Genetisk variasjon hos jordskokk.

Transkript

1 Genetisk variasjon hos jordskokk. Bacheloroppgave i biologi Stine Kooyman 2006 Institutt for naturvitenskapelige fag Fakultet for realfag Høgskolen i Agder, Kristiansand

2 Stine Kooyman 2006 HiA Bacheloroppgave i biologi, referansenr.: Bio Innlevert som oppgave i emnet: Bio300 Bacheloroppgave i biologi, v-2006, under veiledning av Førsteamanuensis Audun Slettan Alle rettigheter reservert. Ingen deler av denne oppgaven kan kopieres uten tillatelse fra forfatteren. Bilde, Forside: Bilde, Innledning: 3D14829&h=635&w=800&sz=87&tbnid=9U3Mol7Ip2HDRM:&tbnh=112&tbnw=142&hl =no&start=3&prev=/images%3fq%3dhelianthus%2btuberosus%26svnum%3d10%26hl% 3Dno%26lr%3D II

3 Forord Denne bacheloroppgaven om genetisk variasjon hos jordskokk ble igangsatt av Høgskolen i Agder, fakultet for realfag, i samarbeid med Bioforsk avdeling Grimstad, i forbindelse med oppnåelse av bachelorgrad i Biologi. Det praktiske og teoretiske arbeidet i forbindelse med denne oppgaven ble utført i perioden januar mai Veileder gjennom hele prosessen har vært førsteamanuensis ved Høgskolen i Agder, Audun Slettan. Tusen takk for all hjelp, støtte og inspirasjon. Jeg vil også takke Åsmund Asdal ved Bioforsk i Grimstad for hjelp med innhøsting av plantemateriale, informasjon om plantene og utvelgelse av aktuelle planter. Til slutt vil jeg takke min samboer, Oddbjørn Haaland, for hjelp med laging av PCR- figurene, og diverse annen dataassistanse. Høgskolen i Agder. 22. mai 2006 Stine Kooyman III

4 Sammendrag Denne bacheloroppgaven handler om genetisk variasjon hos jordskokk. Med tanke på fremtidig bevaring av kulturplanten jordskokk, har jeg i denne oppgaven hatt som mål å etablere en metode for å studere genetisk variasjon hos denne planten. Det ble isolert DNA fra jordskokk ved hjelp av DNeasy Plant Mini- kit fra Qiagen. Det ble bestilt primere som tidligere hadde vert brukt på den nære slektningen solsikke, og det ble kjørt PCR med disse. PCR- produktene ble så kjørt i en 2% agarosegel for å se om de hadde virket. Primerene som virket ble bestilt på nytt, men fluoriserende 5 - ende. Det ble så kjørt en ny PCR med de merkede primerne, og PCRproduktet fra denne kjøringen ble satt inn i 3130 Genetic Analyzer for automatisk analyse. Etter analysen i 3130 Genetic Analyzer ble råmaterialet gjennomgått og resultatene ført ned i tabeller. Gjennom bruk av PCR, gelelektroforese og automatisk analyse av PCR- produkter i 3130 Genetic Analyzer har man fått etablert en metode for å se på den genetiske variasjonen. IV

5 Innhold Innledning 1 Jordskokk 1 Genetisk variajon 3 Metoder for å studere genetisk variasjon 3 VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) 4 RFLP (Restriction Fragment Length Polymorfism) 5 DNA sekvensering og minisekvensering for studier av variasjon 5 Microarray 6 Problemstilling og hypotese 6 Hvordan nå målet? 8 Materialer og metoder 9 Innsamling og oppbevaring av analysemateriale 9 Prosedyre ved isolasjon av Total DNA fra plantevev ved bruk av DNeasy Plant Mini Kit 11 Beregning av DNA- utbytte 13 Valg av genetiske markører 13 PCR (Polymerase Chain Reaction) 14 Prosedyre for PCR 17 Prosedyre for laging av agarose gel elektroforese 19 Nybestilling av PCR- primere med fluorescensmerket5 ende 21 PCR med merkede primere 21 Resultater 23 Resultater fra agarosegel 23 Resultater fra DNA- utbytte analyse 26 Resultater fra 3130 Genetic Analyzer 27 Diskusjon 30 DNA- isolering 30 DNA- utbytte analyse Genetic Analyzer 31 Fenotypisk variasjon 33 Konklusjon 34 Kilder 35 V

6 VI

7 Genetisk variasjon hos jordskokk Innledning Jordskokk Som bacheloroppgave i biologi ved Høgskolen i Agder har jeg valgt å undersøke genetisk variasjon hos kulturplanter. Kulturplanter er vekster som gjennom dyrking eller foredling er tatt i bruk til menneskelige formål. Man skiller mellom fire grupper; matplanter, medisinplanter, prydplanter og planter til industriell eller teknisk bruk som for eksempel bomull. Planten som skal undersøkes er jordskokk (Helianthus tuberosus). Jordskokk er en flerårig plante i kurvplantefamilien og en nær slektning av solsikke (Helianthus annus). Den er ganske høy, med gule blomster og spiselige knoller. Planten setter ikke modne frø i Norge, som altså vil si at den formerer seg vegetativt, og må bevares som knoller. På 90- tallet ble 40 knoller samlet inn av en arbeidsgruppe for grønnsaker ved Nordisk Gen Bank (NGB) og befinner seg nå hos Bioforsk på Landvik i Grimstad. Knollene ble samlet inn med tanke på studier på forskjeller mellom dem og fremtidig bevaring av de ulike typene. Knollene i samlingen viser stor variasjon med henhold til farge og form. De er blitt nærmere undersøkt med tanke på egenskaper ved knoller, stengel, blad og blomst. Avling og knollstørrelse er også registrert(asdal, Å). 1

8 Stine Kooyman Jordskokk: (Helianthus tuberosus) Latin: Helianthus tuberosus Familie: Korgplantefamilien (Asteraceae) Engelsk: Jerusalem artichoke Beskrivelse: Flerårig, men dyrkes som ettårig. Underjordiske stengelknoller, hvite, gule eller rosa. (2n= 102) Innholdsstoffer: Inulin i stedet for stivelse. Bruk og historie: Kokes og formeres som poteter (Aarnes. H) Mange av plantene i Helianthus-slekten er polyploide (A Brief Overview of the Compositae, Lettuce and Sunflower). Det betyr at det har foregått en kromosomal endring som gjør at organismen inneholder mer enn to komplette kromosomsett (2002, Campell & Reece. #1). Jordskokken kom opprinnelig fra Nord- Amerika på tallet. Den ansees som en grønnsak og det diskuteres om den kan være av interesse for diabetikere på grunn av sitt høye innhold av karbohydratet inulin. Ved oralt inntak av inulin vil karbohydratet ikke absorberes og derfor ikke påvirke blodsukkernivået, noe som kan gjøre knollen egnet som mat for diabetikere. Inulin sies også å være foretrukket næring for lactobacillus og kan forbedre balansen av denne bakterien i tarmen. Bifidobacteria fordøyer inulin til ulike syrer hvor av en av syrene påstås å kunne ha forebyggende effekt på tarmkreft (Spiller, GA. 1994). Variasjonsstudier hos jordskokk Det er tidligere gjort lite for å studere genetisk variasjon hos jordskokk, slike studier vil gi mye nyttig biologisk kunnskap om variasjon hos 2

9 Genetisk variasjon hos jordskokk planter generelt og informasjon for bevaring av en viktig historisk og fremtidig kulturplante. Det er imidlertid gjort en del for å studere fenotypisk variasjon, med tanke på knollform, knollfarge, stengelbehåring, stengelfarge og grenethet. Plantene som er innsamlet viser på disse områdene store variasjoner. Genetisk variasjonsstudier er gjort på den nært beslektede solsikken, noe som avdekket stor variasjon mellom amerikanske solsikkestammer (Tang S, Knapp S. J, 2002). Genetisk variasjon Genetisk variasjon er den variasjonen som finnes i arvestoffet, innad og mellom individer, arter og mellom populasjoner. Genetisk variasjon er viktig for å bevare det biologiske mangfoldet her på jorda. Variasjonen gjør det mulig for arter å tilpasse seg forandringer i miljøet de lever i. Genetisk mangfold finnes på individnivå, men også som genetisk variasjon mellom populasjoner. Genetisk diversitet mellom populasjoner assosieres med tilpasninger til lokale forhold. Dersom en populasjon dør ut har arten mistet noe av sin genetiske variasjon som gjør tilpasning mulig. Den genetiske variasjonen er viktig å bevare fordi den gjør at dersom miljøet endres kan det finnes populasjoner som kan takle forandringene og populasjoner som ikke takler endringene (Campbell & Reece, #2). Ettersom jordskokk kun formerer seg vegetativt i Norge vil dette begrense den genetiske variasjonen noe. Metoder for å studere genetisk variasjon Det er genene, sammen med miljøet som bestemmer en organismes fenotype. Variasjoner i sammensetning og organisering av genene danner grunnlaget for evolusjonær utvikling. Gjennom studier av den genetiske variasjonen mellom individer av samme art (slik som i denne oppgaven) 3

10 Stine Kooyman kan vi lære mye om organismens respons på sykdommer, biologisk virkemåte til grunnleggende prosesser i kroppen og skille mellom individer. Man kan også lære mer om slektskap mellom arter gjennom studier av genetisk variasjon. Det finnes mange ulike metoder for å studere genetisk variasjon. Man kan sammenlikne hele DNA sekvensen til forskjellige individer, men dette er tidkrevende og dyrt. Inntil dette kan gjøres på en rask og billig måte benyttes en lang rekke analysemetoder. VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) Korte DNA- sekvenser som er repetert flere ganger etter hverandre i tandem kalles VNTR. Om man da kutter med restriksjonsenzymer vil det gi fragmenter med ulik lengde avhengig av antall repetisjoner av VNTR. Dersom man behandler dette i en polyacrylamidgel vil man få ulike bånd alt ettersom hvor lange fragmentene blir, altså etter hvor mange repeterte sekvenser som er tilstede. VNTR- fragmentene kan også analyseres ved hjelp av PCR. Primere vil feste seg på enkelte steder, og man vil få oppformert området mellom dem. Ved ulikt antall VNTR vil fragmentene få ulik lengde, noe som vil vises på en agarosegel (se figur 3 og 4). Dersom det repeterte elementet er veldig kort (200 eller færre baser) kalles VNTRen for en mikrosatellitt. Ingen vet akkurat hva disse segmentene gjør, men de kan ikke være så veldig viktige ettersom at de er ekstremt variable i lengde, og tilfeldig spredt rundt om i genomet. Ved å utføre PCR med et antall flankerende primere, kan et genetisk fingeravtrykk dannes, og gjøre det mulig å trekke konklusjoner om et individs identitet og genetisk forhold til andre individer, med stor sikkerhet (Dale,J. von Schantz, M. 2002). Det er først og fremst mikrosatellitter som brukes i denne oppgaven. 4

11 Genetisk variasjon hos jordskokk RFLP (Restriction Fragment Length Polymorfism) Det finnes en sekvensvariasjon mellom alleler (genvarianter) som kan påvises ved at DNA- fragmenter får ulik lengde på grunn av at restriksjonsseter har oppstått eller blitt fjernet som følge av en punktmutasjon. Ved RFLP- analyse kuttes DNA med et restriksjonsenzym, dersom det har skjedd en punktmutasjon og et restriksjonssete har blitt fjernet eller satt inn vil dette gi utslag i ev. kortere eller lenger fragment av DNA som kuttes. Dersom man etterpå kjører en gel vil man kunne se om fragmentet kuttes eller ikke. DNA sekvensering og minisekvensering for studier av variasjon. I mange tilfeller ønsker man å studere variasjonen i selve DNA-sekvensen mellom individer. Man vil for eksempel finne hvilken genvariant eller mutasjon som forårsaker en bestemt sykdom. For å gjøre dette kan man amplifisere genet, eller deler av det, ved hjelp av PCR og videre sekvensere PCR- produktet. Dersom samme mutasjonen finnes f. eks. hos alle syke personer, mens ingen analyserte friske personer har det, har man identifisert en mutasjon som er koblet til sykdommen. Mutasjonen er ikke nødvendigvis årsak til sykdommen. Minisekvensering brukes til å finne sekvensen av en DNA- bit hvor man mistenker at det kan finnes en mutasjon. PCR amplifiserer området med mulig mutasjon. Primerne hybridiseres like inntil mulig mutasjon. ddgtp, ddatp, ddttp og ddctp tilsettes. Dersom disse er merket forskjellig kan alle blandes i samme rør. DNA- polymerasen inkorporerer det rette ddxtp avhengig av hvilken nukleotid som er på punktmutasjonsstedet. Analyse på automatisk sekvenseringsmaskin detekterer hvilken nukleotid som er innkorporert hvor, altså genotypen. 5

12 Stine Kooyman Det finnes områder med stor grad av sekvensvariasjon, som for eksempel mitokondrieområder, som kan sekvenseres. Microarray Det finnes mange varianter av microarray. For deteksjon av SNP eller andre mutasjoner i genomisk DNA brukes metoden som beskrives her. Oligonukleotid med komplementær sekvens til kjente mutasjoner festes til et microarray (chip). Et stort antall slike prober ( ) kan festes til chippen, noe som gjør at det kan testes for mange mutasjoner. Aktuelle områder man vil teste for mutasjoner amplifiseres av PCR og merkes. PCR- produktet kan så hybridisere til chippen. Analyse viser hvilke posisjoner PCR- produktene har hyridisert til og følgelig hvilke mutasjoner/ alleler personen som er testet har. Microarray brukes også i genekspresjonsstudier. Problemstilling og hypotese Problemstilling: Det er ønskelig å undersøke grad av genetisk variasjon mellom de innsamlede plantene. Ettersom det tidligere er gjort svært lite når det gjelder studier av genetisk variasjonen hos jordskokk er det behov for et testsystem for deteksjon av DNA- variasjon hos plantene utvikles. Hypotese: solsikkemarkører kan brukes for å studere den genetiske variasjonen hos jordskokk. Nært beslektede organismer ofte har mye likt DNA. Solsikke(Helianthus annus) og jordskokk (Helianthus tuberosus) er så beslektet at de kan krysses, men dette må gjøres manuelt (The biology of Helianthus annus L). 6

13 Genetisk variasjon hos jordskokk I dette prosjektet var hovedmålet å undersøke om genetiske markører fra solsikke kan benyttes til å etablere et testsystem (plukke ut genetiske markører som viser variasjon mellom de ulike typene jordskokk) for studier av genetisk variasjon hos jordskokk. 1: Avella 2: Dagnøytral 4: Søm 6: Kapell 11: Moskva 12: Wuestman 28: Gram 30: Dømmesmoen 37: Elverum 38: Planck Figur 1: Bildene viser knollene til de 10 plantene som ble plukket ut til forsøket. 7

14 Stine Kooyman Hvordan nå målet? Det er viktig å kontrollere om de ulike tingene fungerer. DNA kan være noe mer problematisk å isolere hos planter på grunn av den sterke celleveggen. Først ble det isolert DNA fra en plante. For å kontrollere at DNA- isolering var oppnådd ble det kjørt PCR med en markør fra et av de få genene isolert fra jordskokk, ettersom dette genet ikke hadde noe navn refererer vi til markøren som kontroll. Kontrollmarkøren ble brukt som positiv kontroll, og som negativ kontroll ble det brukt vann. Ut fra resultatene så det ut til at DNA var isolert. Det ble så isolert DNA fra resten av plantene på samme måte som på den første (se prosedyre DNeasy Mini Kit). Det ble plukket ut to tilfeldige planter som så ble kjørt i PCR med alle primerne, for så å sjekke med agarosegel for å se hvilke primere som virket. De markørene som virket bestilte jeg merkede markører av, for så å kunne kjøre dem i DNA analyse maskinen (3130 Genetic Analyzer fra Applied Biosystems). DNA analyse maskinen vil mer nøyaktig kunne analysere lengden på de ulike fragmentene som dannes i PCR, og målet er å finne primere som virker på alle plantene, men der plantene viser stor lengdevariasjon i PCR produktene. DNAet ble også analysert med tanke på DNA-konsentrasjon. Det ble fortynnet med vann og kjørt i spektrofotometer for å se absorbansen ved 260nm og 280nm. Det ble isolert DNA fra 10 innsamlede eksemplarer jordskokk, for så å plukke ut genetiske markører hos den beslektede arten solsikke som skal brukes til å undersøke ved hjelp av DNA- analyser (PCR) og analyse i agarosegel for å se om de utvalgte markørene fungerte i jordskokk. Av de 8

15 Genetisk variasjon hos jordskokk markørene som gir PCR- produkt ble den ene delen av primersettet bestilt på nytt med 5 ende merket med fluoriserende fargestoff. Man vil så forsøke å bestemme grad av variasjon i markørene som fungerte i jordskokk ved hjelp av en 3130 Genetic Analyzer, som er en DNA analyse maskin. De ti plantene som ble undersøkt var plukket ut av Åsmund Asdal ved Bioforsk med tanke på at de skulle være mest mulig forskjellige, og det ble forventet at plantene derfor skulle vise noe variasjon i genmateriale. Vi forventet at de plantene som er samlet fra steder som ligger lengst fra hverandre vil være mest forskjellige. Ettersom jordskokk ikke formerer seg ved hjelp av frø i Norge, vil dette begrense den genetiske variasjonen. Den planten som skilte seg mest ut fra de andre ved første øyekast, var plante nummer 11, Moskva, som hadde en knoll som er vinrød av farge, hvor de andre knollene er lysebrune. Plantene var ellers kartlagt med tanke på stengelbehåring, stengelfarge, grenethet, stilklengde, bladbredde, blomstring, knollform, knollfarge, knollutvekster, knolltype, knollfarge og diverse andre egenskaper av Nordisk GenBank (Bioforsk)ved Landvik i Grimstad. Materialer og metoder Innsamling og oppbevaring av analysemateriale Utstyr: Sprittusj, oppbevaringsglass, saks, spirende planter. Fremgangsmåte Samlet inn plantevev/ blader fra de ti plantene, fortrinnsvis unge skudd (se figur 1). Vevet ble plassert i hver sin plastikkpose og posene ble merket godt. Etter innhøsting ble plantevevet lagret ved -20 C. Det ble foretrukket ungt materiale fordi det inneholder mer celler per vekt og derfor resulterer i mer DNA. I tillegg inneholder dette 9

16 Stine Kooyman materialet mindre polysakkarider og polyfenoler og er derfor letter å håndtere. Plantene har tidligere vært studert med tanke på knollform, knollfarge og liknende og i sammenheng med dette blitt nummerert. Vi brukte det samme nummersystemet. Figur 2. figuren viser de ti plantene vi samlet inn materiale fra. Plantene vi samlet inn var: Tabell 1. Tabellen viser plantenavn og nummer som ble samlet inn. Plantenummer Plante navn 1 Avella 2 Dagnøytral 4 Søm 6 Kapell 11 Moskva 12 Wuestman 28 Gram 30 Dømmesmoen 37 Elverum 38 Planck 10

17 Genetisk variasjon hos jordskokk Prosedyre ved isolasjon av Total DNA fra plantevev ved bruk av DNeasy Plant Mini Kit Utstyr: Plantemateriale, vekt, skalpellblader, veieskip, eppendorfrør, varmeblokk, mikropistill, is, isoporeske til å ha is i, DNeasy Plant mini kit fra QIAGEN. Fremgangsmåte: 1. DNeasy Plante prosedyre er optimalisert for et maksimum av 100mg våt vekt start materiale. Bruk av for mye materiale vil gi ufullstendig lysering og lav renhet. 2. Bruker en mikropistill til å knuse plantemateriale godt. Passet på at det ikke var klumper i materialet. 3. Tilsatte 400µl av Buffer AP1 og 4µl av RNase A stam løsning(100mg/ml). 4. Inkuberte blandingen i 10minutter ved 65 C. Blandet 2-3ganger under inkubasjonen ved å vende røret. Dette lyserte cellene og bryter ned RNA. 5. Tilsatte 130µl Buffer AP2 til lysatet og blandet. Inkuberte i 5minutter på is. Dette steget tok bort detergenter, proteiner og polysakkarider. 6. Sentrifugerte i 1 minutt på max speed (14000rpm). 7. Tilsatte lysatet til QIAshredder Mini Spin Column (lilla) plassert i en 2ml oppsamlingsrør (medfølger i kitet) og sentrifugerte i 2minutter ved x g (14000rpm). Dette fjernet det meste cellematerialet, men en liten del vil nok ha passert gjennom og dannet en pellet i oppsamlingsrøret. 8. Overførte væsken som gikk gjennom membranen fra forrige steg til et nytt rør uten å forstyrre en eventuell pellet i bunnen av oppsamlingsrøret. 11

18 Stine Kooyman 9. Tilsatte 1,5 volum Buffer AP3/E til det klare lysatet og mikset før pipettering. Eksempelvis hvis man har 450µl lysat tilsetter man 650µl Buffer AP3/E. 10. Tilsatte 650µl av miksen fra forrige steg, inkludert eventuelt bunnfall som har blitt dannet, til DNeasy Mini Spin Column i et 2ml oppsamlingsrør (medfølger). Sentrifugerte i 1minutt ved 6000x g (korresponderer til 8000rpm for de fleste mikrosentrifuger) og kvittet meg med det som gikk gjennom. DNA er nå festet til filteret. 11. Repeterte forrige trinn, brukte samme oppsamlingsrør. 12. Plasserte DNeasy Mini Spin Column I et nytt 2ml oppsamlingsrør(medfølger ), tilsatte 500µl Buffer AW (med etanol tilsatt) til DNeasy Mini Spin Column og sentrifugerte i 1minutt ved 6000x g ( 8000rpm). Kvittet meg med det som gikk igjennom og brukte samme oppsamlingsrør i neste trinn. Dette gjøres for å vaske bort uønskede elementer. 13. Tilsatte 500µl Buffer AW til DNeasy Mini Spin Column og sentrifugerte i 2minutter ved 20000x g (14000rpm) til å tørke membranen. Det var viktig å tørke membranen fordi rester av etanol kunne forstyrre andre reaksjoner. 14. Overførte DNeasy Mini Spin Column til et 1,5ml eller 2ml mikrosentrifugerør(medfølger ikke) og pipetterte 100µl Buffer AE direkte på mikrosentrifuge membranen. Inkuberte i 5 minutter ved romtemperatur (15-25 C) og sentrifugerte i 1minutt ved 6000x g ( 8000rpm) for å trekke ut DNA. AE er en lavsalt buffer som fører til at DNA løsner fra filteret og isoleres i eget rør. 15. Repeterte forrige trinn èn gang. 12

19 Genetisk variasjon hos jordskokk 16. Overførte løsningen, som inneholdt DNA, til et eppendorfrør. Passet på å merke røret godt. Beregning av DNA- utbytte For å få en idé om DNA- mengden ble det gjennomført en konsentrasjonsanalyse med et spektrofotometer av typen Helios gamma levert av Unicam. Spektrofotometeret ble innstilt på 260nm og 280nm. DNA- konsentrasjonen ble regnet ut ved: DNA-kons. i kyvetten (ug/ml) = Absorbansverdien fra 260 x 50 fordi en DNA-løsning med kons. 1 ug/ml gir absorbans 1 ved UV260. Så ble det ganget med grad av fortynning (35). DNAet ble fortynnet i vann 35x DNA 7 µl Destillert Vann 240 µl Valg av genetiske markører For å kjøre PCR trengs det primere som er komplementære til deler av DNA, slik at de kan feste seg. Vi brukte primere som fungerer i Solsikke, som er nært beslektet med jordskokk. Da ingen genetiske markører er funnet hos jordskokk, ønsket man å forsøke med markører fra solsikke. DNA- sekvenser hos nært beslektede arter er ofte veldig lik og det er demonstrert at genetiske markører isolert fra én art ofte kan benyttes til å studere genetisk variasjon hos andre, beslektede arter. Det måtte først plukkes ut et utvalg primere som forhåpentligvis skulle virke på jordskokk. Det ble valgt 6 primere som var listet i artikkelen S. Tang, S.J Knapp (2002): Microsatellites uncover extraordinary diversity in native American land races and wild populations of cultivated sunflower (primere fra genomisk DNA som er funnet å virke på en rekke angiospermarter), og 2 primere fra artikkelen Wills, D.M, Hester M. L 13

20 Stine Kooyman (2005). Chloroplast SSR polymorphism in the Compositae and the mode of organellar inheritance in Helianthus annus (primere fra kloroplast DNA). Vi brukte primere fra kloroplast DNA fordi det kun nedarves fra morssiden og dermed kan være et viktig verktøy også for fremtidige populasjonsgenetiske studier. Som positiv kontroll brukte vi markør for et av de få genene isolert fra jordskokk, referert til som kontroll. Markørene ble bestilt fra MWG- Biotech AG via internett. Markørene som ble bestilt var: Tabell 2. Tabellen viser markørnavn og nummer. Navn Nummer Kontroll (L og R) I ORS 310 (A og B) II ORS 311 (A og B) III ORS 317 (A og B) IV ORS 331 (A og B) V ORS 351 (A og B) VI ORS 388 (A og B) VII ccmp5 (Fwd og Rev) VIII NTCP39 (Fwd og Rev) IX Romertallene bak primernavnene er tallene jeg brukte for å skrive ned rekkefølger og liknende, ved PCR og agarosegel. PCR (Polymerase Chain Reaction) PCR er en metode som brukes først og fremst til å oppformere DNA. PCR kan brukes til å lage millioner kopier av et bestemt område på DNA. Templat- DNA, nukleotidene datp, dctp, dgtp og dttp (samlet kalt nntp), DNA- primere, passende reaksjonsbuffer og DNA- polymerase pipetteres over i PCR- rør. PCR- røret plasseres i en Thermocycler, en 14

21 Genetisk variasjon hos jordskokk maskin som er i stand til å raskt varme opp og kjøle ned materialet i rørene. Det dobbeltrådete DNA som skal oppformeres varmes opp slik at de to trådene denatureres (går fra hverandre). DNA- polymerasen(taqpolymerase) som brukes er isolert fra den termofile (varmeelskende) bakterien Thermus aquaticus slik at enzymet fortsatt virker under høye temperaturer. Temperaturen senkes så slik at enkelttrådene kan feste seg til primere (korte DNA stykker) som er komplementære til sekvensen på tråden som skal oppformeres(mullis, K. B & Fallona, F. A (1987)). Temperaturen heves så og Taq- polymerasen syntetiserer DNA fra 3 enden av primerne. Slik får man to nye, like DNA- tråder. Prosessen gjentas ønsket antall ganger til man har fått nok DNA. Mengden DNA fordobles med hver runde og veksten blir derfor eksponentiell. For å regulere temperaturendringene brukes en PCR- termosykler som kan forhåndsprogrammeres til det temperaturprogrammet, inkubasjonstid og antall sykluser man ønsker å bruke. 15

22 Stine Kooyman Figur 3: Figuren viser prinsippet ved en PCR- reaksjon hvor målsekvensen er en mikrosatellitt. PCR- reaksjonen gjentas i ønsket antall sykluser til man har ønsket mengde DNA. 16

23 Genetisk variasjon hos jordskokk Figur 4: Figuren til høyre viser ulike allel klasser av mikrosatelitt fragmenter oppformert i PCR. Fragmentene testes så i en gel, hvor de separeres etter lengde. Man kan se forskjell på individer med ulikt antall repeterte elementer i mikrosatellitten, ettersom båndene vandrer ulikt på grunn av ulik lengde. Prosedyre for PCR Utstyr Destillert vann, 10xPCR- buffer, Gold Taq- polymerase, dntp, markører som listet tidligere, PCR- rør, PCR maskin (GeneAmp PCR System 9700), pipetter, pipettespisser, engangshansker. Generelt På grunn av den enorme amplifikasjonen som er mulig med PCR, vil selv små nivåer av DNA kontaminering, spesielt fra tidligere PCR amplifiseringer, prøver med høye DNA nivåer og positiv kontroll templater, resultere i produktdannelse selv når DNA ikke er tilsatt med vilje. Om mulig burde alle reaksjoner settes opp i et område separat fra PCR produkt analyse. Bruk av engangsinstrumenter, løsninger og pipetter til DNA preparering, reaksjons miksing og prøveanalyse vil redusere fare for kontaminering. 17

24 Stine Kooyman Prosedyre En master miks av reagenser (vann, buffer, dntp, PCR- primere og enzymer) for alle prøvene forberedes først, mengde lages etter hvor mange prøver som skal analyseres, og fordeles i hvert sitt rør. Templat DNA tilsettes så. Oppskrift på reaksjonsmiks i et rør: Destillert vann 17,80 µl 10X PCR buffer II 2,50 µl 10mM dntp 0,50 µl Primer 1 (5pmol/ µl) 1,50 µl Primer 2 (5pmol/ µl) 1,50 µl AmpiTaq Gold DNA Polymerase 0,20 µl Templat DNA 1,00 µl Total miks 25,00 µl Plasserte PCR-rørene i PCR maskinen (GeneAmp PCR System 9700) og programmerte inn temperatur og tid. Stilte inn PCR maskinen på 37 sykluser. 95 C 10 min 94 C 45 sek 52 C 45 sek >37sykler 72 C 45 sek 72 C 7 min 4 C 18

25 Genetisk variasjon hos jordskokk Med 95 C i 10 minutter, 94 C i 45 sekunder, 52 C i 45 sekunder, 72 C i 45 sekunder, 72 C i 7 sekunder og når selve prosessen er ferdig 4 C resten av tiden. Prosedyre av laging av agarose gel elektroforese Bakgrunn Agarose gel elektroforese er den enkleste og vanligste måten å separere DNA etter størrelse og analysere DNA på. Prinsippet baserer seg på at makromolekyler separeres på bakgrunn av sin bevegelsesfart gjennom gelen i et elektrisk felt(campbell & Reece, #3). For DNA er migrasjonsraten, hvor langt molekylet beveger seg mens strømmen er på, invers proporsjonal med molekylets størrelse. Nukleinsyrer har negativt ladde fosfatgrupper proporsjonale til sin lengde, men fibrene i gelen forhindrer bevegelse av lange fragmenter mer enn korte. DNA avsettes i små brønner på den negativt ladde polen av gelen, når strømmen slåes på, vandrer de mot den positive polen på grunn av de negativt ladde fosfatgruppene. Meningen med gelen kan være å se på DNA eller isolere et spesielt bånd. DNA visualiseres i gelen ved å tilsette ethidiumbromid. Dette binder sterkt til DNA ved å interkalere mellom basene og er fluoriserende, som betyr at det absorberer usynlig UV lys og overfører energien som synlig lys. Ulike konsentrasjoner av gelene fører til ulik oppløsning på gelen, slik at man noen ganger må prøve seg fram for å finne den konsentrasjonen som separerer fragmentene best. Laging av 2% agarosegel (2% gel, 100ml). Utstyr: Veieskip, agarose, vekt, erlenmeyerkolbe, 1x TAE, mikrobølgeovn, ethidiumbromid. 19

26 Stine Kooyman 1. Veide opp 2g agarose i en 250ml erlenmeyerkolbe. Tilsatte 100ml 1xTAE, ristet forsiktig for å mikse. 2. Satte i mikrobølgeovn i ca 1minutt for å løse opp agarosen. 3. Lot løsningen stå på benken og kjøle seg ned til ca 60 C. 4. Tilsatte 5 µl etidiumbromid(10 µg/ µl) og ristet forsiktig for å blande. 5. Satte i kammen og sjekket at den var korrekt satt i. Helte gelen sakte over på tanken og passet på at det ikke ble luftbobler. 6. Lot gelen stå å stivne. 7. Helte 1x TAE buffer i geltanken og over gelen slik at bufferen gikk 2-5mm over gelen. Dette var kjøringsbufferen. Forberedelse av prøvene: Loadingbufferen bestod av 50% glyserol og Bromfenolblått. Størrelsesstandarden som ble brukt var 1kb Plus fra Invitrogen. Loadingbuffer 2,0 µl PCR produkt 2,0 µl (eller 1 µl størrelsesstandard) Destillert vann 6,0 µl Totalt volum 10 µl Etter at gelen var stivnet og kammen tatt ut ble DNA prøvene blandet med loadingbuffer og vann og 10 µl ble pipettert over i brønnene. Passet på å merke meg hvilken rekkefølge prøvene ble avsatt i. 20

27 Genetisk variasjon hos jordskokk Nybestilling av PCR- primere med fluorescensmerket5 ende Etter vurdering av resultatene på agarosegelen ble markør II(ORS 310) forkastet, og primere til resten av markørene ble bestilt på nytt fra Applied Biosystems merket med fluoriserende fargestoff i 5 enden. Kun den ene halvdelen av hvert primersett ble bestilt på nytt. Tabell 3. Tabellen viser hvilken del av primersett som ble bestilt på nytt, hva de ble merket med og hvilken primerdel som ble merket. Navn Nummer Merket del Merket med Kontroll (L og R) I L 6- FAM ORS 311 (A og B) III A VIC ORS 317 (A og B) IV A NED ORS 331 (A og B) V A 6- FAM ORS 351 (A og B) VI A VIC ORS 388 (A og B) VII A NED ccmp5 (Fwd og Rev) VIII Fwd 6- FAM NTCP39 (Fwd og Rev) IX Fwd VIC De fluoriserende fargene: 6- FAM: fluoriserende blå VIC: fluoriserende grønn NED: fluoriserende gult PCR med merkede primere PCR miks: Destillert vann 17,8 µl 10x PCR buffer 2,5 µl dntp 0,5 µl 21

28 Stine Kooyman Gold Taq- polymerase 0,12 µl Primer 1 (5pmol/ µl) 1,5 µl Primer 2 (5pmol/ µl) 1,5 µl DNA 1 µl Totalt PCR- volum 25 µl PCRen ble kjørt på samme måte som tidligere, men antall sykluser ble endret til 28 på grunn av at 3130 Genetic Analyzer har et meget sensitivt detektorsystem og vi trenger derfor ikke så mye DNA. Forberedelse av PCR- produkt i 3130 Genetic Analyzer: HiDi Formamid 9,8 µl Størrelses standard (LIZ 500) 0,2 µl PCR- produkt 1,0 µl Analyser av PCR- produkt i 3130 Genetic Analyzer PCR- produktet, størrelsesstandarden samt HiDi formamid ble pipettert opp i en 96- brønners PCR- plate og satt inn i 3130 Genetic Analyzer. Når brettet ble satt inn, ble det på en tilhørende datamaskin laget et oppsett for hvilken brønn som inneholdt hvilken prøve og maskinen ble fortalt hvilken størrelsesstandard som ble brukt Genetic Analyzer fungerte på den måten at den har 4 kapillærrør fylt med en polymer som fungerer på tilsvarende måte som en gel, nemlig ved å separere fragmentene etter størrelse. Når prøven passerer en laser, gir de merkede fragmentene fra seg et lysglimt som blir registrert av et kamera og omgjort til en topp på skjermen på datamaskinen (Se figur 7). Den maskinen som ble brukt hadde 4 kapillærrør og kunne altså analysere 4 prøver om gangen. 22

29 Genetisk variasjon hos jordskokk Resultater Resultater fra agarosegel Kjørte PCR i 37 sykluser med alle plantene og markør I(Kontroll) for å se om vi hadde DNA, etterfulgt av analyse i 1% agarosegel. Kjørte også PCR for resten av markørene på plante 11 og 12. Fikk resultat, men det var vanskelig å tolke ettersom gelen ikke separerte fragmentene godt nok. Testet prøvene en gang til på 2 % agarosegel og fikk da lesbare resultater. For å kunne se på resultatene av agarosegelen ble det brukt en UV-boks med et digitalkamera i slik at bildene av gelene (som det nedenfor) kunne lagres på en minnebrikke, eller skrive ut direkte. Figur 5. Figuren viser 1kb Plus DNA Ladder på 0,9% agarosegel farget med etidiumbromid. Justerte antall PCR- sykluser til 35 og kjørte så PCR med alle primerne på plantene 4 og 6 for å teste de nye PCR- betingelsene og analyserte PCRproduktene i agarosegel (2 %). Båndene ble klare og fine(data ikke vist). På alle gelene ble det også satt på en størrelsesstandard (1kb Plus DNA Ladder) for å indikere lengden på fragmentene. Kjørte så PCR der jeg testet alle plantene for alle primerne (satte opp annealingtemperaturen i PCR- profilen til 59 grader). 23

30 Stine Kooyman Figur 6a) Figur 6b) Figur 6c) 24

31 Genetisk variasjon hos jordskokk Figur 6 a, b og c. Figuren viser resultatene fra analysen av PCR- produkt i 2% agarosegel. Det første sporet på hver rekke er alltid størrelsesstandard. Tallene over sporene markerer hvilken plante som er testet, og minustegnet markerer negativ kontroll. Figur 5A viser resultatet av agarosegel med PCR- produkt med markør II (ORS 310), III (ORS 311) og IV (ORS 317) på alle plantene. Figur 5B viser resultater fra agarosegel med PCR- produkt med markør V(ORS 331), VI (ORS 338) og VII (ORS 351) på alle plantene. Figur 5C viser resultatene fra agarosegeltesting med av PCR- produkt med markør VIII(ccmp5) og IX(NTCP39). Fra figuren kan vi se at det ikke ble resultat på plante 37 og 38 på noen av primerne. Det er da trolig at DNA- isoleringen har vært mislykket og dette ble gjort på nytt. På resultatet fra markør II (ORS 310) kan man ikke se bånd og det konkluderes med at primeren ikke har virket. Resultatene fra markør III (ORS 311) og IV (ORS 317) er det klare bånd og vi konkluderer med at primerne har virket. Båndene fra markør V(ORS 331) er klare og tydelige og primerne har virket. Resultatene fra VI (ORS 338) og VII (ORS 351) er noe mer uklare, uten at vi kan si hvorfor, men disse forkastes ikke fordi det er interessant å se hva som blir resultatet av analysen i 3130 Genetic Analyzer. Resultatene fra markør VIII(ccmp5) og IX(NTCP39) er også klare og tydelige og primerne har virket. Med utgangspunkt i disse resultatene ble markørene I(Kontroll L), III(ORS 311 A), IV(ORS 317 A), V(ORS 331 A), VI(ORS 351 A), VII(ORS 388 A), VIII(ccmp5 Fwd) og IX(NTCP39 Fwd) bestilt på nytt, med 5 merket ende. Vi konkluderte med at markør II ikke fungerte, og forkastet denne. Markør I, som er Kontrollmarkøren(I) brukt til positiv kontroll bestilte vi også merket av, men den ble ikke testet i bildene vist over fordi den er positiv på alle plantene(data ikke vist). 25

32 Stine Kooyman Resultater fra DNA- utbytte analyse Plantenavn/nr. Abs. 260nm Abs. 280nm Forhold abs. 260nm/280nm Konsentrasjon (µg/ml) 1: Avella 0,34 0,029 1, : Dagnøytral 0,129 0,098 1, ,75 4: Søm 0,143 0,109 1, ,25 6: Kapell 0,069 0,065 1, ,75 11: Moskva 0,179 0,084 2,13 313,25 12: Wuestman 0,057 0,035 1,628 99,75 28: Gram 0,041 0,025 1,64 71,75 30: Dømmesmoen 0,025 0,018 1,388 43,75 37: Elverum -0,023-0,03 0, : Planck 0,054 0,038 1,421 94,5 Tabell 4. Tabellen viser resultatene fra absorbansmålingene på DNA. DNAkonsentrasjonen ble regnet ut ved: DNA-kons. i kyvetten (ug/ml) = Absorbansverdien fra 260 x 50 fordi en DNA-løsning med kons. 1 ug/ml gir absorbans 1 ved UV260. Så ble det ganget med grad av fortynning (35). Forholdet mellom absorbansen ved 260nm og 280nm burde egentlig være over 1,8, resultater lavere enn dette kan tyde på forurensninger. Siden det kreves svært små mengder DNA til PCR- reaksjonen vil ikke dette ha noen innvirkning på forsøkene. Absorbansen hos plante 37 ble negativ og DNA- konsentrasjonen ble satt til null. Det er likevel noe DNA tilstede ettersom planten får resultat med to av markørene. 26

33 Genetisk variasjon hos jordskokk Resultater fra 3130 Genetic Analyzer Figur 7: Figuren viser resultater fra plante nummer 6 (øverst), 11 og 12 testet med markør VI(ORS 351). De grønne toppene er PCR- produktene. De oransje toppene er størrelsesstandarden. Den rosa streken i toppen hos plante 6 og 12 indikerer at den grønne toppen er så høy at den går ut av skalaen i programmet. Figur 6 illustrerer hvordan resultatene vil være når PCR- produktene har blitt analysert i 3130 Genetic Analyzer. Slike figurer fikk man for alle plantene testet med de ulike markørene(data ikke vist). De grønne toppene på figuren er det samme som et bånd i en gel. Fordelen med å bruke 3130 Genetic Analyzer er at den med stor nøyaktighet angir lengden på PCRproduktene. 27

34 Stine Kooyman Plantenr./navn I: Kontroll III: ORS 311 IV: ORS 317 V: ORS 331 1: Avella 176, , 346, 350, , 187, 191, : Dagnøytral 176, , 346, 350, , 187, 191, : Søm 176, , 346, 350, , 187, 191, : Kapell 176, , 346, 350, , 187, 191, : Moskva 176, , , : Wuestman 176, , 346, 350, , 187, 191, : Gram 176, , 346, 350, , 187, 191, : Dømmesmoen 176, , 346, 350, , 187, 191, : Elverum 176, , 346, 350, : Planck 176, , 346, 350, , 187, 191, Tabell 5. Tabellen viser resultater fra 3130 Genetic Analyzer. Tallene under de ulike markørene er fragmentenes lengde i basepar. Grønn farge på tallene indikerer at denne fragmentlengden finnes hos alle plantene, rød farge markerer at denne fragmentlengden kun finnes hos denne planten. 28

35 Genetisk variasjon hos jordskokk Plantenr./navn VI: ORS 351 VII: ORS 388 VIII: ccmp5 IX: NTCP39 1: Avella : Dagnøytral : Søm : Kapell : Moskva 247, 257, : Wuestman : Gram : Dømmesmoen : Elverum : Planck Tabell 6. Tabellen viser resultater fra 3130 Genetic Analyzer. Tallene under de ulike markørene er fragmentenes lengde i basepar. Grønn farge på tallene indikerer at denne fragmentlengden finnes hos alle plantene, rød farge markerer at denne fragmentlengden kun finnes hos denne planten. Det var kun ccmp5 som virket på plante 37 ved første kjøring. Plante 12 ble blank på ORS 311(III). Plante 37 ble kjørt på nytt med ulike PCR mikser, en der alle primerne ble tester, men DNA- templatvolumet var 1,5µl og en der DNA- templatvolumet var 2µl. Disse ble kjørt om igjen og det ble da bra resultat på plante 12, men plante 37 virket kun på markør ORS 311, og gav svake resultater. Markør VII (ORS 388) gav ingen synlige produkt på noen av plantene. Selv ikke etter gjentatte forsøk med varierende PCR- betingelser. 29

36 Stine Kooyman Diskusjon DNA- isolering DNA- isoleringen fungerte bra, men det var viktig å knuse plantene godt. Selv om jeg behandlet alle plantene likt på alle måter viste det seg likevel at det var behov for å isolere DNA på nytt fra henholdsvis plante 37 og 38. Disse ble også behandlet likt under isoleringen, men likevel var det dårlig DNA- utbytte på plante 37. Det er uvisst hvorfor dette var tilfelle, men denne planten krevde ny isolering av DNA, noe det ikke var anledning til ettersom det var for tidkrevende og krevde mer plantemateriale. DNA- utbytte analyser I tabell 4 ser vi at forholdet mellom 260nm og 280nm var lavere enn 1,8. Dette kan bety at det er forurensninger tilstede som for eksempel proteiner og rester fra DNA isoleringen. I vårt tilfelle betydde det mindre at DNAkonsentrasjonen var lav og forholdet var lavt fordi vi trengte svært små mengder DNA for at PCR- reaksjonen skulle fungere. På plante 37 fikk vi negative verdier på absorbansen og DNA- konsentrasjonen kan regnes ut til å bli negativ. Dette er selvsagt ikke mulig, og DNA- konsentrasjonen ble satt til null. Det at absorbansen ble negativ i spektrofotometeret skyldes nok at det var veldig små mengder DNA tilstede, og med de naturlige svingningene i spektrofotometeret kan nok dette skje. Planten gav likevel resultater på markør I (Kontroll) på agarosegel og markør III (ORS 311) og VIII (ccmp5), så det tyder på at det var noe DNA- tilstede, bare ikke nok til å få reaksjon på alle markørene. 30

37 Genetisk variasjon hos jordskokk 3130 Genetic Analyzer I: Kontroll Alle plantene var like på dette området. Det var to bånd, et på ca 176 og en på 189. Det kan være lengdeforskjeller hvor det ene kromosomet har en lengde og det andre kromosomet en annen. Vi kan spekulere i om individene er heterozygote. I og med at 189 toppen er kraftig vil fortynning antagelig føre til at det kun blir resultat på den. Blankt resultat på plante 37. III: ORS 310 Alle plantene hadde bånd på 342, 346, 350 og 355 basepar. Plante 37 gav resultat på denne markøren, men noe svakere enn de andre plantene, som kan komme av at det ser ut til at det var dårlig utbytte av DNAisoleringen. Plante 11 skilte seg noe ut, den hadde kun bånd på 342,346. Det er sannsynlig at alle plantene her er heterozygote. IV: ORS 317 Alle plantene var like utenom plante 11. Det ble blankt resultat på plante 37. De fleste plantene hadde bånd på 180, 187, 191 og 193 basepar, plante 11 hadde bånd på 185 og 183 basepar. Der var ellers ganske mange bånd og det var vanskelig å si hva som stemmer, det måtte eventuelt gjøres flere analyser. Det var vanskelig å si hvorfor nr 11 hadde to bånd og de andre fire, det kunne være uspesifikke bånd. Normalt ville man forvente et eller to bånd alt ettersom om planten er homo- eller heterozygot. Flere bånd kan komme av at jordskokk en gang i evolusjonen har hatt en dobling av kromosomene, den er polyploid. I enkelte artikler hevdes den å være 31

38 Stine Kooyman triploid. Det vil da være mulig med flere topper alt ettersom om det enkelte kromosomsettet er homo- eller heterozygot. I og med at de andre var så like, men at plante 11 kun hadde to bånd kunne man spekulere i om dette ikke er tilfeldig, men at det virkelig er en forskjell, dette krever imidlertid mer analysering. V: ORS 331 Alle plantene var like og hadde høye bånd på 179 basepar. De kan sies å være homozygote. VI: ORS 351 Alle plantene utenom plante 11 hadde bånd på 262 basepar, disse kan være homozygote. Kun nummer 11 hadde bånd på 247, 257 og 284 basepar, og kan sies å være heterozygot. Blankt resultat på plante 37. VII: ORS 388 Denne primeren ble blank på to av to kjøringer(data ikke vist). Ut fra resultatene når denne ble testet på agarosegel, var båndene veldig uklare og mange. Den ble tatt med i bestillingen av merkede primere fordi man var nysgjerrig på hva resultatet ville bli. Ut fra disse resultatene konkluderes det med at primeren ikke har virket. VIII: Ccmp5 Alle plantene har bånd på 94 basepar. Svakt resultat på plante 37. IX: NTCP39 Alle plantene utenom plante 11 har bånd på 170 basepar. Plante 11 har bånd på 160 basepar. Blankt resultat på plante

39 Genetisk variasjon hos jordskokk Generelt Markørene vi hadde valgt var markører som viste stor variasjon(stor grad av heterozygoti) når de ble brukt på solsikke. Jordskokken viser også noe heterozygoti. Plantene viser lite variasjon seg imellom, men viser at det finnes stor variasjon med tanke på antall alleler. Ut fra resultatene kan det se ut som de fleste plantene er veldig like på de markørene som ble testet, med unntak av plante 11 (Moskva) som skiller seg ut på noen punkter. Dette er også den planten som ved første øyekast skiller seg utseendemessig mest fra de andre fordi den har en vinrød farge på knollen, mens de knollene fra de andre plantene er nokså like med lysebrun farge (se Figur 1). Plante 11 var lik de andre plantene på markør I (Kontroll), III (ORS 311) og VIII (ccmp5). På markør IV (ORS 317) er den helt ulik de andre plantene. På markør V (ORS 331), VI (ORS 351) hadde den henholdsvis to og et bånd til felles med de andre plantene. På markør IX (NTCP35) var den helt ulik de andre plantene. På plante 37(Elverum) fikk man kun resultat på markør III og VIII, man kan spekulere i om dette var på grunn av dårlig templat- DNA. Plante 37 krever ny isolering av DNA og spesiell rensing og ny undersøkelse av eksisterende DNA. Dette er for tidkrevende og krever også ny innsamling av plantemateriale, noe som ikke lar seg gjøre i løpet av prosjektet. Dette vil selvsagt bli gjort når man bestemmer seg for mer inngående studier av plantene og andre planter i samlingen til Genressursutvalget for planter. Fenotypisk variasjon De ulike plantene i dette prosjektet ble som tidligere nevnt plukket på det grunnlag at de var forventet å være mest mulig forskjellige. Plantene viser 33

40 Stine Kooyman stor variasjon når det gjelder knollform, knollfarge og knollstørrelse, men det er også store variasjoner når det gjelder stengelbehåring, stengelfarge og grenethet. De fenotypiske ulikhetene kan skyldes miljøet, men det er trolig at det også er genetiske ulikheter mellom disse plantene. Plantene ser utseendemessig forskjellige ut, men er like på genotype på de markørene som ble testet, dette kan muligens skyldes at markørene ligger i områder med lite mutasjoner. Ut fra disse forsøkene kan man kun spekulere ettersom det må gjøres videre undersøkelser for å finne grad av genetisk variasjon. Konklusjon 7/9 (ca 77%) av de testede primerne virket. Dette viser at markørene er egnet til å studere genetisk variasjon hos jordskokk. Markør II(ORS 310) og VII(ORS 351) virket ikke. For å få mer kunnskap om den genetiske variasjonen hos jordskokk må flere planter undersøkes og flere markører testes. 34

41 Genetisk variasjon hos jordskokk Kilder Asdal, Å, Bevaring og utnytting av genressurser i grønnsaker. Cited Mai-7. Tilgjengelig fra: nsaker1.pdf A Brief Overview of the Compositae, Lettuce and Sunflower. Cited Mai-9.Tilgjengelig fra: Campbell, N. A & Reece, J. B (2002). Biology 6 th edition. #1, pp glossery: polyploydi. Pearson Benjamin Cummings Publishing Company. Aarnes. H. Kulturplanter. Cited Mai-01. Tilgjengelig fra: Spiller, GA (1994). Dietary Fiber in Health and Nutrition.<D> Boca Raton, Florida: CRC Press. Cited Mars- 22. Tilgjengelig fra: Tang S, Knapp S. J. (2002). Microsatellites uncover extraordinary diversity in native American land races and wild populations of cultivated sunflower. Springer- Verlag 35

42 Stine Kooyman Wills, D.M, Hester M. L (2005). Chloroplast SSR polymorphism in the Compositae and the mode of organellar inheritance in Helianthus annus. Mullis, K. B & Fallona, F. A (1987). Spesific synthesis of DNA in vitro via a polymerase- catalyzed chain reaction. Methods in enzymology 155, Dale,J. von Schantz, M. 2002, From genes to genomes. Pp John Wiley & Sons Ltd. Canadian Food Inspection Agency Plant Products Directorate Plant Biosafety Office. Biology Document BIO : The Biology of Helianthus annuusl. Cited Mai- 20. Tilgjengelig fra: #B3 Campbell & Reece (2002) Biology 6 th edition. #3. pp 384.Pearson Benjamin Cummings Publishing Company. Campbell & Reece (2002) Biology 6 th edition, #2. pp Pearson Benjamin Cummings Publishing Company. 36