iseq 100 Veiledning for sekvenseringssystem Kun til forskningsbruk. Ikke til bruk ved diagnostiske prosedyrer.

Transkript

1 iseq 100 Veiledning for sekvenseringssystem Oktober 2018 ILLUMINA-PROPRIETÆR

2 Dette dokmentet og dets innhold er opphavsrettslig beskyttet for Illmina, Inc. og tilknyttede selskaper («Illmina»), og er ment telkkende for kontraktbrk av knden i forbindelse med brk av prodktet (prodktene) beskrevet her, og for intet annet formål. Dette dokmentet og dets innhold skal ikke brkes eller distriberes til andre formål og/eller på annen måte kommniseres, fremlegges eller reprodseres på noen måte ten fortgående, skriftlig samtykke fra Illmina. Illmina overfører ikke noen lisens nder sitt patent, varemerke, opphavsrett eller sedvanerett eller lignende rettigheter til tredjeparter gjennom dette dokmentet. Instrksjonene i dette dokmentet skal følges strengt og tydelig av kvalifisert og tilfredsstillende tdannet personell for å sikre riktig og sikker brk av prodktet (prodktene) som er beskrevet i dette dokmentet. Alt innhold i dette dokmentet skal leses fllt t og være forstått før prodktet (prodktene) brkes. HVIS DET UNNLATES Å LESE FULLSTENDIG OG UTTRYKKELIG FØLGE ALLE INSTRUKSJONENE I DETTE DOKUMENTET, KAN DET FØRE TIL SKADE PÅ PRODUKTET (PRODUKTENE), SKADE PÅ PERSONER, INKLUDERT BRUKERE ELLER ANDRE, OG SKADE PÅ ANNEN EIENDOM, OG DETTE VIL UGYLDIGGJØRE EVENTUELL GARANTI SOM GJELDER FOR PRODUKTET (PRODUKTENE). ILLUMINA PÅTAR SEG IKKE ANSVAR SOM FØLGE AV FEIL BRUK AV PRODUKTET (PRODUKTENE) SOM ER BESKREVET I DETTE DOKUMENTET (INKLUDERT DELER AV DETTE ELLER PROGRAMVARE) Illmina, Inc. Med enerett. Alle varemerker tilhører Illmina, Inc. eller deres respektive eiere. Ytterligere informasjon om varemerker finner d på ii

3 Revisjonslogg Dokment Dato Beskrivelse av endring Dokmentnr v04 Dokmentnr v03 Dokmentnr v02 Oktober 2018 Agst 2018 Jni 2018 Lagt til anbefalte lastekonsentrasjoner og fortynningsinstrksjoner for Nextera DNA Flex for Enrichment-, TrSeq DNA Nano- og TrSeq DNA PCR-Free-biblioteker. Lagt til informasjon om brk av en normaliseringsmetode som ikke gir enkeltstrengede biblioteker. Lagt til beskrivelser av de to kjøringsmodsene, Local Rn Manager og Manell. Lagt til et 5 % PhiX-anrikingsalternativ og definert formålet med hver prosentandel for anriking. Lagt til følgende trinn: Bytter til sbsadmin-operativsystemkontoen når d installerer kontrollprogramvaren, analysemodlene og annen programvare. Slå av og på instrmentet når d skal gjenopprette til fabrikkinnstillinger. Referanse til Illmina-adaptersekvenser (dokmentnr ) for å avgjøre Index 2 (i5)-retninger for et prøveark. Forklaringer av følgende pnkter: Kassetter må brkes middelbart etter tining. Lastekonsentrasjonene oppført for Nextera DNA Flex- og Nextera Flex for Enrichment-biblioteker gjelder ikke for andre Nextera-bibliotekstyper. SreCell WTA 3 er ikke et kompatibelt bibliotek. Oppdaterte programvarebeskrivelser i iseq-kontrollprogramvare v1.3: La til konfigrasjonsinstrksjoner for Universal Copy Service. Endret navnet på fanen Network Configration (Nettverkskonfigrasjon) til Network Access (Nettverkstilgang). La til instrksjoner om åpning av Local Rn Manager fra kontrollprogramvaren. Oppdaterte standardplassering for tdatamappe til D:\SeqencingRns. La til instrksjoner om tilkobling av systemet til en proxy-server. La til krav om å angi en UNC-bane for tdatamappe- og prøvearkplasseringene i nettverket. Anga de nike kravene for konfigrasjon av en tdatamappeplassering på en intern stasjon, ekstern stasjon eller nettverksplassering. Laget instrksjoner om å opprette et prøveark for manell mods i første trinn av kjøringsoppsett. Korrigerte instrksjoner og brk av installasjonsveiviseren for systemserien. Korrigerte beskrivelsen av tdataminiatyrfiler. Oppdaterte rør brkt for fortynning av biblioteker til Fisher Scientific katalognr eller tilsvarende rør med lav binding. La til en del som beskriver den regionale tilgjengeligheten for avansert bytte. Klarla at biblioteker fortynnet til lastekonsentrasjonen må sekvenseres samme dag. Klarla at reagenskassetten må tas t av esken for tining. iii

4 Dokment Dato Beskrivelse av endring Dokmentnr v01 Dokmentnr v01 Dokmentnr v00 Mai 2018 Mai 2018 Febrar 2018 Oppdaterte programvarebeskrivelser i iseq-kontrollprogramvare v1.2: La til alternativ om å bla til et nedlastet installasjonsprogram for programvare fra kontrollprogramvaren. La til instrksjoner om lagring av miniatyrbilder. Flyttet nettverksinnstillinger til fanen Network Configration (Nettverkskonfigrasjon). Økte maksimal brk av testkomponenter til flergangsbrk til 36, og bemerket at resterende antall ganger brk vises på skjermen. Oppdaterte Local Rn Manager-informasjon: La til trinn for åpning av Local Rn Manager og oppsett av kjøringen. La til RNA Amplicon som en forhåndsinstallert analysemodl, samt anriking og sekvensering av DNA på nytt som andre støttede modler. Oppdaterte dokmentasjonshenvisninger til Veiledning for Local Rn Manager-programvare (dokmentnr ). Oppdaterte tineinstrksjoner for kassetter: La til et alternativ for tining ved romtemperatr. Ga mer detaljerte instrksjoner om vannbad, deriblant oppbevaring før tining. Oppdaterte instrksjoner om klargjøring av biblioteker for sekvensering: Oppdaterte lastekonsentrasjonen av Nextera DNA Flex til 200 pm. La til startlastekonsentrasjon for bibliotektyper som ikke er oppgitt. La til informasjon om metrikken % fyllingsgrad. Økte volm på 1 nm PhiX for en anriking til 50 µl. Oppdaterte Illmina-katalognmre for: Ekstra dryppbrettpte for iseq 100 til Ekstra lftfilter for iseq 100 til Oppdaterte anbefalinger om dråpetellere og dråpetellerspisser. La til følgende diverse instrksjoner: Utføre valideringskjøringer. Opprette et prøveark ved sekvensering i manell mods. Minimere kontrollprogramvaren for å oppnå tilgang til andre programmer. La til følgende trinn i fremgangsmåten for systemkontroll: Laste t og oppbevare testkomponenter til flergangsbrk. Fjerne synlig smss fra teststrømningscellen til flergangsbrk. Omorganiserte følgende innhold for å forbedre kontiniteten: Slo sammen instrksjoner for å tføre en kjøring kn med PhiX med standardinstrksjonene for sekvensering. Slo sammen instrksjoner for klargjøring av strømningsceller med instrksjoner for bibliotekfortynning. Konsoliderte instrksjoner for PhiX-anriking. Flyttet informasjon om antall syklser i en avlesning. Flyttet sanntidsanalyse og kalte det Seqencing Otpt (Utdata for sekvensering) i stedet. Forenklet arbeidsflytdiagrammet for feilmeldinger. Fjernet informasjon om nettbrett- og skrivebordsmodi. Operativsystemet kjører i skrivebordsmods som standard, og det er ikke behov for nettbrettmods. Fjernet krav om å fylle t og sende inn et dekontamineringssertifikat for avansert bytte. Korrigert gjennomsnittlig kjøringsstørrelse til 2 GB. Første versjon. iv

5 Innholdsfortegnelse Kapittel 1 Oversikt 1 Innledning 1 Tilleggsressrser 2 Systemkomponenter 3 iseq 100 i1-reagenser 7 Kapittel 2 Komme i gang 11 Førstegangs oppsett 11 Valideringskjøringer 11 Minimere kontrollprogramvaren 11 Konfigrere kjøringsinnstillinger 12 Tilpasse systeminnstillinger 15 Konfigrere nettverksinnstillinger 16 Brkerlevert forbrksmateriell og tstyr 16 Kapittel 3 Sekvensering 19 Innledning 19 Antall syklser i en avlesning 19 Beste praksis 20 Tine kassetten i pose 20 Klargjøre strømningscellen og bibliotekene 21 Laste forbrksmateriell inn i kassetten 23 Konfigrere en sekvenseringskjøring (Local Rn Manager- mods) 25 Konfigrere en sekvenseringskjøring (manell mods) 28 Kapittel 4 Vedlikehold 32 Frigjøre plass på harddisken 32 Programvareoppdateringer 32 Skifte t lftfilteret 34 Flytte instrmentet 35 Programvarebegrensningspolicyer 37 Vedlegg A Utdata for sekvensering 39 Oversikt over sanntidsanalyse 39 Arbeidsprosess for sanntidsanalyse 41 Vedlegg B Feilsøking 45 Løse feilmeldinger 45 Avbryte en kjøring 45 Foreta en strømtilstandsendring for instrmentet 46 Utføre en systemkontroll 47 Lekkasjebegrensning 49 Gjenopprette til fabrikkinnstillinger 51 v

6 Vedlegg C Avansert bytte 52 Bytte iseq 100-systemet 52 Motta et erstatningssystem 52 Klargjøre det originale systemet for retr 52 Retrnere det originale systemet 55 Indeks 59 Teknisk hjelp 64 vi

7 Kapittel 1 Oversikt Innledning 1 Tilleggsressrser 2 Systemkomponenter 3 iseq 100 i1-reagenser 7 Innledning Illmina iseq 100-sekvenseringssystem sørger for en målrettet tilnærming til neste generasjons sekvensering (NGS). Dette programfokserte systemet pakker Illmina-sekvenseringsteknologi inn i et kostnadseffektivt skrivebordsinstrment. Fnksjoner Accessibility and reliability (Tilgjengelighet og pålitelighet) iseq 100-systemet har en liten grnnflate og er enkelt å installere og brke. Væske- og avbildningskomponenter er innebygd i forbrksmateriellet, noe som gjør det enklere å vedlikeholde instrmentet. Single-step consmable loading (Ettrinns innlasting av forbrksmateriell) En kassett til engangsbrk er forhåndsfylt med alle reagenser som kreves for en kjøring. Bibliotek og en strømningscelle tstyrt med sensor lastes direkte inn i kassetten, som deretter lastes inn i instrmentet. Integrert identifisering mliggjør nøyaktig sporing. iseq 100-systemprogramvare En serie med integrert programvare styrer instrmentoperasjoner, behandler bilder og genererer baseberegninger. Denne serien sørger for dataanalyse på instrmentet og dataoverføringsverktøy for ekstern analyse. On-instrment analysis (Analyse på instrmentet) Local Rn Manager legger inn prøveinformasjon og analyserer deretter kjøringsdata med analysemodlen som er spesifisert for kjøringen. Programvaren inklderer en serie av analysemodler. Clod-based analysis (Skybasert analyse) Arbeidsflyten for sekvensering er integrert med BaseSpace Seqence Hb, Illmina-skyberegningsmiljøet for kjøringsovervåking, dataanalyse, lagring og samarbeid. Utdatafiler strømmes i sanntid til BaseSpace Seqence Hb for analyse. 1

8 Prøve til analyse Følgende diagram illstrerer hele arbeidsprosessen for sekvensering, fra prøve til analyse. Hvert trinn omfatter verktøy og dokmentasjon. Denne veiledningen dekker trinnet Sekvenser biblioteker. D finner annen dokmentasjon på spport.illmina.com. Figr 1 Arbeidsprosess for prøve til analyse Tilleggsressrser Støttesidene til iseq 100-sekvenseringssystemet på Illminas nettsted har tilleggsressrser for systemet. Disse ressrsene inklderer programvare, opplæring, kompatible prodkter og følgende dokmentasjon. Sjekk alltid støttesider for de nyeste versjonene. Ressrs Tilpasset protokollvelger Oppsettplakat for iseq 100- sekvenseringssystem (dokmentnr ) Beskrivelse Et verktøy for å generere ende-til-ende-instrksjoner skreddersydd til din metode for bibliotekklargjøring, kjøringsparametere og analysemetode, med mligheter for å finjstere detaljnivået. Gir instrksjoner for installasjon av instrment og førstegangsoppsett. 2

9 Ressrs Veiledning for klargjøring av stedet for iseq 100-sekvenseringssystem (dokmentnr ) Sikkerhets- og samsvarsveiledning for iseq 100-sekvenseringssystem (dokmentnr ) Samsvarsveiledning for RFID-leser (dokmentnr ) Beskrivelse Gir spesifikasjoner for laboratorieplass, elektriske krav og miljømessige og nettverksmessige hensyn. Gir informasjon om operative sikkerhetshensyn, samsvarserklæringer og instrmentdokmentasjon. Gir informasjon om RFID-leseren i instrmentet, inkldert samsvarssertifiseringer og sikkerhetshensyn. Systemkomponenter iseq 100-sekvenseringssystemet omfatter en av/på-knapp, monitor, statslinje, et forbrksmateriellkammer og et dryppbrett. Figr 2 Eksterne systemkomponenter A B C D E Av/på-knapp Styrer strømmen til instrmentet og angir om systemet er på (lyser), av (mørk) eller av, men med vekselstrøm (plserer). Berøringsskjermmonitor Gjør konfigrasjon og oppsett mlig på instrmentet ved hjelp av kontrollprogramvarens grensesnitt. Statslinje Angir systemstats som klar til å sekvensere (grønn), behandler (blå) eller krever oppmerksomhet (oransje). Forbrksmateriellkammer Inneholder forbrksmateriell nder en kjøring. Dryppbrettdør Gir tilgang til dryppbrettet, som fanger opp lekkede væsker. Strøm- og hjelpetilkoblinger D kan flytte instrmentet for å få tilgang til USB-porter og andre komponenter på baksiden. 3

10 Bak på instrmentet er det en bryter og et inntak som styrer strøm til instrmentet, samt en Ethernet-port for en valgfri Ethernet-tilkobling. To USB-porter gjør det mlig å koble til en ms eller et tastatr, eller å laste opp og laste ned data med en bærbar enhet. MERK Hvis d kobler systemet til et tastatr og en ms, overstyres tastatret på skjermen. Figr 3 Komponenter på baksiden A B C D Ethernet-port Valgfri tilkobling av Ethernet-kabel. USB-porter To porter for tilkobling av hjelpekomponenter. Vekslebryter Slår strømmen til instrmentet på og av. Vekselstrøminntak Tilkobling av strømledning. Forbrksmateriellkammer Forbrksmateriellkammeret inneholder kassetten for en sekvenseringskjøring. Figr 4 Lastet forbrksmateriellkammer A B Kassett Inneholder strømningscellen, biblioteket og reagensene, og samler opp brkte reagenser nder kjøringen. Brett Rommer kassetten nder sekvensering. 4

11 C Dør Åpner seg i 60-graders vinkel slik at d får tilgang til forbrksmateriellkammeret. Programvaren åpner og lkker kammerdøren, og posisjonerer kassetten for avbildning. Døren åpnes ned fra hengsler mot instrmentets sokkel. Ikke sett gjenstander på den åpne døren, da den ikke er laget for å fngere som en hylle. Testkassett og strømningscelle til flergangsbrk Instrmentet leveres med en testkassett og strømningscelle til flergangsbrk som brkes til systemkontrollene. Oppbevares i originalemballasjen ved romtemperatr. Kan brkes på nytt opptil 36 ganger eller i 5 år etter prodksjonsdatoen, alt etter hva som nås først. Under en systemkontroll viser programvaren resterende antall brk. Erstatt tløpte testkomponenter med testsettet for iseq 100. Figr 5 Testkomponenter til flergangsbrk A B Teststrømningscelle til flergangsbrk Testkassett til flergangsbrk Testkomponentene ligner på sekvenseringskomponentene i iseq 100 i1-reagenser, og innlastingsretningene er de samme. Testkassetten har imidlertid ikke en bibliotekbeholder, og ingen av testkomponentene har kjemien som kreves for en kjøring. Systemprogramvare Systemprogramvareserien innbefatter integrerte programmer som tfører sekvenseringskjøringer og analyse på instrmentet. iseq-kontrollprogramvare Styrer instrmentoperasjoner og gir et grensesnitt for konfigrasjon av systemet, oppsett av en sekvenseringskjøring og overvåking av kjøringsstatistikk etter hvert som sekvensering går fremover. Local Rn Manager Definerer kjøringsparametere og analysemetoden før sekvensering. Etter sekvensering begynner dataanalyse på instrmentet atomatisk. Systemet leveres med DNA Amplicon, RNA Amplicon og Generate FASTQ samt analysemodler installert. Systemet støtter også analysemodlene for anriking og sekvensering av DNA på nytt, som er tilgjengelige på støttesidene for Local Rn Manager. D finner mer informasjon om Local Rn Manager og analysemodlene i Veiledning for Local Rn Manager-programvare (dokmentnr ). 5

12 Sanntidsanalyse (RTA2) Utfører bildeanalyse og basebetegnelse nder kjøringen. D finner mer informasjon nder Utdata for sekvensering på side 39. Universal Copy Service Kopierer tdatafiler for sekvensering fra kjøringsmappen til BaseSpace Seqence Hb (hvis det er aktelt) og tdatamappen, hvor d kan oppnå tilgang til dem. Sanntidsanalyse og Universal Copy Service kjører kn bakgrnnsprosesser. Local Rn Manager og kontrollprogramvaren kan ha behov for brkerinndata. Meldinger og varsler Et ikon vises ved siden av instrmentnavnet for å angi meldinger. Hvis d vil vise en liste over meldingene, som omfatter advarsler og feil, velger d ikonet. Advarsler krever oppmerksomhet, men verken stopper en kjøring eller krever annen handling enn kvittering. Feil krever handling før d kan starte eller fortsette med en kjøring. Et panel på venstre side av skjermbildene for kjøringsoppsett viser varsler som gjelder spesielt for kassettinnlasting og kontroller før kjøring. Figr 6 Plasseringer i skjermbildet A B Varsler for kjøringsoppsett Andre meldinger Systeminformasjon Kontrollprogramvaremenyen har en del som heter Abot (Om), hvor d kan vise Illmina-kontaktinformasjon og følgende systeminformasjon: Serienmmer Datamaskinens navn og IP-adresse Oppskriftsfragmentversjon Kjøringsantall Prosessbehandling Skjermbildet Process Management (Prosessbehandling) viser ledig plass (D:\) på harddisken og kjøringsstats, og identifiserer hver kjøring med navn, ID og dato. Skjermbildet oppdateres atomatisk hvert tredje mintt. Kolonnen Stats angir om en kjøring pågår eller er fllført basert på behandlingen av BCL-filer. For hver kjøring viser Process Management (Prosessbehandling) dessten statsen for bakgrnnsprosessene Universal Copy Service, BaseSpace Seqence Hb og Local Rn Manager. 6

13 Uaktelle prosesser vises ikke på skjermen. Hvis for eksempel en kjøring ikke er koblet til BaseSpace Seqence Hb, viser ikke Process Management (Prosessbehandling) BaseSpace-statsen for denne kjøringen. D finner informasjon om hvordan d feilsøker statsproblemer nder Stats for prosessbehandling på side 45. Informasjon om hvordan d sletter kjøringer og frigjør plass finnes i Frigjøre plass på harddisken på side 32. Stats for Universal Copy Service Universal Copy Service viser statsen for filer som blir kopiert fra tdatamappen: In Progress (Pågår) Universal Copy Service kopierer filer til tdatamappen. Complete (Fllført) Universal Copy Service har kopiert alle filene til tdatamappen. Stats for BaseSpace Seqence Hb BaseSpace Seqence Hb viser opplastingsstatsen: In Progress (Pågår) Kontrollprogramvaren laster opp filer til BaseSpace Seqence Hb. Complete (Fllført) Alle filene er lastet opp til BaseSpace Seqence Hb. Stats for Local Rn Manager Local Rn Manager viser analysestatsen i kontrollprogramvare: Not Started (Ikke startet) Analysen står i kø for å starte, eller Local Rn Manager venter på at sanntidsanalyse skal fllføres. In Progress (Pågår) Local Rn Manager analyserer filer. D finner en mer detaljert stats i Local Rn Manager-programvaren. Stopped (Stoppet) Analysen har stoppet, men er ikke fllført. Complete (Fllført) Local Rn Manager har fllført analysen. D finner mer informasjon om analysestats i Local Rn Manager- programvaren. iseq 100 i1-reagenser Å tføre en kjøring på iseq 100-systemet krever ett iseq 100 i1-reagenssett til engangsbrk. Settet er tilgjengelig i én størrelse (300 syklser) og to samlinger: Enkel Inneholder forbrksmateriell til én kjøring. Firepakning Inneholder forbrksmateriell til fire kjøringer. Innhold og oppbevaring iseq 100 i1-reagenser inneholder kassetten og strømningscellen for sekvensering. Når d mottar iseq 100 i1- reagenser: Ikke åpne den hvite folieemballasjen før d blir bedt om det nder tiningen av kassetten. Kassetten skal tines i posen. Komponentene må straks settes til oppbevaring ved angitt temperatr for å sikre riktig ytelse. Oppbevar kassetter slik at etikettene på emballasjen vender oppover. Oppbevar kassetter i minst én dag før d tiner dem i et vannbad. 7

14 Tabell 1 Settkomponenter Samling Forbrksmateriell Antall Oppbevaringstemperatr Enkel Kassett 1 25 C til 15 C Strømningscelle 1 2 C til 8 C* Firepakning Kassett 4 25 C til 15 C Strømningscelle 4 2 C til 8 C* *Sendes ved romtemperatr. Begge forbrksmateriellene har identifikatorer som gjør sporing mlig og sikrer kompatibilitet. Kassetten brker radiofrekvensidentifikasjon (RFID). Strømningscellen brker et elektrisk grensesnitt: elektrisk slettbart, programmerbart skrivebeskyttet minne (EEPROM). Strømningscelle Strømningscellen er en mønstret strømningscelle med én bane som er bygget over en optisk sensor av typen komplementær metalloksidhalvleder (CMOS). En plastkassett omgir den glassbaserte strømningscellen. Opphevede gripepnkter på plasten sikrer trygg håndtering. A B C D E F Gripepnkter CMOS- sensor (oppå) Avbildningsområde Pakning (én av to) CMOS-sensor (nder) Elektrisk grensesnitt Millioner av nanobrønner dekker overflaten av strømningscellen. Klynger genereres i nanobrønnene. Derfra tføres deretter sekvenseringsreaksjonen. Nanobrønnenes ordnede fordeling øker tdataavlesninger og data. Under sekvensering tar CMOS-sensoren bilder for analyse. Kassett Reagenskassetten for sekvensering er forhåndsfylt med grpperings-, sekvenserings-, paired-end- og indekseringsreagenser. En folieforseglet beholder er forbeholdt biblioteker, og et spor på forsiden er forbeholdt strømningscellen. Illminatorlys når strømningscellen gjennom et tilgangsvind oppå kassetten. 8

15 A B C Tilgangsvind Strømningscellespor Bibliotekbeholder Kassetten inneholder alt forbrksmateriell for en kjøring: reagenser, bibliotek og strømningscelle. Biblioteket og strømningscellen lastes inn i den tinte kassetten, som deretter lastes på instrmentet. Etter at kjøringen har begynt, overføres reagenser og bibliotek atomatisk fra kassetten til strømningscellen. Kassetten inneholder pmper, ventiler og alle væsker for systemet, deriblant en beholder på ndersiden til oppsamling av brkte reagenser. Kassetten avhendes etter en kjøring, så det er ikke nødvendig å vaske instrmentet. Antall syklser som støttes Etiketten for 300 syklser på kassetten angir hvor mange syklser som analyseres, ikke hvor mange syklser som tføres. Strømningscellen er kompatibel med hvilket som helst antall syklser og hvilken som helst avlesningstype. Kassetten sørger for tilstrekkelig reagens for opptil 318 sekvenseringssyklser. De 318 syklsene inklderer 151 syklser hver for Read 1 (Avlesning 1) og Read 2 (Avlesning 2), plss åtte syklser hver for Index 1 (Indeks 1) og Index 2 (Indeks 2). D finner informasjon om hvor mange syklser som skal sekvenseres nder Antall syklser i en avlesning på side 19. Symbolbeskrivelser Følgende tabell beskriver symbolene på forbrksmateriellet eller forbrksmateriellets emballasje. Symbol Beskrivelse Dato da forbrksmateriellet tløper. De beste resltatene oppnås ved å brke forbrksmateriellet før denne datoen. 9

16 Symbol Beskrivelse Angir prodsenten (Illmina). Datoen da forbrksmateriellet ble fremstilt. Tiltenkt brk er Kn til forskningsbrk (RUO). Angir delenmmeret slik at forbrksmateriellet kan identifiseres.¹ Angir partikoden for å identifisere partiet eller loten som forbrksmateriellet ble fremstilt i.¹ Angir at d må være forsiktig. Angir en helsefare. Temperatrområde for oppbevaring i grader celsis. Oppbevar forbrksmateriellet innenfor det angitte området.² ¹ REF identifiserer den enkeltstående komponenten, mens LOT identifiserer loten eller partiet komponenten tilhører. ² Temperatren for oppbevaring kan avvike fra forsendelsestemperatren. 10

17 Kapittel 2 Komme i gang Førstegangs oppsett 11 Valideringskjøringer 11 Minimere kontrollprogramvaren 11 Konfigrere kjøringsinnstillinger 12 Tilpasse systeminnstillinger 15 Konfigrere nettverksinnstillinger 16 Brkerlevert forbrksmateriell og tstyr 16 Førstegangs oppsett Det første gangen systemet slås på, starter kontrollprogramvaren med en serie skjermbilder som leder deg gjennom førstegangs oppsett. Førstegangs oppsett omfatter å tføre en systemkontroll for å bekrefte instrmentytelse, konfigrere kjøringsinnstillinger og tilpasse systeminnstillinger. Etter førstegangs oppsett kan d når som helst redigere de innledende innstillingene i alternativet System Settings (Systeminnstillinger) i kontrollprogramvaremenyen. Operativsystemkonti Windows-operativsystemet har to konti: administrator (sbsadmin) og brker (sbsbrker). Administrator-kontoen skal brkes til IT, systemoppdateringer og installering av kontrollprogramvare, Local Rn Manager-analysemodler og annen programvare. Utfør alle andre fnksjoner, deriblant sekvensering, fra brkerkontoen. Passordkrav Operativsystemet krever at passordet endres for begge kontoer (sbsadmin og sbsbrker) ved første pålogging. Oppdater hvert passord hver 180. dag, når d blir bedt om det. Tabell 2 Standard passordpolicyer Policy Tving passordhistorikk Terskel for låsing Minimm passordlengde Passord må oppfylle kravene til kompleksitet Lagre passord med reversibel kryptering Innstilling Hsker fem passord Ti gyldige påloggingsforsøk Ti tegn Deaktivert Deaktivert Valideringskjøringer D kan eventelt tføre en valideringskjøring før d sekvenserer eksperimentelle biblioteker for første gang. En valideringskjøring sekvenserer 100 % PhiX, som fngerer som et kontrollbibliotek, for å bekrefte systemdriften. D finner instrksjoner nder Sekvensering på side 19. Minimere kontrollprogramvaren Oppnå tilgang til andre programmer ved å minimere kontrollprogramvaren. D kan for eksempel bla til tdatamappen i Filtforsker, eller finne et prøveark. 1 Åpne Windows-oppgavelinjen ved å sveipe oppover på berøringsskjermen. 11

18 2 Velg ikonet iseq 100 System (iseq 100-system) eller et annet program. Kontrollprogramvaren minimeres. 3 [Valgfritt] Navigering og skriving tenfor kontrollprogramvaren blir enklere hvis d kobler et tastatr og en ms til instrmentet. 4 Sveip og velg iseq 100 System (iseq 100-system) når d vil maksimere kontrollprogramvaren. Konfigrere kjøringsinnstillinger Kjøringsinnstillinger gjelder for alle kjøringer, og avgjør tdatamappens plassering, kjøringsmods og analysemetode. Angi tdatamappens plassering Denne innstillingen avgjør tdatamappens standardplassering, som d kan endre for hver kjøring nder kjøringsoppsett. Programvaren lagrer BCL-filer og andre kjøringsdata til tdatamappen. En tdatamappe kreves med mindre BaseSpace Seqence Hb er konfigrert for Rn Monitoring and Storage (Kjøringsovervåking og -lagring). Standardplasseringen er D:\SeqencingRns. 1 I kontrollprogramvaremenyen velger d System Settings (Systeminnstillinger), og deretter velger d fanen Rn Mode (Kjøringsmods). 2 I feltet Otpt Folder (Utdatamappe) legger d inn en plassering for tdatamappen eller velger Browse (Bla gjennom) hvis d vil navigere til en plassering. Internal drive (Intern stasjon) Legg inn en eksisterende plassering på stasjon D. Stasjon C mangler tilstrekkelig plass. External drive (Ekstern stasjon) Legg inn plasseringen til en USB-stasjon som er koblet til instrmentet. Network location (Nettverksplassering) Legg inn UNC-banen (\\servernavn\katalog) til en nettverksplassering. Det støttes ikke å starte en bane med en stasjonsbokstav for et tilordnet nettverk, for eksempel T:\. 3 Gå frem på følgende måte. Hvis d anga en intern eller ekstern stasjonsplassering, avsltter d ved å velge Save (Lagre). Hvis d anga en nettverksplassering, fortsetter d med trinn 7 slik at Universal Copy Service konfigreres for å kobles til en konto som har tilgang til plasseringen. 4 Velg fanen Network Access (Nettverkstilgang). 5 Under Universal Copy Service velger d en kontotype: Local System Accont (Lokal systemkonto) Utdatamappen befinner seg i en katalog som det kan oppnås tilgang til med en lokal konto som har tilgang til de fleste lokale plasseringer. Windows Accont (Windows-konto) Utdatamappen befinner seg i en katalog som krever påloggingsinformasjon. Denne innstillingen gjelder for standardplasseringen for tdatamappen og en eventell plassering som er angitt nder kjøringsoppsett. 6 Hvis d valgte Windows Accont (Windows-konto), legger d inn brkernavn og passord for kontoen. 7 Velg Save (Lagre). Konfigrere kjøringsmodsen Kjøringsmodsen avgjør hvor kjøringsparametere skal legges inn og hvordan data skal analyseres: 12

19 Kjøringsmods Kjøringsparametere Dataanalyse Local Rn Manager Lagt inn i Local Rn Manager. Programvaren lagrer data til den angitte tdatamappen for atomatisk analyse i Local Rn Manager. Manell Lagt inn i kontrollprogramvaren. Programvaren lagrer data til en angitt tdatamappe med tanke på senere analyse tenfor instrmentet. Local Rn Manager er standard kjøringsmods, og den gir den mest strømlinjeformede arbeidsflyten: Opprett og lagre kjøringer i Local Rn Manager-programvaren, som deretter vises i kontrollprogramvaren. Etter sekvensering tfører Local Rn Manager atomatisk dataanalyse. Det er ikke nødvendig med egne prøveark og analyseprogrammer. MERK Local Rn Manager er ikke en fnksjon i kontrollprogramvaren. Den er integrert programvare som brkes til å registrere prøver for sekvensering, angi kjøringsparametere og analysere data. BaseSpace Seqence Hb kan brkes med hvilken som helst kjøringsmods til analyseformål. Når kjøringsmodsen er Local Rn Manager og BaseSpace Seqence Hb er konfigrert, analyserer begge programmene dataene. Velge Local Rn Manager-mods 1 I kontrollprogramvaremenyen velger d System Settings (Systeminnstillinger), og deretter velger d fanen Rn Mode (Kjøringsmods). 2 I modsen for kjøringsoppsett velger d Local Rn Manager. Før d sekvenserer i Local Rn Manager-mods, må d lese viktig informasjon om brk av programvaren i Veiledning for Local Rn Manager- programvare (dokmentnr ). 3 Velg Save (Lagre). Velge manell mods 1 I kontrollprogramvaremenyen velger d System Settings (Systeminnstillinger), og deretter velger d fanen Rn Mode (Kjøringsmods). 2 I modsen for kjøringsoppsett velger d Manal (Manell). 3 Velg Save (Lagre). Konfigrere BaseSpace Seqence Hb Konfigrer BaseSpace Seqence Hb på systemet ditt ved hjelp av følgende instrksjoner. Instrksjoner for kontooppsett finnes i Elektronisk hjelp for BaseSpace Seqence Hb (dokmentnr ). 1 I kontrollprogramvaremenyen velger d System Settings (Systeminnstillinger), og deretter velger d fanen Rn Mode (Kjøringsmods). 2 Når det gjelder BaseSpace-innstillinger, velger d ett av følgende alternativer for tilkobling til BaseSpace Seqence Hb: 13

20 Alternativ Rn Monitoring and Storage (Kjøringsovervåking og -lagring) Rn Monitoring Only (Kn kjøringsovervåking) Instrment Performance Data Only (Kn instrmentytelsesdata)* Ingen Beskrivelse og krav Send InterOp-filer, loggfiler og kjøringsdata til BaseSpace Seqence Hb med tanke på fjernovervåking og analyse. Krever en BaseSpace Seqence Hb-konto, en Internett-tilkobling og et prøveark eller kjøringsoppsett i Local Rn Manager. Send InterOp- og loggfiler til BaseSpace Seqence Hb med tanke på fjernovervåking av kjøring. Dette alternativet er standard. Krever en BaseSpace Seqence Hb-konto og en Internett- tilkobling. Send driftsdata til Illmina ten å koble kjøringer til BaseSpace Seqence Hb. Krever en Internett-forbindelse. Koble kjøringer fra BaseSpace Seqence Hb-kontoer, og ikke send instrmentytelsesdata. * Avhengig av kontrollprogramvareversjonen kan navnet på denne innstillingen i programvaregrensesnittet avvike fra navnet i denne veiledningen. Når et annet alternativ enn None (Ingen) er valgt, sendes instrmentytelsesdata til Illmina. Disse dataene gjør det enklere for Illmina å feilsøke og påvise potensielle feil, slik at det er mlig å tføre proaktivt vedlikehold og maksimere instrmentets oppetid. D finner mer informasjon om fordelen ved denne tjenesten i Illminas proaktive tekniske notat (dokmentnr ). Denne tjenesten: Sender ikke sekvenseringsdata med mindre Rn Monitoring and Storage (Kjøringsovervåking og -lagring) er valgt. Er slått på som standard. Hvis d vil velge bort denne tjenesten, velger d None (Ingen). 3 Hvis d valgte None (Ingen) i trinn 2, avsltter d ved å velge Save (Lagre). Ellers fortsetter d med trinn 6. 4 I listen Hosting Location (Vertsplassering) velger d plasseringen til serveren der dataene lastes opp: USA (N. Virginia), EU (Frankfrt) eller Kina (Beijing). 5 Hvis d har et Enterprise-abonnement, konfigrerer d domenet ditt på følgende måte. a b Velg avmerkingsboksen Private Domain (Privat domene). Legg inn domenenavnet (URL-adressen) som brkes til enkel pålogging i BaseSpace Seqence Hb. For eksempel: 6 Velg Save (Lagre). Prøvearkhensyn Når systemet er konfigrert for manell mods med Rn Monitoring and Storage (Kjøringsovervåking og - lagring) i BaseSpace Seqence Hb, krever hver kjøring et prøveark. Opprett et prøveark ved å redigere iseq 100-systemprøvearkmal for manell mods og deretter importere det inn i kontrollprogramvaren nder kjøringsoppsett. Last ned malen fra støttesidene for iseq 100-sekvenseringssystem. FORSIKTIG Sørg for at d legger inn adaptersekvensene for Index 2 (Indeks 2) (i5) i riktig retning for iseq 100- sekvenseringssystemet. D finner informasjon om indeksretninger i Illmina-adaptersekvenser (dokmentnr ). Det kreves også et prøveark når systemet er konfigrert for Local Rn Manager- mods. Local Rn Manager oppretter imidlertid prøvearket for deg og lagrer det til riktig plassering. Under alle andre forhold er et prøveark valgfritt. 14

21 Tilpasse systeminnstillinger Systeminnstillinger styrer instrmentnavnet, lagringsinnstillinger for lyd og miniatyrbilder samt metoden for programvareoppdatering. Navngi instrmentet 1 I kontrollprogramvaremenyen velger d System Settings (Systeminnstillinger), og deretter velger d fanen System Cstomization (Systemtilpassing). 2 I feltet Instrment Nickname (Instrmentets kallenavn) oppgir d et foretrkket navn for instrmentet. Navnet vises øverst i hvert skjermbilde. 3 Velg Save (Lagre). Slå lyd på eller av 1 I kontrollprogramvaremenyen velger d System Settings (Systeminnstillinger), og deretter velger d fanen System Cstomization (Systemtilpassing). 2 Velg om systemets lyd skal dempes: Slå lyden på ved å velge On (På). Slå lyden av ved å velge Off (Av). 3 Velg Save (Lagre). Lagre miniatyrbilder 1 I kontrollprogramvaremenyen velger d System Settings (Systeminnstillinger), og deretter velger d fanen System Cstomization (Systemtilpassing). 2 Velg hvordan d vil lagre miniatyrbilder: Hvis d vil lagre alle miniatyrbilder, velger d avmerkingsboksen Save additional thmbnail images (Lagre ekstra miniatyrbilder). Hvis d ikke vil lagre noen miniatyrbilder, velger d bort avmerkingsboksen Save additional thmbnail images (Lagre ekstra miniatyrbilder). Å lagre alle miniatyrbilder er standard. Hvis d lagrer miniatyrbilder, øker kjøringsstørrelsen noe, men de er til hjelp nder feilsøking. 3 Velg Save (Lagre). Konfigrere programvareoppdateringer 1 I kontrollprogramvaremenyen velger d System Settings (Systeminnstillinger), og deretter velger d fanen System Cstomization (Systemtilpassing). 2 Velg om systemet skal se etter programvareoppdateringer atomatisk: Vil d se atomatisk, velger d avmerkingsboksen Atocheck for software pdates (Se etter programvareoppdateringer atomatisk). Vil d se manelt, velger d bort avmerkingsboksen Atocheck for software pdates (Se etter programvareoppdateringer atomatisk). Å se etter programvareoppdateringer atomatisk krever en Internett-tilkobling. D finner mer informasjon om installasjon av programvareoppdateringer nder Programvareoppdateringer på side Velg Save (Lagre). 15

22 Konfigrere nettverksinnstillinger Brk av systemet og overføring av data krever kn en WiFi- eller Ethernet-tilkobling med standardinnstillingene for nettverk. Det er ikke nødvendig å endre disse innstillingene med mindre organisasjonen har egendefinerte nettverkskrav. Hvis den har det, ber d IT-representanten om hjelp til å endre standardinnstillingene for nettverk. Veiledning for klargjøring av stedet for iseq 100-sekvenseringssystem (dokmentnr ) inneholder retningslinjer for nettverksinnstillinger og kontrolldatamaskinsikkerhet. Koble til Internett Konfigrer en Internett-tilkobling for WiFi eller Ethernet i Windows' innstillinger for nettverk og Internett, som d får tilgang til fra kontrollprogramvaren. Standard Ethernet overfører data på en mer pålitelig måte. 1 I kontrollprogramvaremenyen velger d System Settings (Systeminnstillinger), og deretter velger d fanen Network Access (Nettverkstilgang). 2 Velg Network Configration (Nettverkskonfigrasjon), som minimerer kontrollprogramvaren og åpner Windows' innstillinger for nettverk og Internett. 3 Konfigrer en WiFi- eller Ethernet-tilkobling. Hvis d skal konfigrere WiFi, endrer d adapteralternativet til Wi- Fi. D finner detaljerte konfigrasjonsinstrksjoner i hjelp for Windows 10 på Microsofts nettsted. 4 Når konfigrasjonen er fllført, lkker d innstillingene for Windows og maksimerer kontrollprogramvaren. 5 I fanen Network Access (Nettverkstilgang) velger d Save (Lagre). Koble til en proxy-server 1 Minimer kontrollprogramvaren. 2 I Windows Start åpner d dialogboksen Rn (Kjøring). 3 Legg inn cmd (Kommando), og deretter velger d OK. 4 Legg inn følgende kommando. Erstatt port> med din egen proxy-serveradresse og proxy-port, og NULL med eventelle omgåelser. C:\windows\System32\bitsadmin.exe /Util /SetIEProxy LocalSystem Manal_ proxy port> NULL 5 Foreta en strømtilstandsendring for instrmentet. D finner instrksjoner i Foreta en strømtilstandsendring for instrmentet på side 46. Brkerlevert forbrksmateriell og tstyr Følgende brkerlevert forbrksmateriell og tstyr brkes til sekvensering, vedlikehold og feilsøking. 16

23 Forbrksmateriell for sekvensering Forbrksmateriell Leverandør Formål Engangshansker, pdderfrie Generell laboratorieleverandør Generelt formål. iseq 100 i1-reagenser Illmina, katalognr (én stk.) eller katalognr (firepakning) Mikrorør, 1,5 ml Fisher Scientific, katalognr , eller tilsvarende rør med lav binding Levere reagenser og strømningscellen til en kjøring. Fortynne biblioteker til lastekonsentrasjonen. Tørkepapir Generell laboratorieleverandør Tørke kassetten etter et vannbad. Dråpetellerspisser, 20 µl Generell laboratorieleverandør Fortynne og laste biblioteker. Dråpetellerspisser, 100 µl Generell laboratorieleverandør Fortynne og laste biblioteker. Resspensjonsbffer (RSB) Illmina, leveres med bibliotekklargjøringssett Fortynne biblioteker til lastekonsentrasjonen. [Valgfritt] 10 mm Tris-HCl, ph 8,5 Generell laboratorieleverandør Erstatning for RSB for å fortynne biblioteker til lastekonsentrasjonen. [Valgfritt] PhiX Control v3 Illmina, katalognr. FC Utføre en kjøring kn med PhiX eller tilsetting i en PhiX-kontroll. Forbrksmateriell for vedlikehold og feilsøking Forbrksmateriell Leverandør Formål Blekemiddelservietter, 10 % VWR, katalognr , eller tilsvarende Dekontaminere instrmentet og rengjøre arbeidsflater. Engangshansker, pdderfrie Generell laboratorieleverandør Generelt formål. iseq 100 ekstra dryppbrettpte¹ Illmina, katalognr Dekke dryppbrettet for å absorbere væskelekkasjer. Ekstra lftfilter for iseq 100¹ Illmina, katalognr Bytte lftfilter hver sjette måned. Testsett for iseq 100-system² Illmina, katalognr Utføre en systemkontroll. Servietter med isopropylalkohol, 70 % Laboratorieklt, lavt loinnhold VWR, katalognr , eller tilsvarende VWR, katalognr , eller tilsvarende Rengjøre instrmentet og teststrømningscelle til flergangsbrk. Tørking av dryppbrettet og teststrømningscelle til flergangsbrk. Tørkepapir Generell laboratorieleverandør Tørke opp væske rndt instrmentet. [Valgfritt] Kloroppløsning, 10 % VWR, katalognr (32 oz), (16 oz), eller tilsvarende [Valgfritt] Etanolservietter, 70 % Fisher Scientific, katalognr , eller tilsvarende Rengjøre arbeidsflater etter dekontaminering. Erstatning for servietter med isopropylalkohol for å rengjøre instrmentet og teststrømningscelle til flergangsbrk. ¹ Instrmentet leveres med én installert og én ekstra. Hvis instrmentet ikke er nderlagt garanti, har brkeren ansvaret for tskiftninger. Oppbevares innpakket frem til brk. ² Erstatter testkomponenter til flergangsbrk levert sammen med instrmentet ved tløp etter 5 år eller 36 gangers brk. 17

24 Utstyr Vare Kilde Formål Fryser, 25 C til 15 C Generell laboratorieleverandør Oppbevare kassetten. Isbøtte Generell laboratorieleverandør Sette til side biblioteker. Dråpeteller, 10 µl Generell laboratorieleverandør Fortynne biblioteker til lastekonsentrasjonen. Dråpeteller, 20 µl Generell laboratorieleverandør Fortynne biblioteker til lastekonsentrasjonen. Dråpeteller, 100 µl Generell laboratorieleverandør Fortynne biblioteker til lastekonsentrasjonen. Kjøleskap, 2 C til 8 C Generell laboratorieleverandør Oppbevare strømningscellen. [Valgfritt] Tastatr Generell laboratorieleverandør Tillegg til skjermtastatret. [Valgfri] Ms Generell laboratorieleverandør Tillegg til berøringsskjermgrensesnittet. [Valgfritt] Vannbad Generell laboratorieleverandør Tine kassetten. 18

25 Kapittel 3 Sekvensering Innledning 19 Antall syklser i en avlesning 19 Beste praksis 20 Tine kassetten i pose 20 Klargjøre strømningscellen og bibliotekene 21 Laste forbrksmateriell inn i kassetten 23 Konfigrere en sekvenseringskjøring (Local Rn Manager- mods) 25 Konfigrere en sekvenseringskjøring (manell mods) 28 Innledning Klyngegenerering, sekvensering og analyse omfatter sekvensering på iseq 100-sekvenseringssystemet. Hvert trinn skjer atomatisk nder en sekvenseringskjøring. Avhengig av systemkonfigrasjonen tføres ytterligere analyse tenfor instrmentet etter at kjøringen er fllført. Klyngegenerering Bibliotek denatreres atomatisk til enkle strenger, og fortynnes ytterligere i instrmentet. Under klyngegenereringen blir enkle DNA-molekyler bndet til overflaten på strømningscellen og forsterket for å danne klynger. Sekvensering Klynger avbildes ved hjelp av kjemi med ett fargestoff, som brker én florescerende etikett og to avbildningssyklser når data skal kodes for de fire nkleotidene. Den første avbildningssyklsen påviser adenin (A) og tymin (T). En kjemisykls spalter deretter fargestoffet fra A, og tilsetter samtidig et lignende fargestoff i cytosin (C). Den andre avbildningen påviser C og T. Etter den andre avbildningen tfører sanntidsanalyseprogramvare basebetegnelse, filtrering og kvalitetsscoring. Denne prosessen gjentas for hver sekvenseringssykls. D finner mer informasjon om kjemi med ett fargestoff nder Basebetegnelse på side 42. Analyse Mens kjøringen går fremover, overfører kontrollprogramvaren atomatisk basebetegnelsesfiler (*.bcl) til den angitte tdataplasseringen for dataanalyse. Fremgangsmåten for dataanalyse avhenger av programmet og systemkonfigrasjonen. Antall syklser i en avlesning Hvis d legger inn minimm 26 syklser og maksimalt 151 syklser for hver avlesning, bidrar det til å sikre datakvaliteten. Det nøyaktige antallet syklser avhenger av forsøket d tfører. Minimm og maksimalt antall syklser inklderer en ekstra sykls. Legg alltid én sykls til den ønskede avlesningslengden slik at virkningene av fasing og prefasing korrigeres. Avlesningslengde er antall sekvenseringssyklser i Read 1 (Avlesning 1) og Read 2 (Avlesning 2), som eksklderer ekstra syklser og indekssyklser. Eksempel på kjøringsoppsett: Hvis d ønsker en avlesningslengde på 36 (enkel avlesning), oppgir d 37 i feltet Read 1 (Avlesning 1). 19

26 Hvis d ønsker en avlesningslengde på 150 per avlesning (paired-end), oppgir d 151 i feltet Read 1 (Avlesning 1) og 151 i feltet Read 2 (Avlesning 2). Beste praksis Når d håndterer reagenser og andre kjemikalier, må d ha på deg sikkerhetsbriller, en labfrakk og plverfrie hansker. Skift hansker når d blir bedt om det, slik at d nngår krysskontaminasjon. Kontroller at d har det nødvendige forbrksmateriellet og tstyret før d starter en protokoll. Se Brkerlevert forbrksmateriell og tstyr på side 16. Følg protokollene i den viste rekkefølgen, og brk de angitte volmene, temperatrene og varighetene. Hvis ikke et stoppnkt er angitt, går d straks videre til neste trinn. Tine kassetten i pose 1 Ta på et nytt par pdderfrie hansker. 2 Ta kassetten t av oppbevaring ved 25 C til 15 C. Ved tining i et vannbad, som er den raskeste av de tre tinemetodene, skal den oppbevares i minst 1 dag før brk. FORSIKTIG Hvis d tiner en kassett i et vannbad rett etter levering når den er oppbevart på tørris, kan det ha negativ innvirkning på kassettens ytelse. 3 Hvis kassetten ligger i en eske, fjerner d den fra esken, men ikke åpne den hvite folieposen. 4 Tin kassetten i pose ved hjelp av én av følgende fremgangsmåter. Brkes middelbart etter tining. Skal ikke fryses på nytt eller oppbevares på andre måter. Fremgangsmåte Tinetid Instrksjon 20 C til 25 C vannbad 6 timer, ikke mer enn 18 timer Kjøleskap fra 2 C til 8 C Romtemperert lft (20 C til 25 C) 36 timer, ikke mer enn 72 timer 9 timer, ikke mer enn 18 timer Brk 6 l vann per kassett. Still et temperatrstyrt bad på 25 C, eller bland varmt og kaldt vann for å oppnå 20 C til 25 C. Vend poseetiketten opp, senk kassetten helt ned i vann, og påfør en vekt på ~2 kg for å hindre at den flyter opp. Ikke stable kassetter i vannbad med mindre det er temperatrstyrt. Plasser kassetten slik at etiketten vender opp og lft kan sirklere på alle sider, inkldert nder den. Plasser kassetten slik at etiketten vender opp og lft kan sirklere på alle sider, inkldert nder den. 5 Hvis den er våt etter et vannbad, tørkes den med tørkepapir. 20

27 Klargjøre strømningscellen og bibliotekene Før d laster strømningscellen og bibliotekene i kassetten, sørger d for at strømningscellen når romtemperatr og fortynner biblioteker med en valgfri PhiX-anriking. Biblioteker denatreres atomatisk i instrmentet. Følgende fortynningsinstrksjoner gjelder for støttede Illmina-biblioteker som er dobbeltstrengede. Følgende må alltid gjøres: tfør en kvalitetskontrollanalyse, optimaliser lastekonsentrasjonen for biblioteket ditt, og brk en normaliseringsmetode som genererer dobbeltstrengede biblioteker. Klebasert normalisering som genererer enkeltstrengede biblioteker, er ikke kompatibel med denatrering i instrmentet. Lastevolm og -konsentrasjoner Lastevolm er 20 μl. Lastekonsentrasjonen varierer etter bibliotekstype: Bibliotektype Innlastingskonsentrasjon (pm) 100 % PhiX 60 AmpliSeq for Illmina Library PLUS 50 Nextera DNA Flex 200 Nextera Flex for Enrichment 100 TrSeq DNA Nano 100 TrSeq DNA PCR-Free 100 Når det gjelder andre bibliotektyper, er 50 pm anbefalt startlastekonsentrasjon. Optimaliser denne konsentrasjonen i løpet av påfølgende kjøringer slik at en lastekonsentrasjon som konsekvent gir data som oppfyller spesifikasjonene, identifiseres. En lastekonsentrasjon som er for lav gir en lav klyngeprosent som passerer filteret (% PF) og en lav fyllingsgradprosent (% fyllingsgrad). En lastekonsentrasjon som er for høy gir sboptimal % PF og svært høy % fyllingsgrad. MERK % fyllingsgrad er synlig i BaseSpace Seqence Hb, og angir prosentandelen brønner som inneholder klynger. Fortynne bibliotek til 1 nm 1 Klargjør strømningscellen på følgende måte. a b Fjern en ny strømningscelle fra oppbevaring ved 2 C til 8 C. Sett den åpnede emballasjen til side ved romtemperatr i mintter for å forhindre kondensering. Hvis d klargjør strømningscellen nå, vil den oppnå romtemperatr i tide. 2 Ta resspensjonsbffer (RSB) t av oppbevaring ved 25 C til 15 C. D kan alternativet brke 10 mm Tris-HCl, ph 8,5 i stedet for RSB. 3 [Valgfritt] Ta 10 nm PhiX-råstoff t av oppbevaring ved 25 C til 15 C. PhiX er kn nødvendig for en valgfri anriking eller en kjøring kn med PhiX. 4 Tin RSB og eventelt PhiX ved romtemperatr i 10 mintter. 21

28 5 Brk RSB som fortynner, og klargjør det aktelle bibliotekvolmet på 1 nm i mikrorør med lav binding: Bibliotektype Bibliotekvolm på 1 nm som skal klargjøres (µl) Nextera DNA Flex 25 Nextera Flex for Enrichment TrSeq DNA Nano 12 TrSeq DNA PCR-Free 12 Alle andre biblioteker 10 6 Roter et kort øyeblikk, og deretter sentrifgerer d ved 280 g i 1 mintt. 7 [Valgfritt] Oppbevar 1 nm bibliotek ved 25 C til 15 C i opptil 1 måned. Fortynne bibliotek på 1 nm til innlastingskonsentrasjon 12 1 Kombiner følgende volmer i et mikrorør med lav binding for å klargjøre 100 µl bibliotek fortynnet med den riktige innlastingskonsentrasjonen: Bibliotektype* 100 % PhiX (for en kjøring kn med PhiX) Innlastingskonsentrasjon (pm) 1 nm bibliotekvolm (µl) RSB- volm (µl) AmpliSeq for Illmina Library PLUS Nextera DNA Flex Nextera Flex for Enrichment TrSeq DNA Nano TrSeq DNA PCR-Free * Når det gjelder bibliotektyper som ikke er oppgitt, inkldert andre Nextera-biblioteker, begynner d med en lastekonsentrasjon på 50 pm og optimerer i løpet av påfølgende kjøringer. Denne tabellen gir eksempler på lastekonsentrasjoner. iseq 100-systemet er kompatibelt med alle bibliotekklargjøringssett fra Illmina, nntatt SreCell WTA 3, men den optimale lastekonsentrasjonen kan variere. 2 Roter et kort øyeblikk, og deretter sentrifgerer d ved 280 g i 1 mintt. 3 Sett fortynnet bibliotek til side på is for sekvensering. Sekvenser biblioteker som er fortynnet til lastekonsentrasjonen samme dag som de fortynnes. 4 Hvis d ikke skal legge til PhiX, eller hvis d skal tføre en kjøring kn med PhiX, skal d hoppe over neste del og gå videre til Laste forbrksmateriell inn i kassetten på side 23. Tilsette en PhiX-kontroll (valgfritt) PhiX er et lite Illmina-bibliotek som er klart til brk med balansert nkleotidfremstilling. Tilsetning av en 2 % PhiX-anriking til biblioteket gir ytterligere metrikk. For biblioteker med lav diversitet anbefales 5 % anriking for å øke basediversitet. MERK En anriking så lav som 1 % er effektiv for å gi ytterligere beregninger, men gjør pipettering vanskelig. 1 Kombiner følgende volmer i et mikrorør med lav binding for å klargjøre 50 µl 1 nm PhiX: 22

29 10 nm PhiX (5 µl) RSB (45 µl) 2 Roter et kort øyeblikk, og deretter sentrifgerer d ved 280 g i 1 mintt. 3 [Valgfritt] Oppbevar 1 nm PhiX ved 25 C til 15 C i opptil 1 måned. 4 Kombiner følgende volmer i et mikrorør med lav binding for å fortynne PhiX til samme innlastingskonsentrasjon som biblioteket, for eksempel: PhiX-innlastingskonsentrasjon (pm) 1 nm PhiX-volm (µl) RSB- volm (µl) Kombiner PhiX og bibliotek: Tilsett 2 μl fortynnet PhiX til 100 μl fortynnet bibliotek for å få en 2 % anriking. Tilsett 5 μl fortynnet PhiX til 100 μl fortynnet bibliotek for å få en 5% anriking. Faktisk PhiX-prosentandel varierer avhengig av bibliotekets kvalitet og kvantitet. 6 Roter et kort øyeblikk, og deretter sentrifgerer d ved 280 g i 1 mintt. 7 Sett biblioteket med PhiX-anriking til side på is. Laste forbrksmateriell inn i kassetten 1 [Valgfritt] Hvis d vil se en instrksjon om klargjøring og lasting av kassetter, velger d Seqence (Sekvens). 2 Åpne kassettposen fra hakkene. 3 Unngå tilgangsvindet øverst på kassetten, og ta kassetten t av posen. Kast posen. 4 Sn kassetten fem ganger for å blande reagensene. Innvendige komponenter kan rasle når d snr kassetten, noe som er helt normalt. 5 Sikre reagensaspirasjon ved å slå kassetten (med etiketten vendt opp) lett mot benken eller en annen hard overflate fem ganger. Laste inn bibliotek 1 Perforer bibliotekbeholderen med en ny dråpetellerspiss, og skyv folien t til kantene slik at hllet forstørres. 2 Kast dråpetellerspissen slik at kontaminasjon nngås. 23

30 3 Tilsett 20 µl fortynnet bibliotek i bnnen av beholderen. Unngå å ta på folien. Laste inn strømningscellen 1 Åpne den hvite folieemballasjen fra hakkene. Må brkes innen 24 timer etter åpning. 2 Dra strømningscellen t av emballasjen. D må kn berøre plasten ved håndtering av strømningscellen. Unngå å berøre det elektriske grensesnittet, CMOS-sensoren, glass og pakninger på begge sider av glasset. 3 Hold strømningscellen i gripepnktene med etiketten vendt opp. 4 Plasser strømningscellen i sporet på forsiden av kassetten. Det høres et klikk som angir at strømningscellen er på plass. Når kassetten er lastet riktig inn, stikker grepet frem fra kassetten, og glasset er synlig fra tilgangsvindet. A B Innlasting av strømningscellen Innlastet strømningscelle 24

31 5 Avhend emballasjen på følgende måte. a b c Fjern oppbevaringskofferten fra folieemballasjen. Fjern tørkemiddelet fra oppbevaringskofferten. Resirkler oppbevaringskofferten, og kast folieemballasjen og tørkemiddelet. 6 Gå frem avhengig av kjøringsmods: Hvis det er en kjøring i Local Rn Manager-mods, følger d Konfigrere en sekvenseringskjøring (Local Rn Manager-mods) på side 25. Hvis det er en kjøring i manell mods, følger d Konfigrere en sekvenseringskjøring (manell mods) på side 28. Konfigrere en sekvenseringskjøring (Local Rn Manager-mods) Local Rn Manager-mods er standard kjøringsmods. Kjøringsparametere spesifiseres i Local Rn Manager-programvaren og sendes til kontrollprogramvaren. Etter sekvenseringen starter analysen atomatisk. 1 Åpne Local Rn Manager lokalt på instrmentets monitor eller eksternt fra en annen datamaskin: Tilgangstype Lokal Ekstern Åpne Local Rn Manager I kontrollprogramvaremenyen velger d Local Rn Manager, og deretter velger d Open Local Rn Manager (Åpne Local Rn Manager). I kontrollprogramvaremenyen velger d Abot (Om) slik at d får tilgang til systemets IP- adresse. Fra en datamaskin i samme nettverk som instrmentet åpner d Local Rn Manager i Chromim. Koble til ved hjelp av systemets IP-adresse. 2 Hvis Chromim er tom på instrmentets monitor, foretar d en strømtilstandsendring for instrmentet og starter kjøringsoppsettet på nytt. D finner instrksjoner i Foreta en strømtilstandsendring for instrmentet på side Opprett og lagre kjøringen i Local Rn Manager. D finner instrksjoner i Veiledning for Local Rn Manager-programvare (dokmentnr ). Konfigrer en kjøring kn med PhiX som ikke skal indekseres. Local Rn Manager sender atomatisk lagrede kjøringer til kontrollprogramvaren. 4 I kontrollprogramvaren velger d Seqence (Sekvens) i startskjermbildet. Programvaren åpner døren på skrått, støter t brettet og starter serien med skjermbildet for kjøringsoppsett. 5 [Valgfritt] Vis en påminnelse i skjermbildet ved å velge Help (Hjelp). Disse påminnelsene er tilgjengelige i hvert skjermbilde for kjøringsoppsett for å gi deg ekstra veiledning. 25

32 Laste kassetten inn i instrmentet 1 Kontroller at kassetten er tint og inneholder strømningscellen og det fortynnede biblioteket. 2 Plasser testkassetten på brettet slik at tilgangsvindet vender opp og strømningscellen er inne i instrmentet. Ikke skyv kassetten eller brettet inn i instrmentet. 3 Trekk inn kassetten og lkk døren ved å velge Close Door (Lkk dør). Et panel vises i venstre side av skjermbildet, som viser informasjon fra det skannede forbrksmateriellet. D kan fortsette med kjøringsoppsett nder skanning. Logge på BaseSpace Seqence Hb Skjermbildet BaseSpace Seqence Hb vises når systemet er konfigrert for Rn Monitoring (Kjøringsovervåking) eller Rn Monitoring and Storage (Kjøringsovervåking og -lagring). 1 Hvis d vil koble den aktelle kjøringen fra BaseSpace Seqence Hb, velger d Skip BaseSpace Seqence Hb Sign In (Hopp over pålogging på BaseSpace Seqence Hb). Instrmentytelsesdata sendes likevel til Illmina. 2 Hvis d vil endre innstillingen BaseSpace Seqence Hb for den aktelle kjøringen, velger d et konfigrasjonsalternativ: Rn Monitoring Only (Kn kjøringsovervåking) Send kn InterOp-filer til BaseSpace Seqence Hb for å tillate fjernovervåking. Rn Monitoring and Storage (Kjøringsovervåking og -lagring) Send kjøringsdata til BaseSpace Seqence Hb for å tillate fjernovervåking og analyse. 3 Legg inn e-postadressen din og passordet for BaseSpace Seqence Hb, og deretter velger d Sign In (Logg på). 4 Hvis listen Available Workgrops (Tilgjengelige arbeidsgrpper) vises, velger d en arbeidsgrppe som d vil laste opp kjøringsdata til. Denne listen vises når d tilhører flere arbeidsgrpper. 5 Velg Rn Setp (Kjør oppsett). Velge en kjøring 1 Hvis påloggingsskjermbildet for Local Rn Manager vises, oppgir d brkernavn og passord, og deretter velger d Log In (Logg på). Dette skjermbildet vises når Local Rn Manager er konfigrert for å kreve pålogging. D trenger som standard ikke å logge deg på. 26

33 2 Velg en kjøring i listen Rn Name (Kjøringsnavn), som oppgir kjøringer som er lagret i Local Rn Manager. Vis en oppdatert liste ved å velge Refresh (Oppdater). Hvis listen er tom, oppretter d en kjøring ved å velge Open Local Rn Manager (Åpne Local Rn Manager). Hvis d velger Open Local Rn Manager (Åpne Local Rn Manager), minimeres kontrollprogramvaren, og Local Rn Manager åpnes i Chromim. 3 Hvis d forlot kontrollprogramvaren for å opprette en kjøring, går d tilbake og velger kjøringen. 4 [Valgfritt] Velg Edit (Rediger), og endre kjøringsparametere: a Hvis d vil endre avlesningstype, velger d Single Read (Enkel avlesning) eller Paired End (Pairedend). b Hvis d vil endre Read Cycle (Avlesningssykls), legger d inn syklser hver for Read 1 (Avlesning 1) og Read 2 (Avlesning 2). Legg én sykls til ønsket antall syklser. c Hvis d vil endre tdatamappeplasseringen for den aktelle kjøringen, legger d inn UNC-banen for plasseringen eller velger Browse (Bla gjennom) og navigerer til den. d Velg Save (Lagre), så oppdateres kjøringen i både kontrollprogramvaren og Local Rn Manager. MERK En UNC-bane inneholder omvendte skråstreker, servernavnet og katalogen (\\servernavn\katalog), ikke en bokstav for en tilordnet nettverksstasjon (T:\). 5 Start kontrollen før kjøring ved å velge Start Rn (Start kjøring). Gå gjennom kontroller før kjøring Kontroller før kjøring innbefatter en instrmentkontroll og en strømningskontroll. Strømningskontrollen perforerer kassettforseglingene og sender reagens gjennom strømningscellen, slik at forbrksmateriell ikke kan brkes på nytt etter at strømningskontrollen starter. 1 Vent i ca. 15 mintter mens kontrollene før kjøring fllføres. Kjøringen starter atomatisk etter fllføring. Med mindre systemets lyd er dempet, angir en ringelyd at kjøringen har startet. FORSIKTIG Hvis d åpner døren nder kontrollen før kjøring eller kjøringen, kan kjøringen mislykkes. 2 Hvis det oppstår en feil nder instrmentkontrollen, velger d Retry (Prøv på nytt) slik at kontrollen tføres på nytt. Instrmentkontrollen kommer før strømningskontrollen. Når en kontroll pågår, er stolpen for denne kontrollen aktiv. 3 D finner informasjon om hvordan d feilsøker gjentakende feil nder Løse feilmeldinger på side 45. Overvåke kjøringens fremdrift 1 Overvåk kjøringens fremdrift og metrikk etter hvert som de vises i skjermbildet Seqencing (Sekvensering). Estimated rn completion (Anslått fllføring av kjøring) Den omtrentlige datoen og klokkeslettet når kjøringen blir fllført. %Q30 Read 1 (%Q30 avlesning 1) Prosentandelen av basebetegnelser for Read 1 (Avlesning 1) med en Q-score

34 %Q30 Read 2 (%Q30 avlesning 2) Prosentandelen av basebetegnelser for Read 1 (Avlesning 1) med en Q-score 30. Projected Total Yield (Planlagt total prodksjon) Det forventede antallet baser som betegnes for kjøringen. Q30 og prodksjonsmetrikk vises etter sykls Hvis d vil overvåke kjøringsprosesser, velger d kontrollprogramvaremenyen, og deretter velger d Process Management (Prosessbehandling). Laste t forbrksmateriell 1 Når sekvensering er fllført, velger d Eject Cartridge (Støt t kassett). Programvaren støter den brkte kassetten t av instrmentet. 2 Fjern kassetten fra brettet. 3 Fjern strømningscellen fra kassetten. 4 Avhend strømningscellen, som har elektroniske komponenter, i henhold til gjeldende lokale standarder. 5 Avhend kassetten, som inneholder brkte reagenser, i henhold til gjeldende lokale standarder. En kjøring etter vasking er ikke nødvendig fordi væsken avhendes sammen med kassetten. ADVARSEL Dette reagenssettet inneholder potensielt farlige kjemikalier. Personskade kan forekomme ved innånding, svelging, hdkontakt og øyekontakt. Brk vernetstyr, inkldert vernebriller, hansker og laboratoriefrakk som er egnet ved risiko for eksponering. Brkte reagenser skal behandles som kjemisk avfall og kastes i samsvar med gjeldende regionale, nasjonale og lokale lover og forskrifter. Hvis d ønsker ytterligere informasjon om helse, miljø og sikkerhet, kan d se mer på spport.illmina.com/sds.html. 6 Last inn brettet på nytt og gå tilbake til startskjermbildet ved å velge Close Door (Lkk dør). Programvaren laster atomatisk inn brettet på nytt, og sensorer bekrefter at kassetten er fjernet. Konfigrere en sekvenseringskjøring (manell mods) Når d konfigrerer en kjøring i manell mods, angis kjøringsparametere i kontrollprogramvaren. Data lagres i den angitte tdatamappen for analyse tenfor instrmentet. Hvis d vil generere FASTQ-filer, kreves det et ekstra analysetrinn. 1 Opprett et prøveark for kjøringen ved behov: a Last ned iseq 100-systemprøvearkmal for manell mods fra støttesidene for iseq 100- sekvenseringssystem. b Endre malen etter behov, og lagre den i *.csv-format. Kontroller at: Adaptersekvensene for Index 2 (Indeks 2) (i5) er i riktig retning. D finner informasjon om indeksretninger i Illmina-adaptersekvenser (dokmentnr ). Prøvearkverdier samsvarer med kontrollprogramvareverdier. Legg for eksempel inn 151 i feltet Read 1 (Avlesning 1) i både prøvearket og skjermbildet Rn Setp (Kjøringsoppsett). Systemer som er konfigrert for BaseSpace Seqence Hb med Rn Monitoring and Storage (Kjøringsovervåking og -lagring) krever et prøveark for hver kjøring. 2 I kontrollprogramvaren velger d Seqence (Sekvens) i startskjermbildet. 28

35 Programvaren åpner døren på skrått, støter t brettet og starter serien med skjermbildet for kjøringsoppsett. 3 [Valgfritt] Vis en påminnelse i skjermbildet ved å velge Help (Hjelp). Disse påminnelsene er tilgjengelige i hvert skjermbilde for kjøringsoppsett for å gi deg ekstra veiledning. Laste kassetten inn i instrmentet 1 Kontroller at kassetten er tint og inneholder strømningscellen og det fortynnede biblioteket. 2 Plasser testkassetten på brettet slik at tilgangsvindet vender opp og strømningscellen er inne i instrmentet. Ikke skyv kassetten eller brettet inn i instrmentet. 3 Trekk inn kassetten og lkk døren ved å velge Close Door (Lkk dør). Et panel vises i venstre side av skjermbildet, som viser informasjon fra det skannede forbrksmateriellet. D kan fortsette med kjøringsoppsett nder skanning. Logge på BaseSpace Seqence Hb Skjermbildet BaseSpace Seqence Hb vises når systemet er konfigrert for Rn Monitoring (Kjøringsovervåking) eller Rn Monitoring and Storage (Kjøringsovervåking og -lagring). 1 Hvis d vil koble den aktelle kjøringen fra BaseSpace Seqence Hb, velger d Skip BaseSpace Seqence Hb Sign In (Hopp over pålogging på BaseSpace Seqence Hb). Instrmentytelsesdata sendes likevel til Illmina. 2 Hvis d vil endre innstillingen BaseSpace Seqence Hb for den aktelle kjøringen, velger d et konfigrasjonsalternativ: Rn Monitoring Only (Kn kjøringsovervåking) Send kn InterOp-filer til BaseSpace Seqence Hb for å tillate fjernovervåking. Rn Monitoring and Storage (Kjøringsovervåking og -lagring) Send kjøringsdata til BaseSpace Seqence Hb for å tillate fjernovervåking og analyse (krever et prøveark). 3 Legg inn e-postadressen din og passordet for BaseSpace Seqence Hb, og deretter velger d Sign In (Logg på). 4 Hvis listen Available Workgrops (Tilgjengelige arbeidsgrpper) vises, velger d en arbeidsgrppe som d vil laste opp kjøringsdata til. Denne listen vises når d tilhører flere arbeidsgrpper. 5 Velg Rn Setp (Kjør oppsett). 29

36 Legge inn kjøringsparametere 1 I feltet Rn Name (Kjøringsnavn) oppgir d et nikt navn etter ønske som identifiserer den aktelle kjøringen. Kjøringsnavnet kan inneholde alfanmeriske tegn, bindestreker og nderstrekingstegn. 2 For Read Type (Avlesningstype) velger d hvor mange sekvenseringsavlesninger som skal tføres: Single Read (Enkel avlesning) Utfør én avlesning, som er det enkleste, raskeste alternativet. Paired End (Paired-end) Utfør to avlesninger, som genererer data av høyere kvalitet og gir mer nøyaktig innretting. 3 I Read Cycle (Avlesningssykls) oppgir d antall syklser som tføres i hver avlesning: Read 1 (Avlesning 1) Legg inn syklser, og pass på å legge én sykls til ønsket antall syklser. Index 1 (Indeks 1) Legg inn opptil 8 syklser for primeren for Index 1 (Indeks 1) (i7). For en kjøring kn med PhiX legger d inn 0 i begge indeksfeltene. Index 2 (Indeks 2) Legg inn opptil 8 syklser for primeren for Index 2 (Indeks 2) (i5). Read 2 (Avlesning 2) Legg inn syklser (typisk den samme verdien som Read 1 (Avlesning 1), inkldert den ekstra syklsen). 4 Hvis d vil angi en tdatamappe for den aktelle kjøringen eller laste opp et prøveark, tvider d Advanced (Avansert): I feltet Otpt Folder (Utdatamappe) legger d inn UNC-banen for tdatamappens plassering eller velger Browse (Bla gjennom) og navigerer til den. I feltet Sample Sheet (Prøveark) legger d inn UNC-banen for prøvearkets plassering eller velger Browse (Bla gjennom) og navigerer til den. MERK En UNC-bane inneholder omvendte skråstreker, servernavnet og katalogen (\\servernavn\katalog), ikke en bokstav for en tilordnet nettverksstasjon (T:\). 5 Start kontrollen før kjøring ved å velge Start Rn (Start kjøring). Gå gjennom kontroller før kjøring Kontroller før kjøring innbefatter en instrmentkontroll og en strømningskontroll. Strømningskontrollen perforerer kassettforseglingene og sender reagens gjennom strømningscellen, slik at forbrksmateriell ikke kan brkes på nytt etter at strømningskontrollen starter. 1 Vent i ca. 15 mintter mens kontrollene før kjøring fllføres. Kjøringen starter atomatisk etter fllføring. Med mindre systemets lyd er dempet, angir en ringelyd at kjøringen har startet. FORSIKTIG Hvis d åpner døren nder kontrollen før kjøring eller kjøringen, kan kjøringen mislykkes. 2 Hvis det oppstår en feil nder instrmentkontrollen, velger d Retry (Prøv på nytt) slik at kontrollen tføres på nytt. Instrmentkontrollen kommer før strømningskontrollen. Når en kontroll pågår, er stolpen for denne kontrollen aktiv. 3 D finner informasjon om hvordan d feilsøker gjentakende feil nder Løse feilmeldinger på side

37 Overvåke kjøringens fremdrift 1 Overvåk kjøringens fremdrift og metrikk etter hvert som de vises i skjermbildet Seqencing (Sekvensering). Estimated rn completion (Anslått fllføring av kjøring) Den omtrentlige datoen og klokkeslettet når kjøringen blir fllført. %Q30 Read 1 (%Q30 avlesning 1) Prosentandelen av basebetegnelser for Read 1 (Avlesning 1) med en Q-score 30. %Q30 Read 2 (%Q30 avlesning 2) Prosentandelen av basebetegnelser for Read 1 (Avlesning 1) med en Q-score 30. Projected Total Yield (Planlagt total prodksjon) Det forventede antallet baser som betegnes for kjøringen. Q30 og prodksjonsmetrikk vises etter sykls Hvis d vil overvåke kjøringsprosesser, velger d kontrollprogramvaremenyen, og deretter velger d Process Management (Prosessbehandling). Laste t forbrksmateriell 1 Når sekvensering er fllført, velger d Eject Cartridge (Støt t kassett). Programvaren støter den brkte kassetten t av instrmentet. 2 Fjern kassetten fra brettet. 3 Fjern strømningscellen fra kassetten. 4 Avhend strømningscellen, som har elektroniske komponenter, i henhold til gjeldende lokale standarder. 5 Avhend kassetten, som inneholder brkte reagenser, i henhold til gjeldende lokale standarder. En kjøring etter vasking er ikke nødvendig fordi væsken avhendes sammen med kassetten. ADVARSEL Dette reagenssettet inneholder potensielt farlige kjemikalier. Personskade kan forekomme ved innånding, svelging, hdkontakt og øyekontakt. Brk vernetstyr, inkldert vernebriller, hansker og laboratoriefrakk som er egnet ved risiko for eksponering. Brkte reagenser skal behandles som kjemisk avfall og kastes i samsvar med gjeldende regionale, nasjonale og lokale lover og forskrifter. Hvis d ønsker ytterligere informasjon om helse, miljø og sikkerhet, kan d se mer på spport.illmina.com/sds.html. 6 Last inn brettet på nytt og gå tilbake til startskjermbildet ved å velge Close Door (Lkk dør). Programvaren laster atomatisk inn brettet på nytt, og sensorer bekrefter at kassetten er fjernet. 31

38 Kapittel 4 Vedlikehold Frigjøre plass på harddisken 32 Programvareoppdateringer 32 Skifte t lftfilteret 34 Flytte instrmentet 35 Programvarebegrensningspolicyer 37 Frigjøre plass på harddisken En sekvenseringskjøring krever ca. 2 GB ledig plass på harddisken. Når det er lite ledig plass, sletter d fllførte kjøringer og frigjør plass ved å følge disse trinnene. 1 I kontrollprogramvaremenyen velger d Process Management (Prosessbehandling). Skjermbildet Process Management (Prosessbehandling) vises med en liste over kjøringer som er lagret til harddisken. 2 Velg Delete (Slett) for kjøringen d vil slette. Når d sletter en kjøring, slettes den lokale kjøringsmappen. Utdatamappen, som er en kopi av kjøringsmappen, beholdes. 3 I dialogboksen bekrefter d sletting av kjøringen ved å velge Yes (Ja). 4 Gjenta 2 og 3 for hver kjøring d vil slette. 5 Når d er ferdig, velger d Process Management (Prosessbehandling) for å gå tilbake til startskjermbildet. Programvareoppdateringer Hvis d oppdaterer programvaren, sikrer d at systemet har de nyeste fnksjonene og feilrettingene. Programvareoppdateringer er samlet i en systemserie som inneholder følgende programvare: iseq kontrollprogramvare iseq 100-systemoppskrifter Universal Copy Service Sanntidsanalyse Local Rn Manager (kn rammeverk) MERK Selv om systemserien inneholder Local Rn Manager, inneholder den ikke analysemodlene. Installer dem separat etter behov ved hjelp av sbsadmin-kontoen. Oppnå tilgang til analysemodsprogramvaren fra støttesidene for Local Rn Manager. Systemet er konfigrert for å laste ned programvareoppdateringer atomatisk eller manelt: Atomatic pdates (Atomatiske oppdateringer) Oppdateringer lastes atomatisk ned fra BaseSpace Seqence Hb slik at d kan installere dem. Dette alternativet krever Internett-tilkobling, men ikke en BaseSpace Seqence Hb-konto. Manal pdates (Manelle oppdateringer) Oppdateringer lastet ned fra nettet, lagres lokalt eller på en bærbar enhet, og installeres fra den lagrede plasseringen. Dette alternativet krever ikke en Internetttilkobling. 32

39 Installere en atomatisk programvareoppdatering 1 Bytt til sbsadmin-operativsystemkontoen. 2 Velg kontrollprogramvaremenyen, og velg deretter Software Update (Programvareoppdatering) for å åpne dialogboksen Software Update (Programvareoppdatering). Systemer som er konfigrert for atomatiske oppdateringer viser et varsel når en programvareoppdatering er tilgjengelig. 3 Hvis d vil se etter en oppdatering, velger d ett av følgende alternativer: Check for Update (Se etter oppdatering) Se etter en programvareoppdatering. Atocheck for Updates (Se etter oppdateringer atomatisk) Se etter en programvareoppdatering, og konfigrer systemet slik at det ser etter fremtidige oppdateringer atomatisk. Disse alternativene er synlige på systemer som er koblet til Internett, men ikke konfigrert for atomatiske oppdateringer. 4 Last ned den nye programvareversjonen ved å velge Update (Oppdater). Når nedlastingen er fllført, lkkes kontrollprogramvaren, og installasjonsveiviseren vises. 5 Velg Install (Installer) i installasjonsveiviseren. 6 Når installasjonen er fllført, velger d Close (Lkk). Kontrollprogramvaren starter atomatisk på nytt. En eventell fastvareoppdatering skjer atomatisk etter omstarten. MERK Hvis d avbryter en oppdatering før installasjonen er fllført, stopper oppdateringen på det aktelle stedet. Eventelle endringer som er tført frem til avbrytelsen gjenopprettes til den forrige versjonen eller installeres ikke. Installere en manell programvareoppdatering 1 Bytt til sbsadmin-operativsystemkontoen. 2 Når en programvareoppdatering er tilgjengelig, laster d ned installasjonsprogrammet for serien (*.exe) fra støttesiden for iseq 100-sekvenseringssystem. Lagre installasjonsprogrammet til en lokal eller bærbar stasjon. 3 Hvis d lagret installasjonsprogrammet til en bærbar stasjon, plgger d stasjonen i en USB-port på baksiden av instrmentet. Flytt instrmentet etter behov for å få tilgang til baksiden. 4 I kontrollprogramvaren velger d Software Update (Programvareoppdatering) i kontrollprogramvaremenyen. 5 I dialogboksen Software Update (Programvareoppdatering) tvider d Install from local or portable drive (Installer fra lokal eller bærbar stasjon). 6 Naviger til installasjonsprogrammet ved å velge Browse (Bla gjennom). 7 Start initialiseringen ved å velge Update (Oppdater). Kontrollprogramvaren lkkes, og installasjonsveiviseren vises. 8 Velg Install (Installer) i installasjonsveiviseren. 9 Når installasjonen er fllført, velger d Close (Lkk). Kontrollprogramvaren starter atomatisk på nytt. En eventell fastvareoppdatering skjer atomatisk etter omstarten. 33

40 MERK Hvis d avbryter en oppdatering før installasjonen er fllført, stopper oppdateringen på det aktelle stedet. Eventelle endringer som er tført frem til avbrytelsen gjenopprettes til den forrige versjonen eller installeres ikke. Skifte t lftfilteret Programvaren varsler om et bytte av lftfilter hver sjette måned etter at førstegangs oppsett ble startet. Skift t et tløpt lftfilter ved hjelp av følgende instrksjoner. Lftfilteret er en skmbit til engangsbrk, som dekker de to viftene på baksiden av instrmentet. Det sørger for riktig kjøling og hindrer at smss trenger inn i systemet. Instrmentet leveres med ett lftfilter installert og ett i reserve. Ekstra reservedeler omfattes av garantien, eller de kan kjøpes fra Illmina. 1 Plasser instrmentet slik at d enkelt får tilgang til baksiden. 2 På baksiden av instrmentet trykker d på høyre side av dekkplaten slik at den frigjøres som vist i illstrasjonen nedenfor. 3 Fjern platen fra instrmentet. 34

41 4 Fjern skmlftfilteret fra midten av platen, og kast det. 5 Plasser et nytt lftfilter i platen, og trykk for å feste. 6 Sett de to platekrokene inn i hllene i instrmentet, og trykk platen på plass. 7 Sett instrmentet tilbake på plass. 8 Fortsett ved å velge Filter Changed (Filter byttet). Flytte instrmentet Flytt instrmentet på en sikker måte ved hjelp av følgende instrksjoner. Kontroller at den nye plasseringen oppfyller kravene som beskrives i Veiledning for klargjøring av stedet for iseq 100-sekvenseringssystem (dokmentnr ). Hvis d skal sende et instrment i retr, hopper d over dette avsnittet og går til Avansert bytte på side Velg Sht Down System (Avsltt system) i menyen. 2 Hvis ikke systemet avslttes, trykker d på og holder inne av/på-knappen på venstre side av instrmentet til lyset tones ned. 3 Når av/på-knappen plserer, trykker d på av- siden (Ο) av vekslebryteren på baksiden. Det kan hende at av/på-knappen fortsetter å plsere etter at strømmen er slått av. 35

42 Figr 7 Veksleknappens plassering 4 Koble strømledningen fra stikkontakten, og deretter fra vekselstrømttaket på baksiden. 5 Hvis det er aktelt, kobler d Ethernet-kabelen fra stikkontakten, og deretter fra Ethernet-porten på baksiden. 6 Senk monitoren. 7 Flytt instrmentet til ønsket plassering. Instrmentet veier 15,9 kg, og må løftes av to personer. 8 Hev monitoren. 9 Hvis instrmentet er koblet til et nettverk, kobler d Ethernet-kabelen til en Ethernet-port. 10 Koble strømledningen til strøminntaket på baksiden og deretter til en stikkontakt. 11 Trykk på på-siden (I) av vekslebryteren. 12 Når av/på-knappen plserer, trykker d på den. Figr 8 Av/på-knappens plassering 13 Når operativsystemet er lastet, logger d deg på Windows. 36

43 Kontrollprogramvaren startes og initialiserer systemet. Startskjermbildet vises når initialiseringen er fllført. Programvarebegrensningspolicyer Windows programvarebegrensningspolicyer (SRP) brker regler for kn å tillate at spesifisert programvare kjøres. Når det gjelder iseq 100-systemet, er SRP-regler basert på sertifikater, filnavn og -typer samt kataloger. SRP er slått på som standard slik at ønsket programvare hindres i å kjøre på kontrolldatamaskinen. En ITrepresentant eller systemadministrator kan legge til og fjerne regler slik at sikkerhetsnivået tilpasses. Hvis systemet er lagt til et domene, kan det lokale grppepolicyobjektet (GPO) atomatisk endre reglene og slå av SRP. Tillatte SRP-regler På iseq 100-sekvenseringssystemet tillater SRP følgende regler som standard. Sertifikater iseq-programsertifikat Kjørbare filer Portmon.exe Procmon.exe Procmon64.exe Tcpview.exe Filtyper *.cfg *.lnk *.png *.tif *.txt *.xml Kataloger %HKEY_LOCAL_MACHINE\SOFTWARE\Microsoft\Windows\CrrentVersion\ProgramFilesDir% %HKEY_LOCAL_MACHINE\SOFTWARE\Microsoft\Windows NT\CrrentVersion\SystemRoot% C:\CrashDmps\* C:\Illmina Maintenance Logs\* C:\Illmina Manfactring Test Reslts\* C:\Illmina\* C:\Program Files (x86)\chromim\application\* C:\Program Files (x86)\illmina\* C:\Program Files (x86)\internet Explorer\* C:\Program Files\Illmina\* C:\Program Files\Internet Explorer\* C:\Program Files\Jenoptik\* C:\Program Files\Ophir Optronics\* C:\ProgramData\Illmina\* C:\ProgramData\Package Cache\* C:\ProgramData\webex\* C:\Users\*\AppData\Local\GoToAssist Corporate\* C:\Users\*\AppData\Local\Temp\Citrix\* C:\Users\*\AppData\Local\Temp\CitrixLogs\* C:\Users\*\AppData\Local\Temp\LogMeIn\* C:\Users\*\AppData\Local\Temp\LogMeInLogs\* D:\Recovery\* 37

44 Kataloger GoToAssist Corporate Opener*.exe Trnover to cstomer.bat Legge til og fjerne SRP- regler Tilpass systemsikkerheten ved å legge til og fjerne SRP- regler. D må slå av SRP midlertidig mens d endrer reglene. FORSIKTIG Hvis d slår av SRP, overstyres standardbeskyttelsen. 1 Logg deg på operativsystemet med administratorkontoen. Administratorkontoen har rettighetene som er nødvendige for å endre SRP-reglene. 2 Slå av SRP: a b c Naviger til katalogen C:\Illmina\Secrity. Dobbeltklikk på Disable.reg. Bekreft endringene ved å velge Yes (Ja). MERK Når d brker berøringsskjermgrensesnittet, tilsvarer å trykke og holde i ca. 2 seknder et høyreklikk. 3 Velg Start, og deretter velger d Rn (Kjøring). 4 I feltet Open (Åpne) oppgir d secpol.msc. 5 I dialogboksen Local Secrity Policy (Lokal sikkerhetspolicy) tvider d Software Restriction Policies (Programvarebegrensningspolicyer), og deretter velger d Additional Rles (Tilleggsregler). 6 Slik legger d til en regel: a b c d e I menyen Action (Handling) velger d New Path Rle (Ny baneregel). I feltet Path (Bane) oppgir d sertifikatet, filnavnet, filtypen eller katalogen som d vil tillate. I listen Secrity (Sikkerhetsnivå) velger d Unrestricted (Ubegrenset). [Valgfritt] I feltet Description (Beskrivelse) oppgir d en årsak for å opprette regelen. Legg til regelen ved å velge OK. 7 Slik sletter d en regel: a b Velg regelen d vil slette, og velg deretter Delete (Slett). Bekreft slettingen ved å velge Yes (Ja). 8 Lkk dialogboksen Local Secrity Policy (Lokal sikkerhetspolicy). 9 Gjeninnsett SRP middelbart: a b Naviger til katalogen C:\Illmina\Secrity. Dobbeltklikk på Enable.reg. 10 Hvis SRP- regler ble endret for første gang, logger d av og deretter på igjen for at reglene skal tre i kraft. 38

45 Vedlegg A Utdata for sekvensering Oversikt over sanntidsanalyse 39 Arbeidsprosess for sanntidsanalyse 41 Oversikt over sanntidsanalyse Sanntidsanalyseprogramvaren kjører på instrmentets kontrolldatamaskin. Under en sekvenseringskjøring ekstraherer den intensiteter fra bilder slik at den kan tføre basebetegnelse, og deretter tilordnes basebetegnelsen en kvalitetsscore. iseq 100-sekvenseringssystem brker RTA2-implementeringen av sanntidsanalyse. RTA2 og kontrollprogramvaren kommniserer gjennom et HTTP-grensesnitt på nettet og delte minnefiler. Hvis RTA2 avslttes, gjenopptas ikke behandlingen, og kjøringsdata lagres ikke. MERK Demltipleksytelse beregnes ikke, så fanen Index (Indeks) i Seqencing Analysis Viewer er ikke fylt t. Inndatafiler RTA2 mottar kommandoer fra kontrollprogramvaren som inklderer informasjon om plasseringen til RnInfo.xml-filen og om en tdatafil er spesifisert. RTA2 krever følgende inndatafiler for behandling: Flisbilder plassert i et lokalt systemminne. Konfigrasjonsfil for sanntidsanalyse i XML-format. RnInfo.xml, som kontrollprogramvaren genererer atomatisk i begynnelsen av kjøringen. Fra denne filen avleser RTA2 kjøringsnavnet, antall syklser, om en avlesning er indeksert og antall fliser på strømningscellen. Utdatafiler Bilder sendes i minne til RTA2 som fliser, som er små avbildningsområder på strømningscellen definert av én kameravisning. iseq 100-strømningscellen har 16 fliser. RTA2 brker disse bildene til å frembringe primære tdata som et sett med kvalitetsscorede basebetegnelsesfiler og filterfiler. Andre filer støtter generering av primære tdatafiler. Filtype Basebetegnelsesfiler Basebetegnelsesindeksfiler Klyngeplasseringsfiler Filtype, -plassering og -navn Hver flis som er analysert innbefattes i en basebetegnelsesfil, som aggregeres i én fil per sykls. Den aggregerte filen inneholder basebetegnelsen og tilknyttet kvalitetsscore for hver klynge. Data\Intensities\BaseCalls\L001 [Cycle].bcl.bgzf, hvor [Cycle] (Sykls) representerer syklsnmmeret i fire sifre. Basebetegnelsesfiler komprimeres ved hjelp av blokk-gzip-komprimering. En basebetegnelsesindeksfil bevarer den opprinnelige flisinformasjonen. For hver flis inneholder indeksfilen flisnmmeret og antallet klynger. Data\Intensities\BaseCalls\L001 [Cycle].bcl.bgzf.bci Én klyngeplasseringsfil (s.locs) inneholder X-, Y-koordinatene for hver klynge på strømningscellen. Data\Intensities s.locs 39

46 Filtype Filterfiler InterOp-filer RTA-konfigrasjonsfil Kjøringsinformasjonsfil* Miniatyrbildefiler Filtype, -plassering og -navn Filterfiler angir om klynger går gjennom filter. Det genereres én filterfil for hver flis. Filterfiler genereres i sykls 26 med 25 syklser med data. Data\Intensities\BaseCalls\L001 s_[lane].filter Sanntidsmetrikk av kjøringskvalitet som oppdateres gjennom hele kjøringen. Disse binære filene inneholder fil-, sykls- og avlesningsmetrikk, og kreves for å vise metrikk i Seqencing Analysis Viewer. InterOp-mappe Opprettes i begynnelsen av kjøringen, og oppgir parametere for kjøringen. Denne filen kombinerer verdier fra inndatakonfigrasjonsfilen og verdier som RTA2 definerer. [Rotmappe], RTAConfigration.xml Opprettes i begynnelsen av kjøringen. Oppgir kjøringsnavnet, antall syklser per avlesning, om avlesningen er en indeksavlesning samt antall skår og fliser. [Rotmappe], RnInfo.xml Miniatyrbilder av strømningscellefliser. Images\L001\C[X.1] Filer lagres i én mappe for hver bane og én ndermappe for hver sykls. s_[lane]_[tile].jpg Miniatyrbildet innbefatter flisnmmeret. *Opprettet av kontrollprogramvaren. RTA2 oppretter alle andre filer som er oppgitt i denne tabellen. Local Rn Manager og BaseSpace Seqence Hb brker basebetegnelsesfilene til dataanalyse. Brk bcl2fastq-konverteringsprogramvaren i forbindelse med FASTQ-konvertering og tredjeparts analyseløsninger. Hvis d vil laste ned den nyeste versjonen, går d til støttesidene for iseq 100-sekvenseringssystem på Illminas nettsted. Utdatamappens navn og bane For hver kjøring genererer kontrollprogramvaren atomatisk en tdatamappe og en kjøringsmappe. D får tilgang til kjøringsdataene fra tdatamappen, som er en kopi av kjøringsmappen. Kjøringsmappen er beregnet på systembrk. Banen til tdatamappen er brkerdefinert, men er D:\ som standard. Kontrollprogramvaren navngir tdatamappen med følgende format. Format <ÅÅÅMMDD>_<Instrment-ID>_<Kjøringsnmmer>_ <Strømningscelle-ID> Eksempel _FFSP247_4_BNS Kjøringsnmmeret øker i trinn på én hver gang systemet tfører en kjøring. Serienmre identifiserer instrmentet og strømningscellen. 40

47 Utdatamappens strktr Recipe (Oppskrift) Kjøringsspesifikk oppskriftsfil. Logs (Logger) Loggfiler som beskriver instrmentanalyser, driftstrinn og andre hendelser. Config (Konfig.) Konfigrasjonsinnstillinger for kjøringen. RnParameters.xml RnInfo.xml CopyComplete.txt RnCompletionStats.txt RTAComplete.txt RTAConfigration.xml Data Intensities (Intensiteter) BaseCalls (Basebetegnelser) L001 s.locs InterOp Images (Bilder) SampleSheet.csv Prøveark eller prøvemanifestet. RTALogs Loggfiler som beskriver RTA2-hendelser. Feilhåndtering RTA2 oppretter loggfiler og skriver dem til RTALogs-mappen. Feil registreres i en feilfil i TSV-filformat. Følgende logg- og feilfiler overføres til det endelige tdatamålet etter endt behandling: *GlobalLog*.tsv sammenfatter viktige kjøringshendelser. *Error*.tsv oppgir feil som oppsto nder en kjøring. *WarningLog*.tsv oppgir advarsler som oppsto nder en kjøring. Arbeidsprosess for sanntidsanalyse Intensity Extraction (Intensitetsekstraksjon) Bestemmer en intensitetsverdi for hver klynge. Phasing correction (Fasingkorrigering) Korrigerer virkningene av fasing og prefasing. Base calling (Basebetegnelse) Bestemmer en basebetegnelse for hver klynge. Qality scoring (Kvalitetsscoring) Tilordner hver eneste basebetegnelse en kvalitetsscore. 41

48 Intensitetsekstraksjon Intensitetsekstraksjon beregner en intensitetsverdi for hver nanobrønn i et gitt bilde. Fasingkorrigering Under sekvenseringsreaksjonen tvides hver DNA-tråd i et clster med én base per sykls. Fasing og prefasing forekommer når en streng havner tenfor fase med den aktelle inkorporasjonssyklsen. Fasing forekommer når en base havner på etterskdd. Prefasing forekommer når en base hopper fremover. Figr 9 Fasing og prefasing A B Avles med en base som er fasing Avles med en base som er prefasing RTA2 korrigerer virkningene av fasing og prefasing, noe som maksimerer datakvaliteten i hver sykls gjennom hele kjøringen. Basebetegnelse Basebetegnelse bestemmer en base (A, C, G eller T) for hver klynge for en gitt flis ved en spesifikk sykls. iseq 100-systemet brker sekvensering med ett fargestoff, som krever ett fargestoff og to bilder for å kode data for de fire basene. Intensiteter som ekstraheres fra ett bilde og sammenlignes med et andre bilde, gir fire distinkte poplasjoner som hver tilsvarer en nkleotid. Basebetegnelse bestemmer hvilken poplasjon hver klynge tilhører. 42

49 Figr 10 Visalisering av klyngeintensiteter Tabell 3 Base Basebetegnelser i sekvensering med ett fargestoff Fargestoff i første bilde Fargestoff i andre bilde Konklsjon fra sammenlignede bilder T På På Klynger som viser intensitet i begge bilder er T-baser. A På Av Klynger som kn viser intensitet i det første bildet, er A- baser. C Av På Klynger som kn viser intensitet i det andre bildet, er C- baser. G Av Av Klynger som viser intensitet i ingen av bildene, er G-baser. Klyngepasserende filter Under kjøringen filtrerer RTA2 rådata for å fjerne avlesninger som ikke oppfyller datakvalitetsterskelen. Overlappende klynger og klynger av lav kvalitet, fjernes. Når det gjelder sekvensering med ett fargestoff, brker RTA2 et tfyllingsbasert system for å bestemme renheten (intensitetrenhetsmåling) for en basebetegnelse. Klynger passerer filter (PF) når ikke mer enn én basebetegnelse i de første 25 syklsene har en renhet nder en fast terskel. PhiX-innretting tføres ved sykls 26 på et delsett med fliser for klynger som passerte filter. Klynger som ikke passerer filter basebetegnes ikke, og jsteres ikke. Indeksavlesninger Prosessen for basebetegnelsesindeksavlesninger avviker fra basebetegnelsessekvenseringsavlesninger. De første to syklsene av en indeksavlesning kan ikke starte med to G-baser, fordi intensitet da ikke genereres. Hvis d vil sikre demltipleksytelse, må intensitet finnes i en av de første to syklsene. Kontroller at minst én indekssekvens i en biblioteksammenslåing ikke starter med to G-baser. Velg balanserte indekssekvenser slik at det finnes signal i minst ett bilde (helst begge bildene) for hver sykls. Plateoppsettet og sekvensene som d finner i IDT for Illmina TrSeq UD-indekser er tformet for å ha riktig balanse. D finner mer informasjon om indeksering og sammenslåing i Sammenslåingsveiledning for indeksadapter (dokmentnr ). 43

50 Kvalitetsscoring En kvalitetsscore, eller Q-score, er en prediksjon av sannsynligheten for en feil basebetegnelse. En høyere Q- score innebærer at en basebetegnelse har høyere kvalitet og mer sannsynlig å være korrekt. Q-score er en kompakt måte å kommnisere sannsynligheter for små feil. Q(X) representerer kvalitetsscorer, hvor X er scoren. Følgende tabell viser forholdet mellom kvalitetsscore og sannsynlighet for feil. Q-score Q(X) Sannsynlighet for feil Q40 0,0001 (1 av ) Q30 0,001 (1 av 1 000) Q20 0,01 (1 av 100) Q10 0,1 (1 av 10) MERK Kvalitetsscoring er basert på en endret versjon av Phred-algoritmen. Kvalitetsscoring beregner et sett med prediktorer for hver basebetegnelse, og brker deretter prediktorverdiene for å slå opp Q-scoren i en kvalitetstabell. Kvalitetstabeller opprettes for å gi optimalt nøyaktige kvalitetsprediksjoner for kjøringer som er generert av en spesifikk konfigrasjon av sekvenseringsplattform og kjemiversjon. Etter at Q-scoren er fastslått, registreres resltater i basebetegnelsesfilene. 44

51 Vedlegg B Feilsøking Løse feilmeldinger 45 Avbryte en kjøring 45 Foreta en strømtilstandsendring for instrmentet 46 Utføre en systemkontroll 47 Lekkasjebegrensning 49 Gjenopprette til fabrikkinnstillinger 51 Løse feilmeldinger Dette vedlegget gir detaljert informasjon om diverse feilsøkingstrinn. Følgende flytskjema gir en oversikt over feilsøking av feilmeldinger som vises nder initialisering, kjøringsoppsett, kontroller før kjøring eller sekvensering og som ikke kan løses ved å prøve på nytt. Mange feil kan løses med en strømtilstandsendring: å slå av instrmentet og deretter starte det på nytt igjen. Andre krever en systemkontroll slik at problemet kan diagnostiseres og løses. Figr 11 Oversikt over feilmeldinger Stats for prosessbehandling Slik feilsøker d et statsproblem i skjermbildet Process Management (Prosessbehandling): Hvis kjøringen pågår, lkker d skjermbildet Process Management (Prosessbehandling), venter i ca. fem mintter og åpner det på nytt. Hvis ikke kjøringen pågår, foretar d en strømtilstandsendring for instrmentet, og deretter åpner d skjermbildet Process Management (Prosessbehandling) på nytt. Se Foreta en strømtilstandsendring for instrmentet på side 46. Avbryte en kjøring 1 Velg Stop Rn (Stopp kjøring), og velg deretter Yes, Cancel (Ja, avbryt). 45

52 Skjermbildet Seqencing Canceled (Sekvensering avbrtt) vises med tidsangivelser av datoen og klokkeslettet da kjøringen stoppet. FORSIKTIG Å avbryte en kjøring er endelig. Programvaren kan ikke gjenoppta kjøringen, og forbrksmateriell kan ikke brkes på nytt etter instrmentkontrolldelen av kontroller før kjøring. 2 Åpne døren og støt t brettet ved å trykke på Eject Cartridge (Støt t kassett). 3 Fjern kassetten fra brettet. 4 Ta vare på eller kast kassetten, avhengig av når avbrytelsen skjedde: Forhold D avbrøt før eller nder instrmentkontrollen, og ønsker å brke forbrksmateriell på nytt. Alle andre forhold. Instrksjon La strømningscellen og biblioteket bli i kassetten, og sett den til side ved romtemperatr i opptil 1 time. Fjern strømningscellen fra kassetten. Avhend begge komponenter i henhold til gjeldende lokale standarder. Strømningscellen har elektroniske komponenter. Kassetten inneholder brkte reagenser og bibliotek. 5 Last inn brettet på nytt og gå tilbake til startskjermbildet ved å velge Close Door (Lkk dør). Sensorer bekrefter at kassetten er tatt t. Foreta en strømtilstandsendring for instrmentet Hvis d foretar en strømtilstandsendring for instrmentet, kan systemet trygt avslttes og startes på nytt for å gjenopprette en tapt tilkobling, jstere en spesifikasjon eller løse en initialiseringsfeil. Programvaremeldinger angir når d skal foreta en strømtilstandsendring for å løse en feil eller advarsel. 1 Velg Sht Down System (Avsltt system) i menyen. 2 Hvis ikke systemet avslttes, trykker d på og holder inne av/på-knappen på venstre side av instrmentet til lyset tones ned. 3 Når av/på-knappen plserer, trykker d på av- siden (Ο) av vekslebryteren på baksiden. Det kan hende at av/på-knappen fortsetter å plsere etter at strømmen er slått av. Figr 12 Veksleknappens plassering 4 Vent i 30 seknder. 5 Trykk på på-siden (I) av vekslebryteren. 46

53 6 Når av/på-knappen plserer, trykker d på den. Figr 13 Av/på-knappens plassering 7 Når operativsystemet er lastet, logger d deg på Windows. Kontrollprogramvaren startes og initialiserer systemet. Startskjermbildet vises når initialiseringen er fllført. Utføre en systemkontroll En systemkontroll tar omkring 45 mintter, og brker teststrømningscellen til flergangsbrk og testkassetten til flergangsbrk når feil knyttet til kontroller før kjøring og andre problemer skal feilsøkes. Fire delsystemtester bekrefter om komponenter er riktig innrettet og fngerer som de skal. Normal drift og vanlig vedlikehold krever ikke en systemkontroll. 1 Ta teststrømningscellen til flergangsbrk og testkassetten til flergangsbrk t av oppbevaring ved romtemperatr. 2 I kontrollprogramvaremenyen velger d System Check (Systemkontroll). Dialogboksen System Check (Systemkontroll) vises med de mekaniske, termiske, optiske og sensortestene valgt. 3 Åpne kassettkammerdøren og støt t brettet ved å velge Unload (Last t). 4 Hvis det står i en brkt kassett, fjerner d den fra brettet. 5 Undersøk glassoverflaten på strømningscellen til flergangsbrk med tanke på synlig smss. Hvis d ser smss, rengjør d på følgende måte. a b c Rengjør glassoverflaten med en alkoholserviett. Tørk med en laboratorieserviett med lavt loinnhold. Kontroller at strømningscellen er fri for lo og fibre. Under normale forhold er det ikke nødvendig å rengjøre teststrømningscellen til flergangsbrk. 6 Hold teststrømningscellen til flergangsbrk i gripepnktene med etiketten vendt opp. 47

54 7 Plasser teststrømningscellen til flergangsbrk i sporet på forsiden av testkassetten til flergangsbrk. Det høres et klikk som angir at strømningscellen er på plass. Når kassetten er lastet riktig inn, stikker grepet frem fra kassetten, og glasset er synlig fra tilgangsvindet. a b Innlasting av teststrømningscellen til flergangsbrk Innlastet teststrømningscelle til flergangsbrk 8 Plasser testkassetten til flergangsbrk på brettet slik at tilgangsvindet vender opp og strømningscellen er inne i instrmentet. 9 Velg Load (Last inn) for å laste inn testkassetten til flergangsbrk og lkke døren. 10 Start systemkontrollen ved å velge Start. Under systemkontrollen vil programvaren støte t og trekke inn kassetten én gang. MERK Teststrømningscellen og kassetten til flergangsbrk er gyldig for 36 gangers brk eller i 5 år fra prodksjonsdatoen, alt etter hva som nås først. Gjenværende antall ganger brk vises på skjermen. 11 Når systemkontrollen er fllført, går d gjennom hver test for å se om den er bestått. Resltat Angivelse Tiltak Alle fire tester er bestått Instrmentet fngerer som det skal, og problemet er sannsynligvis knyttet til forbrksmateriell eller bibliotek. Konfigrer en ny kjøring. Hvis d tok vare på forbrksmateriell fra den forrige kjøringen, brker d det til den nye kjøringen. Minst én test besto ikke Instrmentet kan ha en maskinvarefeil. Kontakt Illminas tekniske støtte. 12 Støt t testkassetten til flergangsbrk ved å velge Unload (Last t). 13 Fjern testkassetten til flergangsbrk fra brettet. 48

55 14 Fjern teststrømningscellen til flergangsbrk fra kassetten. 15 Legg testkomponentene til flergangsbrk tilbake i originalemballasjen, og oppbevar dem ved romtemperatr. 16 Lkk dialogboksen System Check (Systemkontroll). Lekkasjebegrensning Ved en dårlig væsketilkobling, et kassettproblem eller hvis det påvises en lekkasje nder en kontroll før kjøring eller sekvensering, avsltter programvaren kjøringen og varsler deg. Etter at d har vrdert lekkasjen og rengjort instrmentet, bekrefter en systemkontroll at normal drift kan fortsette. Et dryppbrett ved instrmentets sokkel fanger opp væske som lekker fra kassetten. Lekket væske kan imidlertid nå andre områder av systemet. Under normale forhold er dryppbrettet tørt. Vrdere lekkasjen 1 Ta på et nytt par pdderfrie hansker. ADVARSEL Dette reagenssettet inneholder potensielt farlige kjemikalier. Personskade kan forekomme ved innånding, svelging, hdkontakt og øyekontakt. Brk vernetstyr, inkldert vernebriller, hansker og laboratoriefrakk som er egnet ved risiko for eksponering. Brkte reagenser skal behandles som kjemisk avfall og kastes i samsvar med gjeldende regionale, nasjonale og lokale lover og forskrifter. Hvis d ønsker ytterligere informasjon om helse, miljø og sikkerhet, kan d se mer på spport.illmina.com/sds.html. 2 Følg ledeteksten i skjermbilder for å støte t kassetten. 3 Undersøk kassetten med tanke på synlig væske. En liten mengde væske (< 500 µl) på strømningscellens glassoverflate er akseptabelt. 4 Hvis d ikke ser noe væske (eller en akseptabel væskemengde), går d videre til Rengjøre instrmentet. Etter rengjøring bekrefter en systemkontroll normal drift. 5 Hvis en betydelig væskemengde er synlig på strømningscellen, kassetten eller instrmentet, avsltter d og kobler fra som beskrevet og kontakter Illminas tekniske støtte. a b c d e f Velg Sht Down System (Avsltt system) i menyen. Hvis kommandoen for å avsltte ikke svarer, trykker d på og holder inne av/på-knappen på venstre side av instrmentet til lyset tones ned. Når av/på-knappen plserer, trykker d på av- siden (Ο) av vekslebryteren på baksiden av instrmentet. Vent i 30 seknder. Koble strømledningen fra stikkontakten, og deretter fra vekselstrømttaket på baksiden. Hvis det er aktelt, kobler d Ethernet-kabelen fra stikkontakten, og deretter fra Ethernet-porten på baksiden. Rengjøre instrmentet 1 Slå for sikkerhets skyld av og koble fra instrmentet. a Velg Sht Down System (Avsltt system) i menyen. 49

56 b c d e f Hvis kommandoen for å avsltte ikke svarer, trykker d på og holder inne av/på-knappen på venstre side av instrmentet til lyset tones ned. Når av/på-knappen plserer, trykker d på av- siden (Ο) av vekslebryteren på baksiden av instrmentet. Vent i 30 seknder. Koble strømledningen fra stikkontakten, og deretter fra vekselstrømttaket på baksiden. Hvis det er aktelt, kobler d Ethernet-kabelen fra stikkontakten, og deretter fra Ethernet-porten på baksiden. 2 Finn dryppbrettdøren nder kassettkammeret på forsiden av instrmentet, og senk deretter døren. 3 Åpne dryppbrettet, og fjern dryppbrettpten. 4 Tørk bort eventell restvæske fra bnnen av brettet med tørkepapir. 5 Kast pten og annet forbrksmateriell i henhold til gjeldende standarder, som kan variere fra sted til sted. D finner mer informasjon i sikkerhetsdatabladet på spport.illmina.com/sds.html. 6 Plasser en ny pte på dryppbrettet. 7 Lkk dryppbrettet, og lkk deretter dryppbrettdøren. 8 Tørk bort eventell synlig væske på eller rndt instrmentet med tørkepapir. 9 Slå på og koble instrmentet til på nytt på følgende måte. 50

57 a b c d e Hvis det er aktelt, kobler d Ethernet-kabelen til en Ethernet-port. Koble strømledningen til strøminntaket på baksiden og deretter til en stikkontakt. Trykk på på-siden (I) av vekslebryteren på baksiden. Når av/på-knappen plserer, trykker d på den. Når operativsystemet er lastet, logger d deg på Windows. Kontrollprogramvaren startes og initialiserer systemet. Startskjermbildet vises når initialiseringen er fllført. 10 Ved hjelp av en systemkontroll bekrefter d at systemet fngerer som det skal. Hvis instrmentet består systemkontrollen, kan d brke det som normalt. D finner instrksjoner nder Utføre en systemkontroll på side 47. Gjenopprette til fabrikkinnstillinger Gjenopprett systemet til fabrikkinnstillinger når d vil nedgradere programvaren, gjenopprette fra en ønsket konfigrasjon eller fjerne brkerdata før d retrnerer et instrment til Illmina. Når d gjenoppretter systemet, avinstalleres kontrollprogramvare, og C:\ tømmes. 1 Start Windows på nytt. 2 Når d blir bedt om å velge et operativsystem, velger d Gjenopprett til fabrikkinnstillinger. Operativsystemalternativene vises et kort øyeblikk før det atomatisk fortsettes med iseqkontrollprogramvare. 3 Vent i ca. 30 mintter mens gjenopprettingen fllføres. Gjenopprettingen kan innbefatte flere omstarter. Når den er fllført, starter systemet på nytt med de opprinnelige fabrikkinnstillingene, ten kontrollprogramvaren. 4 Installer kontrollprogramvaren: a Last ned installasjonsprogrammet for programvare fra støttesidene for iseq 100- sekvenseringssystem. Lagre installasjonsprogrammet til en nettverksplassering eller bærbar USBstasjon. b Kopier installasjonsprogrammet til C:\Illmina. c Åpne iseqsiteinstaller.exe, og gjør det d blir bedt om for å tføre installasjonen. d Når oppdateringen er fllført, velger d Finish (Fllfør). e Foreta en strømtilstandsendring for instrmentet. D finner instrksjoner i Foreta en strømtilstandsendring for instrmentet på side Følg meldingene i skjermbildet når d skal tføre førstegangs oppsett, deriblant systemkontrollen med testkassetten for flergangsbrk og teststrømningscellen for flergangsbrk. 6 Installer eventelle Local Rn Manager-analysemodler: a b c d e Bytt til sbsadmin-operativsystemkontoen. Last ned installasjonsprogrammene for programvare fra støttesidene for Local Rn Manager. Lagre installasjonsprogrammene til en nettverksplassering eller bærbar USB-stasjon. Kopier installasjonsprogrammet til C:\Illmina. Åpne installasjonsprogrammet (*.exe), og gjør det d blir bedt om for å tføre installasjonen. Når oppdateringen er fllført, velger d Finish (Fllfør). 51

58 Vedlegg C Avansert bytte Bytte iseq 100-systemet 52 Motta et erstatningssystem 52 Klargjøre det originale systemet for retr 52 Retrnere det originale systemet 55 Bytte iseq 100-systemet Ettersom lftfilteret og dryppbrettpten er de eneste delene som kan repareres i iseq 100-systemet, brker Illmina avansert bytte for å tbedre problemer som ikke kan løses eksternt. Avansert bytte erstatter et skadet eller defekt system med et renovert system. D vil motta erstatningssystemet før d sender originalen tilbake slik at nedetiden minimeres. Regional tilgjengelighet Avansert bytte er tilgjengelig i de fleste regioner. Andre regioner kan fortsette å motta støtte fra serviceingeniører. Spør Illminas tekniske støtte om hvilke støttemodeller som er tilgjengelige i regionen din. Motta et erstatningssystem 1 Etter at en systemkontroll og andre forsøk på feilsøking har mislyktes, kontakter d Illminas tekniske støtte. Om mlig kan d tføre en ny systemkontroll med en annen testkassett til flergangsbrk og teststrømningscelle til flergangsbrk. Gjør resltatene av systemkontrollen tilgjengelige for teknisk støtte. Hvis den tekniske støtten ikke kan løse problemet eksternt, iverksettes en retr, og det legges inn en bestilling på et erstatningssystem. 2 Når d mottar erstatningssystemet: Pakk t og installer i henhold til Oppsettplakat for iseq 100-sekvenseringssystem (dokmentnr ). Ta vare på all emballasjen som brkes til å emballere det originale systemet og testkomponentene til flergangsbrk for retr. Legg til side retrdokmentene, som omfatter en UPS-retretikett og handelsfaktra (for internasjonale forsendelser). Klargjøre det originale systemet for retr Retrner det originale systemet, testkassetten til flergangsbrk og teststrømningscellen til flergangsbrk til Illmina innen 30 dager etter at d har mottatt erstatningsprodktet. Avsltte og koble fra Hvis systemet er på, følger d trinn 1 3 slik at data lagres og fjernes før systemet avslttes på en sikker måte. Følg resten av trinnene for å fjerne en kassett (ved behov) og koble fra ledninger og kabler. 1 I Filtforsker kopierer d eventelle filer og mapper som d vil lagre til en bærbar USB-stasjon. Plasseringen til sekvenseringsdata er brkerdefinert, men stasjon D er standardplasseringen. 2 Slett eventelle filer og mapper som d ikke vil dele med Illmina. 3 Avsltt systemet på følgende måte. 52

59 a b c Velg Sht Down System (Avsltt system) i menyen. Hvis kommandoen for å avsltte ikke svarer, trykker d på og holder inne av/på-knappen på venstre side av instrmentet til lyset tones ned. Når av/på-knappen plserer, trykker d på av- siden (Ο) av vekslebryteren på baksiden av instrmentet. 4 Hvis det står en kassett i instrmentet, starter d systemet på nytt og fjerner kassetten på følgende måte. a b c d e f g h Trykk på på-siden (I) av vekslebryteren på baksiden. Når av/på-knappen plserer, trykker d på den. Når operativsystemet er lastet, logger d deg på Windows. I kontrollprogramvaremenyen velger d System Check (Systemkontroll). Støt t kassetten ved å velge Unload (Last t), og deretter fjerner d kassetten fra brettet. Hvis tstøtingen mislykkes, må d kontakte Illminas tekniske støtte for nærmere instrksjoner. Velg Load (Last inn) slik at det tomme brettet trekkes inn og døren lkkes. Lkk avmerkingsboksen System Check (Systemkontroll), og deretter avsltter d systemet. Det er nødvendig å avsltte og starte systemet på nytt for å posisjonere kassetten for fjerning. 5 Koble strømledningen fra stikkontakten, og deretter fra vekselstrømttaket på baksiden. 6 Hvis det er aktelt, kobler d: Ethernet-kabelen fra stikkontakten, og deretter fra Ethernet-porten på baksiden. tastatret og msen fra USB-portene på baksiden. Dekontaminere instrmentet Når et instrment skal sendes, må det gjennom følgende dekontamineringsprosedyre, som Illmina bekrefter er komplett. Stedsspesifikke farer kan kreve ekstra dekontaminering. Dekontaminere med klor 1 Ta på et nytt par pdderfrie hansker. 2 Senk instrmentets monitor. 53

60 3 Dra kassettkammerdøren forsiktig fra sidekantene for å åpne den. 4 Rengjør hele kammerdøren med en klorserviett: Dørens innside Dørens tside Dørhengslene 5 Lkk kassettkammerdøren. 6 Finn dryppbrettdøren nder kassettkammeret på forsiden av instrmentet, og senk deretter døren. 7 Åpne dryppbrettet, og fjern dryppbrettpten. 54

61 8 Tørk bort eventell restvæske fra bnnen av brettet med tørkepapir. 9 Kast pten og annet forbrksmateriell i henhold til gjeldende standarder, som kan variere fra sted til sted. D finner mer informasjon i sikkerhetsdatabladet på spport.illmina.com/sds.html. 10 Rengjør dryppbrettet med en klorserviett. 11 Vent i 15 mintter slik at kloret får virke. Nøytralisere med alkohol 1 Fkt en klt eller tørkepapir med vann. D kan brke alle typer vann, også springvann. 2 Tørk over følgende komponenter med den fktige klten eller tørkepapir: Dryppbrett Kassettkammerdør (innvendig og tvendig, inkldert hengsler) Vannet forhindrer at klor og alkohol blandes. 3 Rengjør følgende komponenter på nytt med en alkoholserviett: Dryppbrett Kassettkammerdør (innvendig og tvendig, inkldert hengsler) Alkoholen fjerner rester av klor, som kan forårsake korrosjon. 4 Kontroller at dryppbrettdøren og kassettkammerdøren er lkket. 5 Rengjør laboratoriebenken rndt instrmentet med klorservietter eller kloroppløsning. Retrnere det originale systemet Emballere instrmentet 1 Gjør klar tilstrekkelig plass i laboratoriet til instrmentet og emballasjen. 2 Plasser den lille skmpten mellom den senkede monitoren og instrmentet. 3 Plasser den grå plastposen over instrmentet. 4 Senk den fremre klaffen på den hvite esken. 5 Plasser instrmentet i den hvite esken slik at forsiden av instrmentet vender mot deg. 6 Plasser den firkantede skmbiten over instrmentet slik at de tynnere sidene av skmbiten hviler mot forsiden og baksiden av instrmentet. Kontroller at skmbiten er i flkt med toppen av esken. 55

62 7 Lkk den fremre klaffen, og lkk deretter toppen av esken. Emballere testkomponentene til flergangsbrk 1 Plasser iseq 100-testkassetten til flergangsbrk i den største gjenlkkbare posen, og forsegl den. 2 Plasser iseq 100-teststrømningscellen til flergangsbrk i oppbevaringskofferten. 3 Plasser kofferten i den minste gjenlkkbare posen, og forsegl den. 4 Plasser begge de gjenlkkbare posene i tilbehørsesken for iseq 100-sekvenseringssystem. 5 Lkk tilbehørsesken. 56

63 Sende systemet 1 Hvis den ble fjernet, plasserer d den beskyttende skmbasen i bnnen av den brne fraktesken. 2 Løft den hvite esken etter håndtakene (det anbefales at to personer løfter sammen), og senk deretter den hvite esken ned i den brne esken. Den kan plasseres i hvilken som helst retning. FORSIKTIG Den hvite esken må sendes inni den brne esken. Den hvite esken er ikke tformet eller merket for forsendelse. 3 Plasser det beskyttende skmlokket over den hvite esken. 4 Plasser tilbehørseskene i midten av skmlokket. 5 Plasser den svarte skmpten oppå tilbehørseskene. 6 [Valgfritt] Plasser Ethernet-kabelen og strømledningen hvor som helst i den brne esken. 7 Lkk den brne esken, og forsegle den med fraktteip. 8 Plasser retretiketten over den opprinnelige forsendelsesetiketten, eller fjern den opprinnelige forsendelsesetiketten. 57