FASIT TIL BIOKJEMIEKSAMEN 30. MAI 2005 Oppgave 1 a) Obligat aerobe bakterier må ha oksygen. De utfører aerob respirasjon hvor den endelige elektronakseptoren er oksygen. Fakultativt anaerobe bakterier kan leve både med og uten oksygen. De benytter aerob respirasjon når oksygen er tilstede, og anaerob respirasjon eller fermentering når oksygen ikke er tilstede. Obligat anaerobe bakterier tåler ikke oksygen. De benytter anaerob respirasjon eller fermentering. Obligat aerobe og fakultativt anaerobe bakterier har enzymer som omdanner giftige oksygenforbindelser som peroksider, radikaler og annet. Disse enzymene (superoksiddismutase, katalase) har ikke obligat anaerobe bakterier. b) Ved kolonitelling telles bare antall levende organismer, mens ved OD måling telles både levende og døde. Ved kolonitelling tas en prøve av bakteriekulturen. Av denne lages en dekadisk fortynningsserie (bør forklares hvordan). Fra fortynningene overføres 0,1 ml til agarplater og bakteriesuspensjonen spres utover hele overflaten med en dregalsk spatel (glasstav). Etter inkubering telles antall kolonier og dette tallet ganges opp med fortynningsfaktoren for å gi antall bakterier pr. ml bakteriekultur. c) Figur over eukaryot celle se i lærebok side 40. Innerst finner vi cellekjernen hvor DNA molekylene er samlet og beskyttet. Kjernen er bygget opp av dobbeltlag membraner med porer slik at RNA kan trenge ut av den. Like utenfor kjernen er ru endoplasmatisk retikulum (RER), som er et membran nettverk med ribosompartikler på overflaten. På ribosomene, som er bygget opp av rrna og proteiner foregår proteinsyntesen. Og i endoplasmatisk retikulum modifiseres proteiner som skal ut av cellen, blant annet ved at de påkobles karbohydrater. Små membranblærer som er fylt av disse modifiserte proteinene, kan knipes av RER og fraktes til cellemembranen eller til Golgi apparatet. I Golgiapparatet foregår videre modifisering før proteinene fraktes til cellemembranen. Membranblærene kobles sammen med cellemembranen og proteinene skilles ut ved eksocytose av cellen. Glatt endoplasmatisk retikulum er også et membransystem, men de mangler ribosomene og funksjonen er å delta i biotransformasjon og lipidsyntese. Mitokondriene er bygget opp av to membraner, en ytre som er glatt, og en indre som er veldig foldet. I mitokondriene foregår energiproduksjonen til cellen. Lysosomer, peroksisomer og andre membranblærer kan inneholde ulike enzymer som cellen trenger til degradering av forbindelser. Cytoskjelettet består av flere ulike former for fiberproteiner som bidrar til cellens struktur og bevegelse, både i cytocolen (seigtflytende væske inni cellen, og av selve cellen (flagell i sædceller). Cellemembranen er bygget opp av et lipid dobbeltlag hvor de hydrofobe gruppene (fettsyrer/hydrokarbonkjeder) vender inn i laget og de hydrofile gruppene (alkohol eller andre sidekjeder) vender ut av laget. Membranen har også perifere og integrerte membranproteiner. Proteinene er ofte reseptorer for signaler fra andre celler, eller de kan danne kanaler gjennom lipidlaget slik at forbindelser kan komme gjennom membranen.
Transport over membranen foregår ved passiv eller aktiv transport. Passiv transport foregår fra høy konsentrasjon av en forbindelse til lav konsentrasjon, uten bidrag av energi. Enkel diffusjon er en slik passiv transport der små molekyler som O 2, N 2 og CO 2 vandrer gjennom lipidlaget fra den siden av membranen som har høyest konsentrasjon. Større molekyler, som sukker, aminosyrer osv. og ioner som er ladet, må passere gjennom via proteinkanaler. Dette kalles lettet diffusjon. Aktiv transport utføres ved hjelp av energi fra hydrolyse av ATP. Transporten foregår da gjennom proteinkanaler og mot en konsentrasjonsgradient, dvs. fra lav konsentrasjon til høy konsentrasjon Oppgave 2 a) Globulære proteiner er lett løselige i vann og danner en sammennøstet tredimensjonal struktur. På overflaten av strukturen dannes det kløfter og seter hvor ligander kan feste seg. Et slik sete er det aktive setet på enzymer. Her bindes substratet som enzymet skal katalysere omdanning av. Et annet sete er det allosteriske setet hvor modulatorer (inhibitorer/aktivatorer) kan feste seg. Disse vil kunne senke eller øke aktiviteten til enzymet. Fiber proteiner er mindre løselige i vann og har høy grad av regulær sekundær struktur, så som α- helikser eller β-foldestruktur. Dette leder til en utstrakt tredimensjonal struktur som passer godt til strukturelle molekyler i muskler, hud sener osv. b) Ved isolering av proteiner fra biologisk materiale må vi kunne skille flere proteiner fra hverandre. Ulikhet i løselighet kan benyttes ved å endre betingelsene i proteinblandingen slik at de ulike proteinene feller ut ved ulike tidspunkt. Ved saltutfelling benyttes dette. Et lett løselig salt tilsettes blandingen, og dette medfører at saltionene opptar vannmolekylene slik at det blir vanskelig for proteinene å holde seg løst. De proteinene som er minst løselige vil felle ut ved lavest konsentrasjon av tilsatt salt, mens de proteinene som har høyest løselighet vil felle ut til sist. Vi kan også endre ph i proteinblandingen, og da vil det proteinet som har isoelektrisk punkt (ladning lik 0) ved ph lik løsningen lettest felle ut. Ionebytterkromatografi utnytter også at proteinene har ulik ladning ved ulike ph verdier. I en proteinblanding som ledes gjennom en ionebytterkolonne vil de ulike proteinene bli separert ut fra hvilken ladning de har og dermed hvilken affinitet de har til stasjonærfasen. c) V maks er den maksimale hastigheten en bestemt enzymkatalysert reaksjon kan ha ved bestemte betingelser med hensyn på enzymkonsentrasjon og temperatur blant annet. K M er Michaelis-Mentens konstant. Den er definert som den substratkonsentrasjonen vi har når reaksjonshastigheten er halve V maks. Konstanten ser noe om affiniteten mellom enzym og substrat. Jo mindre K M er desto større affinitet er det mellom enzym og substrat. For å finne V maks og K M i forsøket lager vi flere reaksjonsblandinger med økende substratkonsentrasjon (ONPG) i en passende fosfatbuffer. Deretter overføres 2,5 ml av en av disse blandingene til en spektrofotometer kyvette og det tilsettes 0,3 ml enzym (β-galaktosidase). Kyvetten settes ned i spektrofotometeret og omdanningen av ONPG til gulfarget ONP (produkt) kan følges. Endring i absorbanse pr 20 sek noteres, og det regnes ut reaksjonshastighet (v 0 ). Deretter analyseres de neste reaksjonsblanding på samme måte slik at vi får fem ulike
hastigheter for fem ulike substratkonsentrasjoner. En Michaelis-Mentens kurve kan dermed lages ved å plotte v 0 verdiene mot substratkonsentrasjonene [S]. Eller en Lineweaver-Burk kurve hvor 1/v 0 mot 1/[S] plottes. Ut fra disse kurvene kan V maks og K M avleses. Oppgave 3 a) Blant monosakkaridene er glukose det viktigste. Dette finner vi i blodplasma og i frukt. Glukose brukes også ofte som monomer i polysakkarider. Fruktose i små mengder i frukt, i sukrose og i polysakkarider. Galaktose i disakkaridet laktose. Stivelse, glykogen, cellulose og kitin er vanlige polysakkarider. Stivelse og glykogen er lagringspolysakkarider i henholdsvis planter og dyr. Cellulose og kitin er struturpolysakkarid i henholdsvis planter og skalldyr, sopp og alger (i cellevegg). Stivelse er opplagsnæring i planter, og består av to ulike polysakkarider: amylose og amylopektin. Amylose er lineært polymer av glukosemolekyler bundet α-1,4- glykosidisk til hverandre. Dette gir en spiralform på molekylet. Amylopektin er hovedskaleig lineært som amylose, men har forgreninger hver ca. hver 24-30 glukoseenhet. I forgreningen bindes glukosemolekylene til hverandre med α-1,6- glykosidiske bindinger. b) Karbohydratene degraderes først i munnhulen av spyttamylase. Et enzym som bryter noen av de α-1,4-glykosidiske bindingene. Degraderingen bremses i magesekken på grunn av lav ph, men øker igjen i tarmene der bukspyttamylase skilles ut. Også andre enzymer skilles ut i tarmen slik at vi får enkle glukosemolekyler. Disse tas opp via slimhinnene i tarmtottene og fraktes over i blodbanen. Her vil glukosen transporteres til cellene i kroppen som forsyner seg med glukosen ved behov. Inni cellen treffer de på enzymene i glykolysen som foregår i cytosolen. I glykolysen vil ett glukosemolekyl degraderes til to pyrodruesyremolekyler. c) Pyrodruesyren fraktes over mitokondrimembranen og inni disse organellene vil pyrodruesyren dekarboksyleres og aktiveres til acetyl-coa ved hjelp av pyrodruesyredehydrogenasekomplekset, et enzymkompleks som består av tre enzymer og fem koenzymer. Acetyl-CoA går inn i sitronsyresyklusen og acetylgruppen kondenseres med oksaleddiksyre til sitronsyre. Sitronsyresyklusen foregår i mitokondrienes matriks og funksjonen til denne er å oksidere metabolitter fullstendig til CO 2 og å frigjøre energien i disse metabolittene. Energien overføres til reduserte koenzymer (NADH og FADH 2 ) og GTP. I tillegg benytter cellen mange av mellomproduktene i sitronsyresyklusen til synteser når den har behov for det. Elektrontransportkjeden foregår i indre mitokondriemembran. I denne kjeden overføres elektroner fra de reduserte koenzymene trinnvis, via redoks aktive sentre på membranproteiner, til O 2, som reduseres til H 2 O. Det frigjøres energi ved denne elektrontransporten, og energien benyttes til å pumpe protoner over mitokondriemembranen slik at det dannes en
protongradient over indre membran. Denne protongradienten driver oksidativ fosforylering ved at protonene ledes tilbake over membranen via ATP syntase (et stort enzymkompleks som syntetiserer ATP). Oppgave 4 a) Både DNA og RNA er polynukleotider, det vil si at de er bygget opp av nukleotider i kjeder. Nukleotidene består av et sukkermolekyl (ribose eller 2- deoksyribose) en fosfatgruppe og en ringformet organisk base (A,T, G og C i DNA, I RNA er T byttet med U). Primærstrukturen til begge polynukleotiden er nukleotid/basesekvensen. RNA er enkeltkjedet, men kan tvinne seg tilbake på seg selv og danne lokale heliksstrukturer. DNA er alltid dobbeltkjedet, og de to kjedene tvinnes rundt hverandre slik at det dannes en høyredreid heliks. Heliksen dannes av hydrogenbindingene mellom basene (A-T, og G-C), og den stabiliseres av hydrofob interaksjon mellom baseparene. De to kjeden i DNA ligger antiparallelt, dvs at en ligger i 3` til 5` retning og den andre ligger i 5` til 3`retning. På denne måten dannes de mest stabile H-bindingene mellom A og T (2 H-bind) og mellom G og C (tre H-bind). Den vanligste sekundærstrukturen er en høyredreid heliks hvor det er 10 basepar pr omdreining. Det dannes en dyp og en mindre dyp grop i heliksstrukturen. b) Replikasjon er syntese av DNA ved semikonservativ mekanisme. Transkripsjon er syntese av RNA med DNA som templat. Den starter ved at enzymet RNA polymerase fester seg til promoterområdet på DNA templaten. Dette området gjenkjennes blant annet på grunn av konsensus sekvenser. DNA molekylet åpner seg ved å bryte H-bindingene i ca 17 basepar foran polymerasen. RNA polymerasen beveger seg bortover DNA templaten og leser av nukleotidrekkefølgen samtidig som den kobler RNA nukleotider, som er komplimentære til DNA templaten, til denne. DNA molekylet lukker seg igjen etter at polymerasen har passert, og den voksende RNA kjeden frigjøres gradvis fra DNA templaten. Når polymerasen når stoppområdet som et A rikt vil enzymet slippe tak i templaten blant annet ved at det dannes en hårnålsstruktur i templaten, og RNA molekylet er ferdig syntetisert. c) Proteinsyntesen foregår på ribosompartiklene. Aminoacyl-tRNA syntetase katalyserer aminosyreaktivering, som skjer i cytosolen ved at t-rna kobles til korrekt aminosyre. mrna har med seg kodon (basetripletter) for aminosyrene i proteinet i korrekt rekkefølge trna skal koble til seg aminosyrene og transportere de til ribosompartikkelen. Her vil antikodon (basetriplett) koble seg til kodon i mrna slik at aminosyrerekkefølgen i proteinet blir riktig. Initieringsfaktorene IF2 og IF3 (to proteiner) er aktive i det første trinnet i proteinsyntesen, som forgår på ribosomene. IF3 bindes til den minste
ribosomunderenheten for å hindre sammenslåing av stor og liten ribosomunderenhet før det er korrekt. IF2 bindes sammenmed GTP til ribosompartikkelen, og GTP frigjør energi ved hydrolyse i det stor underenhet festes til liten underenhet. Peptidyltransferase er et katalytisk område på ribosompartikkelen som katalyserer dannelse av peptidbinding mellom aminosyrene, som er koblet til ribosomene ved sine respektive trna.