Offentlig høring om søknad EFSA/GMO/NL/2009/70 under EU-forordning 1829/2003 MON 87460 mais

Matbakteriologi og GMO Direktoratet for naturforvaltning Tungasletta 2 7485 TRONDHEIM Sentralbord: +47 23216000 Fax: +47 23216001 Saksbehandler: Arne Holst-Jensen E-post: arne.holst-jensen@vetinst.no Direktelinje: +47 23216243 Ref: 2010/1524 ART-BI-BRH Vår ref: 10/00192 Dato :13.4.2010 Offentlig høring om søknad EFSA/GMO/NL/2009/70 under EU-forordning 1829/2003 MON 87460 mais Bakgrunn Vi viser til brev fra Direktoratet for naturforvaltning datert 8. februar 2010 vedrørende offentlig høring av søknad EFSA/GMO/NL/2009/70 under EU forordning 1829/2003. Søknaden gjelder import og bruk av maisen (Zea mays) MON 87460 (OECD kode MON-8746Ø-4) i mat og fôr i EU, og er fremmet overfor myndighetene i Nederland. MON 87460 har en genetisk modifikasjon som gjør den mer motstandsdyktig mot tørke. Søknaden er fremmet av Monsanto Company. Genmodifiseringen Maisen MON 87460 er konstruert ved hjelp av plantebakterien Agrobacterium tumefaciens. Denne bakterien er vanlig i jordsmonnet og er en plantepatogen som kan overføre sitt eget plasmid DNA til plantens eget genom. Endringer av denne naturlige prosessen har gjort det mulig å bruke A. tumefaciens til plantetransformering uten å gi skadelige effekter på planten. Agrobacterium-mediert plantetransformering involverer bruk av en modifisert DNA-vektor som inneholder to såkalte grensesekvenser, kalt Left Border (LB) og Right Border (RB). Gener som skal settes inn i en plante sitter da mellom disse to grensesekvensene. Ved bruk av et slikt system er det bare deler av LB og RB og genene som sitter mellom LB og RB som settes inn i plantens arvemateriale. MON 87460 mais har fått satt inn to gener. Begge disse genene sitter sammen i ett konstrukt mellom LB og RB-sekvensene. Det ene genet koder for Cold shock protein B (CspB) som stammer fra bakterien Bacillus subtilis. Dette er en Gram-positiv bakterie som er vanlig forekommende i jordsmonnet (Madigan og Martinko, 2005). Bacillus subtilis brukes både i matproduksjon og som probiotikum og regnes som trygg med tanke på humant konsum. CspB proteinet er et såkalt chaperon som binder til cellenes nukleinsyrer (RNA) og gir større toleranse for stress som bl.a. kulde og redusert vanntilgang. DNA sekvensen til cspb-genet i MON 87460 er endret for å oppnå mer optimal kodebruk for uttrykk i mais. Aminosyresekvensen til CspB fra MON 87460 er derimot lik aminosyresekvensen til CspB fra B. subtilis, med unntak av en endring av aminosyre nr 2 i CspB fra leucin til valin. MON 87460 er den første genmodifiserte planten med uttrykk av CspB som er søkt godkjent for import til bruk i mat og fôr i EU. Det andre genet som er satt inn i MON 87460 mais, er nptii, som koder for enzymet neomycin fosfotransferase II fra tarmbakterien Eschericia coli. Dette enzymet gjør planten motstandsdyktig mot antibiotikaene kanamycin og neomycin. Dette genet ble brukt for å kunne plukke ut planteceller som

har fått satt inn cspb-genet under konstruksjon av MON 87460 mais. En rekke genmodifiserte planter har fått tilført nptii-genet. I MON 87460 mais er nptii-genet lokalisert mellom to loxp-dna elementer. Enzymet Cre rekombinase fra bakteriofagen P1 kan fjerne gener som sitter mellom to loxp-dna elementer, men uvisst av hvilken grunn har ikke nptii genet blitt fjernet fra denne GMOen. Eschericia coli finnes naturlig i mage-tarm systemet hos mennesker og andre vertebrater og nptii-genet er vurdert av EFSA (2007) til ikke å utgjøre noen risiko ved bruk i GM-planter. Bruk av gener som koder for antibiotikaresistens, som nptii-genet, til konstruksjon av GM-planter er likevel omdiskutert. I Norge er omsetning av genmodifiserte næringsmidler og fôrvarer som inneholder funksjonelle antibiotikaresistensgener forbudt gjennom forskrift (FOR-2000-03-04-257; FOR-2002-11-07-1290). Ved analyse av det innsatte genelementet i MON 87460 viste det seg at 22 basepar av maisens eget DNA mangler der hvor det nye genelementet er satt inn. I tillegg mangler RB og deler av promoterelementet til CspB genet i det innsatte genelementet. Trunkeringen av promoterelementet ser ikke ut til å hemme uttrykk av CspB i MON 87460. Southern blott-analyser viser at det innsatte genelementet bare forekommer ett sted i maisens genom og at det bare forekommer i 1 kopi. Southern blott viser også at det bare er selve genelementet som ligger mellom RB og LB som er satt inn i maisens genom og ikke uønskede DNA-elementer fra resten av plasmidvektoren. Ved å analysere hvordan det innsatte genelementet arves over flere generasjoner, har søker vist at genelementet er satt inn i maisens genom i kjernen, og ikke i kloroplast- eller mitokondrie-genomet. Sporbarhet og merking Veterinærinstituttet er nasjonalt referanselaboratorium for GMO, og er derfor spesielt opptatt av å sikre at alle GMOer er sporbare. Sporbarhet forutsetter tilgjengelige påvisningsmetoder og relevant referansemateriale. Disse behovene dekkes delvis gjennom EUs forordning 1829/2003 som krever at søker leverer en spesifikk metode og referansemateriale til EUs Community Reference Laboratory (CRL). Søker har dokumentert at de innsatte gensekvensene forekommer i én kopi, og at kopien er identisk med de opprinnelige gensekvensene fra klonings-/transformasjonsvektoren, basert på både Southern blott-analyser og sekvensering av hele det innsatte genelementet. De flankerende sekvensene (fra maisens genom) er også sekvensert. Ved hjelp av Southern blott-analyser mener søker å ha vist at sekvensen til det innsatte genelementet var stabil over flere generasjoner. En slik stabilitet er viktig med tanke på både sporbarhet og opprettholdelse av funksjon til det innsatte genelementet. En slik analyse bør etter Veterinærinstituttets syn utføres ved sekvensering av DNA og ikke ved hjelp av Southern blott-analyser. Southern blott vil ikke kunne avsløre mindre endringer i basesekvens. Slike mindre forandringer i basesekvens kan få stor betydning for GMOpåvisningsmetodene som benyttes i Europa (inkludert Norge), da disse er basert på polymerase kjedereaksjons (PCR)-teknologi (Morisset et al., 2009). I henhold til gjeldende regelverk i Norge og EU stilles det ikke krav til å dokumentere at basesekvensen i sertifisert frømateriale av GMO er uendret i forhold til det som er beskrevet i søknad om godkjenning. Det er flere kjente eksempler på at basesekvenser i kommersielle GMO er endret i forhold til det som er beskrevet i søknad om godkjenning og/eller søkers metode til CRL: MON 810 mais (Aguilera et al., 2008; Aguilera et al., 2009), MON 863 mais (Holst-Jensen, 2009) og TC1507 mais (Morisset et al., 2009). Takket være den teknologiske utviklingen er DNA-sekvensering nå svært rimelig og enkelt å utføre. Veterinærinstituttet ønsker på denne bakgrunn at sekvensen på innskuddet inkludert flankene offentliggjøres og mener at det som et minimum må være hensiktsmessig å innføre krav om å dokumentere at sertifiserte frø lar seg påvise med de offisielle CRL metodene. Utilsiktet genmodifisert mais i miljø Mais er levende frø og spirer under gunstige betingelser, også i Norge, men mais kan ikke spre seg naturlig og har ingen ville slektninger den kan krysses med i Europa. Mais vokser derfor dårlig som ugress og tåler i tillegg ikke frost. Spredning til miljø i Norge er derfor svært usannsynlig. Side 2 av 5

Utilsiktet genmodifisert mais i felt Søker vil ikke tillate at frø av MON 87460 mais tas fra egen avling. Bønder som ønsker å dyrke MON 87460 mais må derfor kjøpe nye frø hvert år. Dette vil sikre en viss kontroll med utilsiktet spredning, men medfører også at nye (sertifiserte) frø må fremstilles hvert år. Tyveri av frø fra antatt attraktive sorter er et velkjent fenomen, ikke minst i land med lavt utdanningsnivå og høy fattigdom. Det er derfor en teoretisk mulighet for at maiskorn fra MON 87460 kan forurense mais-såvare f.eks. ved uhell eller tyveri. Ved spredning til miljø eller utilsiktet forurensing av annen mais kan CspB proteinet fra MON 87460 gi GM maisen en fordel i tørrere strøk, og derved sørge for at GM-andelen av frø blir konstant eller kanskje til og med øker over tid. Maisdyrking er forholdsvis nytt i Norge og mengden som dyrkes er beskjeden. Spredning av MON 87460 til mais-såvare i Norge er derfor svært usannsynlig. Helse- og miljørisiko Veterinærinstituttet kjenner ikke til spesielle forhold ved MON 87460 mais som skulle tilsi at den i seg selv representerer en større miljø- eller helserisiko enn foreldreplanten. Næringsinnholdet til MON 87460 er tilsvarende det man finner i foreldreplanten, både under normale betingelser og ved begrenset tilgang på vann. Innholdet av de to antatt viktigste antinæringsstoffene og de to antatt viktigste sekundære metabolittene i mais (OECD, 2002) som potensielt kan assosieres med stress ble også undersøkt uten at det ble påvist endringer i forhold til normale nivåer i mais, under både normale vekstbetingelser og ved redusert tilgang på vann. Det er utført akutt toksisitetsforsøk i mus med høye doser av CspB produsert i E.coli og dette gav ingen indikasjoner på at CspB proteinet medfører negative effekter på mus. CspB fra MON 87460 har endret aminosyre nr 2 fra leucin til valin og mangler i tillegg metionin i posisjon 1. Det går ikke klart frem av søkers dokumentasjon om aminosyresekvensen på CspB fra E.coli er identisk med aminosyresekvensen på CspB produsert i MON 87460 mais. Dette bør derfor avklares. Søker har også utført fôringsstudier i rotter og broilere og disse studiene gav ingen indikasjoner på at det er negative effekter forbundet med bruk av MON 87460 i fôr. Vi kan ikke se at fôringsstudier har blitt utført med planter som har vokst under stress (tørke). CspB blir konstitutivt uttrykt i MON 87460. Selv om planter normalt uttrykker proteiner som er homologe til CspB proteinet, er uttrykk av disse under kontroll av ulike stressfaktorer. Feltforsøk viser at MON 87460 gir større avling enn vanlig mais under tørke, noe som viser at CspB proteinet endrer plantens stressrespons. Det er derfor ønskelig at søker undersøker om denne endrede stressresponsen kan ha effekter i fôringsstudier. I MON 87460 er aminosyre nr 2 hos CspB-proteinet endret fra leucin til valin, i tillegg mangler metionin i posisjon 1. Vi kan ikke se at søker har analysert om dette kan medføre en endret effekt og/eller funksjon av CspB i MON 87460 sammenliknet med CspB fra B. subtilis. Søker viser at CspB uttrykt i mais binder til RNA men ikke til DNA i mais. Søker har også vist at CspB uttrykt i E. coli binder til RNA fra mais, men det går ikke klart frem av søkers dokumentasjon om aminosyresekvensen på CspB fra E.coli er identisk med aminosyresekvensen på CspB produsert i MON 87460 mais. Søker har ikke gjort en direkte sammenlikning mellom CspB fra MON 87460 og CspB med original aminosyresekvens med tanke på binding til RNA. Veterinærinstituttet ønsker derfor at søker utfører en slik analyse. Et nytt genelement kan settes inn i både kodende og ikke-kodende områder av maisens genom. Settes et nytt genelement inn i et gen i maisens genom, vil uttrykk av dette maisgenet bli slått av. Settes genelementet inn i ikke-kodende områder, kan uttrykk av nærliggende mais-gen påvirkes, ettersom uttrykk av et gen ofte er regulert av ikke-kodende sekvenser som ligger i nærheten av dette genet. I tillegg til disse mulige effektene på uttrykk av maisens egne gener, kan man potensielt få dannet nye gener i overlappende områder mellom maisens genom og det innsatte genelementet. Ved hjelp av bioinformatiske analyser har søker vist at det er lite sannsynlig at det innsatte genelementet i MON 87460 sitter inne i et eksisterende gen i maisens eget genom. Søker har også analysert for eventuelt uttrykk av nye potensielle gener på selve innsettingsstedet til det nye genelementet i maisens genom ved hjelp av bioinformatikk. Vi kan ikke se at søker har undersøkt om det nye genelementet kan påvirke uttrykk av nærliggende maisgen. Veterinærinstituttet ønsker derfor at søker utfører en slik analyse. MON 87460 inneholder nptii-genet flankert av to loxp-elementer. Dette gjør at nptii-genet kan fjernes ved hjelp av Cre rekombinase fra bakteriofag P1. Ved hjelp av samme enzym kan nptii-genet også potensielt overføres til annet DNA som inneholder loxp-elementer. Bakteriofag P1 er et virus som infiserer E. coli og andre tarmbakterier. Ettersom bakteriofag P1 og E. coli forekommer i tarm, ønsker Side 3 av 5

Veterinærinstituttet at det utredes om tilstedeværelse av loxp-elementer i GMO kan øke muligheten for horisontal genoverføring fra GMO til bakterier. Bærekraft, etikk og samfunnsnytte Norsk regelverk stiller spesielle krav til bærekraft, etikk og samfunnsnytte som forutsetning for eventuell godkjenning av GMO. Dette er ikke uproblematisk fordi det ikke eksisterer noen felles internasjonale retningslinjer for hvordan disse forholdene skal vurderes. Søkere har derfor begrenset mulighet til å dokumentere at en aktuell GMO bidrar til økt bærekraft og/eller er etisk mer forsvarlig enn eksisterende ikke-genmodifiserte plantelinjer på markedet. Selv om søker eventuelt investerte i å fremskaffe omfattende dokumentasjon på den aktuelle GMOens påvirkning på CO 2 -regnskap, energiregnskap, jordbearbeiding og erosjon, avlingsstørrelse, sekundære problemer som mykotoksiner etter insektangrep, osv., så er tilsvarende dokumentasjon for ikke-genmodifiserte alternativer ikke, eller bare i liten grad, tilgjengelig. I mangel av klare og harmoniserte retningslinjer og dokumentasjon for sammenligning må diskusjonen om bærekraft, etikk og samfunnsnytte derfor måtte bli preget av kvalifisert synsing, snarere enn av faktakunnskap og vitenskapelig evaluering. Veterinærinstituttet er derfor av den oppfatning at det ikke er mulig å gi en tilfredsstillende vurdering av disse aspektene i behandlingen av den aktuelle søknaden. Veterinærinstituttet ønsker å styrke muligheten for å trekke inn bærekraft, etikk og samfunnsnytte både i vurderingen av hver enkelt GMO og i den generelle debatten omkring genteknologi og annen foredlingsteknologi som svar på store globale utfordringer omkring matvaresikkerhet, mattrygghet, miljøvern og klimaendringer. Forutsetningen for at dette skal være mulig er både økt internasjonal oppmerksomhet på bærekraft, etikk og samfunnsnytte, og finansiering av forskning på disse forholdene, ikke begrenset til genteknologi. Veterinærinstituttet bidrar aktivt til å øke den internasjonale oppmerksomheten, bl.a. gjennom deltakelse i internasjonale fora. Konklusjon Veterinærinstituttet stiller seg negativ til godkjenning av søknaden, med henvisning til at MON 87460 mais inneholder funksjonelt antibiotikaresistensgen, noe som er i strid med norske forskrifter. Utover dette ønsker Veterinærinstituttet at søker pålegges å utvide dokumentasjonen i forhold til seks spørsmål: Veterinærinstituttet ønsker at det utredes om tilstedeværelse av loxp-elementer på hver side av antibiotikaresistensgenet nptii i MON 87460 mais kan øke muligheten for horisontal genoverføring fra GMOen til bakterier. Veterinærinstituttet ønsker at stabiliteten til tilførte gener og flankerende områder dokumenteres på grunnlag av DNA sekvensering, ikke bare på grunnlag av Southern blott analyser. Veterinærinstituttet ønsker at DNA sekvensen i tilførte gener og flankerende områder i den kommersielle GMOen offentliggjøres. Veterinærinstituttet ønsker at fôringsstudier også utføres med MON 87460 som har vokst under stress (tørke). Veterinærinstituttet ønsker at søker sammenlikner funksjon av CspB i MON 87460 med CspB som har original aminosyresekvens. Veterinærinstituttet ønsker at det utføres en genetisk analyse der det undersøkes om det nye genelementet påvirker uttrykk av nærliggende gen til innsettingsstedet i maisens genom. Veterinærinstituttet etterlyser også en klargjøring fra myndighetene i forhold til retningslinjer og regelverk for å dokumentere bærekraft, etikk og samfunnsnytte. Vennlig hilsen Arne Flåøyen Avdelingsdirektør Avd. for fôr- og mattrygghet Arne Holst-Jensen Forsker, dr. scient. Fagansvarlig GMO Side 4 av 5

Referanser: Aguilera,M., Querci,M., Balla,B., Prospero,A., Ermolli,M. & Van den Eede,G. (2008). A qualitative approach for the assessment of the genetic stability of the MON 810 trait in commercial seed maize varieties. Food Analytical Methods 1(4):252-258. Aguilera,M., Querci,M., Pastor,S., Bellocchi,G., Milcamps,A. & Van den Eede,G. (2009). Assessing copy number of MON 810 integrations in commercial seed maize varieties by 5' event-specific realtime PCR validated method coupled to 2-DDCt analysis. Food Analytical Methods 2(1):73-79. FOR-2000-03-04-257. Forskrift om forbud mot visse genmodifiserte næringsmidler og næringsmiddelingredienser FOR-2002-11-07-1290. Forskrift om fôrvarer. Holst-Jensen,A. (2009). Final report on the target analyte instability bias studies - Deliverable D6.10 of the Co-Extra project. s.1-40. http://www.coextra.eu EFSA (2007). Statement of the Scientific Panel on Genetically Modified Organisms on the safe use of the nptii antibiotic resistance marker gene in genetically modified plants. Tilgjengelig online: http://www.efsa.europa.eu/en/scdocs/doc/742.pdf Madigan,M. and Martinko,J. (editor) (2005). Brock Biology of Microorganisms (11th ed.). ISBN 0-13- 144329-1 Morisset,D., Demsar,T., Gruden,K., Vojvoda,J., Stebih,D. & Zel,J. (2009). Detection of genetically modified organisms - closing the gaps. Nature Biotechnology 27(8):700-701. OECD (2002). Consensus document on compositional considerations for new varieties of maize (Zea mays): key food and feed nutrients, anti-nutrients and secondary plant metabolites. Organization for economic co-operation and development, Paris, Frankrike. ENV/JM/MONO(2002)25. Side 5 av 5