Side 1 ARBEIDSBESKRIVELSE Institutt for husdyr- og akvakulturvitenskap, UMB

Transkript

1 1 EIDSBESKRIVELSE Institutt for husdyr- og akvakulturvitenskap, UMB Metodenavn: Aminosyreanaly - oksiderte prøver IHA-nr: Innledning/hensikt Metoden bestemmer totalinnholdet (peptidbundede og frie) aminosyrer i fôr og faeces, ved å bruke en sator med ionebytterkolonne, ninhydrinanordning, post kolonnederivatiring og fotometrisk detektor. Metoden er egnet for aminosyrene cyst(e)in, methionin, asparaginsyre, threonin, rin, glutaminsyre, prolin, glysin, alanin, valin, isoleucin, leucin, tyrosin, fenylalanin, histidin, lysin og arginin. 2. Reagenr Oksidasjonsvæske, står i kjøleskap. mål ut 111 g vann (MilliQ/ionebyttet). tiltt 889 g konntrert maursyre (98-100%) og bland godt (pass på varmeutvikling). tiltt 4,73 g fenol (står i kjøleskap) og bland godt. Hydrolyvæske, står i kjøleskap. mål ut 400 ml vann (MilliQ/ionebyttet). tiltt, forsiktig, 492 ml kons. HCl (37%/rykende) mens blandingen avkjøles. tiltt 1 g fenol og fortynn til 1 L med vann (MilliQ/ionebyttet). 7,5M NaOH, står under avtrekksskap. vei ut 300 g NaOH og løs dette porsjonsvis i 500 ml vann (MilliQ/ionebyttet) ved hjelp av magnetrører. fortynn med vann (MilliQ/ionebyttet) til 1 L når løsningen er blitt kald. 1,0M NaOH, står under avtrekksskap. vei ut 40 g NaOH og løs dette i ca 500 ml vann (MilliQ/ionebyttet) ved hjelp av magnetrører. fortynn med vann (MilliQ/ionebyttet) til 1 L når løsningen er blitt kald. Hydrogenperoksid (30%) Buffere til Biochrom30 Bestillingsnummer Buffernummer Sodium Citrate Loading Buffer ph 2, Loadingbuffer Sodium Citrate Buffer ph 3, Sodium Citrate Buffer ph 4, Sodium Citrate Buffer ph 2, Borate / Citrate Buffer ph 8, Sodium Hydroxide Solution Ultra Ninhydrin Regent Kit Ninhydrin 1-7

2 2 3. Risikovurdering -Bruk vernebriller/briller og avtrekk ved håndtering av fenol og syrer. -Støvfilter P3 eller bruk av vekt i avtrekksskap ved innveiing av natriumdisulfitt (natrium metabisulfitt). Koking av fenolløsning SKAL utføres i avtrekkskap og i varmeskap skal lokkene på flaskene være godt skrudd igjen. 4. Utstyr Biochrom 30 Amino Acid Analyzer med Midas autoinjektor Varmeskap (110 C) Varmeblokk (145 C) Autotitrator, 751 GPD Titrino med 685 Dosimat fra Metrohm Whirlmixer Bordntrifuge Testglass 60 ml Sintilasjonsglass 150 ml begerglass 200 ml målekolbe Trakt 2 ml GC-vials 300 μl GC-vials 0,45 μm membranfilter 2 ml engangssprøyte 5. Prøvemateriale Mengde prøvemateriale beregnes ut ifra nitrogenmengden i prøvene. Dette bestemmes først med Kjeldahlmetoden. 10 mg mengde nitrogen (g kg) 1000 (g kg) = prøve som skal veies ut (mg) Prøvemengde: mg homogen prøve (prøvene må inneholde ca. 10 mg nitrogen). Malingsgrad: 0,5 mm. Faeces: 1 parallell Fôr: 3 paralleller (anbefales) 6. Arbeidsbeskrivel Oksidasjon 1. Beregne mengde prøve som skal veies ut. 2. Vei ut beregnet mengde prøve i et testglass, 60 ml. 3. Vei ut 140 ± 5 mg soyakontroll i et testglass, 60 ml. 4. Lag oksidasjonsblandingen: - 4,5 ml oksidasjonsvæske x ant. prøver. - 0,5 ml hydrogenperoksid (30%) x ant. prøver. 5. Dekk til beholderen og la blandingen stå 1 time ved C, til den er lys gulblank. 6. Avkjøl blandingen på isbad i ca. 15 min. 2-7

3 3 7. Tiltt 5 ml oksidasjonsblanding til prøvene og soyakontrollen. 8. Bland eller miks kun om dette er helt nødvendig (små klumper vil lø g lv) med en spatel. NB! Forsøk alltid å få mest mulig av prøvematerialet ned i glast, ikke på kanten. NB! 9. Inkuber prøvene ved 4 C i kjøleskap i 17 timer. Eks. tt på kjøling kl. 15 og ta ut prøvene kl. 08 neste dag. Merk deg tidspunktet prøvene ttes til inkubasjon. 10. Vei inn 0,84 g natriumdisulfitt antall analyprøver i sintilasjonsglass med hvit skrukork (trenger ikke vaskes). Gjøres i avtrekk. 11. Etter 17 timer tas prøvene ut og natriumdisulfitt tilttes alle prøvene. Hydroly 12. Sett varmeskapet på 110 C. 13. Tiltt 25 ml hydrolyvæske direkte til det oksiderte materialet i glast. Gjøres i avtrekk. 14. Sett prøvene til koking i varmeskapet i 24 timer (110 C). 15. Husk løs kork første timen. Deretter skru til kork godt. NB! HUSK AVTREKK! NB! 16. Ta ut prøvene av varmeskapet og tt dem til avkjøling i avtrekk. Slipp ut trykket i glasne og tt dem i isbad (is og vann) til avkjøling. ph justering (ph 2,2) ved bruk av autotitrator 17. Kontroller at det er nok løsninger i flaskene og spyl ut det som sitter i slangene Bruk 751GPD Titrino Keyboard: - Trykk Prep (tast 4) en gang for å velge internal D0 (7,5 M NaOH) som står til høyre - Trykk START. - Trykk Prep (tast 4) to ganger for å velge external D1 (1 M NaOH) som står til venstre. - Trykk START. Pass på at det ikke er noen luftbobler i slangene. Utspyling av slangene kan måtte gjentas i mange runder. 18. Kalibrering av ph-meter med bufferne 1,68/4,01/7,00: Bruk 751GPD Titrino Keyboard: - Trykk Ur Meth (tast 3). - Velg recall method med Enter. - Bruk piltastene, eller, til å finne programmet CAL3. - Trykk Enter. - Trykk START. - Trykk Enter for å akptere temperaturen (25 C). - Sett elektroden i buffer 1. Akpter at første buffer er ph=1,68 ved å trykke Enter. Vent på klarsignal. Skyll med RO-vann. 3-7

4 4 - Sett elektroden i buffer 2. Akpter at andre buffer er ph=4,01 ved å trykke på Enter. Vent på klarsignal. Skyll med RO-vann. - Sett elektroden i buffer 3. Akpter at tredje buffer er ph=7,00 ved å trykke på Enter. Vent på klarsignal. Skyll med RO-vann. - Kalibreringsresultatene blir automatisk skrevet ut av skriveren. 19. Innstilling av ph til 2,20 i aminosyreprøver: Bruk 751GPD Titrino Keyboard: - Trykk Ur Meth (tast 3). - Velg recall method med Enter. - Bruk piltastene, eller, til å finne programmet AMINO. - Trykk Enter. 20. Merk 150 ml begerglass med prøvenummer. 21. Hell første prøve over i et merket 150 ml begerglass. 22. Vask testglast (rist) tre ganger med loadingbuffer (Sodium Citrate Loading Buffer ph 2,20, ), som står i kjøleskap, og fortynn med samme buffer til volumet er ca. 75 ml. 23. Tiltt 10 ml 7,5 M NaOH for at ph-justeringen skal gå raskere. Følg med på hvor mye NaOH ph-instrumentet bruker. Tiltt eventuelt mer 7,5M NaOH før titreringen starter. 24. Gjenta trinn 21 til 23 med alle prøvene. 25. Forbered 4-5 prøver før ph-justeringen startes. 26. Plass nr. 16 på prøvekarullen skal være et begerglass med vann (MilliQ/ionebyttet). 27. Sjekk at elektroden, røreren og ledningene på autotitratoren er skikkelig på plass (slik at de treffer i midten av begeret). 28. Når alt er klart: Trykk START (bruk 750 SC Controller). 29. Etter ph-justeringen ttes rørestav og slangeendene i ionebyttet vann over natt for vask av dis. ph-elektroden skal skylles og tilbake i KCl-løsning (3 M). Fortynning av ph-justerte prøver 30. Merk telleglass med ID-nummere som finnes på SKRIV HVOR FILA FINNES. 31. Hell analyprøven over i en 200 ml målekolbe. 32. Skyll ut av begerglast med loadingbuffer. 33. Fortynn til 200 ml med loadingbuffer. 34. Sett på kork og bland godt (snu kolben opp/ned 12 ganger). 35. Hell av litt av blandingen og fyll så opp et merket telleglass med prøve. 36. Hell resten i vasken. 37. Skyll målekoblen med vann (MilliQ/ionebyttet) og bruk denne på nytt. 38. Gjenta punkt 31 til 37 med alle prøvene. 39. Telleglasne skal i kjøleskapet på prøverommet. 40. Loadingbuffer står i kjøleskapet på labben. Analy ved bruk av HPLC Klargjøring av prøver og standarder: 41. Filtrer ca 2 ml av de opparbeidede prøvene og overfør den filtrerte løsningen til GCglass. Bruk sprøyte og sprøytefilter (0,45 µm). 4-7

5 5 42. Kork glasne og tt dem i kjøleskap fram til analyn skal startes. 43. Hent fire standarder (50, 100, 300 og 400 mm). 44. Bland standardene på whirlmixer og tt de deretter i bordntrifugen og la de spinne i ca 1 minutt. Overfør til 300µl-GCglass. Pass på at det ikke er luftbobler i bunnen på glasne. 45. Kork glasne og tt dem i kjøleskap fram til analyn skal startes. Klargjøring av Midas autoinjektor 46. Kontroller at det er nok vaskeløsning (1:1 vann(milliq/ionebyttet):meoh) i flaska som står til venstre for autoinjektoren. 47. Vask injektoren: - Trykk EXIT. - Trykk WASH. 48. Prodyren må gjentas helt til det ikke er mer luft i stemplet. 49. Etter vask aktiveres autosampleren ved å trykke på SERIAL (knapp nr. 3 øverst). Vinduet skal nå vi PANIC STOP og EXIT. 50. Dersom autosampleren har vært av: Tray: 5 C, Cooling: ON. Sett opp kvens i Chromeleon: 51. Åpne Chromelon. 52. Åpne Browren og gå inn på Sequens under Biochrom. 53. Åpne riktig årstallmappe under Sequens og lag en ny kvens (kopier en gammel). 54. Ved kopiering av en eldre kvens pass på at dette er en kvens for natriumsystemet og ikke litiumsystemet. 55. Gi kvenn nytt navn, MMDD_ÅÅÅÅ. 56. Marker kvenn og høyreklikk. 57. Velg Properties og skriv inn oppdragsgiver der hvor det står Title. 58. Kontroller at det står Hydrolysater.qnt og OX_HP_rask.pgm i vinduet over kvenn. 59. Lag kvenn slik at den r slik ut (tilpass til antall prøver): Generelt prøveopptt: - Soyakontroll - 10 prøver - 10 prøver - 10 prøver - Soyakontroll Ved færre enn 20 prøver plasr standardene etter at halvparten av prøvene er kjørt. 60. Marker alle prøvene i kvenn (alt skal bli svart). 61. Trykk Ctrl+c og Ctrl+v fjerner de gamle kromatogrammene. 62. Lagre kvenn. 63. Trykk Start/Stop batch. - fjern eventuelt andre kvenr. 64. Trykk Ready check. - eventuelle feilmeldinger som kommer opp må rettes/fjernes. 5-7

6 6 65. Trykk OK Start. 66. Åpne mappen Panels under Biochrom og åpne panelet Biochrom30.pan. 67. Chromelon er nå klar til analy og venter på signal fra BioSys. - Skal stå som WAIT. Sett opp kvens i BioSys: 68. Åpne BioSys Manual. 69. Trykk på View og Program Control. a. BioSys Programmer: 1000 åpnes. 70. Trykk på Inrt. 71. Trykk på Program Filename og velg OX_HP_rask_2012.prg. 72. Ved sample ID. 73. Trykk på No. Samples: og skriv inn antall analyr (injeksjoner i analyn). 74. Trykk på Vial no.og skriv inn hvor første prøve/standard starter. 75. Trykk på Volume og skriv inn 40 μl. 76. Trykk på Details og velg Microliter pick-up. 77. Trykk deretter på OK og OK. 78. Den alle første prøven i BioSys-kvenn skal hete "regen". Denne må være med da kolonnematerialet må regenereres før første injeksjon. Resten av kvenn skal være helt lik den som er laget i Chromelon. Pass på å få inn riktig "vial no(s)" for standardene og prøvene som skal analyres flere ganger. 79. Sjekk at kvenn i Biochrom, etter "regen" er identisk med kvenn i Chromeleon, både navn og plasring. 80. Trykk Save as. Åpne Mine siste dokumenter, Sample Lists og lagre kvenn som dagens dato; MMDD_ÅÅÅÅ. 81. Plasr så prøvene og standardene på riktig plass i autosampleren. Etterfylling av buffer på Biochrom Sjekk om det er nok buffer i flaskene som står i lømiddelrervoaret oppe på Biochrom30 til å kjøre alle prøvene. 83. Etterfyll om nødvendig! Ca. volum kan kontrolleres på. Husk å fyll ca 150 ml ekstra slik at slangene i flaskene ikke trekker luft på slutten av analyn. 84. Sjekk om det er nok ninhydrinløsning. Lag ny og etterfyll om det skulle være aktuelt. ALDRI etterfyll under en analy! (-husk om bytte av filter legg dette først i et begerglass med ninhydrinløsning og ha i ultralydbad i 5 min for å få ut luft). 85. Pass på at korkene blir skikkelig godt skrudd til på buffer og ninhydrinflaskene. 86. Sjekk at waste-beholderen ikke er full - tømmes om nødvendig. Starte Biochrom Hent fram vinduet Biosys Manual: Huk av REACTION COIL og LAMP. 89. La "reactioncoilen" bli varm og sjekk om lampa er riktig innstilt: - Åpne framdekslet på Biochrom Dra fram den øverste skuffen. - Dekslet over der lampa lyr har to svarte skruer. - Skru dis svarte skruene av og fjern dekslet. 6-7

7 7 - Kontroller at lysstrålen er konntrert, har klare grenr, ved å føre et ark når den borteste veggen. - Juster fokut på lampa, hvis nødvendig med det mørkerøde hjulet. - Skru så på dekslet og dytt skuffa inn igjen. 90. Når "Column temp" har nådd 50 C ttes buffer 3 på. Husk å start med en lav strømingshasstighet (flow), 5 ml/h. Økes stegvis til 35 ml/h når trykket har stabilirt g på hvert steg. 91. Start også ninhydrinpumpa (når temperaturen har nådd 135 C. Se på "pressure" at de svarte strekene går opp. Ellers sjekk trykket, korkene på bufferne. 92. Analyn tar 75 minutter. 93. Sjekk for lekkasjer - spesielt hvis man har skrudd på instrumentet. Starte analyn Biosys Programmer: 1000: 94. Hent fram BioSys Programmer: Merk REGEN og trykk på RUN. 96. Trykk på Run og trykk på fanen Program som står ved siden av Sample list. 97. Merk så trinn 6 eller 7 (trinn 8-12 MÅ være med etter en vaskepross) og trykk på Go to step og deretter OK. 98. Sjekk etter lekkasjer. 99. Biochrom30 slår g av når analyn er ferdig. Fjern markeringen på LAMP. Eventuelle avvik fra standard opparbeiding noteres under «comments» i data FILA Husk å gi standardene riktig navn: 50 mm std1 100 mm std2 200 mm std3 400 mm std4 7-7