UNIVERSITETET I OSLO Det matematisk-naturvitenskapelige fakultet Eksamen i: MBV4010 Arbeidsmetoder i molekylærbiologi og biokjemi I Eksamensdag: Onsdag 23. september 2009 Tid for eksamen: Kl. 09.00 12.00 Oppgavesettet er på 6 sider. Vedlegg: 4 (4 sider) Tillatte hjelpemidler: Kalkulator 1 Kontroller at oppgavesettet er komplett før du begynner å besvare spørsmålene. Les nøye gjennom hver enkelt oppgave før du begynner å besvare delspørsmålene.
2 UNIVERSITETET I OSLO Det matematisk-naturvitenskapelige fakultet Exam in: MBV4010 Methods in molecular biology and biochemistry I Day of exam:. Wednesday 23 September 2009 Exam hours: 09.00 12.00 This examination paper consists of 6 pages. Appendices: 4 (4 pages) Permitted materials: Calculator Make sure that your copy of this examination paper is complete before answering. Read thoroughly through the entire problem before starting to answer the sub-questions.
3 Oppgave 1 I vedlegg 1 vil du finne DNA- og proteinsekvensen (840 nukleotider; 279 aminosyrer + stop-kodon) til trna-metylasen Trm9 fra gjærsoppen Saccharomyces cerevisiae. I vedlegg 2 vil du finne et kart over vektoren pcr 2.1-TOPO, som kan brukes til Topokloning av PCR-produkter. a) Du ønsker å klone Trm9-genet inn i pcr 2.1-TOPO ved å Topo-klone et PCRprodukt. Design forward og reverse primere, begge 20 nukleotider lange, for amplifisering av Trm9-genet. Indiker 5 - og 3 -endene til primerne, vis hvordan primerne assosierer med gen-sekvensen, og i hvilken retning de forlenges av DNA-polymerasen som brukes i PCR-reaksjonen. b) Posisjonen til noen restriksjonsseter samt til kloningssetet i pcr 2.1-TOPO (3931 nukleotider) er oppgitt nedenfor. HindIII: 235 BamHI: 253 EcoRI: 284 and 302 XhoI: 335 Topo-kloningssete: 295 Kutteseter for restriksjonsenzymene NcoI (gjenkjenningssekvens CCATGG, posisjon 94) og VspI (gjenkjenningssekvens ATTAAT, posisjon 421) er tilstede i Trm9 genet (840 nukleotider), og er understreket i nukleotidsekvensen i vedlegg 1. I det følgende, anta at det ikke finnes noen kutteseter for VspI og NcoI i vektoren pcr 2.1-TOPO. Etter kloning av det PCR-amplifiserte Trm9-genet inn i vektoren pcr 2.1-TOPO ønsker du å undersøke orienteringen av innskuddet. Hvilke av de følgende kombinasjoner av restriksjonsenzymer er egnet for å undersøke dette? (Forklar) (Du skal anta at DNA-fragmenter bør ha en størrelsesforskjell på minst 10 % for at de skal kunne skilles ved agarosegelelektroforese) i) HindIII og VspI ii) EcoRI og NcoI iii) XhoI og NcoI c) Du bestemmer deg for å undersøke orienteringen av det innsatte Trm9-genet i vektoren pcr 2.1-TOPO ved kutting med restriksjonsenzymene BamHI og NcoI. Hva er størrelsen på de restriksjonsfragmentene man får dersom Trm9- genet har blitt innsatt i retningen fra BamHI til XhoI? Og hva er størrelsen på fragmentene dersom genet har blitt innsatt i motsatt retning? d) Noen DNA-polymeraser som brukes til PCR har 3 5 exonuklease aktivitet, såkalt proofreading activity ( korrekturlesningsaktivitet ). Ville du anbefalt et slikt enzym dersom PCR-produktet skulle klones inn i vektoren pcr 2.1-TOPO? (Forklar)
4 Problem 1 In appendix 1 you will find the DNA and protein sequence (840 nucleotides; 279 amino acids + stop codon) of the trna methylase Trm9 from the yeast Saccharomyces cerevisiae. In Appendix 2 you will find the map of the vector pcr 2.1-TOPO, which can be used for Topo-cloning of PCR-products. a) You would like to clone the Trm9 gene into pcr 2.1-TOPO by Topo-cloning of a PCR product. Design forward and reverse primers, both of 20 nucleotides, for amplification of the Trm9 gene. Indicate the 5 and 3 ends of the primers, show how the primers anneal to the gene sequence, and in which direction they are extended by the DNA polymerase used for PCR. b) The position of some restriction sites, as well as of the cloning site, in pcr 2.1- TOPO (3931 nucleotides) are given below. HindIII: 235 BamHI: 253 EcoRI: 284 and 302 XhoI: 335 Topo cloning site: 295 Sites for the restriction enzymes NcoI (recognition sequence CCATGG, position 94) and VspI (recognition sequence ATTAAT, position 421) are present in the Trm9 gene (840 nucleotides), and have been underlined in the nucleotide sequence found in Appendix 1. In the following, assume that there are no cleavage sites for the enzymes VspI and NcoI in the vector pcr 2.1-TOPO. After cloning the PCR-amplified Trm9 gene into the vector pcr 2.1-TOPO, you would like to investigate the orientation of the insert. Which of the following combinations of restriction enzymes are suitable for investigating this? (Explain) (You should assume that DNA fragments must differ in size by at least 10 % in order to be distinguishable by agarose gel electrophoresis). (i) HindIII and VspI (ii) EcoRI and NcoI (iii) XhoI and NcoI c) You decide to investigate the orientation of the inserted Trm9 gene in the pcr 2.1-TOPO vector by cleavage with the enzymes BamHI and NcoI. What is the size of the obtained restriction fragments if the Trm9 gene has been inserted in the direction from BamHI to XhoI? And what is the size of the fragments if the gene has been inserted in the opposite direction? d) Some DNA polymerases used for PCR have 3 5 exonuclease activity, socalled proofreading activity. Would you recommend such an enzyme when the PCRproduct is going to be cloned by Topo cloning into the vector pcr 2.1-TOPO? (Explain)
5 Oppgave 2 Du ønsker å mutere en konservert aminosyre i Trm9-sekvensen (Vedlegg 1) ved å bruke QuikChange-metoden. I vedlegg 3 finner du den genetiske koden, samt en liste over aminosyreforkortelser. I vedlegg 4 finner du en sekvenssammenstilling av Trm9- sekvenser fra ulike organismer. a) For å identifisere aminosyrer som er viktige for den enzymatiske aktiviteten til Trm9-proteinet, ønsker du å mutere konserverte aminosyrer. Se på de følgende aminosyrene i Trm9 fra Saccharomyces cerevisiae: Ala7, Trp33, Ile50, Asn56, Asp106, Arg209, Tyr243, Lys278. Hvilke av disse aminosyrene er konservert mellom Trm9-proteinene fra de ulike organismene? b) Du bestemmer deg for å mutere aminosyren His116 til Arg. Når du introduserer mutasjonen, ønsker du også å introdusere et gjenkjenningssete for et klassisk restriksjonsenzym med en 6-basers, palindromisk gjenkjenningssekvens. For å gjøre dette vil du introdusere en mutasjon i gensekvensen som koder for en av de nærmestliggende aminosyrene (His115 eller Trp117). Dessuten, når du muterer His116-kodonet til Arg, velg da det Arg-kodon som gir det laveste antall basesubstitusjoner. Mutageneseprimerne som skal brukes inneholder 12 nukleotider med ikke-mutert sekvens på hver side av mutasjonene. Skriv ned sekvensen til forward-primeren som skal brukes i mutagenesen, og indiker de basesubstitusjonene som er gjort, samt det introduserte kuttesetet for restriksjonsenzym. c) Du utfører QuikChange PCR-reaksjonen, og reaksjonsblandingen inkuberes så med restriksjonsenzymet DpnI. Hvorfor utføres inkuberingen med DpnI? d) Reaksjonsblandingen brukes så til å transformere E. coli, de resulterende koloniene brukes til å inokulere bakteriekulturer, og plasmid DNA blir så isolert fra disse kulturene. For å undersøke om de ønskede mutasjoner har blitt introdusert blir plasmid DNAet kuttet med NcoI (kuttesete i posisjon 94 i Trm9- sekvensen) og med Alw44I, som kutter 6-mer palindromsekvensen som er blitt dannet dersom mutagenesen har vært vellykket. Hva er størrelsen på det lille (200 400 nukleotider) restriksjonsfragmentet man vil observere dersom mutagenesen har vært vellykket? Oppgave 3 a) På hvilket biologisk system er Gateway-teknologien for DNA-kloning basert? (Forklar meget kort) b) Hva er hovedfordelen med Gateway-teknologien? c) Hva er hovedfordelene med å bruke et referansehåndteringsprogram, f. eks. EndNote? d) Hva er et rekombinant protein? e) Hvilke tre elementer må være tilstede i et plasmid som skal brukes til DNAkloning?
6 Problem 2 By using the QuikChange method, you would like to mutate a conserved amino acid in the Trm9 sequence (Appendix 1). In Appendix 3 you will find the genetic code as well as a list of amino acid abbreviations. In Appendix 4 you will find an alignment of Trm9 sequences from different organisms. a) To identify residues in the Trm9 protein that are important for enzymatic activity, you would like to mutate conserved amino acid residues. Consider the following amino acid residues in Trm9 from Saccharomyces cerevisiae: Ala7, Trp33, Ile50, Asn56, Asp106, Arg209, Tyr243, Lys278. Which of these residues are conserved between the Trm9 proteins from the various organisms? b) You decide to mutate the residue His116 to Arg. When introducing the mutation, you would also like to introduce a recognition site for a classic restriction enzyme with a 6-base palindromic recognition sequence. To do this you will introduce a silent mutation in the gene sequence encoding one of the adjacent amino acids (His115 or Trp117). Also, when you mutate the His116 codon to Arg, choose the Arg codon that gives the lowest number of base substitutions. The mutagenesis primers to be used contain 12 nucleotides of non-mutated sequence on both sides of the mutations. Write down the sequence of the forward primer that will be used for mutagenesis, and indicate the base substitutions that have been made and the restriction enzyme cleavage site that has been introduced. c) You perform the QuikChange PCR reaction, and the reaction mixture is then incubated with the restriction enzyme DpnI. Why is the incubation with DpnI performed? d) The reaction mixture is then used to transform E. coli, the resulting colonies are used to inoculate bacterial cultures, and plasmid DNA is isolated from these cultures. To investigate whether the desired mutations have been introduced, the plasmid DNA is digested with NcoI (cleavage site at nucleotide position 94 in the Trm9 sequence) and with Alw44I, which cleaves the 6-mer palindromic sequence that has been generated in the event of a successful mutagenesis. What is the size of the small (200 400 nucleotides) restriction fragment obtained if the mutagenesis has been successful? Problem 3 a) On which biological system is the Gateway technology for DNA cloning based? (Explain very briefly) b) What is the main advantage of the Gateway technology? c) What are the main advantages of using a reference management program, such as EndNote? d) What is a recombinant protein? e) Which three elements must be present in a plasmid that will be used for DNA cloning?
Vedlegg1/Appendix 1 DNA and protein sequence of Trm9 from S. cerevisiae (840 nucleotides; 279 amino acids + stop codon) 1 M E I N Q A A E K E Q E Y V H K V Y N E 1 ATGGAGATAAACCAAGCGGCTGAAAAAGAACAGGAGTATGTTCACAAAGTGTATAATGAG 21 I A P H F S Q T R Y K P W P I V T Q F L 61 ATAGCTCCGCATTTCTCGCAAACTAGATATAAGCCATGGCCCATAGTGACTCAGTTCTTG 41 K T R P M G S I G I D V G C G N G K Y L 121 AAGACTCGCCCAATGGGTTCCATCGGTATCGACGTCGGGTGTGGCAATGGAAAGTACCTC 61 G V N P D I Y I I G S D R S D G L I E C 181 GGAGTGAACCCTGATATATATATTATCGGTTCAGATCGCTCAGATGGTCTTATTGAGTGC 81 A R G I N P S Y N L L V A D G L N L P H 241 GCCAGAGGGATAAACCCATCGTACAACTTACTGGTGGCAGACGGGCTGAACTTACCACAC 101 K N E T F D F A I S I A V V H H W S T R 301 AAAAACGAAACATTTGACTTCGCCATCTCAATTGCTGTAGTGCATCACTGGTCTACAAGG 121 E R R V E V I R H V L S K L R Q G G Q A 361 GAGAGACGTGTTGAGGTGATCAGGCACGTTCTATCGAAACTACGTCAGGGCGGACAAGCA 141 L I Y C W A L E Q G S S R R G Y H E G M 421 TTAATATATTGTTGGGCTCTAGAACAGGGCAGCTCCCGTAGAGGTTACCATGAAGGTATG 161 E Q D V F V P W V L P K S K S K P K T K 481 GAGCAAGATGTCTTTGTCCCCTGGGTTCTTCCCAAGAGTAAATCCAAACCAAAAACTAAA 181 S T P P S K V K T R P K P N L M N I P P 541 TCAACGCCGCCTTCTAAAGTCAAGACAAGGCCAAAGCCAAACTTAATGAATATTCCCCCA 201 K E R S E Y L Q R W K E E Q Q R S K S L 601 AAGGAGCGTTCCGAATACTTGCAGCGCTGGAAGGAGGAACAGCAACGCAGTAAGTCTCTT 221 D D N D E K Q Q Q D Q E Q E R E E V K Y 661 GATGATAACGACGAGAAGCAACAACAAGATCAAGAACAGGAAAGAGAAGAGGTAAAATAC 241 R Y Y H L Y R E G E L A E D C R Q A G A 721 CGATACTATCACTTATACCGAGAGGGCGAATTGGCTGAGGATTGCCGCCAAGCTGGCGCT 261 A V H S E G F E R D N W W V V A Q K R - 781 GCCGTTCATAGTGAGGGCTTCGAGCGCGACAATTGGTGGGTGGTGGCCCAGAAGAGATGA Recognition sites for the restriction enzymes NcoI (CCATGG) and VspI (ATTAAT) are underlined
Vedlegg2/Appendix 2
Vedlegg3/Appendix 3 The genetic code Second letter T C A G TTT Phe TCT Ser TAT Tyr TGT Cys T TTC Phe TCC Ser TAC Tyr TGC Cys C T TTA Leu TCA Ser TAA Stop TGA Stop A TTG Leu TCG Ser TAG Stop TGG Trp G First letter CTT Leu CCT Pro CAT His CGT Arg T CTC Leu CCC Pro CAC His CGC Arg C C CTA Leu CCA Pro CAA Gln CGA Arg A CTG Leu CCG Pro CAG Gln CGG Arg G ATT Ile ACT Thr AAT Asn AGT Ser T ATC Ile ACC Thr AAC Asn AGC Ser C A ATA Ile ACA Thr AAA Lys AGA Arg A ATG Met ACG Thr AAG Lys AGG Arg G Third letter GTT Val GCT Ala GAT Asp GGT Gly T GTC Val GCC Ala GAC Asp GGC Gly C G GTA Val GCA Ala GAA Glu GGA Gly A GTG Val GCG Ala GAG Glu GGG Gly G Abbreviation Abbreviation Amino acid (three letters) (one letter) Alanine Ala A Cysteine Cys C Aspartate Asp D Glutamate Glu E Phenylalanine Phe F Glycine Gly G Histidine His H Isoleucine Ile I Lysine Lys K Leucine Leu L Methionine Met M Asparagine Asn N Proline Pro P Glutamine Gln Q Arginine Arg R Serine Ser S Threonine Thr T Valine Val V Tryptophane Trp W Tyrosine Tyr Y
Vedlegg4/Appendix 4 Alignment of Trm9 sequences from various organisms Sc, Saccharomyces cerevisiae; Sp, Schizosaccharomyces pombe; Hs, Homo sapiens; Gg, Gallus gallus; Dm, Drosophila melanogaster