BORRELIA BURGDORFERI cyste-former En årsak til resistens og reaktivering

Transkript

1 BORRELIA BURGDORFERI cyste-former En årsak til resistens og reaktivering Publisering eller bruk av dette materialet kan kun skje etter avtale med Øystein Brorson eller Sverre- Henning Brorson

2 BORRELIA BURGDORFERI cyste-former En årsak til resistens og reaktivering Øystein Brorson og Sverre-Henning Brorson

3 Cysteformer kan sees i gamle kulturer av Borrelia burgdorferi. Disse strukturer har vært antatt å være degenererte former av bakterien (Darkfield 800x)

4 Kunnskap om cyste og granulerte former av Borrelia er ikke ny kunnskap Dutton & Todd : Spiroketer utviklet seg fra granulære former i Borrelia duttoni infiserte flått hvis temperaturen var over 25ºC Hindle 1911: Granulære former av Borrelia duttoni injisert i mus var infeksiøse Hampp 1950: 31 måneder gamle granuler (Borrelia vincenti og orale spiroketer) konverterte til typiske motile spiroketer når de ble overført til friskt medium DeLamater 1951: Lignende funn gjorde Hampp for patogene og ikke-patogene stammer av Treponema pallidum Når andre forskere mislyktes i å finne bevis for hvile-stadier eller en kompleks livssyklus ble Cyster antatt å være døde degenererte spiroketer

5 Spørsmålet om en kompleks utviklingssyklus kom først opp igjen når Willy Burgdorfer in 1981 oppdaget Lyme disease spiroketen: Borrelia burgdorferi Av spesiell interesse er observasjon av cyster og blebs i spiroket infiserte flått Disse strukturer viste sterk reaksjon når de ble behandlet med FITC- merket antistoff Igjen ble spørsmålet om en kompleks Borrelia livssyklus tatt opp, som har fått forskere til kritisk å undersøke naturen og funksjonen til disse cystestrukturer en forskningsutfordring som først ble reist for 100 år siden av Dutton and Todd.

6 I 1995, etter mye eksperimentering klarte vi å konvertere cyste-former av Borrelia burgdorferi ( som var utviklet ved å dyrke bakterien i serumfritt BSK-H medium i 2 mnd. ved 33 C) tilbake til normale bevegelige spiroketer, når cystene ble inkubert i BSK-H medium med kaninserum 6

7 Cyste-former med kjernestrukturer etter 3 uker sulteforing av spiroketene. Noen av kjernestrukturene hadde livlige irregulære bevegelser En normal skiroket er også tilstede Etter 6 uker var kun cyster tilstede, ingen spiroketer kunne observeres Interferenskontrast mikroskopi original forstørrelse 2000x

8 De sulteforede spiroketene ble overført til friskt BSK-H medium med kaninserum. Den negative kontrollen ble filtrert gjennom et 0.45 filter Etter 6 uker kunne det observeres en fargeforandring i det ene rørert, i kontrast til den negative kontrollen. Når innholdet ble undersøkt i interferenskontrast mikroskopi, kunne normale bevegelige spiroketer sees. Interferenskontrast mikroskopi 2000x

9 Transvers fisjon av spiroketer inne i en cyste og fisjon av en cyste fylt med mørke strukturer TEM Ultrastrukturelt kunne cyster, kjerner og blebs sees å være omgitt av en dobbel membran. Fisjon of spiroketer kunne observeres inne i noen cyster, i tillegg til flageller og makromolekylært materiale. En cyste er også i deligsprosess.

10 Utvikling av en cyste som inneholder fire spiroketer En begynnende cyste, muligens som et resultat av en fisjonsprosess hvor den ytre membran ikke blir klippet av. Blebs som perlekjeder kan også sees. Cysten er her skåret i lengderetningen, og fremstår med en tykkelse på ca1µm, ligner på en stige.

11 Flageller inne i en cyste og mange kjernestrukturer

12 Borrelia burgdorferi konverterte raskt til cysteformer når de ble overført til spinalvæske Konverteringstiden var avhengig av protein-konsentrasjonen i spinalvæsken. Borrelia burgdorferi i logaritmisk vekst overført til spinalvæske inkubert i 24 timer. Normal protein. ICM 2000x

13 Borrelia burgdorferi inkubert i spinalvæske i 24 timer. Lav proteinkonsentrasjon. 0.34g/l Ingen kjernestrukturer Høy proteinkonsentrasjon. 0.51g/l Begynnende kjerner og kjerner med mørkt materiale. Sett i mørkefelt-mikroskopi

14 Cyster fra spv inkubert i BSK-H medium 1 dag Legg merke til sekresjon av blebs. (Biologisk aktiv cyste). Etter 9-17 dager inkubasjon (I sentrifugat), ble det første tegn til bevegelige spiroketer observert. Etter 4 uker inkubasjon I BSK-H medium kunne mange bevegelige spiroketer og cyster sees.

15 Cyster har en meget sterk ytre membran Cystemembran rupterte når unge cyster ble eksponert for for 0.1 M NaOH, og spirokete-lignende strukturer kan sees. I eldre cyster vil spiroketer transformeres til kjernestrukturer og eventuelt små komma formede strukturer. Kjernene vil ikke lysere. FITC konjugert til WGA som reagerer med peptidoglukan 1600x

16 Vi utviklet så en metode for rask produksjon av Borrelia burgdorferi cyster, som har evnen til å konvertere tilbake til mobile spiroketer Spirokerer eksponert for destilert vann i 3 timer. Legg merke til spiroketestrukturene inne i cysten og produksjon av blebs. To uker gamle cyster i dest vann med en blebs produserende kjerne. Fem uker gamle cyster i dest vann. Legg merke til de mørke kjerner og komma -lignende bakterier.

17 En 5 min. gammel cyste med en spiroket inne i. (ICM) Et aggregat (koloni) av cyster som er inkubert 1 uke i dest vann. (DF) Fem uker inkubasjon i dest vann hvor en cyste inneholder flere kjernestrukturer. (ICM)

18 Flammefikserte utsryk av cyster farget med akridin orange ph 6.4 for å observere utvikling av kjernestrukturer (Biologisk aktive organismer) Fem dager gamle cyster fra dest vann. Ingen kjernestrukturer har enda blitt utviklet. Den ytre membran er ikke synlig. AO 1600x Fem uker gamle cyster. Legg merke til utallige kjernestrukturer inne i cystene. Noen cyster er i en fissjonsprosess. AO 1000x

19 Transvers fisjon av en cyste En dag gamle cyster som er inkubert 4 uker i BSK-H medium. Normale spiroketer og en cyste som er i begynnelsen av en fisjonsprosess. Mange blebs er også tilstede. Fisjonsprosessen synes å være nærmest fullført.

20 En dag gamle cyster i dest vann inkubert i BSK-H medium 1 til 4 uker. To unge spiroketer og blebs vokser ut fra en cyste (1 uke) Spiroketer ser ut til å være i en prosess hvor hvor de forlater cysten (1 uke) En spiroket ser ut til å utvikle seg fra en granulær cyste (1 uke) Mange normale motile spiroketer blant cyste-strukturer (4 uker) (TEM)

21 Konvertering av cyster til spiral former DF Cyster inkubert 1 uke i BSK-H medium. Tynne hypermobile filament strukturer med blebs utvikler seg fra en cyste. Cyster 4 uker i BSK-H medium. Noen normale spiroketer er tilstede. Spiroketer utvikler seg fra et stort aggregat med cyster (biofilm), og blir beveglige.

22 Seks år gamle cyster fra dest vann. Under inkubering 4 uker i BSK-H medium konverterer de til ubeveglige spiroketer med blebs produksjon (levende organismer).

23 Konklusjon Konvertering av cyster til beveglige spiroketer avhenger av: Alder av cystene Inkubasjonstiden Sammensetningen av kulturmediet

24 Borrelia burgdorferi cyster Cyster har vært observert in vivo og in vitro når Borrelia burgdorferi har vært eksponert for antibiotika (i nærhet av MIC) I nærvær av komplement, antistoff, lysozyme, forandret ph, hypotont miljø, næringsfattig medium, alkohol og hydrogen peroxide I vev fra alle dyr (inkludert menneske) som er infisert med Borrelia burgdorferi. I hjernevev ved NB, inta og extracellulært i nevroner, gliaceller og astrocytter apoptose (latens og persistens-immune evasion) I den sentrale del av EM Cysteformer produsert i dest vann er infeksiøse for mus Cyster overlever 30 min ved 80ºC Reversibel cyste-mobile spiroketer er observert hos minst 12 spirokete species

25 Borrelia burgdorferi eksponert for antibiotika Borrelia burgdorferi konverterer til normale cyster med distinkte spiroketer inni når de blir eksponert for lav konsentrasjon penicillin (0.125 g/ml) Ved høy konsentrasjon penicillin blir spiroketene komplett ødelagt, bare flageller og blebs er synlig (1 g/ml) (Schaller M, Neubert U)

26 Borrelia burgdorferi eksponert for antibiotika Borrelia burgdorferi inkubert med meget lav konsentrasjon av telithromycin ( g/ml) i 14 dager i BSK-H medium. Overveiende tomme cyster med degradert innhold kan observeres, men enkelte cyster med normale mørke kjærner kan også sees. Ingen intakte spiroketer er synlig, bare blebs. Andre antibiotika som utvikler cyster: Ceftriaxon Penicilliner Ciprofloxacin Vancomycin Clarithromycin Azithromycin Doxy/tetracycline

27 Borrelia burgdorferi cyster in vivo. Spv Cyster fra en MS (NB) pasient observert i elektron mikroskop. Pasienten hadde vært behandlet iv med ceftriaxone i 4 mnd. Dyrkning BSK-H medium 5 mnd. Denne observasjon inspirerte oss til å gjøre en liten kontrollert studie for å undersøke om cysteformer finnes oftere i MS pasienter enn i kontroll pasienter

28 Borrelia burgdorferi cyster in vivo Cyster i spv of MS pasienter. Spv hadde vært dyrket i BSK-H medium i 5 mnd. Spiroket strukturer kunne observeres i 2 of 10 MS pasienter

29 Borrelia burgdorferi cyster in vivo Cyste strukturer i spv fra en EM pasient som er dyrket i BSK-H medium i 5 mnd. In vitro cyste-former av Borrelia burgdorferi i spv

30 En cyste fra en MS pasient som reagerer med polyklonalt anti-borrelia som er merket med immunoguld

31 Spv fra en MS pasient inkubert i BSK-H medium i 5 mnd. FITC konjugert med WGA som reagerer med peptidoglycan

32 Borrelia burgdorferi cyster in vivo Cyste strukturer i en biopsi fra den sentrale delen av EM. (Hulinska D)

33 Antigen forandring Positiv reaksjon med Osp A protein i Borrelia burgdorferi cyster. Proteinet er lokalisert inne i cysten. (Hulinska D) Reaksjon med cystens peptidoglykan (membran) og FITC konjugert med WGA (1600x) Cyster uttrykker minst 20 nye antigener, som mange er antigene. Noen gamle antigen er lokalisert inne I cysten. OspA og VlsE er oppgradert.

34 Resistensbestemmelse av cyster Flammefikserte utsryk. Akridin orange ph 6.4 RNA=rød/orange Utvikling av kjærnestrukturer betyr levende organismer.

35 Flammefikserte utstryk. Acridin orange ph 6.4 Mengde RNA (levende celler )kan observeres og ruptering av cystene(grønn skygge)

36 Vital akridin orange farging ph 7.4 Grønn farge betyr levende organismer og rød betyr døde

37 BacLight Grønne strukturer: levende organismer Røde strukturer: døde organismer

38 Transmisjon elektron mikroskopi Destruksjon av cyste, kjærne, blebs og spiroket strukturer

39 Transmisjon elektron mikroskopi Rupturing av cyster

40 Mørkefelt mikroskopi Hemming av cysteproduksjon når resistensbestemmelse er utført i dest vann

41 Dyrkning av eksponerte cyster

42 MBC 37ºC Inkubasjon 14 dager gamle cyster 1 dag cyster Metronidazole 4 g/ml Tinidazole Hydroxchloroquine Bismuth Tigecycline (34 C 1 uke) 0.1 Spiroketer Ved å tilsette disse antibiotika til dest vann før inkubering av spiroketer, ble konvertering av spiroketer til cyster hemmet. Ruptering av cyster, kjerner og blebs Degradering av cysteinnholdet og kjernestrukturer utviklet seg ikke Minsket/eliminering av RNA inne i cystene Ny behandling; Kombinasjonsterapi for å behandle både mobile spiroketer, cyster, granuler og blebs.

43 Konklusjon Det er sannsynlig at cyster er hvileformer av spiroketen. Kan forklare: resistens mot antibibiotika, antistoff, hydrogen peroxide, lysozyme Lang latensperiode og reaktivering Antigen variasjon Negative serologiske resultater Lav PCR følsomhet Negative dyrkningsresultater Cystemembran består bl.a. av peptidoglucan som fører til ekstra patogenitet; øket IL-1, histamin og kapillær permabilitet Sekresjon av blebs (Osp A,B and D) er viktige penicillin-bindende proteiner og kan spille en rolle i beskyttelse av genetiske markører (plasmider)