Forelesninger i BI 212 - Cellebiologi - Våren 2002 Protein Sorting- Kap. 17 Tor-Henning Iversen, Plantebiosenteret (PBS),Botanisk institutt,ntnu e-mail : Tor- Henning.Iversen@chembio chembio.ntnu.no Tlf. 73 59 60 87 PBS`s hjemmeside (hvor forelesningene er samlet) ; www.plantebiosenteret.no
Emner som gjennomgåes i Kap. 17 Innledning Syntese og mål for mitokondrie- og kloroplast-proteiner (Del 17.1) : Syntese av mitokondrie-proteiner i cytosol Cytosol chaperoner og mitokondrie-membranen Betydning av matrix chaperoner og chaperoniner Betydningen av eksperimenter med chimeriske proteiner Energikrav ved opptak av mitokondrie-proteiner Veiene for mitokondrie-proteiner Veiene for opptak fra cytosol av kloroplast-proteiner Syntese og mål for peroxisom -proteiner ( Del 17.2) : Målsekvenser for proteiner til peroxisom-matriks Visse sykdommer skyldes genetisk defekt ved opptak av peroxisomproteiner
Emner som gjennomgåes i Kap. 17 Oversikt over de sekretoriske syntese- og transportveier (Del 17.3): Transportveien for sekretoriske proteiner Forsøk med gjærcelle-mutanter ledet til kunnskap om transportveier Modningsprosesser i Golgi avgjør transportretninger Glykoproteiner i plasmamembraner -sml. med sekretoriske proteiner Transport av sekretoriske proteiner over ER-membranen (Del 17.4): Betydningen av signalsekvenser Signalsekvenser og ER-membranen Via transmembran-proteiner til ER lumen GTP-hydrolyse av betydning for protein-transport til ER Post-translasjonell modifisering og kvalitetskontroll i r-er (Del 17.6) : Dannelse av disulfid-bindinger Foldinger av proteinet Samling til multimere proteiner Kun riktig foldete proteiner blir transportert fra ER til Golgi Proteiner transportert fra ER til cis-golgi blir hentet tilbake til ER
Innledning I en dyrecelle med opp til 10.000 ulike proteiner må hvert enkelt til enhver tid være lokalisert på riktig sted - i en membran eller et vandig miljø. Mange av proteinene må derfor sorteres og transporteres - f.eks. må RNA- og DNA-polymeraser sendes inn i kjernen. Denne prosessen - å dirigere et nylig syntetisert protein til sitt spesielle virkeområde - kalles protein targeting eller protein sorting. Sorteringen kan skje på ulike nivåer ; proteiner kodet for av DNA i kloroplaster og mitokondrier syntetiseres av ribosomer på stedet og blir der, proteiner i disse og andre organeller kodes fra kjerne-dna og syntetiseres på ribosomer i cytosol med påfølgende signaler for fordeling til resp. brukersted.
Innledning (forts.) En sentral figur (Figure 17-1) gir en oversikt over sortering av nascente proteiner fra cytosoliske ribosomer : Etter modifikasjoner i ER og Golgi til plasmalemma, sekresjon og lysosomer - sekretorisk pathway [Figure 17-1: gul 1, 2, 3, 4(a,b,c)] Øvrige kjernekodete proteiner blir endelig modifisert på cytosoliske ribosomer og frigjort i cytosol (Figure 17-1: blå 2)- hvis de ikke har spesifikke signaler for transport til mitokondrier (Figure 17-1: blå 3a, 4a), kloroplaster (Figure 17-1: blå 3b), peroxisomer (Figure 17-1: blå 3c, 4b) eller kjernen (Figure 17-1: blå 3d, 4c). En mer detaljert redegjørelse for hvordan de ulike sorteringer og videre transport foregår, er gitt i resten av Kap. 17. Figure 17-1
Syntese og mål for mitokondrie- og kloroplast-proteiner Syntese av mitokondrie-proteiner i cytosol Likheter og forskjeller mellom kloroplaster og mitokondrier er gjennomgått i Kap. 16. (Merk at nye organeller oppstår ved deling og avsnøring.) Proteiner som brukes i kloroplaster og mitokondrier syntetiseres utenfor organellene på cytosoliske ribosomer (utenfor ER-kontroll). De nysyntetiserte proteiner frigjøres i cytosol og opptas i resp. organeller ved binding til reseptor-proteiner på organell-overflaten som gjenkjenner opptak-mål-sekvenser i de nye proteinene (Table 17-1).
Syntese og mål for mitokondrie- og kloroplast-proteiner Syntese av mitokondrie-proteiner i cytosol (forts.) En liste over noen av de proteiner som er syntetisert utenfor mitokondriet og senere inkorporert (de fleste i matrix eller indre membran) er vist i Table 17-2. Bruk av pulsmerking med radioaktivt merkete aminosyrer (f.eks. 35 S-methionin) viser lokaliseringen. Proteiner som er bestemt for matrix i mitokondriet eller kloroplast stroma har organell-spesifikke N-terminale opptak-mål-sekvenser (se Table 17-1) som sikrer lokaliseringen (Figure 17-2). Etter importen av proteinet til matrix/stroma, fjernes mål-sekvensen av proteaser (Figure 17-3).
Syntese og mål for mitokondrie- og kloroplast-proteiner Figure 17-2 Opptaks-målsekvenser hos importerte mitokondrieproteiner.målsekvensene fjernes (unntatt fra ytre membran - P70) Figure 17-3 Cellefrie-systemer for studier av post-transjonelt opptak av mitokondrieproteiner.
Syntese og mål for mitokondrie- og kloroplast-proteiner (forts.) Cytosol chaperoner og mitokondriemembranen En oversikt over protein-importen fra cytosol inn i matrix av mitokondriet er vist i Figure 17-4. I cytosol vil de løselige nascente precursor av mitokondrie-proteinene bindes til chaperoner (= pr. def. proteiner som hindrer misfoldinger av målproteiner). Disse holder proteinet i sin ufoldete form ved bruk av ATP. De to sentrale chaperoner cytosolisk Hsc70 og mitokondrie-import-stimulerings-faktor (MSF) hindrer misfolding eller aggregering av precursor mitokondrie-proteinene slik at de kan tas opp i mitokondriet. Detaljer i opptaket ved bruk av reseptorene Tom37/ 70 og Tom20/22 og tilslutt Tom40 som er den egentlige transmembran-kanalen i den ytre membran hvor precursor mitokondrie-proteinene kommer igjennom til det ytre eller intermembran rommet, er vist i Figure 17-4. Figure 17-4
Syntese og mål for mitokondrie- og kloroplast-proteiner (forts.) Betydning av matrix chaperoner og chaperoniner For at proteinene skal komme videre inn i matrix bindes de til chaperonet matrix Hsc70 ved bruk av ATP. Dette chaperonet sitter på matrix-siden av den indre membran hvor den N- terminale mål-sekvensen fjernes av proteaser (Figure 17-4, step 6). Den endelige foldingen av precursor-proteinet til et aktivt protein, kan skje uten hjelp (step 7a) eller vha Hsc60 (ikke samsvar Fig.tekst/tekst)- et matrix chaperonin (step 7b).
Syntese og mål for mitokondrie- og kloroplast-proteiner (forts.) Betydningen av eksperimenter med chimeriske proteiner Et eksempel på import av et enzym (DHFR = dihydrofolate reduktase) fra cytosol til matrix i mitokondriet er vist i Figure 17-5. Sentralt element i dette eksperimentet er en matrixmål-sekvens ved den N-terminale enden og at enzymet er ufoldet pga chaperoner (Figure 17-4) før transport. Mål-sekvensen fjernes etter ankomst i matrix før folding av DHFR skjer. Folding på cytosol-siden pga methotrexate (DHFR-inhibitor; Figure 17-5 b) hindrer translokasjonen - kun et translokasjons-intermediate går gjennom. Dette forutsetter minst 50 aminosyrer (aa) spacer sekvens. Fjernes methotrexate skjer translokasjonen. Figure 17-5
Syntese og mål for mitokondrie- og kloroplast-proteiner (forts.) Betydningen av eksperimenter med chimeriske proteiner Translokasjonen skjer i kontakt-seter (se Figure 17-4) - kan demonstreres ved TEM/immunoteknikk (Figure 17-5 c) Energikrav ved opptak av mitokondrie-proteiner Translokasjonen krever energi ;ATP-hydrolyse i cytosol, en proton-motive force over indre membran og ATP-hydrolyse i matrix (Figure 17-4). I teksten (s. 682/683) er forsøkt gitt noen forklaringer på hvordan energien sees i sammenheng med proteinets foldinger under translokasjonen.
Syntese og mål for mitokondrie- og kloroplast-proteiner (forts.) Veiene for mitokondrie-proteiner Det som er nevnt foran gjelder målrettet translokasjon til mitokondriets matrix. Hvilke målsekvenser benyttes og hvordan skjer translokasjonen av proteiner til andre deler av mitokondriet - intermembranrommet, den indre membran og den ytre membran? (Summarisk er svaret på dette tidligere vist i Figure 17-2) Translokasjon til ytre membran kommer fra bruk av ytre-membranproteinet P70 (Figure 17-2).
Syntese og mål for mitokondrie- og kloroplast-proteiner (forts.) Veiene for mitokondrie-proteiner Translokasjon til intermembran-rommet av f.eks. cyt c 1 og cyt b 2 (Figure 17-6): To veier - konservativ og ikke-konservativ vei samt to ulike opptak-mål-sekvenser. Konservativ vei for cyt c 1 ; hele proteinet kommer inn i matrix v/bruk av første målsekvens, den andre målsekvens dirigerer så proteinet bundet til Hsc70, gjennom indre membran og ut i intermembranrommet (Figure 17-6,1a, 2a og 3a) hvor målsekvensen spaltes fra av protease, folding skjer og en hemgruppe påleires. Ikke-konservativ vei for cyt b 2 ; proteinet beveges gjennom både ytre og indre membran men 2. målsekvens (hydrofobisk stopp-sekvens) festes i indre membran og hindrer translokasjon av C-terminus-delen av proteinet.resten av proteinet overføres til intermembranrommet (Figure 17-6,1b og 2b). Etter at målsekvensen er spaltet fra av protease, skjer folding og en hemgruppe påleires. Figure 17-6
Syntese og mål for mitokondrie- og kloroplast-proteiner (forts.) Veiene for mitokondrie-proteiner (forts.) Cyt c transporteres inn til intermembranrommet direkte fra cytosol uten hjelp av målsekvenser. Den cytosoliske formen (kalt apocytokrom c) mangler hemgruppen som påleires og gir holocytokrom c etter ankomst i intermembranrommet. Holocytokrom c kan ikke diffundere tilbake til cytosol.