnhold. To hunner i høydosegruppen ble avlivet på dag 27 etter tegn på abort. Signifikant nedgang i kroppsvekt ble observert mellom dag 7 og 12 i høydosegruppen (-56 gram ), og det var også svak nedgang i kroppsvekt i gruppen dosert med 30 mg/kg kv/dag (-5 gram). I de tre andre gruppene var det en vektøkning på gram i samme periode. Økning i kroppsvekt var signifikant redusert i høydosegruppen (se tabell under) Gjennomsnittlig fôrinntak var redusert i høydosegruppen, reduksjonen var signifikant mellom dag 7 og 12 med verdier på rundt 47 % av kontroll (ikke medregnet hunner med total resporpsjon). Utviklingstoksisitet:

30 Side 5-21 Ved forsøksslutt (dag 29 av graviditeten) var det 22, 23, 22, 21 og 13 kaniner med levedyktige fostre ved forsøksslutt etter dosering med henholdsvis 0, 3, 10, 30 eller 100 mg pinoksaden/kg kv/dag. Reduksjonen i høydosegruppen var forårsaken av dyret som ble avlivet, to aborter og 7 tilfeller av total resorpsjon (hovedsakelig tidlig i svangerskapet) (se tabeller under). Tre fostre fra samme kull i høydosegruppen var dødfødte. Ingen ytterligere funn ble gjort i høydosegruppen, men antall fostre var kraftig redusert sammenlignet med de andre dosegruppene (se tabell under). Ett avkom i gruppen dosert med 30 mg/kg kv/dag hadde en papula/knute på rygghuden (ca 0,5 cm), og to fostre fra forskjellige kull hadde vannhode. Historiske kontrolldata viser at tilsvarende misdannelse i gjennomsnitt forekommer i 0,1 % av fostre og 0,6 % av kull. Ett foster i kontrollgruppen hadde mangelfull utvikling av nyre og urinleder. Ett avkom i gruppen dosert med 30 mg/kg kv/dag hadde flere skjellettavvik og variasjoner, Tilsvarende effekter har oppstått sporadisk i historiske kontroller (se tabell s. 227 i T1). Generelle data. Doses (mg/kg bw/day) Observation Dams Mortality a Body weight gain (g) * Foetuses Number of litters Resorptions * Live foetuses 6,5 5,7 5,9 5,8 3,6 a Total malformations (litters) 1 (1) (2) 0 Total anomalies (litters) 4 (4) 4 (4) 7 (6) 9 (7) 3 (3) Total variations (litters) 97 (22) 83 (22) 89 (22) 85 (21) 49 (13) * p < 0.01 a Avlivet i løpet av forsøket grunnet vekttap (1) eller tegn til abort (2) Data fra keisersnitt, implantasjonstap, resorpsjoner, antall foster. Observation Dose level (mg/kg bw/day) Litters with total resorptions * Post implantation All pregnant dams ** loss (%): dams with total resorptions excluded number of early All pregnant dams ** resorptions/dam dams with total resorptions excluded Live foetuses per All pregnant dams ** dam dams with total resorptions excluded Dead foetuses per dam *= P<0.05, ** = p<0.01 NOAEL (mødre) 10 mg/kg kv/dag basert på reduksjon i kroppsvekt og redusert vektøkning ved 30 og 100 mg/kg kv/dag. NOAEL (avkom) 30 mg/kg kv/dag basert på økning i resorpsjoner og dødelighet ved 100 mg/kg kv/dag. (Khalil, 2003). Oppsummering kanin: NOAEL (mødre) 10 mg/kg kv/dag basert på redusert vektøkning ved 30 og 100 mg/kg kv/dag i hovedforsøk II, samt effekter på kroppsvekt ved høyere doser observert i det innledende dosebestemmende studiet (Khalil, 2003). NOAEL (avkom) 10 mg/kg kv/dag basert på misdannelser av diafragma ved 30 og 100 mg/kg kv/dag i hovedstudie I (Altmann, 2003b). Sammendrag (reproduksjonstoksisitet og teratogenese): Reproduksjonstoksisitet: Nyretoksisitet (økt organvekt, histopatologi (kronisk nefropati, tubulær atrofi, utvidelse av nyrebekken og kortikomedulær mineralisering, glykogenavsetning i lever og hemosiderose) og økt vanninntak) og signifikant/skadelig økning i levervekt ble observert etter behandling med pinoksaden. NOAEL (foreldre): 10 mg/kg kv/dag, siden det er observert økt levervekt ved denne dosen.

31 Side 5-22 Teratogenese: Pinoksaden medførte mortoksisitet i form av redusert kroppsvekt, fôrinntak og ulike kliniske tegn i rotter dosert med 800 og 300 mg/kg kv/dag. Høydosen gav samtidig fostertoksisitet som bestod av små utviklingsforsinkelser. Disse ble indikert av redusert fostervekt og noe ufullstendig i forbeining av fosterskjelettet. De marginale forandringene observert ved 300 mg/kg kv/dag ble begrenset til bare to skjelettvariasjoner. Tegn på fostertoksisitet ble bare sett ved tilstedeværelse av mortoksisitet. Pinoksaden medførte mortoksisitet i form av redusert vektøkning og vekttap i kaniner dosert med 30 og 100 mg/kg kv/dag. Fostertoksiske effekter inkluderte fosterdødelighet og resporpsjoner ved 100 mg/kg kv/dag og misdannelser av diafragma ved 30 og 100 mg/kg kv/dag. NOAEL (utviklingstoks) 10 mg/kg kv/dag i kanin (avkom). Basert på misdannelser, fosterdødelighet og resorpsjoner vurderes pinoksaden som mulig fosterskadelig (Innfrir kravene til merking med R63) Nevrotoksisitet Akutt oral, rotte Dosenivåer på 0, 100, 500 og 2000 mg/kg kroppsvekt. Tilført med sonde (0,5 % karboksymetylcellulose og 0,1 % Tween 80) til 10 rotter (Alpk:APfSD, Wistarderivert)/kjønn/gruppe. Dyrene ble observert i 14 dager. I tillegg til daglige observasjoner av kliniske symptomer, ble rottene observert i en rekke funksjonelle tester (FOB) og motorisk aktivitet på dag 1, 8 og 15. Kroppsvekt og fôrinntak ble målt ukentlig. Ved forsøkets slutt ble 5 dyr/kjønn/gruppe perfusert in situ. Hjernen, øyet, ryggmargen og ulike ganglier og nervefibre ble undersøkt med histopatologiske metoder. OECD guideline 424/GLP/QA) Resultater: Det ble ikke sett noen behandlingsrelaterte effekter på fôrinntak, kroppsvekt, funksjonelle tester, motorisk aktivitet eller vevsstruktur. NOEL: 2000> mg/kg kv/dag for hanner og hunner basert på høyeste dose testet. (Lees, 2003). Rotte, 28 dager Dosebestemmelsesforsøk for undersøkelse av nevrotoksisitet. Dosenivåer på 0, 300, 450, 600 og 1000 mg/kg kv/dag. Tilført med sonde (0,5 % karboksymetylcellulose og 0,1 % Tween 80) til 8 rotter (Alpk:APfSD, Wistar-derivert)/kjønn/gruppe. Kliniske observasjoner, kroppsvekt og fôrinntak ble undersøkt gjennom hele forsøksperioden. Vanninntaket ble undersøkt i et døgn hver uke og urin ble samlet i løpet av uke 4. Ved fosøket slutt ble dyra undersøkt makroskopisk og blodprøver ble tatt ved hjertepunktur. Nyrene og ulike skader ble undersøkt med mikroskop, GLP/QA. Forsøket er kun supplerende pga for få dyr og få undersøkelser. Resultater: Høyeste dose ga lavere fôrinntak uke 1, lavere kroppsvakt og kroppsvektøkning i hanner. Alle dyr, med få unntak, fikk økt spyttutskillesle ved dosering. Nyrene var målorgan. Hanner ved alle dosenivåer hadde en doserelatert økning i vanninntaket, urea i plasma og ketonuri. Hanner ved de tre høyeste dosene hadde øket plasmakreatinin, og hanner i høyeste dose hadde økt relativ nyrevekt. Hunnene hadde økt vanninntak ved høyeste dose. Det ble sett en doserelatert ketonuri i alle gruppene. Undersøkelser av nyrevev viste en doseavhengig nefrotoksisk effekt (cortical tubulær nefropati) hos alle behandlede hanner og i hunner ved de tre høyeste dosene. Konklusjon: Det ble sett en doserelatert nefropati i forsøket. Hanner var mer sårbare enn hunner. Dosenivåer på 600 mg/kg kv/dag og over ansees å være for høye for et subkronisk nevrotoksisitetsforsøk. (Lees, 2003) Rotte, 90 dager Dosenivåer på 0, 10, 100 og 500 mg/kg kv/dag. Tilført med sonde (0,5 % karboksymetylcellulose og 0,1 % Tween 80)/via fôr til 12 rotter (Alpk:APfSD, Wistarderivert) /kjønn/gruppe. % dyr /kjønn fra kontrollgruppen og høydosegruppen ble in situ perfusjonsfiksert og ble histopatologisk undersøkt. OECD guideline 424/GLP/QA. Resultater: Det var ingen effekter på fôrinntak og vekst i forsøket. Det var sett behandlingsrelatert økning av spyttutskillelse for begge kjønn ved 100 og 500 mg/kg kv/dag, hyppigst ved høyeste dose. Øket spyttutskillelse ble sett like før dosering og ikke under FOB-testene tidligere på dagen. Øynene fra dyr ved høyeste dose var

32 Side 5-23 normale, unntatt for en hunn ved høyeste dose som hadde rosetter i retina. Dette er imidlertid en vanlig forekommende defekt hos denne stammen. Det ble ikke sett effekter i funksjonelle tester eller effekter på motoriske aktivitet. Det ble ikke funnet skader på organer. Høyeste dose ga minimale effekter på nyrene. Det ble funnet en svak økning i hyppighet og alvorlighetsgrad av ensidig hydronefrose (vannyre) hos hanner i forhold til kontrollgruppen. Det ble også sett en svakt økt hyppighet av fokal tubulær basofili hos begge kjønn ved høyeste dose. Begge disse tilstandene er vanlig spontant forekommende hos stammen på dette alderstrinnet. NOAEL: 500 mg/kg kv/dag for hanner og hunner basert på høyeste dose benyttet. (Lees, 2003). Sammendrag (nevrotoksisitet): Pinoksaden ansees ikke som nevrotoksisk. Dosevalget ansees som godt nok til å skille mellom potensielle nevrotoksiske skader og potensielle sekundære nevrotoksiske skader. NOAEL (nevrotoks): 500 mg/kg kv/dag for hanner og hunner basert på høyeste dose benyttet Humane data Produksjonsarbeideres helse Førstehjelp ved forgiftning Ikke rapportert Ingen akutte virkninger er nevnt. Ingen antidoter er nevnt Klassifisering og merking Pinoksaden er ikke oppført i Stofflisten. I konklusjon foreslås klassifiseringen: [Xn]; [R- 20 Farlig ved innånding. R36 Irriterer øynene. R63 Mulig fare for fosterskade]. ADI AOEL ARfD Nasjonale normer ADI settes til 0,1 mg/kg kv/dag. Dette er basert på 2 års forsøk med rotte og teratologiforsøk i kanin der NOAEL ble satt til 10 mg/kg kv/dag med en usikkerhetsfaktor på 100. I EU er ADI satt til 0,1 mg/kg kv/dag. Dersom Faggruppen er enig i NOAEL i reproduksjonsforsøket er < 10 mg/kg/dag bør ADI fastsettesle diskuteres på nytt og da spesielt med hensyn til valg av UF. AOEL settes til 0,1 mg/kg kv/dag. Dette er basert på teratologiforsøk i kanin der NOAEL ble satt til 10 mg/kg kv/dag med en usikkerhetsfaktor på 100. I EU er AOEL satt til 0,1 mg/kg kv/dag. ARfD settes til 0,1 mg/kg kv/dag. Dette er basert på teratologiforsøk i kanin der NOAEL ble satt til 10 mg/kg kv/dag med en usikkerhetsfaktor på 100. I EU er ARfD satt til 0,1 mg/kg kv/dag. 5.4 Metabolitter Følgende metabolitter av pinoksaden ble vurdert å kunne forurense grunnvann i konsentrasjoner > 0,1 μg/l: NOA (M3), M52, SYN (M11), M54, M55 og M56. I planter ble metabolittene M3, M6 og M10 påvist. M3 og M6 ble testet for akutt giftighet, gentoksisitet og i kortidsforsøk mens M10 ble testet for akutt giftighet og gentoksisitet. Resultatene av testing er oppsummert i tabellene nedenfor:

33 Akutt og kortidsforsøk Forsøk NOAEL (mg/kg/ dag) LOAEL (mg/kg/ dag) Effekt M3 Akutt oralt - - LD50 = 1089 mg/kg 28 dager rotte 90 dager rotte 0, 150, 1000 og 6000 ppm 500 ppm (=66 mg/kg/dag) 150 ppm (=15 mg/kg/dag) 3000 ppm (=385 mg/kg/dag) 1000 ppm (100 mg/kg/dag) Økt levervekt (redusert glukogen/økt eosinofili) Økt levervekt med histopatologiske endringer (redusert glukogen/økt eosinofili) M6 Akutt oralt - - LD50 >2000 mg/kg 28 dager rotte 90 dager rotte Akutt giftighet ppm (=1310 mg/kg/dag) ppm (=1000 mg/kg/dag) - De ble ikke sett noen effekter - Det ble ikke sett noen effekter M LD50 >2000 mg/kg Side 5-24 Johnson 2002 Twomey 2003 Twomey 2003 Johnson 2003 Brammer 2003 Brammer 2003 Johnson 2004 Gentoksisitet. M3 Ames/ Negativt Callander 2003 Reversjons-test Kromosomforstyrrelser Positivt Fox 2003 in vitro Muse Negativt Clay 2003 lymfomceller in vitro Mikro-kjernetest Negativt Fox 2003 in vivo UDS in vivo Negativt Fox 2003 M6 Ames/ Negativt Callander 2003 Reversjons-test Kromosomforstyrrelser Negativt Fox 2003 in vitro Muse Negativt Clay 2003 lymfomceller in vitro M10 Ames/reversjonstest Negativt Callander 2003 Kromosomforstyrrelser in vitro Negativt Fox 2003

34 Muse Positivt Clay 2003 lymfomceller in vitro Mikro-kjernetest Negativt Fox 2004 in vivo UDS in vivo Negativt Clay 2004 Side 5-25 Metabolitter i planter: Metabolitten M6 viser lav giftighet og var negativ i gentoksforsøk in vitro. Metabolitten M10 viser også lav giftighet. Metabolitten var positiv i mutasjonstest i muse lymfomceller test in vitro, men ble testet negativt in vivo. Metabolitten M3 er omtalt under. Metabolitter i grunnvann: Metabolitten M3 ble funnet å være mer toksisk enn modersubstansen og var positiv for klastogenitet in vitro. M3 viser også høyere giftighet enn modersubstansen i kottidsforsøk med blant annet histopatologiske endringer i lever (muligens pre-noeplastiske endringer). Vurdering av metabolitter i grunnvann: EUs guidance dokument for vurdering av relevante metabolitter stiller krav om testing for gentoksisitet av alle metabolitter som forekommer i konsentrasjon > 0,1 μg/l. For virksomme stoffer som er giftige eller meget giftige 1 kreves det videre at metabolittene testes/vurderes med hensyn til giftighet for å bestemme om metabolittene har de samme egenskapene som modersubstansen. I følge dokumentet kan testing/vurdering også kreves for metabolitter av virksomme stoffer som ikke besitter giftige eller meget giftige egenskaper. Konsentrasjon av M3 ble beregnet til 0,71 μg/l. Metabolitten ble testet for akutt giftighet, gentoksisitet og subkronisk giftighet. Metabolitten er ikke testet/vurdert med hensyn til kreft og reproduksjonskader. Med utgangspunkt i resultater fra innleverte forsøk med M3 (gentoks in vitro og levereffekter i subkroniske forsøk ved lave doser) kan klassifisering av metabolitten som giftig (kreft, kronisk giftighet eller reproskader) ikke utelukkes. I EU monografien er det konkludert med at resultater fra forsøk med M3 ikke indikerer en klassifisering av metabolitten som giftig. Monografien gir imidlertid ikke tydelig begrunnelse av dette (se side i monografien). Metabolittene M52, M11, M54, M55 og M56 har også potensiale for å forurense grunnvann i konsentrasjoner > 0,1 ug/l. Disse har sammenliknbar struktur med M3 og vil derfor kunne besitte de samme egenskapene som denne metabolitten. Disse metabolittene er imidlertid ikke testet. Sammendrag (metabolitter): Karakterisering av iboende egenskaper av metabolitter i grunnvann er mangelfull og klassifisering av M3 som giftig (kreft, kronisk giftighet eller repro) kan ikke utelukkes. En eventuell klassifisering av denne metabolitten som giftig vil kunne føre at virksomt stoff ikke godkjennes. 5.5 Formuleringsstoffer Axial 50 EC inneholder over 10 % aromatiske hydrokarboner. Overflatespenningen er 31,2 mn/m og viskositeten er 8,2 centistoke ved 40ºC. Siden viskositeten er over grensen på 7 centistoke, skal preparatet ikke merkes for aspirasjonsfare (R65). Etiketten bør imidlertid merkes med at brekninger ikke må fremkalles i tilfelle svelging (S62). 5.6 Preparat Axial 50 EC 1 Giftig eller meget giftig definert basert på merkeforskriften.

35 Akutt oral Akutt toksisitet Side 5-26 LD50 i rotter er > 5000 mg/kg kv. Limit-test. 3 dyr ble testet. Ingen dyr døde i løpet av forsøket. Kliniske symptomer var rufsete pels hos 3 rotter som varte til dag 3,5 og 8. Sammenkrøpet stilling ble sett hos alle dyr fra 30 min-1 time til dag 2 eller 3. Ligging på magen ble sett hos 1 dyr etter 2-3 timer og hos et annet dyr etter 3 timer. 3 av dyrene hadde lavt aktivitetsnivå/stillesittende deler av testperioden (Straube, 2005) Akutt dermal Akutt inhalasjon LD50 i rotter er > 5000 mg/kg kv. Ingen dyr døde ble funnet etter eksponering. Kliniske symptomer var lavt aktivitetsnivå/stillesittende dyr, svakt rufsete pels (alle dyr i 2. behandlingsruppe). Andre symptomer som ble hos enkelte dyr var svak til moderat erytem, svak til betydelig erytem, svak ødem, svak til moderat ødem, svak til moderat avskalling/flassing, skorpedannelse, moderat sprekkdannelse og svak sprekkdannelse (Straube 2005). Preparatet Axial 50 EC er ikke testet med hensyn inhalasjonstoksisitet. Men derimot er preparatet Axial 100 EC med dobbelt så mye virksomt stoff testet med hensyn til inhalasjonstoksisitet. Forsøket er beskrevet nedenfor: LC50 i rotte er > 5 mg/l luft. (neseeksponerte) MMAD var 1,81-1,85 µm (GSD 2,43-2,22) (Noakes, 2003). OECD guideline 403. Det ble ikke sett noen dødsfall i forbindelse med dette studiet. Kliniske symptomer observert hos alle dyr var redusert respons på lyd, nedsatt pustehastighet, dypere pust og sikling fra 1 time og utover eksponeringsperioden. Det ble også sett våt pels hos alle dyr. Rett etter eksponering ble det sett nedsatt aktivitet, sammenkrøpet stilling, nedsatt respons for lyd, nedsatt refleks i fot, irritasjon av øvre luftveier og sikling. Sammendrag (akutt toksisitet): Axial er ikke farlig ved innånding, svelging eller hudkontakt. Hudirritasjon Øyeirritasjon Allergi Irritasjon/allergi Gjennomsnittlig hudirritasjonsindeks (24, 48 og 72 timer) var 2,0 for erytem og 1,9 for ødem. OECD 404. (Straube, 2005). Gjennomsnittlig øyeirritasjonsindeks var 0 for uklarheter i hornhinnen, 0 for skader i regnbuehinnen, 0,7 for ødem i bindehinnen og 1,0 for rødhet i bindehinnen. OECD 405. (Straube, 2005). Axial er vist allergifremkallende i en Buehlertest i marsvin. Responsen hos dyr som hadde fått testkonsentrasjoner på 1 % i challenge-fasen var på 94 % (Dvs 17 av 18 dyr hadde svak/lappete til moderat/sammenflytende rødhet) etter 24 timer og 78 % (dvs 14 av 17 dyr hadde svak/lappete rødhet) etter 48 timer. Responsen (dvs svak/flekkete rødhet) hos dyr som hadde fått testkonsentrasjoner på 0,5 % i challenge-fasen var på 67 % etter 24 timer og 11% (dvs) etter 48 timer. Ingen hudreaksjoner ble sett i kontrollgruppene. OECD 403. (Straube, 2005). Sammendrag (irritasjon/allergi): Axial er hudirriterende for kanin og allergifremkallende ved hudkontakt for marsvin (infrir kravene til merking med Xi; R38, R43) Klassifisering og merking Preparatet Axial klassifiseres som irriterende, Xn; Helseskadelig, R38, R43, R63. Det er tatt hensyn til klassifiseringen av virksomt stoff, formuleringsstoffer, og forsøkene på preparatet. Axial 50 EC inneholder over 10 % aromatiske hydrokarboner. Overflatespenningen er 31,2 mn/m og viskositeten er 8,2 centistoke ved 40ºC. Siden viskositeten er over grensen på 7 centistoke, skal preparatet ikke merkes for aspirasjonsfare (R65). Etiketten bør imidlertid merkes med at brekninger ikke må fremkalles i tilfelle svelging (S62).

36 5.6.4 Dermal absorpsjon Side 5-27 Det foreligger to formuleringer av Axial: Axial 50 EC (50 g/l formulering) og Axial 100 EC (100 g/l formulering). Tilvirker har utført standard testing for dermal absorpsjon med Axial 100 EC mens på Axial 50 EC er det kun utført forsøk på hud fra mennesker in vitro. Dermal absorpsjon in vitro, menneske Axial 50 EC: Det ble brukt 2 doser. Lav dose 10 μl/cm2 (6,2 μg/cm2) av bruksløsningen med fortynning 1/83,3 v/v (0, 6 g/liter) og høy dose 10 μl/ cm2 (480 μg /cm2) av konsentrat av Axial (50 g/l). Løsningen ble applisert på 2,54 cm2 hudmembran. Eksponeringen varte i 6 eller 24 timer. Resultatene fra 24 timer (worst case) er vist i tabellen under. Absorbert dose, % av tilsatt dose Rest i hornlaget, % av tilsatt dose Massebalanse, % av tilsatt dose Høy dose (480 μg/cm2) Lav dose (6, 2 ug/cm2) 0,86 0,51 4,35 4,03 95,4 104 Axial100 EC: Det ble brukt 2 doser. Lav dose 10 μl/cm2 (6 μg/cm2) av bruksløsningen 1/167 v/v (0, 6 g/liter), mens høy dose 4 μl/ cm2 (400 μg /cm2) var konsentrat av Axial 100 EC(100g/l). Løsningen ble applisert på 2,54 cm2 hudmembran. Eksponeringen varte i 6 eller 24 timer. Resultatene fra 24 timer (worst case) er vist i tabellen under. Absorbert dose, % av tilsatt dose Rest i hornlaget, % av tilsatt dose Massebalanse, % av tilsatt dose Høy dose, menneske Høy dose, rotte Lav dose, menneske Lav dose, rotte 8,58 46,6 4,86 46,2 9,59 8,48 17,2 16,1 98,4 97,4 97,4 97,2 Dersom man regner rest i hornlaget som absorbert vil absorpsjonen gjennom menneskehud være på ca. 18 % og 22 % for henholdsvis konsentrat og fortynnet preparat. Absorpsjonen gjennom rottehud blir ca. 55 og 62 % for henholdsvis konsentrat og fortynnet preparat. Gjennomtrengeligheten in vitro var større i rottehud enn i menneskehud. Høy dose ga en menneske:rotte-ratio på 18:55 mens lav dose ga et forhold på 22:62 (Ward, 2003). Dermal absorpsjon in vivo, rotte To doser, hvorav den høyeste var rent preparat (Axial 100 EC), mens den andre var en fortynning av preparatet som tilsvarte en bruksløsning (0,6 g/liter). Radioaktiv merking. Rottene ble eksponert i 6 timer for stoffet. Det var 4 avlivingstidspunkter med 4 hanner per avlivingstidspunkt. Resultatene er vist i tabellen nedenfor Dosenivå Lav dose, 6 μg/cm2 Høy dose, 400 μg/cm2 Avlivningstidspunk t (timer) Absorbert 2,95 7,81 11,50 8,38 18,29 16,92 13,57 19,85 Stratum korneum 11,70 9,76 6,14 8,20 1,61 1,62 2,63 2,67 Rester i epiderm 3,66 1,03 0,66 1,23 2,01 0,73 0,39 0,73 Ikke absorbert** 95,65 90,21 87,04 90,94 74,26 76,53 82,94 75,32 * Utskillelse i urin, vask av bur, utskilt i avføring, rester i blod og kropp ** vask av hud, stoff på dekke og fester over applikasjonsstedet. Absorpsjonen i rotter in vivo var på 20 og 12 % for henholdsvis konsentrat og fortynnet løsning. (Smith, 2003). Sammendrag (dermal absorpsjon):

37 Side 5-28 Basert på resultater fra oven nevnte forsøk beregnes dermal absorpsjon for Axial 100 EC gjennom menneskehud in vivo som følger: Konsentrert preparat: 20 * 18/55 = 6,5% Fortynnet løsning: 12 * 22/66 = 4% Sammenlikning av in vitro forsøk på menneskehud viser at pinoxaden absorberes i mindre grad fra Axial 50 EC enn fra Axial 100 EC. Absorpsjonsdata for Axial 100 EC benyttes derfor i videre beregning av eksponering. 5.7 Eksponering ved bruk og arbeid med sprøytet kultur Eksponering ved bruk NAD for Axial 50 EC er satt til 0,9 l/ha (basert på sprøyting i korn). Sprøytemetoden for det søkte bruksområdeer traktormontert åkersprøyte (korn). Forventet eksponering, beregnet vha. UKPOEM og Tysk modell, er oppsummert i tabellen nedenfor. Eksponeringen er sammenlignet med en foreslått AOEL for pinoksaden på 0,1 mg/kg /dag (basert på teratologiforsøk i kanin med NOAEL på 10 og UF = 100). Modell* UK Poem Flytende formulering ** Tysk modell, 75 percenti l*** Total absorbert dose (mg/kg kv/dag) Uten verne utstyr Hansker utbl Hansker utbl/spr Hansker utbl/spr + maske utbl Hansker utb/spr + overtr.- dress spr Hansker utb/spr+ maske utbl/spr Hansker utb/spr+ maske utbl/spr + overtrekk spr % av foreslått AOEL uten verneutstyr 0,032 0, ,018 0, ,6 % av foreslått AOEL med verneutstyr * Felles parametre for alle modellene: Dermal absorpsjon 6,5 og 4 % for henholdsvis konsentrat og fortynning og sprøytetid 6 timer ** Sprøyteareal [50] ha, kroppsvekt 60 kg. Kan ikke velge maske under sprøyting. *** Sprøyteareal [20] ha, kroppsvekt 60 kg. Beregnet eksponering varierer fra 0,018 til 0,032 mg/kg kv/dag uten bruk av verneutstyr, dvs. ingen overskridelse av foreslått AOEL for pinoxaden i samtlige modeller. Bruk av verneutstyr vil imidlertid kreves på grunn av merking av prepratet som irriterende. Eksponering ved opphold i og/eller arbeid med sprøytet kultur: Siden bruksområdet for Axial er korn er det ikke aktuelt med håndtering av kulturen etter sprøyting. Med tanke på andre som måtte oppholde seg i nærheten under sprøytingen vil eksponering være av minimal karakter, da preparatet er svært fortynnet, samt at det ved den aktuelle sprøytemetoden (åkersprøyte) ikke vil dannes inhalerbare partikler. På denne bakgrunn ansees ikke denne type undersøkelser eller beregninger som nødvendig. Tilvirker har likevel levert inn beregninger basert på DFR som viser eksponering <<< 1 % av AOEL uten bruk av verneutstyr. Bruk av hansker vil imidlertid kreves ved arbeid med sprøytet kultur da prepratet er allergifremkallende ved hudkontakt. Konklusjon og sammendrag eksponering:

38 Side 5-29 Eksponering ved bruk: Beregnet eksponering for Axial 50 EC overskrider ikke foreslått AOEL for pinoksaden selv uten bruk av verneutstyr. Bruk av verneutstyr vil imidlertid kreves på grunn av merking av prepratet som irriterende og allergifremkallende. Eksponering ved opphold og/eller arbeid med sprøytet kultur: AOEL overskrides heller ikke ved opphold og/eller arbeid med sprøytet kultur selv uten bruk av verneutstyr. Bruk av hansker vil imidlertid kreves ved arbeid med sprøytet kultur da prepratet er allergifremkallende ved hudkontakt.

39 Revus 250 SC - mandipropamid Side Rester i produkter til mat eller fôr Er ikke tatt med i denne rapporten.

40 Side 7-1 Er ikke tatt med i denne rapporten. 7. Skjebne i miljøet

41 Side 8-1 Er ikke tatt med i denne rapporten. 8. Økotoksikologi

42 Side Dokumentasjonens kvalitet Toksikologi Den foreliggende dokumentasjon er tilstrekkelig tilstrekkelig til å foreta en toksikologisk vurdering av virksomt stoff og preparat. Referanser Følgende vedlegg sendes alle ekspertene i VKM Faggruppe 2: Følgende vedlegg sendes til ekspertene innen henholdsvis toksikologi og økotoksikologi: T1: Draft Assessment Report 2005 UK Toxicology and metabolism. T2: Addendum 1 Draft Assessment Report 2005 UK Toxicology and metabolism. Ø1: Ø2: