DA, NO, SV 2) Dette dokument indeholder bogmærker. For at få vist korrekt brug af Adobe Reader eller Adobe Acrobat-software.

Transkript

1 DA, NO, SV 2) Dette dokument indeholder bogmærker. For at få vist korrekt brug af Adobe Reader eller Adobe Acrobat-software. 15) Dette dokumentet inneholder bokmerker. Bruk Adobe Reader eller Adobe Acrobat til å vise riktig. 28) Det här dokumentet innehåller bokmärken. För att visa korrekt användning av Adobe Reader eller Adobe Acrobat.

2 Et immunoassay til kvantitering af Bb fragmentet af Factor B, en indikator for aktivering af den Alternative komplementvej, i humant plasma og serum OPSUMMERING MicroVue Bb Plus Fragment EIA Side 1 af 13

3 ANVENDELSES OMRÅDE The MicroVue Bb Plus Enzym Immunoassay Kit bestemmer mængden af komplement fragmentet Bb, et aktiverings fragment af Factor B fra den alternative komplementvej, i human plasma eller serum. Aflæsning af Bb i human plasma eller serum giver dokumentation for at den alternative vej er involveret. Aflæsning af den aktiverede alternative vej hjælper til diagnosticering af flere nyre sygdomme f.eks kronisk glomerulonephritis, lupus nephritis så vel som flere hud sygdomme f.eks dermititis herpetiformis og pemphigus vulgaris. Andre sygdomme hvor aktivering af den alternative komplementvej er observeret inkludere rheumatoid arthritis, sickle cell anemia og gram-negative bacterielle infektioner. OVERSIGT OG BESKRIVELSE AF TESTEN Den alternative komplement vej giver naturlig beskyttelse mod mikrobielle agens ved fravær af specifikke antistoffer. 1-5 Aktivering af denne komplement vej kan udløses af mange substanser inklusiv mikrobielle polysaccharider eller lipider, gramnegative bakteriel lipopolysaccharider og overflade determinanter præsenteret på visse vira, parasitter, viral inficerede mammalian celler og cancer celler. I autoimmune sygdomme kan aktivering af den alternative komplement kaskade bidrage direkte til vævs ødelæggelse. En central vigtig reaktion der sker under aktivering af den alternative vej er konvertering af 93 Kd Factor B zymogen til et aktivt proteolytisk enzym. Dette sker i to step. Under første reaktion former Factor B et magnesium-afhængig kompleks med C3(H20) eller C3b. 4 C3(H20),B komplekset formes kun i væske-fase mens C3b,B komplekset kan dannes enten i væske-fase eller på en overflade. 1-4 Factor B, som er tilstede i C3(H20),B eller C3b,B komplekset, bliver kløvet til Ba (33 Kd) og Bb (60 Kd) fragmenter i det andet step ved hjælp af enzymet Faktor D i den alternative vej. 1-4 Det deraf følgende C3b,Bb bimolekylære kompleks er C3 konvertase enzym i den alternative aktiverings vej. Bb subunit er den katalytiske aktive del af komplekset som er i stand til at kløve C3 til C3a og C3b fragmenter. 1-4,6 De øvrige C3b fragmenter der er produceret på denne måde kan danne C3b,Bb,C3b trimolekylær kompleks som er C5 konvertase enzym fra den alternative vej. Denne C5 konvertase er i stand til at kløve C5 til C5a og C5b fragmenter. 1-4,6 C3 og C5 konvertaser fra den alternative aktiveringsvej kan stabiliseres af Factor P (også kaldet Properdin) en komponent fra den alternative vej der normalt er til stedet i humant plasma eller serum, 1-4 eller af C3 nephritic factor, et autoantistof der produceres i nogle patienter der oplever omfattende aktivering af den alternative vej. 5 C3 og C5 konvertaser fra den alternative vej kan adskilles og derved inaktiveres ved spontan henfald 7 eller ved binding af Factor H eller Complement Receptor 1 (CR1). 4,8 Bb fragmentet, der er adskilt fra hver convertase beholder nogen biologisk aktivitet, f.eks. tilbageholdelse af funktionel hæmolytisk aktivitet, 4,9 evnen til at inducere macrophag-udspredelse 10 og plasminogen aktivering. 11 Selvom den alternative aktiveringsvej menes at foregå primært ved fravær af specifikt antistof, opstår mange situationer, i hvilken den alternative aktiveringsvej vil ske som et resultat af aktivering af den klassiske aktiveringsvej. For eksempel kan immunkomplekser der er til stede i patienter med autoimmune sygdomme udløse den klassiske aktiveringsvej med det resultat at der produceres C3b fragmenters. Som beskrevet herover er disse C3b molekyler i stand til at binde Factor B og initierer kløvning til Ba og Bb fragmenter. Således kan den alternative aktiveringsvej optræde i antistof medieret autoimmune tilstande og kan bidrage signifikant til forstærket komplement aktivering og deraf følgende vævs destruktion. Ved aflæsning af Factor B kløvnings produkter i prøver udtaget på sygdomstidspunktet, kan man estimere omfanget af den alternative aktiveringsvej. MicroVue Bb Plus EIA giver en simple, hurtig, ikke-radioaktiv, høj specifik og kvantitativ procedure til aflæsning af Factor B aktivering. Det er ideelt til undersøgelse af rolle eller status af den alternative komplement aktiveringsvej i adskillig forskning, klinisk baggrund og for monitorering af generering af Bb i vitro. MicroVue Bb Plus Fragment EIA Side 2 af 13

4 PROCEDURE PRINCIP MicroVue Bb Plus Enzym Immunoassay til kvantitering af Bb i human serum, plasma eller andre prøver er en tretrins procedure der anvender (1) en microassay plade coatet med et musse monoclonalt antistof der binder specifik til human Bb, (2) et HRP-konjugeret murint anti-human Bb, og (3) et kromogent substrat. I første step tilsættes Standarder, Kontroller og prøvemateriale til brøndene præcoatede med et specifikt anti-bb monoclonalt antistof. Bb, men ikke Factor B eller andre komplement aktiverings produkter der er til stede i Standarder, Kontroller eller prøver, vil binde sig til det immobiliserede anti-bb monoclonalt antistof. Efter inkubation fjerner et vaskestep ubundet materiale. I andet step tilsættes horseradish peroxidase (HRP)-konjugeret murint anti-bb antistof til hver brønd. Det enzym konjugerede anti-bb binder til Bb bundet i brøndene. Efter inkubation fjernes overskydende ubundet konjugat ved en vaskeprocedure. I tredje step tilsættes et farvet enzym substrat til hver brønd. Det bundne HRP-konjugat reagerer med substratet og danner en blå farve. Efter inkubation stoppes enzym reaktionen kemisk, farven skifter til gul og farve intensiteten aflæses spektrofotometrisk ved 450 nm. Farve intensiteten er proportional med koncentrationen af Bb tilstede i prøverne, Standarder og Kontroller. MEDFØLGENDE REAGENSER OG MATERIALER 96 Assay for Bb fragment af Factor B MicroVue Bb Plus Enzym Immunoassay kit indeholder følgende: A B C D E Bb Plus Standarder Del A9948-A ml hver (frysetørret) hver indeholder en kendt koncentration af Bb i human serum fortyndet i PBS, protein stabilisatorer, 0,035% ProClin 300 L Bb Plus Lav Kontroller Del A ml (frysetørret) Indeholder en kendt koncentration af Bb i human serum fortyndet i PBS, protein stabilisatorer, 0,035% ProClin 300 H Bb Plus Høje Kontroller Del A ml (frysetørret) Indeholder en kendt koncentration af Bb i human serum fortyndet i PBS, protein stabilisatorer, 0,035% ProClin 300 ❶ Microassay Plade Del A x 8 brønde 12 otte-brønde strips coatet med et oprenset monoclonalt muse- antistof specifik for human Bb i en folie pose der kan genlukkes ❷ Stopopløsning Del A ml Indeholder 1N Syre-Hydrochloric ❸ 20X Wash Solution Koncentrat Del A ml Hver indeholder phosphat bufferet saltvand (PBS), 1,0% Tween-20, og 0,035% ProClin 300 ❹ Complement Speciment Diluent Del A ml Indeholder PBS, 0.05% Tween-20, 2,5% protein stabilisatorer, 0,035% ProClin 300 ❺ TMB Substrat Del ml Indeholder 3,3, 5,5 tetramethylbenzidine (TMB) og Hydrogen Peroxide (H 2 O 2 ) ❻ Bb Plus Konjugat Del A ml Indeholder horseradish peroxidase-konjugeret murin anti-human Bb opslemmet i HRP stabiliseret buffer med konserveringsmiddel MicroVue Bb Plus Fragment EIA Side 3 af 13

5 ❽ Hydreringsreagens Del A ml Indeholder 0,035% ProClin 300 Tween 20 er et registreret varemærke af ICI Americas Ic. ProClni er et registreret varemærke af Rohm og Haas Company. NØDVENDIGE MATERIALER DER IKKE MEDFØLGER Timer (60 minutter interval) Lommeregner eller anden databehandlings metode til validering af assay Ren ubrugt microassay plade og/eller test rør og racks Beholder til vaskebuffer fortynding Vaske bowle eller anden immunoassay vaske system Justerbar multikanel pipette (8 eller 12 kanaler) eller repetér mikropipette (valgfri) Rene pipetter, 1 ml, 5 ml, og 10 ml Mikropipette og pipette tips Reader der er I stand til at aflæse optisk densitet (OD) mellem 0,0 og 2,0 Ionbyttet eller destilleret vand ADVARSLER OG FORSIGTIGHEDS REGLER Til I vitro Diagnostik. Brug af Heparin plasma i dette assay kan give forkerte resultater. Blodprøver skal behandles som potentielt infektiøse. Følg generelle sikkerhedsregler når dette kit eller patientprøver håndteres. Anvend de medfølgende materialer som en samlet enhed og anvend dem inden udløbsdatoen, der er indikeret på pakkemærkaten. Opbevar kit reagenserne som anvist. Anvend ikke coatede strips hvis posen er itu. Bunden af brøndene må ikke skrabes eller røres når der tilsættes eller opsuges væsker fra microassay brøndene. Brug af inkubationstid eller temperatur forskellig fra de angivne kan give forkerte resultater. Mikroassay brøndene må ikke tørre ud når proceduren er startet. Brug ikke en brønd til mere end én test Multikanal pipette eller repeter pipette anbefales for at sikre rettidig inkubationstider. For fejlfri aflæsning skal prøver og standarder placeres korrekt Afpipeter omhyggeligt og anvend kun kalibreret udstyr. Korrekt venepunktur og opbevaring af blodprøver er essentiel for korrekte resultater (se PRØVE INDSAMLING OG PRÆPARATION, side 4). Undgå mikrobiel eller kryds-kontamiation af prøver, reagenser eller materiale. Ukorrekte resultater kan ses ved kontaminering. Hver donor enhed der er anvendt til fremstilling af standarder og kontrol sera blev testet med en FDA godkendt metode for tilstedeværelse af antistof mod human immundefekt virus, (HIV 1 og 2) og hepatitis C virus, såvel som for hepatitis B surface antigen og fundet negativ (ikke gentagen reaktiv). Eftersom ingen testmetode kan give fuldstændig garanti for fravær af smittefarlige stoffer, skal disse reagenser behandles efter biosikkerhedsniveau 2 som anbefalet for alle potentielt smittefarlige humane serum-eller blodprøver i Centers for Disease Control/National Institutes of Health s vejledning Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, ProClin 300 anvendes som konserveringsmiddel. Utilsigtet kontakt med eller indtagelse af buffer eller reagenser indeholdende ProClin kan forårsage irritation af hud, øjne eller mund. Anvend GLP til at reducere eksponering. Søg læge hvis du oplever symptomer. Substrat koncentrat er lysfølsomt. Undgå forlænget udsættelse for stærkt eller direkte lys. Opbevar reagenser mørkt når de ikke anvendes. For at undgå aerosol dannelse under vask anvendes et apparat til opsugning i en beholder med husholdnings klor. MicroVue Bb Plus Fragment EIA Side 4 af 13

6 Brug en skylleflaske til at skylle pladen. For at sikre optimale resultater må man ikke bruge en multikanalpipette til at skylle microassay-pladen.varme-inaktiveret, hyperlipemic eller kontamineret prøve kan give ukorrekte resultater. Testning skal udføres i et område med tilstrækkelig ventilation. Bortskaf beholdere og ubrugt indhold i henhold til gældende kliniske retningslinjer for bortskaffelse af biologisk farligt materiale. Bær egnet beskyttelsestøj, handsker og øjen/ansigtsbeskyttelse ved håndtering af indholdet i dette kit. Vask hænderne grundigt efter håndtering. For yderligere oplysninger om faresymboler, sikkerhed, håndtering og bortskaffelse af komponenterne i dette kit henvises til sikkerhedsdatabladet (SDS), der findes på quidel.com. REAGENS FORBEREDELSE Bring alle reagenser og materialer op til 15 C til 25 C før brug. Efter at have udtaget de nødvendige reagenser og materialer returneres de ubrugte varer til korrekt opbevaringstemperatur (se OPBEVARING). Coatede Strips Beregn antallet af strips, der er nødvendig. Udtag det valgte antal strips. Sæt de strips, der skal bruges i plade rammen. Læg de ubrugte strips tilbage i opbevaringsposen, forsegl posen og opbevar den ved 2 C til 8 C. Vaskeopløsning Fremstil vaskeopløsning til vask af brøndene ved at fortynde 50 ml af 20X Wash Solution koncentrat op til en brugsfortynding på i alt 1 liter med destilleret eller ionbyttet vand. Miks grundigt før brug. Vaskeopløsningen er stabil i 30 dage når den opbevares i en ren beholder ved 2 C til 8 C. Hvis der opstår urenheder smides reagenset ud. Bb Plus Standard og kontrol rekonstitution Tilsæt 1,0 ml. af Hydrating Reagens til hver standard glas (A-E) samt til den lave kontrol og den høje kontrol. Lad de opløste glas stå i mindst 15 minutter ved stuetemperatur. Miks grundigt. Undgå at danne skum eller bobler, når du mikser. Rekonstituerede standarder og kontroller er stabile i 30 dage når de opbevares ved 2 C til 8 C. Prøve fortynding FORSIGTIG: Alle prøver bør behandles som potentiel infektiøs. Anvend ikke varme-inaktiverede eller kontaminerede prøver. Det anbefales at fortynde plasma prøver 1:10 i Specimen Diluent inden brug af MicroVue Bb Plus Enzym Immunoassay. Det anbefales at fortynde serum prøver 1:20 i Specimen Diluent. Når prøverne er fortyndet, skal de tilsættes brøndene indenfor 30 minutter. Gem eller genbrug ikke fortyndede prøver. Eventuel overskydende fortyndet materiale skal kastes bort. Prøver med høje værdier af komplement aktivering kan kræve højere fortynding end de angivne. Tilsætning af fortyndet prøve til microtiterbrøndene En af to metoder kan anvendes ved tilsætning af fortyndede prøver, standarder, kontroller og buffer til brøndene (se Step 3 af ANALYSEPROCEDURE). Ved et lille antal prøver der skal testes kan fortyndede prøver og andre reagenser tilsættes direkte til deres respektive brønde med en mikropipette (100 µl/brønd). For et lille eller stort antal prøver, specielt et stort antal, anbefaler vi at bruge en multikanel pipette ved tilsætning af prøver. (En multi-kanel pipette kan også bekvemt anvendes til tilsætning af konjugat, substrat og stop reagens). MicroVue Bb Plus Fragment EIA Side 5 af 13

7 For at tilsætte standarder, kontroller og fortyndet prøvemateriale til brøndene så hurtigt som muligt, kan kopi plade procedure anvendes. I stedet for at tilsætte 100 µl af hver standard, kontrol eller fortyndet prøve til de antistofcoatede brønde individuelt, kan µl af hver opløsning opdryppes i individuelle brønde i en blank plade (medfølger ikke) der korrespondere den endelige EIA plade. Når alle blandingerne, der ønskes testet, er dryppet op i de respektive brønde i den blanke plade, kan man hurtigt overføre 100 µl fra hver blank brønd til de antistof-coatede brønde med en multikanel pipette. For at undgå muligheden for kryds- kontaminering skal pipette spidser skiftes hver gang man har overført en række. OPBEVARING Det uåbne kit opbevares ved 2 C til 8 C. Efter åbning skal 20X Wash Solution koncentrat og Hydrating Reagent opbevares ved 2 C til 25 C. Alle reagenser skal opnå stuetemperatur (15 C til 25 C) før brug. Placer alle ubrugte microassay strips i opbevaringsposen; luk posen og opbevar ved 2 C til 8 C. INDIKTIONER PÅ USTABILITET ELLER FORRINGELSE AF REAGENSER Uklarhed i Wash Solution indikerer en ødelæggelse af dette reagens. Hvis dette se bør væsken kasseres. PRØVE INDSAMLING OG PRÆPARATION Håndtering og bortskaffelse af alle prøver i henhold til universale sikkerhedsprocedure. Korrekt prøvetagning og opbevaring af materiale er essentiel idet Factor Bb er følsom for proteolyse i forkert udtaget og opbevaret materiale. På grund af komplement aktivering der sker under koagulation vil Bb koncentrationen i normale humane serum prøver være højere end dem fra EDTA plasma prøver. Bb niveauet i EDTA plasma kan derfor repræsenterer et mere akkurat mål for in vivo koncentrationerne. Serum eller EDTA plasma prøver bør tages aseptisk ved standard teknik. Prøverne bør testes straks eller opbevares ved 4 C eller på is indtil de analyseres. Dog bør denne kort tids opbevaring på is ikke overstige 4 timer. For længere opbevaring skal serum eller plasma fryses ved 70 C eller derunder indenfor 2 timer efter prøven er taget. Tø frosne ( 70 C) prøver hurtigt i et 37 C vandbad indtil prøven netop er tøet. Overfør straks optøede prøver til is (for maksimalt 4 timer) for at forhindre komplement aktivering før fortynding. Efterlad ikke prøver ved 37 C. Tø ikke prøver ved stuetemperatur eller 4 C da det kan føre til komplement aktivering. Frosne prøver skal testes så hurtigt som muligt efter optøning. Gentagne frysninger og optøninger anbefales ikke. Hvis prøverne skal gen-fryses for yderligere analyse, anbefaler Quidel at fryse flere aliquot af prøven for at forhindre gentagne fryse/tø forløb. ANALYSEPROCEDURE Læs hele brugsanvisningen inden opstart af assayet. Se ADVARSLER OG FORSIGTIGHEDSREGLER og REAGENS FORBEREDELSE. 1. Registrer brøndenes positioner sammenholdt med de blanke brønde, alle prøver, standarder og kontroller så vel som lot numre fra glassenes mærkater. Marker et hjørne af pladen ad hensyn til retningen. 2. Forbered microassay stripsne som følger: a. Tilsæt ca. 300 µl wash solution til hver brønd ved hjælp af enten en sprøjteflaske eller en automatiseret plade vasker. BEMÆRKBEMÆRK: For at sikre optimale resultater må man ikke bruge en multikanalpipette til at skylle microassay pladen. MicroVue Bb Plus Fragment EIA Side 6 af 13

8 b. Inkubér brøndene i 1 minut ved 15 C til 25 C. c. Opsug indholdet fra hver brønd. d. Tilsæt ca. 300 µl Wash Solution til hver brønd. e. Opsug indholdet fra hver brønd. f. Gentag step d-e yderligere én gang for at opnå 3x vask. g. Vend pladen på hovedet og bank hårdt på absorberende papir for at fjerne tiloversblevet væske. 3. Tilsæt 100 µl Specimen Diluent, Rekonstituerede standarder, kontroller eller fortyndet prøve til de respektive brønde. 4. Inkubér ved 15 C til 25 C i 30 ± 1 minut. 5. Vask brøndene 5 gange efter følgende procedure: a. Opsug indholdet fra hver brønd. b. Tilsæt ca. 300 µl Vaskeopløsning til hver brønd ved hjælp af en sprøjteflaske eller automatisk vasker. BEMÆRK: For at sikre optimale resultater må man ikke bruge en multikanalpipette til at skylle microassay-pladen Inkubér brøndene i 1 minut ved 15 C til 25 C. c. Opsug indholdet fra hver brønd. d. Tilsæt ca. 300 µl vaskeopløsning til hver brønd. e. Opsug indholdet fra hver brønd. f. Gentag step e-f yderligere 3 gange. g. Efter 5 vask vendes pladen på hovedet. Bank solidt på absorberende papir for at fjerne tiloversblevet væske. 6. Dispenser 50 µl af Bb konjugat til hver vasket brønd inklusiv de(n) blank(e) brønd(e) ved hjælp af en multikanal pipette eller en repetér pipette. 7. Inkubér stripsne ved 15 C til 25 C i 30 ± 1 minut. 8. Vask brøndene efter 30-minutters inkubation (step 7), som beskrevet under ASSAY PROCEDURE, step 5. BEMÆRK: For at sikre optimale resultater må man ikke bruge en multikanalpipette til at skylle microassay pladen 9. Straks efter vaskeproceduren dispenseres 100 µl TMB Substrate Solution til hver brønd inklusiv de(n) blanke. BEMÆRK: TMB Substrate skal beskyttes mod lys under opbevaring og inkubering. TMB Substrate må ikke dispenseres ned i en reagensbeholder eller et andet apparat, hvor udsættelse for lys kan forekomme, indtil umiddelbart før dispensering ned i microassay brøndene. 10. Inkubér stripsne ved 15 C til 25 C i 15 ± 1 minut i mørket. 11. Tilsæt 100 µl Stop Solution til hver brønd for at stoppe enzym reaktionen. Stop Solution skal tilsættes brøndene i samme rækkefølge som Substrate Solution blev tilsat. 12. Bank forsigtigt pladen på bordpladen for at fordele farveudviklingen helt og jævnt. 13. Aflæs absorbans ved 450 nm for hver brønd indenfor en time efter tilsætning af Stop Solution (step 11), og anvend de(n) blanke som korrektion i overensstemmelse med det anvendte spectrofotometriske system. 14. Bortskaf overskydende fortyndede prøver, kontroller, substrat og de brugte strips (se ADVARSLER OG FORSIGTIGHEDS REGLER). KVALITETS KONTROL Analyse certifikatet, der er inkluderet i dette kit, er lot specifik og skal anvendes til at verificere at resultater opnået i laboratoriet er tilsvarende dem Quidel Corporation har opnået. De opgivne Optisk Densitet (OD) værdier er kun tiltænkt som guidelines. De opnåede resultater i laboratoriet kan adskille sig herfra. Kvalitetskontrol intervaller er opgivet. Kontrolværdierne er tiltænkt til verificering af prøve resultater og validering af kurven. Hvert laboratorium bør etablere egne parametre for acceptable grænseværdier. Hvis kontrol værdierne IKKE er indenfor laboratoriets acceptable grænser, bør test resultaterne betragtes som tvivlsomme og prøverne bør gentages. TOLKNING AF RESULTATER MicroVue Bb Plus Fragment EIA Side 7 af 13

9 Brug af standardkurve Standardkurven for Bb EIA er skabt ved at anvende den blanke A450 værdi subtraheret fra hver standard værdi (på y aksen) og den fastsatte koncentration for hver standard (på x aksen). Efter lineær regression må den generede standardkurve opfylde valideringskravene (se herunder). De fleste computere og lommeregnere er i stand til at udføre disse kalkulationer. Alternativt kan dataene afbilledes manuelt og værdierne (µg/ml) af testprøverne aflæses direkte fra den bedst-egnet linje af standardkurven. Et eksempel på en typisk standardkurve er vist i figur 1. Figur 1. Repræsentativ Standardkurve Beregning af aktuel Bb koncentration i test prøver Den aktuelle Bb koncentration der er til stede i hver ufortyndet prøve bestemmes ved at multiplicere koncentrationen af Bb/ml aflæst på kit standardkurven med den reciprokke værdi af den anvendte fortyndingsfaktor. Hvis A 450 værdien for en given prøve er større end den højeste Bb kit standard (E), skal resultatet afgives som større end Bb koncentrationen af den højeste kit standard (E) ganget med fortyndings faktoren. Hvis en mere præcis Bb koncentration kræves skal prøven re-analyseres med en højere fortyndings faktor. I alle gentagne assay skal Bb kit standarder og kontroller også inkluderes. VALIDERING Fastlæg hældningen, skæringen og korrelations koefficienten af den afledte bedst-egnet linje. For at assayet kan anses som godkendt, skal værdierne være indenfor den specificerede grænse: korrelations koefficient (r): > 0,96 hældning (m): mellem 1,094 og 2,558 y-skæring (b): mellem ( )0,145 og 0,113 Se glas etiketterne for gennemsnits værdi af Bb koncentration for den høje og lave kontrol. BEGRÆNSNINGER MicroVue Bb Plus Enzym Immunoassay har været anvendt til prøver taget som serum eller plasma i EDTA. Heparin plasma er IKKE anvendeligt til dette assay. Andre antikoagulanser har ikke været testet. EFFEKTIVITET Begrænsninger MicroVue Bb Plus Fragment EIA Side 8 af 13

10 LOD: Detektionsgrænsen (LOD) for Bb Plus assay er 0,018 µg/ml, fastlagt ved øverste 3SD grænse i et nulstandard studie. LLOQ: Den laveste grænse for kvantitering (LLOQ) for Bb Plus assay er 0,033 µg/ml, den laveste koncentration på standardkurven der opfylder NCCLS kriterier for nøjagtighed og præcision. ULOQ: Den øverste grænse for kvantitering (ULOQ) for Bb Plus assay er 0,836 µg/ml, den højeste koncentration der opfylder NCCLS kriterier for nøjagtighed og præcision. Interferende Substancer Na+ Heparin ved 14 U/ml (koncentration overensstemmende med Heparin plasma prøveglas) interferere med Bb Plus assay og anbefales derfor ikke til brug som plasma antikoagulans i prøveglas. Følgende substanser blev testet i Bb Plus assay og fundet ikke interfererende med assayet: Substans Bilirubin Hæmoglobin Triglycerider Albumin Glucose Kolesterol Koncentration 40 mg/dl 500 mg/dl 3000 mg/dl 6000 mg/dl 1200 mg/dl 500 mg/dl Præcision Under kørsel og mellem kørsler præcision blev aflæst ved kørsel af 20 replikater af 2 plasma prøver og 2 serum prøver i 10 forskellige kørsler. Prove EDTA Plasma Serum Bb (µg/ml) 1 n=20 replikater 2 n=10 kørsler Under kørsel 1 C.V. (%) Mellem kørsler 2 C.V. (%) 1,550 2,4 7,7 0,517 2,5 6,7 2,129 3,1 6,2 2,375 4,0 9,1 Linearitet Linearitet blev foretaget ved seriel fortynding af prøver og observerede værdier sammenlignet med forventede værdier. Typiske resultater er vist herunder. MicroVue Bb Plus Fragment EIA Side 9 af 13

11 Prøve EDTA Plasma Serum 1 Serum 2 Fortyndings faktor Observeret Bb (µg/ml) Forventet Bb (µg/ml) Recover y (%) 1:10 0,160 * * 1:16 0,107 0, ,9% 1:20 0,079 0,080 98,7% 1:32 0,052 0, ,9% 1:20 0,161 * * 1:32 0,103 0, ,0% 1:40 0,069 0,081 85,4% 1:64 0,044 0,050 87,2% 1:20 0,597 * * 1:25 0,467 0,478 97,7% 1:30 0,420 0, ,4% 1:40 0,310 0, ,8% 1:50 0,230 0,239 96,2% 1:60 0,196 0,199 98,4% 1:80 0,133 0,149 89,0% PRØVE VÆRDIER EDTA plasma fra seksogtredive (36) og serum fra niogfyrre (49) normale donorer blev testet i MicroVue Bb Plus Enzym Immunoassay kit. Resultaterne er præsenteret herunder. n Gennemsnitlig (µg/ml) OMRÅDE (µg/ml) ± 2 SD ± 3 SD EDTA Plasma 36 0,96 0,49 til 1,42 0,26 til 1,65 Serum 49 3,53 0,80 til 6,26 0,0 til 7,62 OBS: Mean og Standard Deviation (SD) for Bb fragment koncentrationer fastlagt for plasma eller serum prøver kan variere mellem laboratorier. Det anbefales derfor at hvert laboratorium fastsætter mean Bb fragment koncentration og standard deviation værdier for prøver. ASSISTANCE For services udenfor U.S.A eller for teknisk assistence, kontakt venligst din lokale distributør. Yderligere information om Quidel, vores produkter og vore distributører kan findes på REFERENCER 1. Schreiber, R.D. and Müller-Eberhard, H.J New developments in the activation of the alternative pathway of complement. In: Immunoassays: Clinical Laboratory Techniques for the 1980 s. Alan R. Liss, Inc., New York. p Gotze, 0. and Müller-Eberhard, H.J The alternative pathway of complement activation. Adv. Immunol. 24:1. 3. Fearon, D.T. and Austen, K.F Current concepts in immunology: the alternative pathway of complement a system for host resistance to microbial infection. New Engl. J. Med. 303: Pangburn, M.K. and Müller-Eberhard, H.J The alternative pathway of complement. Springer Semin Immunopathol 7: Ratnoff, W.E., Fearon, D.T., and Austen, K.F The role of antibody in the activation of the alternative complement pathway. Springer Semin Immunopathol 6: Hugli, T.E Biochemistry and biology of anaphylatoxins. Complement 3:111 MicroVue Bb Plus Fragment EIA Side 10 af 13

12 7. Fearon, D.T. and Austen, K.F Activation of the alternative complement pathway due to resistance of zymosan-bound amplification convertase to endogenous regulatory mechanisms. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA). 74: Fearon, D.T Regulation of the amplification C3 convertase of human complement by an inhibitory protein isolated from human erythrocyte membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA). 76: Fishelson, Z. and Müller-Eberhard, H.J Residual hemolytic and proteolytic activity expressed by Bb after decay-dissociation of C3b,Bb. J. Immunol. 132: Gotze, O., Bianco, C. and Cohn, Z.A The induction of macrophage spreading by Factor B of the properdin system. J. Exe. Med. 149: Sundsmo, J.S. and Wood, L.M Activated factor B(Bb) of the alternative pathway of complement activation cleaves and activates plasminogen. J. Immunol. 127: Kolb,W.P., Morrow, P.R. and Tamerius, J.D Ba and Bb Fragments of Factor B activation: Fragment production, biological activities, neoepitope expression and quantitation in clinical samples. Complement and Inflammation 6: Centers for Disease Control. Recommendations for prevention of HIV transmission in health-care settings. MMWR 1987;36 (suppl no. 2S): Sefton, M.V., et al Using ELISA to evaluate complement activation by reference biomaterials J. Mat. Sci 5: ,. 15. Mold, C. Tamerius, J.D., et al Complement activation during painful crisis in sickle cell anemia Clinical Immunology and Immunopathology 70:3, Manzi, S. Rairie, J. et al Sensitivity and Specificity of plasma and urine complement split products as indicators of lupus disease activity Arthritis and Rheumatism 39(7) J.Jarvis, Taylor, H Complement activation and immune complexes in children with polyarticular juvenile rheumatoid arthritis: a longitudinal study J Rheumatology 21(6) Aggarwaal, et al Evidence for activation of the alternative complement pathway in patients with juvenile rheumatoid arthritis Rheumatology 39: J. Buyon, Tamerius J. et al Assessment of Disease activity and impending flare in patients with systemic lupus erythematosis Arthritis and Rheumatism 35(9) D. Shaw, Rustagi, P. et al Effects of Synthetic Oligonucleotides on human complement and coagulation Biochemical Pharmacol 53(8) Mollnes. T.E., et al Complement activation in patients with systemic lupus erythematosis without nephritis Rheumatology 38: Sturfelt, G, Truedsson, L Complement and its breakdown products in SLE Rheumatology 44: Alexander, J.J. et al Complement-dependent apoptosis and inflammatory gene changes in murine lupus cebritis J. Immunology 175: Thurman, J., Holers, V.M The central role of the alternative pathway in human disease J. Immunology 176: Pawluczkowycz, A.W et al Hematin promotes complement alternative pathway-mediated deposition of C3 activation fragments on human erythrocytes: potential implications for the pathogenesis of anemia in malaria J. Immunology 179: Atkinson, C. et al Low-dose targeted complement inhibition protects against renal disease and other manifestations of autoimmune disease in MRL/lpr mice J. Immunology 180: A027 MicroVue Bb Plus Fragment EIA Kit MicroVue Bb Plus Fragment EIA Side 11 af 13

13 MDSS GmbH Schiffgraben Hannover, Germany Quidel Corporation 2005 East State Street, Suite 100 Athens, OH USA quidel.com PIA027002DA00 (02/17) MicroVue Bb Plus Fragment EIA Side 12 af 13

14 ORDLISTE MicroVue Bb Plus Fragment EIA Side 13 af 13

15 En immunanalyse for kvantifisering av Bb-fragmentet i Faktor B, en indikator for aktivering av alternativ komplementbane i humant plasma og serum SAMMENDRAG MicroVue Bb Plus Fragment EIA Side 1 av 13

16 BRUKSOMRÅDE MicroVue Bb Plus Enzyme Immunoassay Kit måler mengden av komplementfragmentet Bb, som er et aktiveringsfragment til Faktor B i komplementets alternative bane i humant plasma eller serum. Måling av Bb i humant plasma eller serum gir belegg for at komplementet har en alternativ bane. Måling av aktivering av en alternativ bane bidrar til å diagnostisere en rekke nyresykdommer, som f.eks. kronisk glomerulonefritt, lupus nefritt, samt flere hudsykdommer, som f.eks. herpesdermatitt og pemfigus vulgaris. Andre sykdommer der man har observert aktivering av komplementets alternative bane, omfatter revmatoid artritt, sigdcelleanemi, og gramnegative bakterieinfeksjoner. SAMMENDRAG OG FORKLARING Den alternative komplementbanen gir naturlig beskyttelse mot mikrobielle agens, der spesifikke antistoffer ikke finnes. 1-5 Aktivering av denne komplementbanen kan utløses av mange forskjellige substanser, som bl.a., mikrobielle polysakkarider eller lipider, gramnegative bakterielle lipopolysakkarider, og overflatedeterminanter som finnes på noen virus, parasitter, virusinfiserte pattedyrceller, og kreftceller. Ved autoimmune sykdommer kan den alternative komplementbanen bidra direkte til å ødelegge vev. En svært viktig reaksjon som opptrer under aktivering av den alternative banen, er omdanningen av 93 Kd Faktor B zymogen til et aktivt proteolytisk enzym. Dette foregår i en totrinnsreaksjon. I det første reaksjonstrinnet danner Faktor B et magnesium-avhengig kompleks med C3(H20) eller C3b. 4 C3(H20),Bkomplekset dannes bare i flytende fase, mens C3b,B-komplekset kan dannes, enten i flytende fase, eller på en egnet overflate. 1-4 Faktor B, som finnes i C3(H20),B- eller C3b,B-komplekset, spaltes til Ba- (33 Kd) og Bb- (60 Kd) fragmenter i det andre reaksjonstrinnet av alternativ bane enzymet, Faktor D. 1-4 Det bimolekylære C3b,Bb-komplekset, som er resultatet av dette, er den alternative banens C3 konvertase enzym. Bbsubenheten er det katalytisk aktive stedet av komplekset, som er i stand til å spalte C3 i C3a- og C3bfragmenter. 1-4,6 De øvrige C3b-fragmentene som er fremstilt på denne måten, kan danne det C3b-,Bb-,C3btrimolekylære komplekset, som er den alternative banens C5 konvertase enzym. Dette C5-konvertase enzymet er i stand til å spalte C5 i C5a- og C5b-fragmenter. 1-4,6 C3- og C5-konvertase enzymene i den alternative banen kan stabiliseres av faktor P (også kalt Properdin), en komponent av den alternative banen, som vanligvis finnes i humant plasma eller serum, 1-4 eller av nefrittisk faktor C3, et autoantistoff, som forekommer hos noen pasienter som opplever aktivering av alternativ bane i omfattende grad. 5 C3- og C5-konvertase enzymene i den alternative banen kan dissosieres ved en spontan nedbrytningsprosess, og blir inaktivert, 7 eller ved binding av Faktor H eller komplementreseptor 1 (CR1 ). 4,8 Bb- fragmentet som er dissosiert fra begge konvertasene beholder noe biologisk aktivitet, for eksempel, bibehold av funksjonell hemolytisk aktivitet, 4,9 evnen til å indusere makrofag-spredning, 10 og aktivering av plasminogen. 11 Selv om man har trodd at aktivering av en alternativ bane hovedsakelig skjer ved fravær av et spesifikt antistoff, dukker det opp situasjoner, der aktivering av alternativ bane kan finne sted som resultat av en tradisjonell aktivering. For eksempel, immunkomplekser hos pasienter med autoimmune sykdommer, kan sette i gang en aktivering av komplementbane på tradisjonelt vis, noe som fører til produksjon av C3 b- fragmenter. Som beskrevet ovenfor, er disse C3 b-molekylene i stand til å binde Faktor B og sette i gang spalting i Ba- og Bb-fragmenter. Derfor kan aktivering av alternativ bane forekomme ved antistoff-medierte autoimmune sykdomstilstander, og kan i betydelig grad bidra til øket aktivering av komplement og derav følgende ødeleggelse av vev. Ved å vurdere spaltningsproduktene fra Faktor B i testmaterialet ved de sykdomstilstandene man undersøker, kan man anslå i hvilken grad alternative baner benyttes, på det tidspunktet man tar prøver. MicroVue Bb Plus EIA er en enkel, rask, ikke radioaktiv, høyst spesifikk, og kvantitativ prosedyre for å måle aktivering av Faktor B. Den er ideell for undersøkelser som går ut på å studere funksjon eller status av alternative komplementbaner i tallrike forskningsmiljøer, og for å undersøke utviklingen av Bb in vitro. MicroVue Bb Plus Fragment EIA Side 2 av 13

17 PROSEDYREPRINSIPP MicroVue Bb Plus Enzyme Immunoassay for kvantitering av Bb i humant serum, plasma, eller andre prøver, er en tretrinns prosedyre der man bruker (1) en mikrotiterplate som er dekket med monoklonalt museantistoff som binder seg spesifikt til humant Bb, (2) et HRP-konjugert murint anti-humant Bb, og (3) et kromogent substrat. I det første trinnet fordeles standarder, kontroller, og testmaterialet i mikrotiterbrønnene som på forhånd er dekket med et spesifikt monoklonalt anti-bb antistoff. Bb, men ikke Faktor B eller andre komplementaktiveringsprodukter, som finnes i standardene, kontrollene, eller prøvene, vil binde seg til det monoklonale anti-bb antistoffet som er i fast fase. Etter inkubasjon fjernes ubundet materiale ved vask. I det andre trinnet tilsettes pepperrotperoksidase (HRP)-konjugert, murint anti-bb-antistoff i hver testbrønn. Det enzymkonjugerte anti-bb binder seg til Bb som er festet i mikrotiterbrønnene. Overflødig og ubundet konjugat fjernes ved vask etter inkubasjon. I det tredje trinnet tilsettes et kromogent enzymsubstrat i hver mikrotiterbrønn. Det bundne HRPkonjugatet reagerer med substratet og det farges blått. Etter inkubasjon stopper man enzymreaksjonen kjemisk. Fargen skifter til gult, og fargeintensiteten måles med spektrofotometer ved 450 nm. Fargeintensiteten i reaksjonsblandingen er proporsjonal med konsentrasjonen av Bb som finnes i prøvene, standardene og kontrollene. REAGENSER OG MATERIALE SOM LEVERES 96 Analyser for Bb-fragmentet av Faktor B MicroVue Bb Plus Enzymimmunanalyse settet inneholder følgende: A B C D E Bb Plus Standarder Del A9948-A ml hver (lyofiliserte) Hver av dem inneholder en kjent konsentrasjon av Bb i humant serum, fortynnet i PBS, protein stabilisatorer, 0,035% ProClin 300 L Bb Plus Lav Kontroll Del A ml (lyofilisert) Inneholder en kjent konsentrasjon av Bb i humant serum, fortynnet i PBS, proteinstabilisatorer, 0,035% ProClin 300 H Bb Plus Høy Kontroll Del A ml (lyofilisert) Inneholder en kjent konsentrasjon av Bb i humant serum, fortynnet i PBS, proteinstabilisatorer, 0,035% ProClin 300 ❶ Mikrotiterplate Del A x 8 brønner 12 åtte-brønns strimler dekket med renset monoklonalt museantistoff, spesifikt for humant Bb i en foliepose som kan forsegles ❷ Stoppløsning Del A ml Inneholder 1N Hydrochloric Syre ❸ 20X Konsentrert Vaskeløsning Del A ml Hver enkelt inneholder fosfatbufret saltløsning (PBS), 1,0% Tween-20, og 0,035% ProClin 300 ❹ Komplementprøvefortynner Del A ml Inneholder PBS, 0.05% Tween-20, 2,5% proteinstabilisatorer, 0,035% ProClin 300 ❺ TMB Substrat Del ml Indeholder 3,3, 5,5 tetramethylbenzidine (TMB) og Hydrogenperoksid (H 2 O 2 ) ❻ Bb Plus Konjugat Del A ml Inneholder pepperrotperksidasekonjugert murint anti-humant Bb oppslemmet i HRP stabiliseringsbuffer med konserveringsmiddel MicroVue Bb Plus Fragment EIA Side 3 av 13

18 ❽ Hydratiserende reagens Del A ml Inneholder 0,035% ProClin 300 Tween-20 er et registrert varemerke fra ICI Americas Inc. ProClin er et registrert varemerke fra Rohm and Haas Company. NØDVENDIG MATERIALE SOM IKKE LEVERES Signalur (for 60 minutter) Kalkulator eller annen datametode til å validere analyseresultater Rene, ubrukte mikrotiterplater og/eller prøverør og stativ Beholder for fortynning av vaskebuffer Vaskeflaske eller annet utstyr for vask av mikrotiterplater Justerbar multikanal pipette (8 eller 12 kanaler) eller mikropipetter for flergangsbruk (valgfritt) Rene pipetter, 1 ml, 5 ml, og 10 ml Mikropipetter og pipette-spisser Plateavleser med kapasitet for avlesning av optisk densitet mellom 0,0 og 2,0 Ikke-ionisert eller destillert vann ADVARSLER OG FORHOLDSREGLER Til In vitro-diagnostisk bruk. Bruk av heparin plasma i denne analysen vil gi feilaktige resultater. Håndter prøvemateriale som potensielt smittefarlig. Følg generelle forholdsregler når du håndterer innholdet i dette settet og alle pasientprøvene. Bruk de reagensene som er levert, som en vesentlig del før utløpsdatoen som er angitt på pakningen. Oppbevar analysereagensen slik som anvist. Ikke bruk dekkede strimler hvis det er gått hull på posen. Ikke skrap eller rør bunnen av mikrotiterbrønnene når du tilsetter eller fjerner væske. Hvis man bruker andre inkubasjonstider og -temperaturer enn de som er angitt i prosedyreavsnittet, kan det gi feilaktige resultater. Ikke la mikrotiterbrønnene tørke når analysen har begynt. Ikke bruk en mikrotiterbrønn for mer enn en test. Det anbefales at man bruker multikanalpipetter eller pipetter for flergangsbruk for å sikre fordeling av reagenser i tide. For å oppnå eksakt måling av prøvene, må prøver og standarder tilsettes nøyaktige. Pipetter forsiktig med kalibrert utstyr. For å oppnå nøyaktige resultater, er riktig innsamling og oppbevaring av prøvemateriale svært viktig (se INNSAMLING OG FORBEREDELSE AV PRØVER, side 4). Unngå mikrobiell- eller krysskontaminering av prøvemateriale og reagenser. Feilaktige prøvesvar kan bli resultatet ved kontaminering. Hver blodgiverenhet som er brukt til fremstilling av standarder og kontroll-sera i dette produktet ble testet med FDA-godkjent metode for påvisning av antistoff mot humant immunsvikt-virus (HIV1 OG HIV) og mot hepatitt C-virus, samt for hepatitt B-overflateantigen, og funnet å være negative (var ikke gjentatt reaktive). Siden ingen testmetode helt kan garantere fullstendig fravær av smittefarlige stoffer, skal disse reagensene håndteres med grad 2 for biologisk sikkerhetshåndtering, slik som anbefalt for potensielt smittefarlig humant serum eller blodprøver i Centers for Disease Control/National Institutes of Health manual Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, ProClin 300 brukes som konserveringsmiddel. Utilsiktet kontakt med eller inntak av buffere eller reagenser som inneholder ProClin kan forårsake irritasjon i huden, øynene eller munnen. Bruk god laboratoriepraksis for å redusere faren for å bli utsatt. Hvis symptomer opptrer, bør lege tilkalles. Det konsentrerte substratet er følsomt for lys. Unngå derfor at det utsettes for sterkt og direkte lys over lengre tid. Oppbevar reagenser i mørke når de ikke brukes. MicroVue Bb Plus Fragment EIA Side 4 av 13

19 For å unngå at det dannes aerosol under vaskeprosedyren, skal man bruke utstyr til å suge væsken opp i en flaske som inneholder husholdningsblekemiddel. Det skal brukes en vaskeplate for å vaske platen. For de beste resultater, skal du ikke bruke en flerkanals pipette til å vaske mikrotiterplaten. Prøver som er inaktivert ved oppvarming, er hyperlipemiske eller forurensede, kan gi feilaktige resultater. Testing skal utføres i et område med god ventilasjon. Kast beholdere og ubrukt innhold i henhold til føderale, statlige og lokale myndighetskrav. Bruk egnede verneklær, hansker og beskyttelse for øyne og ansikt når du håndterer innholdet i dette settet. Vask hendene grundig etter håndtering. Hvis du ønsker mer informasjon om faresymboler, sikkerhet, håndtering og kassering av komponentene i dette settet, se sikkerhetsdatabladet på quidel.com. FORBEREDELSE AV REAGENSER La alle reagensene komme opp i 15 C til 25 C før bruk. Etter å ha tatt ut reagenser og utstyr som skal brukes, legges det ubrukte materiale tilbake for oppbevaring i riktig temperatur (se OPPBEVARING). Dekkede strimler Bestem antall strimler som kreves for analysen. Ta ut det nødvendige antall strimler, og fest dem i platerammen. Legg de strimlene som ikke brukes tilbake i oppbevaringsposen, som forsegles igjen, og oppbevares ved 2 C til 8 C. Vaskeløsning Forbered vaskeløsning for vask av mikrotiterbrønnene ved å fortynne 50 ml av den 20X konsentrerte vaskeløsningen med opp til en liter destillert eller ikke-ionisert vann. Bland vaskeløsningen grundig før bruk. Vaskeløsningen er holdbar i 30 dager hvis den oppbevares i en ren beholder ved 2 C til 8 C. Hvis reagensen blir grumset, skal den kastes. Fortynning av Bb Plus standard og kontroll Tilsett 1,0 ml av hydratiserings-reagensen i hvert hetteglass med standard (A-E), og i hetteglassene med lav og høy kontroll. La de fortynnede hetteglassene hydratiseres igjen i minst 15 minutter ved romtemperatur. Bland grundig og unngå at det dannes skum eller bobler. Fortynnede standarder og kontroller er holdbare i 30 dager hvis de oppbevares ved 2 C til 8 C. Fortynning av prøver ADVARSEL: Håndter alt prøvemateriale som potensielt smittefarlig. Prøver som er inaktivert ved oppvarming eller er forurenset, skal ikke brukes. Det anbefales at plasmaprøver fortynnes 1:10 i prøvefortynner for bruk i MicroVue Bb Plus Enzymimmunanalysen. Det anbefales at serumprøver fortynnes 1:20 i prøvefortynner. Når de er fortynnet, må prøvene tilsettes mikrotiterbrønnene innen 30 minutter. Fortynnede prøver skal ikke oppbevares eller brukes om igjen. Gjenværende prøver skal kastes. Prøver med høye nivåer av komplementaktivering, kan kreve mer fortynning enn den som er angitt. Tilsætning af fortyndet prøve til microtiterbrøndene En av to metoder kan brukes for å tilsette fortynnede prøver, standarder, kontroller og buffer, i brønnene of (se trinn 3 ANALYSE-PROSEDYRE). For små analyser, der bare noen få prøver skal testes, kan de fortynnede prøvene og andre reagenser, tilsettes direkte i de respektive brønnene med en mikropipette (100 µl/brønn). For små eller store analyser, og spesielt for store analyser, anbefaler vi at det brukes en MicroVue Bb Plus Fragment EIA Side 5 av 13

20 multikanalpipette for å tilsette prøver, slik som beskrevet nedenfor. (En multikanalpipette kan også brukes for å tilsette konjugat, substrat og stoppløsning på en enkel måte.) For å fordele standarder, kontroller og fortynnede prøver i mikrotiterbrønnene så raskt som mulig, kan man bruke en kopi-plate -prosedyre. Istedenfor å tilsette 100 µl av hver standard, kontroll eller fortynnede prøve i hver enkelt av brønnene som er dekket med antistoff, kan man tilsette µl av hver løsning i hver enkelt brønn på en tom plate (ikke levert) som stemmer overens med det endelige EIAmønsteret man ønsker. Etter at alle løsningene som skal testes, er fordelt i mikrotiterbrønnene på den tomme platen, overfører man raskt 100 µl fra hver null- brønn til de brønnene som er dekket med antistoff ved å bruke en multikanal mikropipette. For å hindre kryss-forurensning, må pipettespissene byttes hver gang sammensetningen av prøvene, som skal testes, er en annen. OPPBEVARING Et uåpnet sett skal oppbevares ved 2 C til 8 C. Etter at settet er åpnet, kan den 20X konsentrerte vaskeløsningen og hydratiserings-reagensen oppbevares ved 2 C til 25 C. Alle reagenser må komme opp i romtemperatur (15 C til 25 C) før bruk. Legg alle ubrukte mikroanalysestrimler i oppbevaringsposen, forsegl den igjen og oppbevar den ved 2 C til 8 C. TEGN PÅ USTABILITET ELLER FORRINGELSE AV REAGENSER Uklar vaskeløsning er tegn på forringelse av reagensen. Hvis dette skjer, må løsningen kastes. INNSAMLING OG FORBEREDELSE AV PRØVER Håndter og kast alle prøver i overensstemmelse med generelle forholdsregler. Riktig innsamling og oppbevaring av prøver er viktig, fordi Faktor Bb proteolyseres lett i prøver som er feilaktig innsamlet eller lagret. På grunn av komplementaktivering som forekommer under koagulasjon, vil Bb-konsentrasjonen i normale, humane serum-prøver være høyere enn de man oppnår med EDTA plasmaprøver. Bb-nivåene i EDTA plasma kan derfor nøyaktigere vise in vivo-konsentrasjonene. Serum- eller EDTA plasmaprøver bør tas aseptisk ved hjelp av standardteknikker. Prøvene bør testes umiddelbart eller oppbevares ved 4 C eller legges på is inntil de skal analyseres. Men den korte lagringstiden på is bør ikke være lenger enn fire timer. For lengre tids oppbevaring skal serum- eller plasmaprøver fryses ved 70 C eller kaldere innen to timer etter at de er tatt. Frosne prøver ( 70 C) tines raskt i et vannbad på 37 C til de er akkurat tint. Legg de tinte prøvene på is med en gang (men ikke lenger enn fire timer) for å hindre komplementaktivering før fortynning. Ikke la prøvene ligge ved 37 C. Ikke tin prøver ved romtemperatur eller 4 C, da dette kan føre til komplementaktivering. Frosne prøver skal testes så snart som mulig etter at de er tint. Gjentatt nedfrysing og opptining anbefales ikke. Hvis prøvene skal fryses igjen for senere analyse, foreslår Quidel å dele opp prøvene i flere deler, for å unngå gjentatt frysing og opptining. ANALYSEPROSEDYRE Les pakningsvedlegget før du begynner med analysen. Se ADVARSLER OG FORHOLDSREGLER og FORBEREDELSE AV REAGENSER. MicroVue Bb Plus Fragment EIA Side 6 av 13

21 1. Noter plasseringene på mikrotiterbrønnene som tilsvarer null-brønn(er), alle prøver som skal testes, standarder og kontroller, samt varepartinumrene som er angitt på pakningen. Merk av et hjørne på mikrotiterplaten til orientering. 2. Forbered mikrotiterstrimlene på følgende måte: a. Ved å bruke en vaskeflaske eller automatisk platevaskutstyr tilsettes ca. 300 µl vaskeløsning i hver brønn. OBS: For de beste resultater, skal du ikke bruke en flerkanals pipette til å vaske mikrotiterplaten. b. Inkuber brønnene i ett minutt ved 15 C til 25 C. c. Sug opp innholdet i hver brønn. d. Tilsett ca. 300 µl vaskeløsning i hver brønn. e. Sug opp innholdet i hver brønn. f. Gjenta trinn d-e en gang til, slik at det blir totalt tre vaskeomganger. g. Snu platen opp ned og slå den fast mot tørkepapir for å fjerne eventuell gjenværende væske. 3. Tilsett 100 µl prøvefortynner, fortynnede standarder, kontroller, eller fortynnede prøver i de respektive brønnene. 4. Inkuber ved 15 C til 25 C i 30 ± 1 minutter. 5. Vask mikrotiterbrønnene i alt 5 ganger med følgende fremgangsmåte: a. Sug opp innholdet i hver brønn. b. Tilsett ca. 300 µl vaskeløsning i hver brønn ved å bruke en vaskeflaske eller automatisk vaskeutstyr. OBS: For de beste resultater, skal du ikke bruke en flerkanals pipette til å vaske mikrotiterplaten. c. Inkuber brønnene i 1 minutt ved 15 C til 25 C. d. Sug opp innholdet i hver brønn. e. Tilsett ca. 300 µl vaskeløsning i hver brønn. f. Sug opp innholdet i hver brønn. g. Gjenta trinn e-f tre ganger til. h. Etter den femte vaskeomgangen snus platen opp ned, og slås fast mot tørkepapir for å fjerne eventuell gjenværende væske. 6. Ved å bruke en multikanalpipette eller en pipette for flergangsbruk, fordeles 50 µl av Bb-konjugatet i hver av de vaskede testbrønnene, også null-brønn(ene). 7. Inkuber mikrotiterstrimlene ved 15 C til 25 C i 30 ± 1 minutter. 8. Vask mikrotiterbrønnene etter 30-minutters inkubasjon (trinn 7), slik som beskrevet under ANALYSE- PROSEDYRE, trinn 5. OBS: For de beste resultater, skal du ikke bruke en flerkanals pipette til å vaske mikrotiterplaten. 9. Umiddelbart etter vaskeprosedyren fordeles 100 µl av TMB-substratløsningen i hver brønn, også nullbrønn(ene). MERK: TMB-substratet må beskyttes mot lys under oppbevaring og inkubasjon. TMBsubstratet skal ikke dispenseres til et reagensreservoar eller andre apparater hvor lyseksponering kan skje før umiddelbart før det dispenseres inn i mikrotiterbrønnene. 10. Inkuber mikrotiterstrimlene ved 15 C til 25 C i 15 ± 1 minutter i mørket. 11. Tilsett 100 µl stoppløsning i hver brønn for å stoppe den enzymatiske reaksjonen. Stoppløsningen skal tilsettes brønnene i samme rekkefølge og med samme fordelingshastighet som med substratløsningen. 12. Slå forsiktig på platen slik at fargeutviklingen fordeler seg helt og jevnt. 13. Bestem absorbansen ved avlesning ved 450 nm for hver testbrønn innen en time etter tilsetning av stoppløsningen (trinn 11), og utfør en null-korreksjon i overensstemmelse med det spektrofotometriske systemet som brukes. 14. Kast det som er igjen av fortynnede prøver, kontroller, substrat, og de brukte mikrotiterstrimlene (se ADVARSLER OG FORHOLDSREGLER). KVALITETSKONTROLL Analysesertifikatet i dette settet er spesifikt for dette varenummeret, og skal brukes for å verifisere at de resultatene som er oppnådd i ditt laboratorium tilsvarer de som er oppnådd ved Quidel Corporation. Verdiene for optisk densitet, som er levert, er kun ment som retningslinjer. Resultatene som er oppnådd i ditt laboratorium, kan avvike. MicroVue Bb Plus Fragment EIA Side 7 av 13

22 Grenseverdier for kvalitetskontrollen foreligger. Det er meningen at kontrollverdiene skal verifisere validiteten av kurven og prøveresultatene. Hvert laboratorium bør sette opp egne parameter for akseptable analysegrenser. Hvis kontrollverdiene IKKE er innenfor ditt eget laboratoriums godkjente grenser, vil analyseresultatene betraktes som tvilsomme, og prøvene bør gjentas. FORTOLKNING AV RESULTATER Bruk av standardkurve Standardkurven for Bb EIA har man fått ved å bruke A 450 -nullverdiene som er trukket fra for hver standard (på y-aksen) og den fastsatte konsentrasjonen for hver standard (på x-aksen). Ved lineær regresjon, må den standardkurven man har fått, oppfylle valideringskriteriene (se nedenfor). De fleste datamaskiner og kalkulatorer kan utføre disse beregningene. Alternativt kan dataene fremstilles grafisk manuelt, og verdiene (µg/ml) for testprøvene leses direkte fra den linjen i standardkurven som passer best. Et eksempel på en typisk standardkurve er vist i figur 1. Figur 1 Representativ standardkurve Beregning av virkelig Bb-konsentrasjon i prøvene som testes Den virkelige Bb-konsentrasjonen i hver enkelt ufortynnet prøve bestemmes ved å multiplisere Bb/mlkonsentrasjonen, fastsatt ved settets standardkurve, med den angjeldende fortynningsfaktoren for prøven. Hvis A 450-verdiene for en bestemt prøve som testes, er høyere enn den høyeste Bb i settets standard (E), skal resultatene rapporteres som høyere enn Bb-konsentrasjonen i det høyeste av settets standard (E) multiplisert med prøvens fortynningsfaktor. Hvis man krever en mer nøyaktig Bb-konsentrasjon, må prøven analyseres om igjen ved å bruke en høyere fortynningsfaktor. Bb-standarder og -kontroller må også testes når en analyse utføres om igjen. VALIDERING Bestem helningen, krysningspunktet og korrelasjonskoeffisienten for den avledede linjen som passer best. Verdien må ligge innefor de spesifiserte grensene for at analysen skal kunne godkjennes: korrelasjonskoeffisient (r): > 0,96 stigning (m): mellom 1,094 og 2,558 y-krysningspunkt (b): mellom ( )0,145 og 0,113 MicroVue Bb Plus Fragment EIA Side 8 av 13

23 Se etikettene på hetteglassene eller produktet C av A for de godkjente, gjennomsnittlige grenseverdiene for Bb- konsentrasjon av høye og lave kontroller. BEGRENSNINGER MicroVue Bb Plus Enzymimmunanalysen er blitt brukt til å teste prøver, som er tatt som serum eller som plasma i EDTA. Heparin plasma er IKKE egnet for denne analysen. Andre antikoagulantia er ikke blitt testet. TESTENS YTEEVNE Grenser LOD: Grensen for påvisning (LOD) med Bb Plus analysen er 0,018 µg/ml, fastsatt ved høyeste 3SD-grense i en null-standard studie. LLOQ: Den laveste grense for kvantifisering (LLOQ) med Bb Plus analysen er 0,033 µg/ml, den laveste konsentrasjonen på standardkurven som oppfyller NCCLS kriterier for nøyaktighet og presisjon. ULOQ: Den øverste grense for kvantifisering (ULOQ) med Bb Plus analysen er 0,836 µg/ml, den høyeste konsentrasjonen som oppfyller NCCLS kriterier for nøyaktighet og presisjon. Interfererende Substanser Na+ Heparin på 14 U/ml (konsentrasjonen tilsvarer prøverør for heparin plasma) påvirker Bb Plus analysen, og anbefales derfor ikke brukt som antikoagulant for plasmaprøver. Følgende substanser er testet i Bb Plus analysen, og funnet å ikke påvirke analysen: Substans Bilirubin Hemoglobin Triglyserider Albumin Glukose Kolesterol Konsentrasjon 40 mg/dl 500 mg/dl 3000 mg/dl 6000 mg/dl 1200 mg/dl 500 mg/dl Presisjon Presisjon i samme analyse og Mellom analyser ble fastsatt ved vurdering av 20 dobbelttester av 2 plasmaprøver og 2 serumprøver i 10 forskjellige analyseomganger. Prøve EDTA Plasma Serum Bb (µg/ml) 1 n = 20 dobbelttester 2 n = 10 omganger I samme analyse 1 C.V. (%) Mellom-analyser 2 C.V. (%) 1,550 2,4 7,7 0,517 2,5 6,7 2,129 3,1 6,2 2,375 4,0 9,1 Linearitet Linearitet ble utført ved å blande serier av fortynnede prøver, og sammenligne de observerte verdiene med forventede verdier. Typiske resultater vises nedenfor. MicroVue Bb Plus Fragment EIA Side 9 av 13

24 Prøve EDTA Plasma Serum 1 Serum 2 Fortynnings faktor Observert Bb (µg/ml) Forventet Bb (µg/ml) Gjenopprettelse (%) 1:10 0,160 * * 1:16 0,107 0, ,9% 1:20 0,079 0,080 98,7% 1:32 0,052 0, ,9% 1:20 0,161 * * 1:32 0,103 0, ,0% 1:40 0,069 0,081 85,4% 1:64 0,044 0,050 87,2% 1:20 0,597 * * 1:25 0,467 0,478 97,7% 1:30 0,420 0, ,4% 1:40 0,310 0, ,8% 1:50 0,230 0,239 96,2% 1:60 0,196 0,199 98,4% 1:80 0,133 0,149 89,0% PRØVEVERDIER EDTA-plasma fra trettiseks (36) og serum fra førtini (49) normale blodgivere ble testet i MicroVue Bb Plus Enzymimmunanalysen. Resultatene vises nedenfor. n Gjennomsnitt (µg/ml) Konsentrasjonsområde (µg/ml) ± 2 SD ± 3 SD EDTA Plasma 36 0,96 0,49 til 1,42 0,26 til 1,65 Serum 49 3,53 0,80 til 6,26 0,0 til 7,62 MERK: Gjennomsnittsverdien og standardavviket (SD) for Bb-fragmentkonsentrasjonene som er fastsatt for plasma- eller serumprøver kan være forskjellige, avhengig av laboratoriet. Derfor anbefales det at hvert laboratorium fastsetter gjennomsnittsverdien for Bb-fragmentkonsentrasjon og standard-avvik for prøvene. ASSISTANSE For service utenfor USA, vennligst ta kontakt med din lokale forhandler. Ytterligere informasjon om Quidel, vare produkter og vare fordelere kan bli funnet pa var website pa quidel.com. REFERANSER 1. Schreiber, R.D. and Müller-Eberhard, H.J New developments in the activation of the alternative pathway of complement. In: Immunoassays: Clinical Laboratory Techniques for the 1980 s. Alan R. Liss, Inc., New York. p Gotze, 0. and Müller-Eberhard, H.J The alternative pathway of complement activation. Adv. Immunol. 24:1. 3. Fearon, D.T. and Austen, K.F Current concepts in immunology: the alternative pathway of complement a system for host resistance to microbial infection. New Engl. J. Med. 303: Pangburn, M.K. and Müller-Eberhard, H.J The alternative pathway of complement. Springer Semin Immunopathol 7: Ratnoff, W.E., Fearon, D.T., and Austen, K.F The role of antibody in the activation of the alternative complement pathway. Springer Semin Immunopathol 6: Hugli, T.E Biochemistry and biology of anaphylatoxins. Complement 3:111 MicroVue Bb Plus Fragment EIA Side 10 av 13

25 7. Fearon, D.T. and Austen, K.F Activation of the alternative complement pathway due to resistance of zymosan-bound amplification convertase to endogenous regulatory mechanisms. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA). 74: Fearon, D.T Regulation of the amplification C3 convertase of human complement by an inhibitory protein isolated from human erythrocyte membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA). 76: Fishelson, Z. and Müller-Eberhard, H.J Residual hemolytic and proteolytic activity expressed by Bb after decay-dissociation of C3b,Bb. J. Immunol. 132: Gotze, O., Bianco, C. and Cohn, Z.A The induction of macrophage spreading by Factor B of the properdin system. J. Exe. Med. 149: Sundsmo, J.S. and Wood, L.M Activated factor B(Bb) of the alternative pathway of complement activation cleaves and activates plasminogen. J. Immunol. 127: Kolb,W.P., Morrow, P.R. and Tamerius, J.D Ba and Bb Fragments of Factor B activation: Fragment production, biological activities, neoepitope expression and quantitation in clinical samples. Complement and Inflammation 6: Centers for Disease Control. Recommendations for prevention of HIV transmission in health-care settings. MMWR 1987;36 (suppl no. 2S): Sefton, M.V., et al Using ELISA to evaluate complement activation by reference biomaterials J. Mat. Sci 5: ,. 15. Mold, C. Tamerius, J.D., et al Complement activation during painful crisis in sickle cell anemia Clinical Immunology and Immunopathology 70:3, Manzi, S. Rairie, J. et al Sensitivity and Specificity of plasma and urine complement split products as indicators of lupus disease activity Arthritis and Rheumatism 39(7) J.Jarvis, Taylor, H Complement activation and immune complexes in children with polyarticular juvenile rheumatoid arthritis: a longitudinal study J Rheumatology 21(6) Aggarwaal, et al Evidence for activation of the alternative complement pathway in patients with juvenile rheumatoid arthritis Rheumatology 39: J. Buyon, Tamerius J. et al Assessment of Disease activity and impending flare in patients with systemic lupus erythematosis Arthritis and Rheumatism 35(9) D. Shaw, Rustagi, P. et al Effects of Synthetic Oligonucleotides on human complement and coagulation Biochemical Pharmacol 53(8) Mollnes. T.E., et al Complement activation in patients with systemic lupus erythematosis without nephritis Rheumatology 38: Sturfelt, G, Truedsson, L Complement and its breakdown products in SLE Rheumatology 44: Alexander, J.J. et al Complement-dependent apoptosis and inflammatory gene changes in murine lupus cebritis J. Immunology 175: Thurman, J., Holers, V.M The central role of the alternative pathway in human disease J. Immunology 176: Pawluczkowycz, A.W et al Hematin promotes complement alternative pathway-mediated deposition of C3 activation fragments on human erythrocytes: potential implications for the pathogenesis of anemia in malaria J. Immunology 179: Atkinson, C. et al Low-dose targeted complement inhibition protects against renal disease and other manifestations of autoimmune disease in MRL/lpr mice J. Immunology 180: MicroVue Bb Plus Fragment EIA Side 11 av 13

26 A027 MicroVue Bb Plus Fragment EIA Kit MDSS GmbH Schiffgraben Hannover, Germany Quidel Corporation 2005 East State Street, Suite 100 Athens, OH USA quidel.com PIA027002NO00 (02/17) MicroVue Bb Plus Fragment EIA Side 12 av 13

27 ORDLISTE MicroVue Bb Plus Fragment EIA Side 13 av 13

28 En enzymimmunanalys för kvantifiering av Bb fragmentet från faktor B, en indikator av aktiveringen av den alternativa komplementbanan, i människaplasma och serum SAMMANDRAG MicroVue Bb Plus Fragment EIA Sida 1 av 13

29 AVSEDD ANVÄNDNING MicroVue Bb Plus enzymimmunanalys kit mäter mängden av komplementfragmentet Bb, ett aktiveringsfragment till Faktor B i den alternativa komplementvägen, i humanplasma eller -serum. Mätning av Bb i humanplasma eller -serum tillhandahåller bevis för inblandning av den alternativa komplementvägen Mätning av aktivering av den alternativa vägen är en hjälp vid diagnos av ett flertal njursjukdomar, t ex kronisk glomerulonefrit och lupusnefrit, såväl som flera hudsjukdomar, t ex dermititis herpetiformis och pemphigus vulgaris (blåsdermatos) Andra sjukdomar hos vilka man observerat aktivering av den alternativa komplementvägen inkluderar reumatisk artrit, sickle cell-anemi och gramnegativa bakteriella infektioner. SAMMANDRAG OCH FÖRKLARING Den alternativa komplementvägen ger medfött skydd mot mikrobiella agenser vid avsaknad av specifik antikropp. 1-5 Aktiveringen av denna komplementväg kan utlösas av en mängd olika substanser inklusive mikrobiella polysackarider eller lipider, gramnegativa bakteriella lipopolysackarider och ytmarkörer, som finns på några virus, parasiter, virusinfekterade däggdjursceller och cancerceller. Vid autoimmuna sjukdomar kan den alternativa komplementvägen direkt bidra till vävnadsskada. En centralt viktig reaktion som uppstår under aktivering av den alternativa vägen är konverteringen av Faktor B- zymogen med en molekylärvikt på 93 kd till ett aktivt proteolytiskt enzym Detta genomförs i en tvåstegsreaktion. Under det första reaktionssteget bildar Faktor B ett magnesium-beroende komplex med C3(H20) eller C3b. 4 C3(H20),B-komplexet bildas endast i vätskefas medan C3b,B-komplexet kan bildas antingen i vätskefas eller på en målyta. 1-4 Faktor B, som finns i C3(H20),B eller C3b,B-komplexet, klyvs i det andra reaktionssteget av enzymet i den alternativa vägen, Factor D, i fragmenten Ba (33 Kd) och Bb (60 Kd). 1-4 Det resulterande C3b,Bb-bimolekylära komplexet är den alternativa vägens C3- konverteringsenzym. Bb-subenheten är komplexets katalytiskt aktiva site som är kapabel att klyva C3 i fragmenten C3a och C3b. 1-4,6 Ytterligare C3b-fragment som framställts på detta sätt kan bilda det trimolekylära komplexet C3b,Bb,C3b som är den alternativa vägens C5- konverteringsenzym. Detta C5-konvertas är kapabelt att klyva C5 i fragmenten C5a och C5b. 1-4,6 Den alternativa vägens C3- och C5-konvertaser kan stabiliseras av Faktor P (också kallad properdin), en komponent i den alternativa vägen som normalt finns i humanplasma eller -serum, 1-4 eller av nefritfaktor C3, en autoantikropp som produceras hos några patienter som upplever en omfattande aktivering av den alternativa vägen. 5 Den alternativa vägens konvertaser C3 och C5 kan dissocieras och därmed inaktiveras genom spontan sönderfallsdissociering 7 eller genom bindning av Faktor H eller komplementreceptor (Complement Receptor) 1 (CR1). 4,8 Bb-fragmentet som dissocierats från någondera konvertaser bibehåller några biologiska aktiviteter, t ex retention av funktionell hemolytisk aktivitet, 4,9 förmågan att framkalla makrofagspridning, 10 och plasminogen aktivering. 11 Fastän aktivering av den alternativa vägen tros uppträda primärt vid frånvaro av specifik antikropp, uppstår många situationer, i vilka aktivering av den alternativa vägen kan uppstå som resultat av aktivering av den klassiska vägen Till exempel kan immunkomplex som finns hos patienter med autoimmuna sjukdomar utlösa aktivering av den klassiska komplementvägen med en resulterande produktion av C3b-fragment. Såsom beskrivits ovan, är dessa C3b-molekyler kapabla att binda Faktor B och initiera klyvning av denna i fragmenten Ba and Bb Sålunda kan aktivering av den alternativa vägen uppstå i tillstånd av antikroppsmedierad autoimmun sjukdom och kan väsentligt bidra till ökad komplementaktivering och åtföljande vävnadsförstörelse. Genom att fastställa Faktor B-klyvningsprodukter i prover kan man uppskatta omfattningen av användandet av den alternativa vägen som uppstår vid tiden för provtagning i det sjukdomstillstånd som är under utredning MicroVue Bb Plus EIA tillhandahåller en enkel, snabb, icke-radioaktiv, högst noggrann och kvantitativ procedur för mätning av Faktor B-aktivering. Den är idealisk för undersökningar som involverar MicroVue Bb Plus Fragment EIA Sida 2 av 13

30 den alternativa komplementvägens roll eller status i ett stort antal forsknings- och kliniska miljöer och för att följa bildandet av Bb in vitro. PROCEDURENS PRINCIP MicroVue Bb Plus EIA (enzymimmunanalys) för kvantifiering av Bb i humanserum, -plasma eller andra prover är en trestegsprocedur, där man använder (1) en mikroanalysplatta som är ytbehandlad med en monoklonal antikropp från mus som specifikt binder till human-bb, (2) ett HRP-konjugerat murint antihumant Bb och (3) ett kromogent substrat. I det första steget tillsätts standarder, kontroller och testprover till mikroanalysbrunnar som i förväg är ytbehandlade med en specifik anti-bb-monoklonal antikropp. Bb, men inte Faktor B eller andra komplementaktiveringsprodukter, som finns i standarder, kontroller eller prover, kommer att binda till den immobiliserade anti-bb-monoklonala antikroppen. Efter inkubering avlägsnar en tvättprocedur obundet material. I det andra steget tillsätts pepparrotsperoxidas- (horseradish peroxidase) (HRP) konjugerad murin anti-bbantikropp till varje testbrunn Det enzym-konjugerade anti-bb:t binds till Bb som har bundits in till mikroanalysbrunnarna. Efter inkubering avlägsnar en tvättprocedur obundet överskott av konjugat. I det tredje steget tillsätts ett kromogent enzymsubstrat till varje mikroanalysbrunn. Det bundna HRPkonjugerade materialet reagerar med substratet och bildar en blå färg. Efter inkubering stoppas enzymreaktionen kemiskt, färgen ändrar sig till gul och färgintensiteten mäts spektrofotometriskt vid 450 nm Reaktionsblandningens färgintensitet är proportionell till den Bb-koncentration som finns i testproverna, standarderna och kontrollerna. INGÅENDE REAGENSER OCH MATERIAL 96 analyser för Faktor B:s Bb-fragment MicroVue Bb Plus Enzymimmunanalys innehåller följande: A B C D E Bb Plus Standarder Del A9948-A9952 var och en 1 ml (lyofiliserad) Var och en innehåller en känd koncentration av Bb i humanserum utspätt i PBS, proteinstabilisatorer, 0,035 % ProClin 300 L Bb Plus Låg Kontroll Del A ml (lyofiliserad) Innehåller en känd koncentration av Bb i humanserum utspätt i PBS, proteinstabilisatorer, 0,035% ProClin 300 H Bb Plus Hög Kontroll Del A ml (lyofiliserad) Innehåller en känd koncentration av Bb i humanserum utspätt i PBS, proteinstabilisatorer, 0,035% ProClin 300 ❶ Mikroanalysplatta Del A x 8 brunnar 12 åttabrunnsremsor ytbehandlade med en renad monoklonal antikropp från mus specifik för human- Bb i en återförslutningsbar foliepåse ❷ Stopplösning Del A ml Innehåller 1N saltsyra ❸ 20X Tvättlösning Koncentrat Del A ml Var och en innehåller fosfatbuffrad saltlösning (PBS), 1,0 % Tween-20, och 0,035 % ProClin 300 ❹ Komplementprovspädningsvätska Del A ml Innehåller PBS, 0,05% Tween-20, 2,5% proteinstabilisatorer, 0,035% ProClin 300 MicroVue Bb Plus Fragment EIA Sida 3 av 13

31 ❺ TMB Substrat Del ml Innehåller 3,3, 5,5 tetramethylbenzidine (TMB) och Väteperoxide (H 2 O 2 ) ❻ Bb Plus-konjugat Del A ml Innehåller pepparrotsperoxidas-konjugerat murint anti-human-bb upplöst i HRP-stabiliseringsbuffert med skyddsmedel ❽ Hydratiserande reagens Del A ml Innehåller 0,035% ProClin 300 Tween-20 är ett varumärke som tillhör ICI Americas Inc. ProClin är ett varumärke som tillhör Rohm and Haas Company. ERFORDERLIGA MEN EJ INGÅENDE MATERIAL Timer (60 minuters) Miniräknare eller annan databaserad metod för utvärdering av analysen Rena, oanvända mikroanalysplattor och/eller provrör och ställ Behållare för utspädd tvättbuffert Tvättflaska eller annat tvättsystem för immunanalys Justerbar multikanalspipett (8 eller 12 kanaler) eller repetermikropipetter (valfritt) Rena pipetter, 1 ml, 5 ml och 10 ml Mikropipetter och pipettspetsar Plattavläsare som kan läsa av en optisk densitet på mellan 0,0 och 2,0 Avjonat eller destillerat vatten VARNINGAR OCH FÖRSIKTIGHETSÅTGÄRDER För in vitro-diagnostisk användning. Användning av heparinplasma i denna analys kan ge felaktiga resultat. Behandla proverna som potentiellt riskavfallsmaterial Följ allmänna försiktighetsåtgärder vid hantering av innehållet i detta kit och eventuella patientprover. Använd de tillhandahållna reagenserna som en sammanhängande enhet före det utgångsdatum som finns angivet på förpackningsetiketten. Lagra analysreagenserna enligt föreskrift. Använd inte de ytbehandlade remsorna om det har gått hål på påsen. Vid tillförande eller utsugning av vätskor från mikroanalysbrunnarna, skrapa inte i eller vidrör bottnen på brunnarna. Användning av andra inkuberingstider och -temperaturer än de som föreskrivits i Procedur-avsnittet kan ge felaktiga resultat. Låt inte mikroanalysbrunnarna torka ut när analysen väl har börjat. Använd inte samma mikroanalysbrunn för mer än ett test. Användning av multikanalspipetter eller repeterpipetter rekommenderas för försäkran om tillsättning av reagens på utsatt tid. För exakt mätning av prover, tillsätt prover och standarder i exakt mängd Pipettera noggrant och använd endast kalibrerad utrustning. Korrekt insamling och lagring av prover är väsentlig för noggranna resultat (se INSAMLING OCH FÖRBEREDANDE AV PROVER, sid 4). Undvik mikrobiell eller korskontaminering av prover, reagenser eller material Oriktiga resultat kan erhållas vid kontaminering. Varje donerat prov som använts vid framställningen av standarder och kontrollserum har testats med en FDA-godkänd metod beträffande befintlighet av antikropp riktad mot humant immunodeficiensvirus, (HIV 1 och 2) och hepatit C-virus, såväl som beträffande hepatit B-ytantigen, och proverna har befunnits vara negativa (där de inte har varit upprepat reaktiva) Eftersom emellertid ingen testmetod kan erbjuda en fullständig försäkran om att infektiösa agenser inte finns, bör dessa reagenser hanteras på biosäkerhetsnivå 2, såsom rekommenderas för eventuellt potentiellt infektiöst MicroVue Bb Plus Fragment EIA Sida 4 av 13

32 humanserum eller -blodprov i manualen Biosäkerhet på mikrobiologiska och biomedicinska laboratorier ( Biosafety in Micro-biological and Biomedical Laboratories ) 2007 på centra för sjukdomskontroll/statliga hälsovårdsinstitut. ProClin 300 används som ett skyddsmedel. Tillfällig kontakt med eller förtäring av buffertar eller reagenser som innehåller ProClin kan orsaka irritation på huden, i ögonen eller munnen. Använd god laboratoriepraxis (GLP) för att reducera exponering Sök medicinsk vård vid eventuella symptom. Substratkoncentratet är ljuskänsligt. Undvik utdragen exponering för starkt eller direkt ljus Lagra reagenserna i mörker när de inte används. För undvikande av aerosolbildning vid tvättning kan man använda en apparat för att suga ut tvättvätskan i en flaska som innehåller hushållsblekningsmedel. En sprutflaska bör användas för att tvätta plattan. För bästa resultat, använd inte en multkanalpipett för att tvätta av mikroanalysplattan. Värmeinaktiverade, hyperlipemiska eller kontaminerade prover kan ge felaktiga resultat. Testning ska utföras i utrymmen med tillräcklig ventilation. Kassera behållare och oanvänt innehåll i enligt gällande nationella och lokala reglerings föreskrifter. Använd lämpliga skyddskläder, -handskar och -glasögon/ansiktsskydd vid hantering av kitets innehåll. Tvätta händerna grundligt efter hantering. För ytterligare information om farosymboler, säkerhet, hantering och bortskaffande av delarna som ingår i denna sats, hänvisas till säkerhetsdatabladet (SDS) på quidel.com. FÖRBEREDANDE AV REAGENS Värm alla reagenser och material till 15 C till 25 C före användning. Lägg efter borttagning av de reagenser och material som behövs tillbaka de oanvända artiklarna i sin rätta lagringstemperatur (se LAGRING). Ytbehandlade Remsor Bestäm antalet remsor som behövs för analysen. Ta bort det önskade antalet remsor. Fäst de remsor som ska användas i plattans ram. Lägg tillbaka de remsor som inte behövs i lagringspåsen, förslut påsen och lagra den vid 2 C till 8 C. Tvättlösning Förbered tvättlösningen för tvättning av mikroanalysbrunnarna genom att späda ut 50 ml av 20Xtvättlösningskoncentratet med destillerat eller avjonat vatten till en slutlig volym på en liter Blanda ordentligt före användning. Tvättlösningen håller sig i 30 dagar, om den lagras i ett rent kärl vid 2 C till 8 C. Om grumlighet uppstår, kassera reagensen. Bb Plus Standard- och Kontrollspädning Tillsätt 1,0 ml hydratiserande reagens till varje standardvial (A-E) och till den låga kontrollen och den höga kontrollen. Låt de rekonstituerade vialerna rehydrera i minst 15 minuter i rumstemperatur. Blanda noggrant. Undvik skum- eller bubbelbildning under blandandet. Rekonstituerade standarder och kontroller håller sig i 30 dagar vid lagring vid 2 C till 8 C. Provutspädning VARNING: Behandla alla prover som om de vore potentiellt infektiösa. Använd inte värmeinaktiverade eller kontaminerade prover. Det rekommenderas att plasmaprover späds ut 1:10 i provutspädning för användning i MicroVue Bb Plus enzymimmunanalys. Det rekommenderas att serumprover späds ut 1:20 i provutspädning. När de väl spätts ut måste proverna tillsättas till mikroanalysbrunnarna inom 30 minuter. Lagra eller återanvänd inte utspädda prover. Eventuella återstående prover ska kasseras. MicroVue Bb Plus Fragment EIA Sida 5 av 13

33 Prover med höga nivåer av komplementaktivering kan fordra högre provspädning än de tidigare nämnda. Tillsättning av utspädda prover i mikrotiterbrunnarna Endera av två metoder kan användas för att tillsätta utspädda prover, standarder, kontroller och buffertar till brunnarna (se Steg 3 i ANALYSPROCEDUR) För små analyskörningar, där endast ett fåtal prover testas, kan de utspädda proverna och andra reagenser tillsättas direkt till sina anvisade brunnar med en mikropipett (100 µl/brunn). För små eller stora körningar, men särskilt för större körningar, rekommenderar vi användning av en multikanalspipett för tillsättande av prover enligt följande (En multikanalspipett kan användas för att på ett bekvämt sätt tillsätta konjugatet och substratet, såväl som stopplösningen). För att ladda mikroanalysbrunnarna med standarder, kontroller och utspädda prover så snabbt som möjligt kan man använda sig av en replica plating -procedur. Istället för att tillsätta 100 µl av vart och ett av standard, kontroll eller utspätt prov till de antikroppsytbehandlade brunnarna var för sig, kan µl av varje lösning tillsättas till var och en av brunnarna på en tom platta (ingår ej) som motsvarar det slutliga, önskade EIA-mönstret. Sedan alla lösningar som ska testas har tillsatts till mikroanalysbrunnarna på den tomma plattan, ska 100 µl snabbt överföras från varje brunn för bakgrundsbestämning till de antikroppsytbehandlade brunnarna med användning av en multikanalsmikropipett. För att undvika möjligheten till korskontaminering måste pipettspetsar bytas ut varje gång man byter till annan provsammansättning som ska överföras. LAGRING Lagra oöppnat kit vid 2 C till 8 C Sedan kitet öppnats, kan 20X-tvättlösningskoncentratet och den hydratiserande reagensen lagras vid 2 C till 25 C. Alla reagenser måste tas fram i rumstemperatur (15 C till 25 C) före användning. Lägg alla oanvända mikroanalysremsor i lagringspåsen, återförslut påsen och lagra vid 2 C till 8 C. INDIKATIONER PÅ INSTABILITET ELLER FÖRSÄMRING HOS REAGENSER Grumlighet i tvättlösningen indikerar försämring av denna reagens. Om detta inträffar, ska lösningen kasseras. INSAMLING OCH FÖRBEREDANDE AV PROVER Hantera och kasta alla prover med användande av allmänna försiktighetsåtgärder. Korrekt insamling och lagring av prover är viktig, eftersom Faktor Bb är känslig för proteolys i felaktigt insamlade eller lagrade prover. Beroende på komplementaktivering som uppkommer under koagulering blir Bb-koncentrationen i normala humanserumprover högre än de som erhålls med EDTA-plasmaprover. Bb-nivåerna i EDTA-plasma kan därför på ett mera riktigt sätt representera in vivo-koncentrationerna. Serumprover eller EDTA-plasmaprover ska samlas in aseptiskt med användande av standardtekniker. Proverna ska testas omedelbart eller lagras vid 4 C eller på is tills analys är gjord. Denna korttidslagring på is får emellertid inte överskrida fyra timmar. För långtidslagring ska serum eller plasma frysas vid 70 C eller lägre inom två timmar efter insamling. Tina frusna ( 70 C) prover snabbt i 37 C-vattenbad tills det precis tinat. Lägg tinade prover omedelbart på is (i högst fyra timmar) för att förhindra komplementaktivering före utspädning. Låt inte proverna ligga kvar i 37 C. Tina inte prover i rumstemperatur eller vid 4 C, eftersom detta kan leda till MicroVue Bb Plus Fragment EIA Sida 6 av 13

34 komplementaktivering. Frusna prover ska testas så snart som möjligt efter upptining. Upprepad infrysning och upptining rekommenderas ej. Om prover måste frysas om för ytterligare analys, föreslår Quidel att man fryser in multipla aliquoter av proverna för att förhindra upprepade infrysnings-/upptiningscykler. ANALYSPROCEDUR Läs hela produktbladet innan analysen påbörjas. Se VARNINGAR OCH FÖRSIKTIGHETSÅTGÄRDER och REAGENSFÖRBEREDELSE. 1. Registrera mikroanalysbrunnarnas positioner i förhållande till brunnen/-arna för bakgrundsbestämning, alla testprover, standarder och kontroller, såväl som de angivna serienummerna från etiketterna på vialerna. Sätt en etikett på ett hörn av mikroanalysplattan för orienteringens skull. 2. Förbered mikroanalysremsorna på följande sätt: a. Tillsätt med användning av en tvättflaska eller automatisk plattvättningsanordning ca 300 µl tvättlösning till varje brunn. OBS: För bästa resultat, använd inte en multikanalpipett för att tvätta av mikroanalysplattan. b. Inkubera brunnarna i en minut vid 15 C till 25 C. c. Sug ut innehållet från varje brunn. d. Tillsätt ca 300 µl tvättlösning till varje brunn. e. Sug ut innehållet från varje brunn. f. Upprepa steg d-e en gång till, totalt tre tvättningar. g. Vänd upp och ner på plattan och knacka den hårt mot ett absorberande papper för att avlägsna eventuell kvarvarande vätska. 3. Tillsätt 100 µl av provutspädning, rekonstruerade standarder, kontroller eller utspädda prover till de därför avsedda brunnarna. 4. Inkubera vid 15 C till 25 C i 30 ± 1 minuter. 5. Tvätta mikroanalysbrunnarna totalt 5 gånger med användning av följande procedur: a. Sug ut innehållet från varje brunn. b. Tillsätt med användning av en tvättflaska eller automatisk plattvättningsanordning ca 300 µl tvättlösning till varje brunn. OBS: För bästa resultat, använd inte en multikanalpipett för att tvätta av mikroanalysplattan. c. Inkubera brunnarna i 1 minut vid 15 C till 25 C. d. Sug ut innehållet från varje brunn. e. Tillsätt ca 300 µl tvättlösning till varje brunn. f. Sug ut innehållet från varje brunn. g. Upprepa steg e-f ytterligare tre gånger. h. Vänd efter den femte tvättomgången upp och ner på plattan och knacka den hårt mot absorberande papper för att avlägsna eventuell kvarvarande vätska. 6. Fördela genom användning av en multikanals- eller repeterpipett 50 µl Bb-konjugat till varje tvättad testbrunn, inklusive brunnen/-arna för bakgrundsbestämning. 7. Inkubera mikroanalysremsorna vid 15 C till 25 C i 30 ± 1 minuter. 8. Tvätta mikroanalysbrunnarna efter 30-minutersinkuberingen (steg 7) som det beskrivs under ANALYSPROCEDUR, steg 5. OBS: För bästa resultat, använd inte en multikanalpipett för att tvätta av mikroanalysplattan. 9. Fördela omedelbart efter tvättproceduren 100 µl av TMB-substratlösningen till varje brunn, inklusive den/de för bakgrundsbestämning OBS: TMB-subtratet måste skyddas mot ljus under förvaring och inkubation. TMT-subtratet bör inte dispenseras i en reagensreservoar eller annan apparatur i vilken exponering för ljus kunde vara möjlig, förrän alldelses innan man dispenserar i mkroanalysbrunnarna. 10. Inkubera mikroanalysremsorna vid 15 C till 25 C i 15 ± 1 minuter I mörker. 11. Tillsätt 100 µl stopplösning till varje brunn för att stoppa den enzymatiska reaktionen. Stopplösningen ska tillsättas till brunnarna i samma ordning och i samma takt som substratlösningen har tillsatts. 12. Knacka försiktigt plattan mot bänkens översida för att sprida färgutvecklingen fullständigt och jämnt. MicroVue Bb Plus Fragment EIA Sida 7 av 13

35 13. Bestäm absorberingsavläsningen vid 450 nm för varje testbrunn inom en timma efter tillsättandet av stopplösningen (steg 11) genom att göra en bakgrundskorrigering enligt det använda spektrofotometriska systemet. 14. Kasta de återstående utspädda proverna, kontrollerna, substraten och de använda mikroanalysremsorna (se VARNINGAR OCH FÖRSIKTIGHETSÅTGÄRDER). KVALITETSKONTROLL Analyscertifikatet som finns med i detta kit är serienummerspecifikt och ska användas för att verifiera att resultaten som erhållits av ert laboratorium är liknande dem som erhållits på Quidel Corporation. De tillhandahållna värdena för optisk densitet är endast avsedda som riktlinje. De resultat som erhålls av ert laboratorium kan avvika. Intervallerna för kvalitetskontroll tillhandahålls. Kontrollvärdena är avsedda att verifiera kurvans och provresultatens validitet. Varje laboratorium bör etablera sina egna parametrar för acceptabla analysgränser. Om kontrollvärdena INTE är inom ert laboratoriums acceptansgränser, bör analysresultaten anses diskutabla och provtagningarna bör upprepas. TOLKNING AV RESULTAT Användning av standardkurvan Standardkurvan för Bb EIA har tagits fram genom att man använt de fråndragna A 450- bakgrundsvärdena för varje standard (på Y-axeln) och den anvisade koncentrationen för varje standard (på x-axeln). Efter linjär regression måste den framtagna standardkurvan möta valideringskraven (se nedan). De flesta datorer och miniräknare klarar av att utföra dessa beräkningar. Alternativt kan data visas grafiskt på manuell väg och värdena (µg/ml) på testproverna avläsas direkt från den bäst anpassade trendlinjen på standardkurvan. Ett exempel på en typisk standardkurva visas i Figur 1. Figur 1 Representativ Standardkurva Beräkning av faktisk Bb-koncentration i prover Den faktiska Bb-koncentration som finns i varje outspätt testprov fastställs genom multiplicering av den Bb/mL-koncentration, som bestämts ur kitets standardkurva, med det reciproka värdet av den använda provutspädningsfaktorn. Om A 450-värdena för ett givet testprov är högre än det för Bb-högsta-kit-standarden (E), ska resultaten rapporteras som högre än den högsta-kit-standardens (E) Bb-koncentration multiplicerad med provutspädningsfaktorn. Om ett mera noggrant Bb-koncentrationsvärde erfordras, kan testproverna MicroVue Bb Plus Fragment EIA Sida 8 av 13

36 omanalyseras med användning av en högre utspädningsfaktor. I alla omanalyser måste Bb-kit-standarder och -kontroller också köras. VALIDERING Bestäm lutningen, interceptet och korrelationkoefficienten på den erhållna bäst anpassade trendlinjen. Värdena måste vara inom de specificerade intervallerna för att kvalificera analysen: korrelationskoefficient (r): > 0,96 lutning (m): mellan 1,094 och 2,558 y-avskärning (b): mellan ( )0,145 och 0,113 Hänvisa till vial-etiketterna eller A:s produkt C för medelvärdena av acceptabla intervaller för Bbkoncentrationsvärdena hos de höga och låga kontrollerna. BEGRÄNSNINGAR MicroVue Bb-Plus enzymsimmunanalys (MicroVue Bb Plus Enzyme Immunoassay) har använts för att testa prover insamlade som serum eller plasma i EDTA. Heparinplasma är INTE lämplig för denna analys. Andra anti-koagulerande medel har inte testats. UTFÖRANDE AV TESTET Begränsningar LOD: Detektionsgränsen (The limit of detection) (LOD) för Bb Plus-analysen är 0,018 µg/ml, bestämd av den övre 3SD-gränsen i en nollstandardstudie. LLOQ: Den lägre gränsen för kvantifiering (The lower limit of quantitation) (LLOQ) för Bb Plus-analysen är 0,033 µg/ml, den lägsta koncentration på standardkurvan som mötte NCCLS:s kriterier för noggrannhet och precision. ULOQ: Den övre gränsen för kvantifiering (The upper limit of quantitation) (ULOQ) för Bb Plus-analysen är 0,836 µg/ml, den högsta koncentration som mötte NCCLS kriterier för noggrannhet och precision. Interfererande Substanser Na+ Heparin vid 14 U/mL (den koncentration som överensstämmer med heparinplasmainsamlingsrör) interfererar med Bb Plus-analysen och rekommenderas därför inte för användning som ett plasmaantikoagulerande medel för provinsamling. Följande substanser testades i Bb Plus-analysen och befanns inte interferera med analysen: Substans Koncentration Bilirubin 40 mg/dl Hemoglobin 500 mg/dl Triglycerider 3000 mg/dl Albumin 6000 mg/dl Glukos 1200 mg/dl Kolesterol 500 mg/dl Precision Intra- och interkörningsprecision bestämdes genom analys av 20 replikat av 2 plasmaprover och 2 serumprover i 10 olika körningar. Prove Bb (µg/ml) Intrakörning 1 C.V. (%) Interkörning 2 C.V. (%) EDTA Plasma 1,550 2,4 7,7 MicroVue Bb Plus Fragment EIA Sida 9 av 13

37 Serum Prove Bb (µg/ml) 1 n = 20 replikat 2 n = 10 körningar Intrakörning 1 C.V. (%) Interkörning 2 C.V. (%) 0,517 2,5 6,7 2,129 3,1 6,2 2,375 4,0 9,1 Linjäritet Linjäritet utfördes genom seriespädning av prover och genom att jämföra observerade värden med förväntade värden. Representativa resultat presenteras nedan. Prøv Utspädn,- Faktor Observerat Bb (µg/ml) Förväntat Bb (µg/ml) Återvinning (%) EDTA Plasma Serum 1 Serum 2 1:10 0,160 1:16 0,107 0, ,9% 1:20 0,079 0,080 98,7% 1:32 0,052 0, ,9% 1:20 0,161 1:32 0,103 0, ,0% 1:40 0,069 0,081 85,4% 1:64 0,044 0,050 87,2% 1:20 0,597 1:25 0,467 0,478 97,7% 1:30 0,420 0, ,4% 1:40 0,310 0, ,8% 1:50 0,230 0,239 96,2% 1:60 0,196 0,199 98,4% 1:80 0,133 0,149 89,0% PROVVÄRDEN EDTA-plasma från trettiosex (36) och serum från fyrtionio (49) normala donatorer testades i MicroVue Bb Plus-enzymimmunanalys- (MicroVue Bb Plus Enzyme Immunoassay) kitet. Resultaten presenteras nedan. n Medel (µg/ml) Intervall (µg/ml) ± 2 SD ± 3 SD EDTA Plasma 36 0,96 0,49-1,42 0,26-1,65 Serum 49 3,53 0,80-6,26 0,0-7,62 Anmärkning: Medelvärdes- och standardavvikelse- (Standard Deviation) (SD) beteendet hos Bbfragmentkoncentrationer som är bestämda för plasma- eller serumprover kan variera mellan laboratorier. Därför rekommenderas att varje laboratorium bestämmer medelvärdet för Bbfragmentkoncentration och standardavvikelsevärdena för prover. SUPPORT För tjänster utanför USA: kontakta en lokal distributör för Quidel-produkter. Ytterligare information om Quidel, våra produkter eller distributörer finns på vår hemsida quidel.com. MicroVue Bb Plus Fragment EIA Sida 10 av 13

38 REFERENSER 1. Schreiber, R.D. and Müller-Eberhard, H.J New developments in the activation of the alternative pathway of complement. In: Immunoassays: Clinical Laboratory Techniques for the 1980 s. Alan R. Liss, Inc., New York. p Gotze, 0. and Müller-Eberhard, H.J The alternative pathway of complement activation. Adv. Immunol. 24:1. 3. Fearon, D.T. and Austen, K.F Current concepts in immunology: the alternative pathway of complement a system for host resistance to microbial infection. New Engl. J. Med. 303: Pangburn, M.K. and Müller-Eberhard, H.J The alternative pathway of complement. Springer Semin Immunopathol 7: Ratnoff, W.E., Fearon, D.T., and Austen, K.F The role of antibody in the activation of the alternative complement pathway. Springer Semin Immunopathol 6: Hugli, T.E Biochemistry and biology of anaphylatoxins. Complement 3: Fearon, D.T. and Austen, K.F Activation of the alternative complement pathway due to resistance of zymosan-bound amplification convertase to endogenous regulatory mechanisms. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA). 74: Fearon, D.T Regulation of the amplification C3 convertase of human complement by an inhibitory protein isolated from human erythrocyte membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA). 76: Fishelson, Z. and Müller-Eberhard, H.J Residual hemolytic and proteolytic activity expressed by Bb after decay-dissociation of C3b,Bb. J. Immunol. 132: Gotze, O., Bianco, C. and Cohn, Z.A The induction of macrophage spreading by Factor B of the properdin system. J. Exe. Med. 149: Sundsmo, J.S. and Wood, L.M Activated factor B(Bb) of the alternative pathway of complement activation cleaves and activates plasminogen. J. Immunol. 127: Kolb,W.P., Morrow, P.R. and Tamerius, J.D Ba and Bb Fragments of Factor B activation: Fragment production, biological activities, neoepitope expression and quantitation in clinical samples. Complement and Inflammation 6: Centers for Disease Control. Recommendations for prevention of HIV transmission in health-care settings. MMWR 1987;36 (suppl no. 2S): Sefton, M.V., et al Using ELISA to evaluate complement activation by reference biomaterials J. Mat. Sci 5: ,. 15. Mold, C. Tamerius, J.D., et al Complement activation during painful crisis in sickle cell anemia Clinical Immunology and Immunopathology 70:3, Manzi, S. Rairie, J. et al Sensitivity and Specificity of plasma and urine complement split products as indicators of lupus disease activity Arthritis and Rheumatism 39(7) J.Jarvis, Taylor, H Complement activation and immune complexes in children with polyarticular juvenile rheumatoid arthritis: a longitudinal study J Rheumatology 21(6) Aggarwaal, et al Evidence for activation of the alternative complement pathway in patients with juvenile rheumatoid arthritis Rheumatology 39: J. Buyon, Tamerius J. et al Assessment of Disease activity and impending flare in patients with systemic lupus erythematosis Arthritis and Rheumatism 35(9) D. Shaw, Rustagi, P. et al Effects of Synthetic Oligonucleotides on human complement and coagulation Biochemical Pharmacol 53(8) Mollnes. T.E., et al Complement activation in patients with systemic lupus erythematosis without nephritis Rheumatology 38: Sturfelt, G, Truedsson, L Complement and its breakdown products in SLE Rheumatology 44: Alexander, J.J. et al Complement-dependent apoptosis and inflammatory gene changes in murine lupus cebritis J. Immunology 175: Thurman, J., Holers, V.M The central role of the alternative pathway in human disease J. Immunology 176: MicroVue Bb Plus Fragment EIA Sida 11 av 13

39 25. Pawluczkowycz, A.W et al Hematin promotes complement alternative pathway-mediated deposition of C3 activation fragments on human erythrocytes: potential implications for the pathogenesis of anemia in malaria J. Immunology 179: Atkinson, C. et al Low-dose targeted complement inhibition protects against renal disease and other manifestations of autoimmune disease in MRL/lpr mice J. Immunology 180: A027 MicroVue Bb Plus Fragment EIA Kit MDSS GmbH Schiffgraben Hannover, Germany Quidel Corporation 2005 East State Street, Suite 100 Athens, OH USA quidel.com PIA027002SV00 (02/17) MicroVue Bb Plus Fragment EIA Sida 12 av 13