Resistensbestemmelse av Candida. AFA kurs november 2017 Cecilie Torp Andersen

Transkript

1 Resistensbestemmelse av Candida AFA kurs november 2017 Cecilie Torp Andersen

2 Invasive Candidainfeksjoner Ca 80% av alle invasive soppinfeksjoner Høy syklighet og høy dødlighet >200 candidemier pr.år Ukjent antall invasive infeksjoner uten candidemi og invasive muggsoppinfeksjoner Rask oppstart med riktig soppmiddel reduserer dødligheten Hva er det beste soppmiddelet?

3 Antimykotika Bare 3 klasser Polyener amphotericin B (ulike formuleringer) Azoler Itrakonazol Flukonazol Vorikonazol Posaconazol Isavukonazol Echinocandiner Caspofungin Micafungin Anidulafungin og nucleosidanalogen Flucytocin (uregistrert)

4 Antimykotika Antimykotiske midler interfererer med soppens stadige vedlikehold eller nydanning av cellevegg eller cellemembran. Målet for moduleringen: Ergosterol, som er en vesentlig komponent i soppens cellemembran Beta-1,3-D-glukan i celleveggen Resultatet blir drap av soppen (fungicid )eller hemming av vidre vekst (fungistatisk effekt).

5 Seleksjon Økt forbruk av soppmidler Behandling og profylakse Seleksjon av naturlig resistente stammer Medfører endret epidemiologi Terapisvikt Langvarig behandling medfører fare for ervervet resistens Flukonazol og azoler Echinocandiner Terapisvikt

6 Resistensmekanismer hos sopp I prinsippet de samme som dem man ser hos bakteriene Soppen kan endre målmolekylet nedsette permeabiliteten i cellemembranen oppregulere efflukspumper Danning av enzymer som inaktiverer medikamenter er foreløpig ikke dokumentert hos sopp.

7 Azoler Hemmer ergosterolsyntesen via soppens cytokrom P450 enzym lanosterol 14αdemetylase Medfører defekter i soppcelleveggen. Flukonazol Itrakonazol Vorikonazol Posaconazol Isavukonazol

8 Flukonazol Fungistatisk effekt på mange gjærsopp Resistens Alle aspergillusarter og andre muggsopp Flere candidaarter, bl.a. C krusei, C norvegiensis og C inconspicua er naturlig azolresistente. C glabrata er intermediært følsom eller resistent mot flukonazol

9 Ervervet flukonazolresistens Etter gjentatt eller langvarig behandling med flukonazol hos pasienter med AIDS (øsofagitt) Sjelden ved candidemi 3 hovedgrupper av resistensmekanismer mot azoler hos Candida: endring eller overekspresjon av målmolekyl nedsatt permeabilitet i cellemembranen oppregulering av efflukspumper Ofte er flere resistensmekanismer involvert samtidig

10 Amfotericin B Midlet binder seg til steroler i soppens cellevegg, noe som fører til endring i membranpermeabiliteten og lekkasje av celleinnhold. Fungistatisk eller fungicid effekt avhengig av konsentrasjonen Konvensjonell formulering Liposomal formulering (små fosfolipid«kuler») Når liposomer gis intravenøst, blir amfotericin B frigjort intracellulært etter endocytose.

11 Amfotericin B Antimykotisk spektrum De fleste stammene av Candida, Aspergillus og kryptokokker har MIC 1 mg/l eller lavere. Resistens Primært resistente stammer forekommer sjelden, men resistens kan utvikles under behandling. C.lusitaniae C.guilliermondii A.terreus

12 Echinocandiner Hemmer syntesen av beta-1,3-d-glukan som finnes i celleveggen i de fleste sopparter Midlene har fungicid effekt på candidaarter og fungistatisk effekt på Aspergillus og noen andre sopper. Caspofungin Anidulafungin Micafungin

13 Echinocandinresistens Hos Candida; mutasjoner i FSK1 eller FKS2- genet, som koder for en subenhet av glukansyntetase Vanligst hos C.glabrata C.tropicalis og C.albicans C.parapsilosis har naturlig nedsatt følsomhet pga endringer i målgenet C.guilliermondii er resistent Kryptokokker og Mucorales-arter er naturlig resistente (lite betaglucan i celleveggen)

14 I Norge C.albicans (>65%) 100% fluconazolfølsomhet i invasive isolat Echinocandinresistens er en raritet-enda C.glabrata (15-16%) naturlig nedatt følsomhet for fluconazol Echinocandinresistens er en raritet-enda C.parapsillosis naturlig nedsatt følsomhet for echinocandiner kanskje uten klinisk betydning C.tropicalis og C.dubliniensis oftest følsomme for alle testede midler

15 Problematiske stammer C.krusei C.lusitaniae C.guilliermondii C.norvegiensis C.inconspicua C.auris Multiresistent stamme med potensial for nosokomial smitte- global spredning

16 Strategirapporten 2013 Rask OG riktig artsidentifikasjon kan rettlede kliniker i behandlingsvalg Større laboratorier bør dessuten foreta resistenstesting av invasive candidaisolat med en validert kommersiell test mot flukonazol, amfotericin B og anidulafungin

17 Kromagar Rask identifikasjon av C.albicans og C.tropicalis Hvis trenet øye kan man også skille C. glabrata, C. tropicalis, C. parapsilosis og C. krusei. Maldi TOF gjør livet enklere OBS blandingsinfeksjoner! Vanskelig å se på SAB skåler Fra toppen C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis, C. parapsilosis og C. krusei.

18 Hvilke isolat skal resistensbestemmes? Gjærsoppisolat fra normalt sterile områder og blod I tillegg anbefales resistensbestemmelse av koloniserende flora ved invasive infeksjoner og slimhinneinfeksjoner ved behandlingssvikt gjærsoppisolat som vurderes som klinisk relevante hos pasienter eksponert for antifungale midler

19 Metoder Referansemetode=Gullstandard Buljongfortynning i mikrotiterplate EUCAST CLSI Kommersielle Agarbasert Disk diffusjon med lapper Agardiffusjon med MIC gradient test Mikrodilusjon/Buljongfortynning

20 Referansemetodene EUCAST og CLSI buljongfortynning er IKKE identiske Det har foregått et omfattende harmoniseringsarbeid Resultatet av resistensbestemmelsen, den endelige følsomhetskategoriseringen er, med noen unntak*, uavhengig av hvilken av de 2 referansemetodene som benyttes. *Echinocandiner

21 EUCAST referansemetode Buljongfortynning i mikrotiterplate Visuell eller automatisert avlesning Metoden er arbeidsintensiv og lite hensiktsmessig til bruk i rutinelaboratoriene Ikke brytningspunkt for caspofungin i motsetning til CLSI Anser villtypepopulasjonen til C.parapsillosis og C.guillerimondi som echinocandin intermediær følsom

22 Brytningspunkt for sopp EUCAST har i de senere årene etablert brytningspunkt for de hyppigst forekommende sopparter og de fleste soppmidler.

23 Resistensbestemmelse av sopp Ulike faktorer kan influere på resultatet Valg av medium Tykkelse og ph på mediet Oppbevaring av medier/strips/mikrotiterplater Tillaging av inokulat Inokulatets tetthet Inkubasjonstid Inkubasjonstemperatur Valg av kriterium for avlesning av endepunkt Valg av brytningspunkt CLSI/EUCAST

24 Factors influencing the endpoint Medium (type, brand, batch) CLSI vs. EUCAST: glucose conc. 0.2% vs. 2% Inoculum size the higher the higher the MIC Inoculum growth phase the shorter the lag phase the higher the MIC Incubation temperature affects growth rate, expression of res mechanisms Incubation time the longer the higher the MIC Definition of endpoint (50%, 80%, 100% inhibition) the more stringent the higher the MIC Reading variation visual vs. spectrophotometric trailing M. Cavling Arendrup ssi

25 Kommersielle tester Kommersielle metoder for resistensbestemmelse av sopp er stort sett gode til å påvise resistens, men få resistente stammer i utprøvingen av mange av testene Før en kommersiell test tas i bruk må den valideres, ikke alle drug-bug kombinasjoner fungerer like godt for alle testene.

26 Kommersielle Agarbaserte Disk diffusjon med lapper ROSCO Agardiffusjon med MIC gradient test E-Test biomérieux MIC strips Liofilchem

27 Kommersielle testsystem basert på buljongfortynning Sensititre YeastOne (TREK Diagnostic Systems) Fungitest (BioRad) Micronaut (MERLIN Diagnostika) SensiQuattro Candida EU (Liofilchem) Vitek (BioMérieux)

28 Kommersielle testsystem basert på Mikrodilusjon/buljongfortynning Inkorporert fargeomslag i mediet for visuell eller spektrometrisk avlesning Semi-automatiset avlesning reduserer problemet med subjektiv vurdering av endepunkt Utvalget av antifungale midler og MIC range er gitt (noen produsenter tilbyr å lage etter behov) For noen drug-bug kombinasjoner er det, avhengig av hvilket testsystem som benyttes, ikke i harmoni med aktuelle EUCAST brytningspunkt

29 MIC gradient test Materiale Gjærsoppisolat fra sabouraud glukose-agar. Reagenser Saltvann (0,85% NaCl) RPMI-skåler MIC gradienttest stimler (Etest AB BioMerieux) Utstyr Sterile bomullspensler Sterile reagensrør Sterile engangspipetter Densichek Rotator

30 Resistensbestemmelse av gjærsopp RPMI skål 5 kolonier fra SAB suspensjonen justeres ved hjelp av densichek Candida 0.5 McF Cryptokokker: 1 McF Tove Brastad, bioingeniør, Oslo universitetssykehus

31 Resistenbestemmelse av sopp Suspensjonen helles utover en temperert RPMI skål. Overskytende væske suges opp. Overgang til swabbing i 2017 La skålen stå med lokket av til overflaten er tørr, ca min. Tove Brastad, bioingeniør, Oslo universitetssykehus

32 MIC gradientstrips (E-test) Stripsene til soppresistens kommer i flate fryseforpakninger; oppbevares i fryser (-20ºC) Pass på at de ikke er gått ut på dato og at de har romtemperatur før de åpnes.

33 Resistensbestemmelse avgjærsopp Skålen må være tørr før e-testene legges på. Inkuber skålene i timer ved 35 C i aerob atmosfære i skap med vannbad Kontroller settes opp 1 gang/uke Tove Brastad, bioingeniør, Oslo universitetssykehus

34 Resistensbestemmelse av gjærsopp Tove Brastad, bioingeniør, Oslo universitetssykehus

35 Inkubering Candida sp. inkuberes i t. Rhodotorula sp vokser som regel best ved 28 C. Ved god vekst etter 24 timer leses MICverdier av Skålene reinkuberes i ytterligere 24 timer for å se etter Heteroresistens mot azoler Innvekst av store kolonier i sonene. Ved svak vekst etter 24 timer leses MICverdier av først etter 48 timer. C. neoformans inkuberes i t.

36 Avlesning Flukonazol, Vorikonazol, Itrakonazol, Posakonazol, Caspofungin, Anidulafungin og Micafungin leses av ved 80 % hemning. Flucytosin leses av ved 90 % hemning. Amfotericin B leses av ved 100 % hemning. Det skal ikke være innvekst av noen kolonier i sonen.

37 MIC gradienttest-avlesning kan være vanskelig. Stammer med sterk innvekst i sonen (trailing) kan lett tolkes som resistente. Se egen avlesningsmanual: Etest technical guide 4 Ved store endringer i MIC-verdi ved kontrollavlesning dag 2 bør man vurdere buljongfortynning

38 Fluconazol 80% hemning Ulik grad av vekst i sonen Sjekk overgangen til mindre vekst C.albicans CCUG er en stamme med mye trailing og benyttes til avlesningskontroll

39 Utfordringer AZOLER Resistent? Trailing? Heteroresistens? Uren resistensbestemmelse?

40 Uren res?? Hva er i sonen ID og ny resistensbestemmelse

41 C.krusei Alltid Fluconazol R Ingen brytningspunkt for vorikonszol Kan være kraftig vekst etter 24 timer OBS Amfotericin B kan bli >1 (metodebetinget) R, verifiseres sjelden

42 Amfotericin B 100% hemming Feilkilder Inokulat ph Agardybde Inkubasjonstid C.krusei MIC ofte nær BP

43 Echinocandiner Leser bare av Anidulafungin på kurset 80% hemning Ulik grad av vekst i sonen OBS pasienter som har stått på 2-3 ukers behandling MIC «sniker» seg over BP C.parapsillosis villtypen er alltid intermediær, evt resistent

44 Følsomhetskategorisering EUCAST eller CLSI? Sjekk drug-bug kombinasjoner med den testen dere velger

45 EUCAST

46 Anidulafungin internasjonal MIC distribusjon C.albicans BP;S<0,032 R>0,032

47

48 MICAFUNGIN EUCAST BP C.albicans R>0,016/C.glabrata R> 0,032 Correlation between the EUCAST and Etest methods for in vitro testing of the susceptibility of 933 Candida isolates to micafungin. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2016;60(8),

49 Oppsummering Resistensbestemmelse er ikke alltid nødvendig Det er lite ervervet resistens i Norge Identifikasjon til artsnivå er viktig Veiledende resistensbestemmelse av invasive isolat og isolat fra pasienter som får systemisk soppbehandling bør gjøres lokalt Invasive isolat sendes også til referanselaboratoriet Resistens påvist med en kommersiell metode MÅ verifiseres med EUCAST buljongfortynning og genetisk påvisning, foreløpig sender vi til ssi i København.