Eksperimentell skrapesyke hos sau muligheter og begrensninger MARTHA J. ULVUND¹, CECILIE ERSDAL¹, ², ARILD ESPENES² OG CHARLES McL PRESS² Institutt for produksjonsdyrmedisin, NVH-Sandnes¹og Institutt for basalfag og akvamedisin². Innledning Skrapesyke (scrapie) er en snikende, overførbar dødelig hjernesykdom hos sau. Symptomene viser seg hos voksne dyr. Sykdommen skyldes feilfolding av et eget vertskodet (prion) protein (PrP). Det normale cellulære prionproteinet (PrP C ) finnes i forskjellige vev. Funksjonen er i stor grad ukjent, men tilstedeværelse av proteinet i vertsdyret er nødvendig for overføring av sykdommen. Introduksjon av det feilfoldete proteinet (PrP Sc ) i kroppen fører hos mottagelige dyr til at PrP C omdannes til PrP Sc, som avleires i celler og vev og fører til funksjonssvikt og celledød. Mottageligheten av scrapie er avhengig av polymorfier i prionproteingenet. Hos norske saueraser er minosyren valin (V) på kodon 136 og glutamin (Q) på kodon 171 assosiert med økt mottakelighet for klassisk scrapie (Tranulis m. fl. 1999), mens den nye varianten, Nor98, er knyttet til variasjon i kodon 154 (AHQ) og 141 (F) (Moum m. fl. 2005). Scrapie hos sau smitter ikke direkte til menneske, men kan ha forårsaket kugalskap (BSE), som er overførbar til menneske og gir variant Creutzfeldt - Jakobs sykdom (vcjd). BSE er ikke naturlig påvist hos sau, men lar seg overføre til sau eksperimentelt, og oppfører seg da som klassisk scrapie med spredning av smitte (PrP Sc ) i organer og vev. Klinisk scrapie kan være vanskelig å diagnostisere (Ulvund m.fl. 1996, Ulvund 1999). Spesielt i land med BSE kan en ikke utelukke at BSE kan forekomme skjult hos sau. For bekjempelse og forebygging er det derfor viktig å kjenne patogenesen ved scrapie hos forskjellige (geno-) typer av sau, dvs. smittemåter, celler og vev som er involvert ved opptak, spredning, organer og vev med smitte, tidspunkt for opptreden av kliniske symptomer etc. I en norsk saueflokk der det ble funnet to dyr med klinisk scrapie (4 %), viste hele 17 av 48 sauer (35 %) ansamlinger av smittestoff (PrP Sc ) i et eller flere vev eller organ (Ersdal m. fl. 2003). Alle som hadde PrP Sc i forskjellige vev hadde mottagelige genotyper (AV 136 QQ 171, VV 136 QQ 141 ). Tre sauer hadde PrP Sc i halslymfeknutene (retrofaryngeale) men ikke i hjernen, noe som viser nytten av denne lymfeknuten ved undersøkelse av slakt. Av 6 undersøkte 2-3 mnd gamle lam etter PrP Sc -positive mødre hadde to PrP Sc i tarmen (ileale peyerpletter, IPP).
Studier av ovin scrapie er gjerne foretatt på naturlig infiserte dyr, mens eksperimentelle studier ofte er utført på mus. Eldre eksperimentelle studier på sau ble utført på et heterogent sauemateriale, før betydningen av genotyper var kjent, men noen moderne studier er utført (Foster m. fl. 2001). Den norske scrapie-modellen NVH Sandnes diagnostiserte fra slutten av åttiårene scrapie på sau fra Sørvestlandet, og materiale ble i løpet av en tiårsperiode innsamlet for studier av bl.a. patogenese og morfologi. Infisert hjernemateriale ble frosset med tanke på smittepodingsforsøk. Studier av kasus viste hvilke genotyper som var mest mottagelige (Tranulis m. fl. 1999), og det ble mulig å sortere dyr i mottagelige, intermediære og motstandsdyktige. Vi kunne i løpet av noen år bygge opp en scrapie-mottagelig stamflokk som kunne produsere lam med ønskede mottagelige genotyper. Den første podingen på lam ble utført i 1998, senere er modellen utbygd i takt med prosjektbevilgninger og utvidelse av smitteisolatet. Modellen går i korthet ut på å holde en stamflokk av svært mottagelige mødre, skilt (ute og inne) fra den ordinære flokken, foreta paring med ønsket genotype av vær, lamming i egne bokser, fravenning etter 1-2 døgn og oppkopping fram til 6-8 ukers alder, da smittepoding blir foretatt. Lamma doseres med infisert hjernemateriale fra scrapiekasus med kjent genotype og scrapie-variant, hvert lam får en dose som tilsvarer 5 g hjernemateriale per os (magesonde), og plasseres i lukket isolat med video overvåking. For hvert lam som doseres med smitte doseres en alders- og genotype-matchet kontroll med fysiologisk saltvann, og denne settes i åpent isolat. Lamma avlives etter forskjellige tidspunkt og organer undersøkes. Utsjalta stamdyr undersøkes nøye for PrP Sc for å bekrefte at de er negative. Muligheter og begrensninger. Ingen dyreart kan erstatte sauen ved studier av ovin scrapie. Modellen muliggjør studier av opptak av PrP Sc i tarmen, spredning i kroppen, og utvikling av ny diagnostikk på levende dyr (biopsi av tonsiller, lymfeknuter, blinkhinne, rektum). Det er ennå usikkert om det er smitte i blod ved prionsykdommene, modellen gir god anledning til å studere dette. En vet heller ikke om scrapie Nor98 er like smittsom som klassisk scrapie, forsøk på dette pågår i et samarbeid med VI. Sauer er store dyr med langt generasjonsintervall, forsøkene må være langsiktige, de er mer kostnadskrevende enn museforsøk, antall dyr er begrenset, og forsøkene er mer kvalitative enn kvantitative. Modellen er avhengig av tilgang på homogene, friske og godt karakteriserte stamsauer og rikelig relevant smittemateriale.
Noen resultater opptak og spredning Fordelingen av prionprotein (PrP C ) i tarmen hos normale og poda lam viste at PrP C var utbredt i nervepleksus og lymfatisk vev (IPP), og lokaliseringen var noe forskjellig mellom normale og poda dyr 1 og 5 uker etter podingen (Heggebø m.fl. 2000). Undersøkelsen viste at IPP kan være en viktig inngangsport for smittestoffet. Det ble ikke påvist PrP Sc i noe lymfatisk organ 1 uke etter poding, men allerede 5 uker etter poding ble PrP Sc påvist hos de mest mottagelige PrP genotypene (AV 136 QQ 171, VV 136 QQ 141 ) i tonsillene, tarmen (distale jejunale lymfeknuter, DJLN), halslymfeknutene og milten. Fem måneder etter poding var det større ansamlinger av PrP Sc i IPP, halslymfeknutene og tarmen (DJLN). Elleve måneder etter dosering ble PrP Sc funnet i alt undersøkt lymfatisk vev hos dyr med mottagelige genotyper (Heggebø m.fl. 2003). Til sammen 21 poda sauer ble så undersøkt for PrP Sc i perifert lymfatisk vev og sentralnervesystemet, de fleste 5-25 måneder etter poding (Ersdal m. fl. 2005). Bare mottagelige dyr (AV 136 QQ 171, VV 136 QQ 141 ) viste avleiring av PrP Sc 5 måneder etter poding (halslymfeknuter, IPP). Ti måneder etter poding ble PrP Sc funnet i stort sett alle undersøkte organer og vev hos de mottagelige dyra. Smittestoffet (PrP Sc ) kunne påvises i hjernestammen (obex) etter 10-11 mnd, og i ryggmarg og ganglier etter nærmere 15 mnd. Det var tendens til at homozygote VV 136 sauer hadde større ansamlinger og utbredelse av PrP Sc enn heterozygote (AV 136 ), spredningen ser derfor ut til å gå litt senere hos disse. Lokaliseringen av PrP Sc tydet på at smitten spredte seg både gjennom lymfe, langs nerver (støtteceller) og via blodet. De første kliniske symptomene kom ca. 10 mnd etter poding hos de mest mottagelige. Det var ikke alltid samsvar mellom symptomer og utbredelse av PrP Sc, et dyr hadde avleiringer av PrP Sc uten å vise symptomer, mens tre hadde vage symptomer uten at PrP Sc kunne påvises. Studier av endringer i genuttrykk (mrna) i IPP er utført (Skretting m. fl. 2003) og deler av podeforsøkene inngår i EU-prosjekt (SC-Gut). Diagnostikk - levende dyr Biopsiteknikk for påvisning av PrP Sc i lymfatisk vev i endetarmen er etablert (Espenes m.fl. 2003). I et samarbeid med danske forskere har vi funnet det første bevis på en link mellom scrapie-mottagelighet og nivå av PrP C på forskjellige blodcellefenotyper (Ohm m.fl. 2004). Gjennom EU, NoE (Network of Excellence, Neuroprion) er det etablert samarbeid om deteksjon av PrP Sc og infektivitet i blod. Referanser Ersdal, C., Ulvund, M. J., Benestad, S. l., Tranulis, M. A., 2003. Accumulation of pathogenic prion protein (PrPSc) in nervous and lymphoid tissues of sheep with subclinical scrapie. Vet. Pathol. 40, 164-174.
Ersdal, C., Ulvund, M. J., Espenes A., Benestad, S. L., Sarradin, P., Landsverk, T., 2005. Mapping PrP Sc propagation in experimental and natural scrapie in sheep. Vet. Pathol. Accepted, 2005. Espenes, A., Press, C. Mc. L., Gunnes, G., Aleksandersen, M., Ulvund, M. J., Landsverk, T., 2003. PrP Sc in rectal lymphoid tissue of sheep experimentally infected with scrapie. Conference on methods for control of scrapie (Oslo, Norway, 15-16 May),Abstract, 47. Foster, J. D., Parnham, D., Chong, A., Goldman, W., Hunter, N., 2001. Clinical signs, histopathology and genetics of experimental transmission of BSE and natural scrapie to sheep and goats. Vet. Rec. 148, 165-171. Heggebø, R.., Press, C.Mc.L., Gunnes, G., Lie, K,.I., Tranulis, M.,A., Ulvund, M,.J., Groschup, M., Landsverk, T., 2000. Distribution of prion protein in the ileal Peyer s patch of scrapie-free lambs and lambs naturally and experimentally exposed to the scrapie agent. J. Gen. Virol. 8, 2327-37. Heggebø, R.., Press, C. Mc. L., Gunnes, G., Ulvund, M. J., Tranulis, M. A., Landsverk, T., 2003. Detection of PrP Sc in lymphoid tissues of young lambs experimentally exposed to the scrapie agent. J. Comp. Pathol., 128,172-181. Moum, T., Olsaker, I., Hopp, P., Moldal, T., Valheim, M., Moum, T., Benestad, S. L., 2005. Polymorphisms at codons 141 and 154 in the ovine prion protein gene are associated with scrapie Nor98. J. Gen. Virol., 86, 231-5. Ohm J. E.,Ulvund M. J., Riber U., Lind P., Heegard P M. H., 2004. Cell surface expression of PrP on subsets of peripheral blood monocytes from sheep of different genotypes. International Winter Meeting on Growth and Death in the Nervous System. St. Moritz/Switzerland, March 24-28, 2004. Skretting, G., Espenes, A., Ulvund, M. J., Olsaker, I., 2003. cdna representational difference analysis of ileal Peyer s patches in lambs after oral inoculation with scrapie. Biochem. And Biophys. Research Comm. 316, 272-279. Tranulis, M. A., Osland, A., Bratberg, B., Ulvund, M. J., 1999. Prion protein gene polymorphisms in sheep with natural scrapie and healthy controls in Norway. J. Gen. Virol. 80, 1073-1077. Ulvund, M. J., Bratberg, B., Tranulis, M. A., 1996. Prionsykdommer hos dyr. Nor.Vet.Tidsskr, 108,455-466. Ulvund, M. J., 1999. Scrapie a clinical challenge. I Norges veterinærhøgskole, Publications 1998, 5-23.