Påvisning av resistens hos M. tuberculosis-komplekset

Transkript

1 Påvisning av resistens hos M. tuberculosis-komplekset Anne Torunn Mengshoel Overlege Avdeling for tuberkulose, blod og seksuell smitte Nasjonalt referanselaboratorium for mykobakterier Folkehelseinstituttet

2 Mycobacterium Eneste genus/slekt i familien Mycobacteriaceae >180 arter Karakteristisk cellevegg m/mykolsyre 2

3 Inndeling Mycobacterium M. tuberculosis-komplekset M. leprae M. ulcerans Non-tuberculous mycobacteria (NTM); Mycobacteria other than M. tuberculosis (MOTT) Atypiske mykobakterier 3

4 M. tuberculosis-komplekset M. tuberculosis M. canettii M. africanum M. bovis M. mungi M. orygis M. microti M. pinnipedii M. caprae M. suricattae 4

5 Structure of the cell wall of mycobacteria Brennan P.J. and Crick D.C Curr. Top. Med. Chem. 7: Essentials of Glycobiology Second Edition Chapter 20, Figure 8 5

6 Celleveggen (magp complex) Hydrofob Cord Motstandsdyktig Immunforsvaret Antibiotika Desinfekjson Uttørking Krever spesiell fargeteknikk Ziehl-Neelsen Syrefaste staver; avfarges ikke med syre-alkohol

7 Resistenstesting Gi effektiv pasienten behandling Resistent TB; globalt problem TB i Norge; flest importerte Forekomst av resistens overvåkes NORM, ECDC, WHO

8 NORM NORM-VET 2016 Antimicrobial susceptibility of 228 isolates of Mycobacterium tuberculosis complex (not M. bovis (BCG)) from human infections in Figures from 2015 are shown in parentheses. Resistance to antimicrobial agents (No. of isolates) Origin No. of No. of of birth cases isolates Isoniazid Rifampicin Ethambutol Pyrazinamid MDR-TB* Norway 33 (36) 22 (22) 2 (1) 2 (0) 0 (0) 0 (3) 2 (0) Europe excl. Norway 39 (27) 34 (22 ) 3 (1) 2 (0) 2 (0) 7 (0) 2 (0) Asia 104 (115 ) 80 (88) 4 (9) 3 (2) 0 (0) 2 (5) 3 (1) Africa 120 (137) 90 (111) 10 (11) 4 (4) 0 (0) 6 (4) 4 (4) America 1 (3) 1 (2) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) Oceania 1 (0) 1 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) Unknown 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) Total 298 (318) 228 (245) 19 (22) 11(6) 2 (0) 15 # (12) 11 (5) Proportion resistant isolates (%) 8.3 (9.0) 4.8 (2.4) 0.9 (0.0) 6.6 (5.0) 4.8 (2.0)

9 Resistens hos M. tuberculosis-komplekset Påvises fenotypisk: Vekst i nærvær av antibiotika? Krever oppformert kultur; tar tid Påvises molekylært: Tilstedeværelse av mutasjoner? Direkte i prøvemateriale eller i kultur; raskere

10 Medikament Rifampicin Isoniazide (prodrug) Pyrazinamide (prodrug) Ethambutol Kinoloner Aminoglykosider Virkningsmekanisme (delvis kartlagt) Hemmer transkribsjon og proteinsyntese (binder til β-subenhet av RNA polymerase) Hemmer dannelse av fettsyrer generelt inkl. mykolsyre; hemmer celleveggsyntese, og hemmer en rekke andre metabolske prosesser Påvirker bla cellemembranen Hemmer dannelse av arabinogalactan; hemmer celleveggsyntese Hemmer nukleinsyresyntese (binder til DNA gyrase) Hemmer proteinsyntese (binder seg til 16S rrna og ribosomet) Noen involverte gener rpob katg, inha, ahpc, fabg1 pnca, rpsa embb gyra, gyrb rrs, eis, rpsl

11 BACTEC MGIT 960 BD (Becton Dickinson) Rør med ab og bakteriekultur Ktr rør med bakteriekultur Automatisk utflagging når vekst i ktr når en gitt terskelverdi Vekst i rør med ab sammenlignes med vekst ktr rør Deteksjon av vekst vha CO2 konsentrasjon og fluorescens Daglig avlesning

12

13

14 Prinsipp BACTEC MGIT 960 «Critical propotion and critical concentration» Detekterer større andel enn normalt av resistente mutanter i populasjonen Vekst i ab rør kontra vekst i kontroll rør Kritiske konsentrasjoner av antibiotika

15 COMPANION HANDBOOK WHO 2014

16 Førstelinje medikamenter: OUS, FHI Isoniazid, ethambutol, rifampicin Pyrazinamid Standardisert fra 2005 Fenotypisk MTBC NORGE BACTEC MGIT 960 Andrelinje medikamenter: FHI (TB exist / EpiCenter programvare) Prothionamid Amikacin, capreomycin, (kanamycin) Moxifloxacin, (ofloxacin) Linezolid Standardisert fra 2010 SNRL i Sverige: alle MDR/RR stammer sendes PAS (para-amino salicylsyre), cycloserin og klofazimin Ev. bedaquilin, delamanid

17 Molekylær påvisning av resistens på primærlaboratorier Mutasjoner i rpob genet: Rifampicin resistens: Indikator for MDR-TB Xpert MTB/Rif: mange lab. Sekvensering: OUS (kultur) Mutasjoner rpob, katg og inha genene: Rifampicin og isoniazid resistens: MDR-TB LPA GenoType MTBDRplus: Haukeland Abbott RealTime MTB RIF/INH: Stavanger LPA Line probe assay

18 Molekylær påvisning av resistens på FHI; kultur Mutasjoner rpob, katg, inha genene: MDR-TB LPA GenoType MTBDRplus (Hain) Rifampicin resistens rpob Isoniazid resistens katg og inha Mutasjoner gyra, gyrb, rrs, eis genene: XDR-TB LPA GenoType MTBDRsl v2 (Hain) Fluorokinoloner gyra, gyrb Aminoglykosider rrs, eis Helgenomsekvensering under implementering LPA Line probe assay

19 Resistens hos M. tuberculosis-komplekset Påvises molekylært: Tilstedeværelse av mutasjoner «rule in» kontra «rule out» resistens Fenotypisk testing parallelt for å utelukke resistens Lavgradig eller høygradig resistens? Fenotypisk testing for å avgjøre grad av resistens

20 Rifampicin resistens Ca 96% skyldes mutasjoner i rpob genet koder for β subenheten i RNA polymerasen Bindingssete for rifampicin gir vanligvis høygradig resistens enkelte mutasjoner gir lavgradig resistens

21 Xpert MTB/Rif Direkte i repiratoriske prøver Påviser MTBC og rifampicin resistens

22 x. 5 hours Approx. Line Probe 5 hours Assay (LPA) Hain Conjugate Control Amplification Control M. tuberculosis complex rpob Locus Control rpob wild type probe 1 rpob wild type probe 2 rpob wild type probe 3 rpob wild type probe 4 rpob wild type probe 5 rpob wild type probe 6 rpob wild type probe 7 rpob wild type probe 8 rpob mutation probe 1 rpob mutation probe 2A rpob mutation probe 2B rpob mutation probe 3 katg Locus Control katg wild type probe katg mutation probe 1 katg mutation probe 2 inha Locus Control inha wild type probe 1 inha wild type probe 2 inha mutation probe 1 inha mutation probe 2 inha mutation probe 3A inha mutation probe 3B colored marker Conjugate Contr ol Amplification Contr ol M. tuberculosis complex gyra Locus Contr ol gyra wild type pr obe 1 gyra wild type pr obe 2 gyra wild type pr obe 3 gyra mutation pr obe 1 gyra mutation pr obe 2 gyra mutation pr obe 3A gyra mutation pr obe 3B gyra mutation pr obe 3C gyra mutation pr obe 3D rrs Locus Contr ol rrs wild type pr obe 1 rrs wild type pr obe 2 rrs mutation pr obe 1 rrs mutation pr obe 2 Rifampicin og isoniazid resistens påvises; vanligste mutasjonene angis embb Locus Cont rol embb wild type pr obe 1 embb mutation pr obe 1A embb mutation pr obe 1B colored marker

23 Sekvensering av aktuelle gen Sekvensering av enkelt gen; rpob Gir endelig svar på mutasjon Fra kultur; tar tid

24 Sekvensering av aktuelle resistensgen Helgenomsekvensering og automatiserte analyseverktøy for påvisning av resistens Mycobacterium tuberculosis resistance prediction and lineage classification from genome sequencing: comparison of automated analysis tools. Schleusener V et al Sci Rep Apr 20;7:46327 CASTB, KvarQ, Mykrobe Predictor, PhyResSE, TBProfiler Fra kultur; tar tid

25 Grad av resistens Påvist mutasjon men fenotypisk følsom? Rifampicin Ulike mutasjoner gir ulike MIC Fenotypisk testing 1,0 mg/l Isoniazide katg mutasjoner «høygradig» inha mutasjoner lavgradig Fenotypisk testing 0,1 og 0,4 mg/l Fluorokinoloner gyra mutasjoner ulike mutasjoner gir ulike MIC for ulike generasjoner av fluorokinoloner Fenotypisk testing av moxifloxacin» Ved 0,5 og 2,0 mg/l også 0,25 mg/l på FHI

26 Utelukke resistens med molekylære metoder? For enkelte medikamenter med relativt stor grad av sikkerhet Avhengig av hvilke gener som undersøkes for mutasjoner Forutsetter Resistensmekanismen er kjent og hvilke gener som er involvert For de fleste medikamenter er dette fortsatt ikke fullstendig kartlagt

27 Takk for oppmerksomheten!