Bioforsk Rapport Bioforsk Report Vol. 5 Nr

Transkript

1 Bioforsk Rapport Bioforsk Report Vol. 5 Nr Utvikling av en multipleks mitokondrie-dna test spesifikk for elg, rein, rødrev, mårhund og grevling Analyse av 406 ekskrementer negative for brunbjørn-dna fra innsamlingen til overvåkning av brunbjørn i Norge i 2009 Hans Geir Eiken, Mari Bergsvåg, Per M. Knappskog, Siv Grete Aarnes, Paul E. Aspholm, Ingvild Wartiainen og Snorre B. Hagen Bioforsk Jord og miljø, Svanhovd

2 Hovedkontor/Head office Frederik A. Dahls vei 20 N-1432 Ås Tel.: (+47) Bioforsk Svanhovd Bioforsk Jord og miljø Svanhovd N-9925 Svanvik Tel.: (+47) Tittel/Title: Utvikling av en multipleks mitokondrie-dna test spesifikk for elg, rein, rødrev, mårhund og grevling. Analyse av 406 ekskrementer negative for brunbjørn-dna i fra innsamlingen til overvåkning av brunbjørn i Norge i Forfatter(e)/Author(s): Hans Geir Eiken, Mari Bergsvåg, Per M. Knappskog, Siv Grete Aarnes, Paul E. Aspholm, Ingvild Wartiainen og Snorre B. Hagen Dato/Date: Tilgjengelighet/Availability: Prosjekt nr./project No.: Saksnr./Archive No.: Åpen Arkivnr Rapport nr./report No.: ISBN-nr./ISBN-no: Antall sider/number of pages: 191/ Antall vedlegg/number of appendices: Oppdragsgiver/Employer: Direktoratet for naturforvaltning Kontaktperson/Contact person: Hans Geir Eiken Stikkord/Keywords: Mitokondrie DNA, ekskrementer rødrev, elg, rein, grevling, mårhund, brunbjørn Mitochondrial DNA, feces, Red fox, Moose, Reindeer, Badger, Raccoon dog, Brown bear Fagområde/Field of work: Molekylær økologi Molecular ecology Sammendrag: Mitokondrielt DNA (mtdna) forekommer i høyt kopitall i celler, og viser sekvenser med høy spesifisitet for ulike arter. Vi har utviklet en multiplex PCR analyse for mtdna for rødrev (Vulpes vulpes), elg (Alces alces), rein (Rangifer tarandus), grevling (Meles meles) og mårhund (Nyctereutes procyonoides). Multipleks mtdna assayet ble anvendt til analyse av 406 bjørne-negative ekskrementer fra innsamlingen til overvåkning av brunbjørn i Norge i Vi har tidligere rapportert påvisning av brunbjørn-dna i 573 (58 %) av 980 ekskrementprøver fra denne innsamlingen i felten i Multipleks mtdna testen viste at elg (9,2 %) og rødrev (4,5 %) var de hyppigst forekommende forvekslingsartene i denne feltinnsamlingen. I tillegg ble det påvist grevling, rein og mårhund i et mindre antall prøver. Blandinger av to eller tre arter ble påvist i 35 prøver (3,6 %), og årsaken til dette kan være påvisning av byttedyr-dna i ekskrementene fra kjøttetere. I så fall er andelen rødrevekskrementer blant forvekslingene høyere (6,7 %) enn det som er påvist med enkelt arts bestemmelse alene (4,5 %). En mulig tilblanding av DNA fra byttedyr i ekskrement prøvene kan også ha ført til at mtdna testen viser litt for mange elg og rein, men uten at denne andelen kan bestemmes i denne studien. Samlet viser denne studien at arten kunne bestemmes for 768 (78 %) av 980 ekskrementer samlet inn i Norge i Summary: Mitochondrial DNA exists in high copy number in cells and shows sequences of high specificity for different species. We have developed a multiplex PCR analysis for mtdna for red fox (Vulpes vulpes), moose (Alces alces), reindeer (Rangifer tarandus), badger(meles meles) and raccoon dog (Nyctereutes procyonoides).the multiplex mtdna assay for the five species was applied to the

3

4 Innholdsfortegnelse 1. Sammendrag Innledning Material og Metode Resultater Diskusjon Referanser Appendiks

5 1. Sammendrag Mitokondrielt DNA (mtdna) forekommer i høyt kopitall i celler, og viser sekvenser med høy spesifisitet for ulike arter. Vi har utviklet en multiplex PCR analyse for mtdna for rødrev (Vulpes vulpes), elg (Alces alces), rein (Rangifer tarandus), grevling (Meles meles) og mårhund (Nyctereutes procyonoides). Multipleks mtdna assayet ble anvendt til analyse av 406 bjørne-negative ekskrementer fra innsamlingen til overvåkning av brunbjørn i Norge i Vi har tidligere rapportert påvisning av brunbjørn-dna i 573 (58 %) av 980 ekskrementprøver fra denne innsamlingen i felten i Multipleks mtdna testen viste at elg (9,2 %) og rødrev (4,5 %) var de hyppigst forekommende forvekslingsartene i denne feltinnsamlingen. I tillegg ble det påvist grevling, rein og mårhund i et mindre antall prøver. Blandinger av to eller tre arter ble påvist i 35 prøver (3,6 %), og årsaken til dette kan være påvisning av byttedyr-dna i ekskrementene fra kjøttetere. I så fall er andelen rødrevekskrementer blant forvekslingene høyere (6,7 %) enn det som er påvist med enkelt arts bestemmelse alene (4,5 %). En mulig tilblanding av DNA fra byttedyr i ekskrement prøvene kan også ha ført til at mtdna testen viser litt for mange elg og rein, men uten at denne andelen kan bestemmes i denne studien. Samlet viser denne studien at arten kunne bestemmes for 768 (78 %) av 980 ekskrementer samlet inn i Norge i

6 2. Innledning Bestandsovervåkning av brunbjørn (Ursus arctos) i Norge og Sverige er basert på innsamling av ekskrementprøver i felt med påfølgende DNA-analyse av prøvene. DNA-analysen for individbestemmelse er basert på multiple STR (Short Tandem Repeats) med høy informasjonsverdi (Eiken et al. 2009). I innsamlingen i Norge i 2009 var 58 % av ekskrementprøvene positive for brunbjørnindivider (Wartiainen et al. 2010), mens i en tilsvarende innsamling i Västerbotten i Sverige samme år ble det påvist brunbjørn i hele 74 % av prøvene (Eiken et al. 2010). De mange negative prøvene har likevel aktualisert spørsmålet om i hvilken grad innsamling av ekskrementer fra andre arter innvirker på resultatet. I tillegg er det vanskelig å evaluere DNA-metodenes sensitivitet på grunn av denne usikkerheten. I 2006 utførte vi en mitokondrie-dna (mtdna) test for rødrev (Vulpes vulpes) på 435 bjørne-negative ekskrementprøver fra Norge, og 17 % av disse var positive for rødrev (Bjervamoen&Eiken 2007). Mitokondrie DNA foreligger i et stort antall kopier per celle, og representerer således også en mye mer sensitiv test enn DNAanalyse basert på det kjerne-dna som er utgangspunktet for STR-analysen og identitetsbestemmelsen. Cytokrom b genet i mtdna viser liten variasjon imellom individer av samme art, men samtidig noe variasjon mellom arter, og har derfor vært brukt til å lage artsspesifikke DNA-tester. Tobe & Linacre presenterte i 2008 et muliplex assay for 18 ulike pattedyr basert på Cytokrom b -genet. Vi har i denne studien brukt denne kunnskapen for å lage et nytt mtdna mulipleks assay spesifikt for artene rødrev, elg (Alces alces), rein (Rangifer tarandus), grevling (Meles meles) og mårhund (Nyctereutes procyonoides). Prosjektet for å utvikle artsspesifikke DNA-tester for rødrev, elg, rein, grevling og mårhund ble gjort på oppdrag fra Direktoratet for naturforvaltning i Norge og Länsstyrelsen i Västerbotten i Sverige. Vi har i en tidligere rapport i år beskrevet utviklingsarbeidet og anvendelsen av mtdna-tester for fem arter på 344 brunbjørnnegative ekskrementer fra innsamlingen i Västerbotten i Sverige i 2009 (Eiken et al. 2010). I denne rapporten beskrives anvendelsen av mtdna testen for de fem artene på 406 brunbjørn-negative ekskrementer fra innsamlingen i Norge i Eiken et al. Bioforsk Rapport vol. 5 nr

7 3. Materiale og metode 3.1 DNA-analyse for brunbjørn DNA ble renset fra 980 ekskrementprøver, og tilstedeværelsen av bjørne-dna ble testet med to spesifikke DNA-analyser (STR-markører). Det ble analysert for kjønn og genotyper for 8 STR-markører (MU05, MU09, MU10, MU23, MU50, MU51, MU59, og G10L). Analysen ble utført i henhold til beskrivelse i akkreditert prosedyre. En detaljert metodebeskrivelse fås ved henvendelse til laboratoriet (metode MH101). Resultatet for bjørne-positive ekskrementprøver (n=573) og negative prøver (n=407) er beskrevet i Bioforsk rapport nr (Wartiainen et al. 2010). 3.2 Multipleks mtdna assay Universelle primere og spesifikke primere for PCR-amplifisering av cytokrom b genet i mtdna ble laget og satt sammen etter en modifisert fremgangsmåte etter Tobe & Linacre (2008). For artene mårhund, elg og rein ble helt nye, spesifikke PCR-primere konstruert i Oligo (Medprobe) og testet mot Genbank (BLAST, NCBI) for spesifisitet. Multipleks PCR ble utført etter en modifisert protokoll etter Tobe&Linacre (2008). FAM-merkede PCR produkter av spesifikk størrelse ble analysert på en ABI 3130xl Genetic Analyzer (kapillær elektroforese) (se Fig. 1). Rødrev Rein Mårhund Elg Grevling Fig. 1. Multiplex PCR-amplifisering av cytokrom b genet i mtdna for fem ulike arter. Panelet viser resultatet av kapillær elektroforese med spesifikke topper (blå og grønne fylte topper) for hver art (ca 1pg templat DNA), røde topper uten fyll viser størrelsesmarkør. 4

8 4. Resultater Utvikling av et multipleks mtdna-assay for artene rødrev, elg, grevling, rein og mårhund ble utført etter en modifisert fremgangsmåte etter Tobe & Linacre (2008). Det var mulig å utføre assayet i en PCR reaksjon med en enkelt fluorecence-farge (se Materiale og Metode). Multipleks assayet ble testet ned til >1 pg templat DNA i en blanding fra alle fem artene (se Fig. 1). I tillegg ble multipleksassayet testet med DNA fra ekskrementprøver. Alle primersett var spesifikke for ønsket art, og ga negative resultat i analyse der DNA fra andre arter ble tilsatt som templat (resultat ikke vist). Alle kontroller uten DNA eller kontroller som inneholdt bjørne-dna var negative i alle forsøk med multipleks assayet. Det ble i 2009 samlet inn 980 ekskrementprøver i Norge, og av disse var 573 positive for bjørne-dna (58 %). Av de 407 negative prøvene fra innsamlingen ble 406 prøver testet for artene rødrev, elg, grevling, rein og mårhund med multipleks mtdna-assayet (se Tabell 1 og Appendiks 1). Alle kontroller uten DNA eller med bjørne-dna var blanke i undersøkelsen. Tabell 1: Resultat fra multipleks mtdna-analyse av brunbjørn-negative ekskrementer fra innsamlingen i Norge i 2009 sammenlignet med resultatene fra innsamlingen i Västerbotten samme år. Art Antall Andel (%)av negative prøver i Norge i 2009 (n=406 1 ) Andel (%) av alle prøver i Norge i 2009 (n=980) Västerbotten (%) i 2009 (n=1341) Elg 90 22,2 9,2 4,4 Rødrev 44 10,8 4,5 7,2 Grevling 15 3,7 1,5 1,2 Rein 9 2,2 0,9 0,2 Mårhund 2 0,5 0,2 0 Blanding av arter 35 8,6 3,6 4,5 Uidentifisert art ,0 21,5 8,1 Totalt ,0 41,4 25,6 1 Totalt var det 407 negative prøver i innsamlingen i 2009, men kun 406 er med i denne studien ut fra at en prøve i ettertid er vurdert til å være fra annet materiale enn ekskrementer. Eiken et al. Bioforsk Rapport vol. 5 nr

9 Elg var den arten som hyppigst kunne påvises i innsamlingen i 2009 med 9,2 % av prøvene. Rødrev ble påvist i 4,5 % av prøvene, mens grevling, rein og mårhund kunne påvises i et mindre antall prøver (0,2-1,5 %). Sammenligner vi med den tilsvarende innsamlingen i Västerbotten samme år kan vi se at det er elg og rødrev er i motsatt rekkefølge, dvs. at rødrev er den hyppigste blant de negative prøvene og elg er nr. 2 i Västerbotten (se Tabell 1). Totalt var 195 prøver (48 %) av de 406 uidentifiserte ekskrementprøvene positive for andre arter i multipleks mtdna assayet. En kombinasjon av to ulike arter ble påvist i 34 prøver, mens i en prøve var en blanding av tre ulike arter (Tabell 2, Appendiks 1). For alle de 35 blandingsprøvene ble eksperimentet gjentatt en gang til, men med det samme resultatet for alle prøvene. Rødrev var representert i 28 av de 35 blanda prøvene, og rødrev-elg kombinasjonen var den hyppigste. Utenom rødrev-kombinasjonene var der 3 prøver hver av grevling og mårhund i kombinasjon med elg eller rein. Tabell 2. Multipleks mtdna assay: Resultater fra analyse av blanding av ulike arter i 35 av 406 ekskrementprøver Blanding mtdna Antall(n=35) Rødrev-Elg 22 Rødrev-Grevling 3 Rødrev-Mårhund 2 Grevling-Elg 3 Mårhund-Elg 2 Mårhund-Rein 1 Rein-Elg 1 Rødrev-Elg-Mårhund 1 Total 35 6

10 Den fylkesvise fordelingen av arter (Tabell 3) er kun i mindre grad avvikende fra fordelingen for landet som helhet med elg som vanligst og rødrev som nr. 2. Av mindre forskjeller kan det nevnes at for Nordland og Nord-Trøndelag er elg og rødrev omtrent likt representert. Fylkene Nordland, Sør-Trøndelag og Oppland har ellers betydelig høyere andel artsbestemte prøver enn landsgjennomsnittet, men for disse fylkene er også tallmaterialet lite. Tabell 3. Multipleks mtdna assay: Fylkesvis fordeling av påviste arter i negative prøver 2009 Hedmark Oppland Alle fylker Elg Rev Grevling Rein Mårhund Art Finnmark Troms Nordland Nord- Trøndelag Sør- Trøndelag Rødrev- Elg Andre blandinger Uidentifisert art Totalt Elg og rødrev er påvist i alle fylker i disse bjørne-negative ekskrementprøvene (Tabell 3). Videre er grevling ikke påvist alene som art i Finnmark og Troms, mens rein ikke er påvist i Hedmark. Mårhund er kun påvist alene som art i Nordland og Hedmark, men viser også i to blandingsprøver med elg fra Hedmark og i en blandingsprøve med rein fra Troms (Appendiks 1). I tillegg viser mårhund i tre prøver i blanding med rødrev, og alle disse prøvene er fra Vest-Finnmark. Eiken et al. Bioforsk Rapport vol. 5 nr

11 5. Diskusjon Multipleks mtdna assayet for de fem artene gav et entydig resultat med kjente DNAkontroller, og assayet sin sensitivitet var betydelig lavere enn 1 picogram DNA. Assayet var negativt med bjørne-dna, og enkeltvis var alle mtdna-artstestene negative for DNA fra de andre artene. I den gruppen ekskrementer fra innsamlingen i Norge i 2009 som var negative for STRer spesifikke for bjørn, kunne testen påvise andre arter for ca. halvparten av prøvene (195 av 406). Elg (9,2 %) og rødrev (4,5 %) var de hyppigst forekommende forvekslingsartene i innsamlingen. Innsamlingen vi har studert her ser ut til å ha en vesentlig lavere andel ekskrementer fra rødrev enn vi fant i en tilsvarende innsamling i Norge i 2006, som hadde hele 17 % ekskrementer positive for rødrev (Bjervamoen & Eiken 2007). Grevling, rein og mårhund var også representert blant forvekslingsartene, men i mindre antall. I en tilsvarende innsamling i Västerbotten samme år var rødrev vanligere som forvekslingsart enn elg (Eiken et al. 2010), men likevel utgjorde disse to artene til sammen hovedandelen av bestemte arter for bjørne-negative ekskrementer i begge undersøkelsene. En mindre andel av de bjørne-negative prøvene (3,6 %) viste et blandingsresultat, der en kombinasjon av to, og i et tilfelle 3 arter kunne påvises med testen. Ut fra testen alene kan dette resultatet ikke forklares. Det kan være flere ulike årsaker til at flere enn en art forekommer i en slik test, og vi har gjort følgende vurderinger: i) Påvisning av byttedyr i ekskrementer: I en nylig publisert studie er det sannsynliggjort at mtdna fra vertebrat-byttedyr kan påvises som lav-kopi DNA i ekskrementer fra dvergsjimpanse (Pan paniscus) og gorillaer (Gorilla gorilla) (Hofreiter et al. 2010). Tidligere kontrollforsøk med mating av tamme sjøløver viser lignende resultater (Deagle et al. 2005). Ut fra dette tror vi at påviste byttedyr i ekskrementene er den mest sannsynlige årsaken til våre funn av mer enn en art i en mindre andel av prøvene. I så fall er det sannsynliggjort at kjøtteterene i kombinasjon med elg og rein er fra de førstnevnte. Potensielt er da andelen av de tre artene kjøttetere noe høyere enn det Tabell 1 viser, og korrigerer vi for dette blir de summerte resultatene som følger: Rødrev utgjør 6,7 % (n = ), grevling utgjør 1,8 % (n = ) og mårhund utgjør 0,5 % (n = 2 + 3) av de innsamla ekskrementprøvene. Et lite antall prøver (n = 6) er en kombinasjon mellom disse tre kjøttetende artene, og her kan ikke opphavet bestemmes. I tillegg åpner dette en liten mulighet for at prøver med relativt svake topper av elg og rein allikevel kan være lav kopi DNA tilblandinger av byttedyr i ekskrementer fra brunbjørn, selv om de to STR-testene har vært negative (se material og metoder). Det kan også være snakk om andre kjøttetere som testen ikke inkluderer. I fremtidige mtdna tester bør kanskje et mtdna assay spesifikt for brunbjørn inkluderes i denne type studier, selv om prøvene er negative med vanlig PCR og at risikoen for oversmitting øker (se pkt. ii) under). De fleste resultatene som er positive for elg og rein i denne studien har mye templat DNA renset opp fra ekskrementene (resultater ikke vist), men likevel er mangelen på resultater fra et spesifikt brunbjørn mtdna assay en svakhet ved studien. Det er derfor mulig at andelen av elg og rein kan være litt lavere enn vist i tabell 1, men uten at denne andelen kan bestemmes. I materialet finnes et eksempel på en rein-elg prøve, og en av flere mulige forklaring på en slik prøve kan være forekomst av DNA fra byttedyr i ekskrementet uten at kjøtteter arten er bestemt. 8

12 ii) iii) Oversmitting i laboratoriet: mtdna foreligger i >1000 ganger så mange kopier som kjerne-dna, og således er risikoen for oversmitting fra andre prøver forhøyet i forhold til vanlig STR-analyse. Kontroller uten DNA kjøres for hver 11. prøve for å ha kontroll med oversmitting. I disse eksperimentene har alle kontroller vært negative. I tillegg har det vært tatt med positive kontroller for hver av de fem artene samt bjørn i hvert eksperiment, uten at tilblanding har vært observert. Eksperimentene utføres adskilt fra annen aktivitet, og de samme rutinene for PCR som for akkrediterte analyser legges til grunn. Vi bruker heller ikke DNA fra de fem nye artene rutinemessig i vårt laboratorium som er spesialisert på brunbjørn. Basert på dette tror vi sannsynligheten for oversmitting er liten, men muligheten kan selvsagt aldri utelukkes helt. Oversmitting ved innsamling: Ved håndtering av blod og vev av andre arter før innsamling av ekskrementer og ved overføring til plastpose kan oversmitting fra annen art være mulig. Teoretisk kan dette forekomme ved slakting av elg /rein og håndtering av kjøtt med påfølgende innsamling av ekskrementer. Oversmitting er en særlig risiko i en slik sammenheng siden vev og blod inneholder mye større mengder DNA enn ekskrementer. Vi tror likevel at sannsynligheten for slik oversmitting er liten med gode innsamlingsrutiner. Samlet viser dette arbeidet at for 768 ekskrementer av de 980 ekskrementene fra innsamlingen fra Norge i 2009 var mulig å bestemme arten (573 brunbjørn og 195 annen art og 1 ikke-ekskrement), dvs. DNA-ekstraksjonen og DNA-analysen har fungert for 78 % av prøvene. De 211 prøvene som gjenstår som uidentifisert art (22 %) i innsamlingen i Norge i 2009 kan være fra andre arter enn de fem vi har undersøkt for her. Prøvene kan også ha så dårlig DNA eller lavt kopitall av DNA at mtdna assayet ikke har fungert. Samme analyse av innsamlingen i Västerbotten samme år viser et noe bedre resultat (92 %), og rødrev som den hyppigste forvekslingsarten i stedet for elg som denne studien viser. Det er vanskelig å spekulere i årsakene til dette, men resultatet kan gjenspeile forskjeller i rutiner i innsamling og lagring av prøver. Det er også en mulighet for at uidentifiserte prøver kan være fra brunbjørn ut fra at mtdna-assayet er en mer sensitiv test enn STR-testene (se også pkt. i) over). En mtdna test for brunbjørn bør derfor også utvikles og brukes i slike studier, selv om dette krever strenge forholdsregler for oversmitting i laboratoriet. Vi mener rapporten viser at mtdna-tester spesifikke for utvalgte arter vil være til nytte for både forvaltning og forskning i fremtiden. Eiken et al. Bioforsk Rapport vol. 5 nr

13 6. Referanser Bjervamoen S. G. og Eiken H.G Populasjonsovervåkning av brunbjørn DNA-test for rødrev (Vulpes vulpes) utført på brunbjørn-negative eksrementprøver fra Bioforsk rapport 74:1-12. Deagle B.E., Tollit D.J., Jarman S.N., Hindell M.A., Trites A.W., Gales N.J Molecular scatology as a tool to study diet: analysis of prey DNA in scats from captive Steller sea lions. Mol Ecol 14: Eiken H. G., Andreassen, R. J., Kopatz, A., Bjervamoen, S. G., Wartiainen, I., Tobiassen, C., Knappskog, P. M., Aspholm, P. E., Smith, M. E., Aspi, J Population data for 12 STR loci in Northern European brown bear (Ursus arctos) and application of DNA profiles for forensic casework. Forensic Science International: Genetic Supplement Series 2: Eiken H.G., Bergsvåg M., Knappskog P.M., Aarnes S.G., Aspholm P.E., Wartiainen I., Hagen S.B Utvikling av en multipleks mitokondrie-dna-test spesiifikk for elg, rein, rødrev, mårhund og grevling. Analyse av 344 ekskrementer negative for brunbjørn-dna fra innsamlingen til overvåkning av brunbjørn i Västerbotten i Bioforsk rapport 126:1-21. Hofreiter M., Kreuz E., Eriksson J., Schubert G., Hohmann G Vertebrate DNA in fecal samples from Bonobos and Gorillas: Evidence for meat consumption or artefact? PLoS ONE 5(2): e9419. doi: /journal.pone Tobe S. S. and Linacre A.M A multiplex assay to identify 18 European mammal species from mixtures using the mitochondrial cytochrome b gene. Electrophoresis 29: Wartiainen, I., Tobiassen, C., Brøseth, H., Bergsvåg M, Aarnes S. G., Eiken, H. G Populasjonsovervåkning av brunbjørn : DNA analyse av prøver samlet i Norge i Bioforsk rapport 58:

14

15 7. Appendiks 1 Appendix 1. Artsspesifikk mtdna-analyse av 406 brunbjørn-negative prøver fra innsamlingen i Norge i Svanhovd ID Strekkode Resultat Tilblanding FunnDato År Fylke (-09) BF001 B Rev Elg Øst Finnmark BF004 B Elg Øst Finnmark BF006 B Elg Øst Finnmark BF007 B Elg Øst Finnmark BF009 B N Troms BF013 B N Troms BF020 B Elg Øst Finnmark BF028 B N Øst Finnmark BF035 B Rev Øst Finnmark BF039 B N Øst Finnmark BF046 B Elg Øst Finnmark BF051 B Elg Øst Finnmark BF053 B Elg Øst Finnmark BF057 B N Troms BF058 B N Troms BF060 B N Troms BF063 B N Øst Finnmark BF064 B N Øst Finnmark BF067 B Elg Øst Finnmark BF070 B Elg Øst Finnmark BF071 B N Øst Finnmark BF072 B Elg Øst Finnmark Eiken et al. Bioforsk Rapport vol. 5 nr

16 BF073 B Elg Øst Finnmark BF074 B Elg Øst Finnmark BF077 B N Øst Finnmark BF082 B Rev Elg Øst Finnmark BF083 B Rev Øst Finnmark BF084 B Rev Elg Øst Finnmark BF085 B Elg Øst Finnmark BF088 B N Øst Finnmark BF086 B Elg Øst Finnmark BF090 B Rev Øst Finnmark BF091 B Elg Øst Finnmark BF093 B Rev Elg Øst Finnmark BF094 B N Øst Finnmark BF097 B N Øst Finnmark BF099 B N Øst Finnmark BF103 B N Øst Finnmark BF111 B N Øst Finnmark BF112 B N Øst Finnmark BF113 B N Øst Finnmark BF114 B N Øst Finnmark BF115 B N Øst Finnmark BF116 B N Øst Finnmark BF117 B N Øst Finnmark BF118 B N Øst Finnmark BF121 B N Øst Finnmark BF122 B N Øst Finnmark BF123 B N Øst Finnmark BF125 B N Øst Finnmark BF127 B N Øst Finnmark BF129 B N Øst Finnmark 12

17 BF130 B N Øst Finnmark BF132 B Elg Sør Trøndelag BF133 B N Sør Trøndelag BF135 B N Sør Trøndelag BF143 B N Øst Finnmark BF144 B N Øst Finnmark BF145 B N Øst Finnmark BF146 B N Øst Finnmark BF147 B N Øst Finnmark BF148 B N Øst Finnmark BF149 B N Øst Finnmark BF150 B N Øst Finnmark BF151 B N Øst Finnmark BF152 B N Øst Finnmark BF157 B Elg Nord Trøndelag BF158 B Elg Nord Trøndelag BF160 B Elg Nord Trøndelag BF166 B N Nord Trøndelag BF167 B Elg Øst Finnmark BF168 B Elg Øst Finnmark BF169 B Elg Øst Finnmark BF170 B N Øst Finnmark BF174 B N Øst Finnmark BF186 B N Øst Finnmark BF187 B N Øst Finnmark BF188 B N Øst Finnmark BF189 B Elg Øst Finnmark BF190 B Elg Øst Finnmark BF192 B Elg Øst Finnmark BF193 B Elg Øst Finnmark Eiken et al. Bioforsk Rapport vol. 5 nr

18 BF198 B Elg Øst Finnmark BF199 B N Øst Finnmark BF201 B N Øst Finnmark BF205 B Elg Øst Finnmark BF206 B Elg Øst Finnmark BF207 B Elg Øst Finnmark BF214 B N Øst Finnmark BF215 B N Øst Finnmark BF217 B Rein Nordland BF218 B N Nordland BF219 B Rev Nordland BF221 B N Nordland BF222 B N Nordland BF223 B Rein Nordland BF224 B Elg Nordland BF225 B N Nordland BF226 B N Nordland BF227 B N Nordland BF228 B N Nordland BF231 B Elg Nordland BF232 B Elg Nordland BF233 B Rev Nordland BF234 B Rev Elg Sør Trøndelag BF236 B N Sør Trøndelag BF237 B N Sør Trøndelag BF238 B N Sør Trøndelag BF239 B Rev Sør Trøndelag BF240 B N Sør Trøndelag BF242 B N Sør Trøndelag BF243 B Elg Sør Trøndelag 14

19 BF244 B N Sør Trøndelag BF245 B Elg Sør Trøndelag BF246 B Elg Sør Trøndelag BF247 B Elg Sør Trøndelag BF248 B Elg Sør Trøndelag BF249 B Elg Sør Trøndelag BF252 B Elg Sør Trøndelag BF254 B Elg Sør Trøndelag BF255 B Rein Sør Trøndelag BF256 B N Sør Trøndelag BF258 B Elg Sør Trøndelag BF265 B N Troms BF266 B Rein / Mårhund Troms BF267 B N Troms BF268 B N Troms BF269 B N Troms BF270 B Rein Troms BF271 B N Troms BF272 B N Troms BF273 B N Troms BF274 B N Troms BF279 B N Øst Finnmark BF281 B Elg / Grevling Nord Trøndelag BF286 B N Nord Trøndelag BF290 B N Nord Trøndelag BF291 B N Nord Trøndelag BF292 B N Nord Trøndelag BF294 B N Nord Trøndelag BF295 B N Nord Trøndelag BF296 B N Nord Trøndelag Eiken et al. Bioforsk Rapport vol. 5 nr

20 BF299 B N Nord Trøndelag BF304 B N Nord Trøndelag BF307 B Rev Nord Trøndelag BF308 B N Nord Trøndelag BF312 B N Nord Trøndelag BF313 B N Nord Trøndelag BF314 B N Nord Trøndelag BF315 B Elg Nord Trøndelag BF318 B N Nord Trøndelag BF321 B Elg Nord Trøndelag BF323 B N Nord Trøndelag BF324 B N Nord Trøndelag BF326 B N Nord Trøndelag BF328 B Rev Nord Trøndelag BF330 B Rev Nord Trøndelag BF331 B N Nord Trøndelag BF332 B N Nord Trøndelag BF342 B N Nord Trøndelag BF344 B Elg Nord Trøndelag BF348 B Rev Nord Trøndelag BF352 B N Nord Trøndelag BF353 B N Nord Trøndelag BF354 B N Nord Trøndelag BF355 B Elg Nord Trøndelag BF360 B Elg Nord Trøndelag BF361 B N Nord Trøndelag BF362 B N Nord Trøndelag BF366 B N Nord Trøndelag BF368 B N Nord Trøndelag BF369 B N Nord Trøndelag 16

21 BF372 B N Nord Trøndelag BF381 B N Nord Trøndelag BF383 B N Nord Trøndelag BF384 B Rev Nord Trøndelag BF389 B Rev Nord Trøndelag BF394 B Rev Nord Trøndelag BF397 B Rev Nord Trøndelag BF399 B N Nord Trøndelag BF400 B Rev Nord Trøndelag BF401 B Rev Nord Trøndelag BF408 B N Øst Finnmark BF409 B N Øst Finnmark BF412 B Rev Øst Finnmark BF413 B N Øst Finnmark BF415 B Rein Øst Finnmark BF416 B Rein Øst Finnmark BF417 B N Øst Finnmark BF418 B N Øst Finnmark BF419 B N Øst Finnmark BF422 B N Hedmark BF427 B Elg Hedmark BF429 B N Hedmark BF430 B N Hedmark BF431 B N Hedmark BF432 B N Hedmark BF433 B Elg Hedmark BF435 B N Hedmark BF436 B N Hedmark BF437 B Elg Hedmark BF438 B N Hedmark Eiken et al. Bioforsk Rapport vol. 5 nr

22 BF441 B N Hedmark BF443 B N Hedmark BF444 B Elg Hedmark BF445 B N Hedmark BF446 B N Hedmark BF450 B Elg Hedmark BF453 B Elg Hedmark BF454 B Elg / Mårhund Hedmark BF457 B Grevling Hedmark BF458 B Elg Hedmark BF461 B Rev Hedmark BF462 B Elg Hedmark BF463 B N Hedmark BF464 B Rev Hedmark BF465 B N Hedmark BF471 B N Hedmark BF472 B N Hedmark BF475 B Elg Hedmark BF476 B Rev Hedmark BF478 B Rev (Elg) Hedmark BF480 B Rev Hedmark BF481 B N Hedmark BF482 B Elg Hedmark BF483 B N Hedmark BF486 B Elg Hedmark BF489 B Elg Hedmark BF491 B N Hedmark BF492 B N Hedmark BF494 B Elg Hedmark BF497 B Mårhund Hedmark 18

23 BF499 B Rev Hedmark BF501 B N Hedmark BF506 B N Øst Finnmark BF508 B N Øst Finnmark BF510 B N Øst Finnmark BF511 B Elg Øst Finnmark BF518 B N Øst Finnmark BF529 B N Vest Finnmark BF543 B N Øst Finnmark BF544 B N Troms BF562 B N Øst Finnmark BF564 B N Øst Finnmark BF566 B Rev Øst Finnmark BF581 B Elg / Rein Øst Finnmark BF582 B Rein Øst Finnmark BF583 B Elg Øst Finnmark BF584 B Elg Rev Øst Finnmark BF585 B Grevling Elg Øst Finnmark BF586 B Rev / Elg Vest Finnmark BF588 B Rev / Elg Vest Finnmark BF591 B Rev Vest Finnmark BF592 B Rev Elg Vest Finnmark BF593 B Rev Elg Vest Finnmark BF594 B Rev Mårhund Vest Finnmark BF595 B Rev Elg / Mårhund Vest Finnmark BF596 B Rev Mårhund Vest Finnmark BF600 B N Hedmark BF604 B N Hedmark BF609 B Elg Hedmark BF610 B Rev Hedmark Eiken et al. Bioforsk Rapport vol. 5 nr

24 BF621 B N Hedmark BF622 B Grevling Oppland BF624 B Rev Oppland BF626 B N Oppland BF629 B Rein Oppland BF630 B N Oppland BF632 B Grevling Oppland BF633 B Elg Oppland BF635 B Elg Oppland BF636 B N Oppland BF637 B Elg Oppland BF638 B Elg Oppland BF639 B Elg Oppland BF642 B N Oppland BF653 B Elg Troms BF657 B Elg Troms BF659 B Rev Troms BF660 B Rev Troms BF663 B N Troms BF664 B N Troms BF666 B Elg Troms BF669 B N Troms BF673 B Elg Troms BF677 B N Troms BF681 B N Troms BF682 B N Troms BF684 B N Troms BF687 B N Troms BF691 B N Troms BF694 B N Troms 20

25 BF698 B N Troms BF700 B N Troms BF702 B Elg Troms BF706 B Elg Troms BF707 B N Troms BF711 B Grevling Sør Trøndelag BF713 B Elg Sør Trøndelag BF714 B Grevling Sør Trøndelag BF716 B Grevling Sør Trøndelag BF717 B Elg Sør Trøndelag BF718 B Rev Elg Sør Trøndelag BF723 B Grevling Sør Trøndelag BF725 B Rev Sør Trøndelag BF727 B N Sør Trøndelag BF728 B N Sør Trøndelag BF729 B Elg Sør Trøndelag BF730 B N Sør Trøndelag BF732 B Elg Sør Trøndelag BF733 B N Sør Trøndelag BF735 B Grevling Sør Trøndelag BF736 B N Sør Trøndelag BF747 B Rev Hedmark BF750 B Rev Elg Hedmark BF751 B Rev Elg Hedmark BF752 B Rev Hedmark BF756 B Rev Hedmark BF757 B N Hedmark BF759 B Elg Hedmark BF762 B N Hedmark BF763 B Rev Grevling Hedmark Eiken et al. Bioforsk Rapport vol. 5 nr

26 BF765 B N Hedmark BF767 B Elg Rev Hedmark BF772 B Rev Hedmark BF776 B Elg Hedmark BF777 B Rev Hedmark BF778 B Elg Hedmark BF780 B N Hedmark BF784 B Elg Hedmark BF787 B N Hedmark BF788 B N Hedmark BF792 B Grevling Elg Hedmark BF796 B N Hedmark BF802 B Grevling Hedmark BF803 B Elg Mårhund Hedmark BF806 B Rev Hedmark BF809 B Rev Hedmark BF811 B Rev Elg Nordland BF812 B N Nordland BF813 B Rev Grevling Nordland BF814 B Rev Nordland BF815 B Rev Nordland BF816 B Elg Nordland BF818 B Rev Nordland BF820 B Rev Elg Nordland BF821 B N Nordland BF822 B Elg Nordland BF824 B Grevling Nordland BF825 B Elg Nordland BF826 B Elg Nordland BF827 B Rev Elg Nordland 22

27 BF835 B N Nord Trøndelag BF853 B N Nord Trøndelag BF854 B N Nord Trøndelag BF856 B N Nord Trøndelag BF857 B Rein Nord Trøndelag BF859 B N Nord Trøndelag BF860 B N Nord Trøndelag BF864 B N Nord Trøndelag BF865 B N Nord Trøndelag BF866 B Elg Nord Trøndelag BF870 B N Nord Trøndelag BF873 B Rev Elg Nord Trøndelag BF877 B N Nord Trøndelag BF884 B Elg Nord Trøndelag BF887 B N Nord Trøndelag BF889 B N Nord Trøndelag BF892 B N Nord Trøndelag BF903 B N Nord Trøndelag BF907 B N Nord Trøndelag BF909 B N Nord Trøndelag BF913 B Grevling Nord Trøndelag BF915 B N Nord Trøndelag BF917 B N Nord Trøndelag BF921 B Elg Nord Trøndelag BF933 B N Nord Trøndelag BF937 B N Nord Trøndelag BF938 B Elg Nord Trøndelag BF940 B N Nord Trøndelag BF948 B N Nord Trøndelag BF949 B N Nord Trøndelag Eiken et al. Bioforsk Rapport vol. 5 nr

28 BF950 B N Nord Trøndelag BF952 B N Nord Trøndelag BF954 B N Nord Trøndelag BF956 B Elg Nord Trøndelag BF963 B Rev Nord Trøndelag BF965 B N Nord Trøndelag BF970 B N Nord Trøndelag BF971 B Rev Nord Trøndelag BF972 B N Nord Trøndelag BF973 B Rev Nord Trøndelag BF974 B Rev Nord Trøndelag BF975 B Grevling Nord Trøndelag BF976 B Rev Nord Trøndelag BF977 B N Nord Trøndelag BF978 B Rev Elg Nord Trøndelag BF979 B Grevling Nord Trøndelag BF980 B Rev Elg Nord Trøndelag BF982 J Grevling Nord Trøndelag BF983 B Rev Nord Trøndelag BF985 B N Nord Trøndelag BF986 B Grevling Nord Trøndelag BF987 B Elg Nord Trøndelag BF989 B Grevling Nord Trøndelag BF991 B N Øst Finnmark BF994 B Rev Øst Finnmark BF997 B Rev Nordland BF998 B Mårhund Nordland BF1000 B Elg Nordland BF1001 B Rev Grevling Nordland BF1002 B Rev / Elg Nordland 24

29 BF1003 B Rev Nordland BF1004 B Rev Elg Vest Finnmark BF1005 B N Vest Finnmark BF1006 B Grevling Nord Trøndelag Eiken et al. Bioforsk Rapport vol. 5 nr