EPO og annen bloddoping - fysiologisk effekt og analytiske utfordringer

Transkript

1 EPO og annen bloddoping - fysiologisk effekt og analytiske utfordringer Forum for klinisk fysiologi, NIH 9.januar 2014 Yvette Dehnes Norges WADA-akkrediterte laboratorium 1

2 Disposisjon: EPO og rekombinante analoger Påvisning av bloddoping Blodprofiler Påvisning av mikrodoser EPO Rekombinant EPO (repo): Stor farmasøytisk industri (anemi; nyresykdom, kreft) Nye generasjoner EPO forbedret behandling Misbrukes pga stor prestasjonsfremmende effekt Bivirkninger: blodpropp, hjerneslag, lungeemboli Generasjon EPO-analog Injeksjons hyppighet På markedet Epoetin alfa, -beta, (Eprex, NeoRecormon), Biosimilar EPO (Retacrit) Darbepoetin alfa (NESP) CERA (Continues erythropoietin receptor activator) 3x /uke 1x /uke 1x /måned

3 EPO og repo: 165 aminosyrer, molekylvekt: kda Glykoprotein sukker utgjør 40% av totalmasse, viktig for: affinitet til EPO-reseptor, øke stabilitet i blod, begrense hepatisk clearance Figur fra Chemical and Engineering News Sukkergruppene brukes til å påvise doping med repo. CERA pegylert repo (epoetin beta) Struktur Halveringstid Lavere affinitet for EPO-reseptoren Fra websiden til Roche, Norway Lengre halveringstid 3

4 EPO-Fc fusion protein EPO (dimer eller monomer) fusjonert til Fc-delen på IgG Kan tas opp i blodet via Fcreseptor ved inhalering Mye lengre halveringstid EPO genterapi: EPO gendoping I Adenoassossierte virus (AAV), kunstige humane kromosomer, transplantasjon av celler manipulert ex vivo EPIDURE Biopumps - microdermis transfektert med EPO-genet Kontinuerlig produksjon av EPO (3-36 mnd; fase I og II-studier ) (EPODURE Biopums, Medgenics Inc.) 4

5 EPO gendoping II Oppregulering av EPO genet: HIF-stabilisatorer (prolyl hydroksylase hemmer) (Fibrogen: FG-2216, FG-4592), HIF= Hypoxy Inducible Factor Hemmere av transkripsjonsfaktorene GATA-2 og NF-ΚB Påvisning av bloddoping Analytiske utfordringer ved påvisning av doping med repo og analoger: 1. EPO er et endogent molekyl 5

6 Hvordan skille repo fra endogent EPO? human nyre Det humane EPO-genet uttrykt i Ulike enzymer: ulike sukkergrupper, ulik ladning hamsterceller 6 HuEPO (pi ) IEF ph IEF repo (pi ) 2 Isoelektrisk fokusering (IEF) Elektroforetisk deteksjon av EPO Isoelektrisk fokusering IEF SDS-PAGE CERA (Mircera TM ) NESP (Aranesp TM ) Epoetin delta (Dynepo TM ) Norges Norges laboratorium laboratorium for dopinganalyse for dopinganalyse 6

7 Påvisning av CERA CERA kunne påvises i serum hos 7 av 8 personer CERA kunne påvises i urin hos 6 av 8 personer IEF-profiler etter én injeksjon CERA: CERA: (repo+peg) PEG repo Påvist i både morgenurin og urin samlet etter trening Deteksjonsvinduet var minst 2x lengre i serum enn i urin Dehnes and Hemmersbach (2011), Drug Testing and Analysis. 3:291 Sukker Norges Norges laboratorium laboratorium for dopinganalyse for dopinganalyse Påvisning - annen bloddoping I Blodtransfusjon: Autolog transfusjon bruker eget blod Per i dag ingen påvisningsmetode Homolog transfusjon bruker fremmedblod Analysemetode: flow-cytometri 7

8 Påvisning - annen bloddoping II Syntetisk erytropoesestimulerende peptid Peginesatide: SDS-PAGE, ELISA Syntetiske oksygenbærere (HBOC; Hemopure, PolyHeme): Kolorimetrisk direkte visuell metode, HPLC EPO gendoping: Deteksjon av transgent EPO Deteksjon av transgent DNA (kan påvises i mnd år) Deteksjon av ektopisk EPO mrna ekspresjon Analytiske utfordringer ved påvisning av doping med repo og analoger: 2. Påvisningstid virkningstid Deteksjonsvindu: repo: 1-3 dager NESP: 3-5 dager CERA: 1-2 uker Virkningstid: 1-2 mnd! 8

9 Tolkning av blodprøver indirekte effekt av bloddoping Navn Fork. Antall parametre Hemoglobin Hgb 1 Hematokrit Hct 1 Retikulocytter Ret% 1 OFF-score* 2 Abnormal Blood Profile Score ABPS 2-12 * OFF-score= Hgb (g/l) 60* (Ret%) EPO og andre ESAs Startfase Vedlikeholds fase Blodtransfusjon Tapping Infusjon Individuelle blodprofiler matematisk sannsynlighetsmodell basert på bayesiansk statistisk teori. 9

10 Ricco italiensk syklist Analytiske utfordringer ved påvisning av doping: 3. Mikrodoser 10

11 Påvisning av mikrodoser EPO Studieprotokoll: 9 friske, frivillige personer fikk intravenøse mikrodoser EPO (7.5 U/kg bw) 2x/uke i 3 uker. Urin og blod ble samlet på ulike tidspunkt etter injeksjonene Prøvene ble analysert med EPO WGA MAIIA, SAR-PAGE og IEF Prosjektet var godkjent av REK EPO WGA MAIIA: Nytt screening assay for EPO? Kombinert WGA affinitetskromotografi og lateral flow immunoassay EPO isoformer separeres i en sone med WGA i en tynn mikrokolonne (dipstick) Bindingsaffinitet til WGA: repo >> endogent EPO PMI = % migrerte isoformer Lectin = WGA (Wheat Germ Agglutinin) Norwegian Doping Control Laboratory 11

12 Påvisning av mikrodoser EPO Dehnes et al. Drug Test Anal Nov 4. doi: /dta.1579 Elektroforetisk påvisning av mikrodoser med MAIIA-assay SAR-PAGE av urin samlet ca 10 timer etter 1. iv mikrodose (7.5 U/kg): BRP= referansepreparat for repo (1:1 epoetin alfa og epoetin beta) 12

13 Elektroforetisk påvisning av mikrodoser (7.5 U/kg bw) EPO: Urinprøver: Plasmaprøver: Dehnes et al. Drug Test Anal Nov 4. doi: /dta.1579 Norges Norges laboratorium laboratorium for dopinganalyse for dopinganalyse Takk til Alexandra Shalina, mastergradsstudent Farmasi, UiO/Norges laboratorium for dopinganalyse, OUS Prosjektdeltakere fra Norges idrettshøyskole (NIH) Linda Myrvold, Mette Borgen, Mette Istad og andre kollegaer ved, OUS Jostein Hallén, Seksjon for fysisk prestasjonsevne, NIH Sykepleiere og leger ved Endokrinologisk poliklinikk, OUS Aker Prosjektet ble støttet av Kulturdepartementet Takk for oppmerksomheten! Norges Norges laboratorium laboratorium for dopinganalyse for dopinganalyse 13