GlaxoSmithKline Biologicals s.a. Prosess for rensing av et bakterielt cytolysin.

Transkript

1 O. nr /HNY/EH Patentsøknad nr.: Søker: GlaxoSmithKline Biologicals s.a. Tittel: Prosess for rensing av et bakterielt cytolysin. TRYKNINGSKLARE DOKUMENTER

2 1 1 2 Teknisk område. Foreliggende oppfinnelse vedrører området bakterielt cytolysin-rensing og særlig en fremgangsmåte for rensing av et bakterielt cytolysin. Pneumolysin er et protein fra Streptococcus pneumoniae med gode antigen-egenskaper som er en egnet vaksinebestanddel mot S. pneumoniae-infeksjon eller otitis media. Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen beskriver et uvanlig og fordelaktig trinn med rensing av cytolysin i ett enkelt kromatografi-trinn, ved å binde det til en hydrofob interaksjonskolonne i nærvær av et vaskemiddel og høyt saltinnhold. Prosessen gjør fordelaktig bruk av den egenskapen at bakterielle cytolysiner har høy affinitet til aromatiske forbindelser som ligner kolesterol, særlig når de er i en aggregert tilstand, og vil dermed generelt være anvendelig for rensing av medlemmer av denne familien av toksiner. Tiol-aktiverte cytolysiner danner en fremtredende gruppe av bakterielle toksiner, av hvilke steptolysin O er prototypen (Billington et al FEMS Microbiol. Lett. (00), 182; 197-). Disse toksinene er lytiske overfor eukaryote celler ved dannelsen av porer i cellemembranen. Oksyderende midler påvirker på ugunstig måte deres cytolyse-aktivitet, mens reduksjonsmidler kan gjenopprette aktivitet. Medlemmer av denne gruppen viser -60% likhet når det gjelder primær aminosyresekvens, og inneholder en nesten uforanderlig undecapeptid-sekvens nær C- terminus. Kolesterol er den viktigste målcellereseptoren for disse toksinene. Cytolysiner binder seg til kolesterolholdige membraner og oligomeriseres og danner transmembrane porer opptil nm i diameter og sammensatt av monomerdelenheter. Bindingen av membran-kolesterol bevirker en konformasjonell endring av toksin-monomerer som driver de påfølgende hendelsene med oligomerisering, membran-innsettelse og poredannelse. Streptococcus pneumoniae er det agens som forårsaker flere menneskelige sykdommer, innbefattende pneumoni, bakteriemi, meningitt, otitis media og sinusitt. Noen ganger kan disse sykdommene føre til dødsfall, til tross for at antibiotika er tilgjengelig. Fremveksten av antibiotika-resistente stammer av S. pneumoniae har forverret problemene forårsaket av dette patogenet. I denne sammenhengen er det viktig at effektive vaksiner mot S. pneumoniae blir utviklet. Flerverdige pneumokokk-vaksiner som inneholder rensede kapsel-polysakkarider har vært tilgjengelig i flere år. Deres anvendelse er begrenset av dårlig immunogenisitet særlig hos høyrisikogrupper, innbefattende spedbarn, eldre og

3 2 1 2 de med sigdcelleanemi, multiple myelomer, cirrhose eller alkoholisme. De gir også serotype-spesifikk beskyttelse og kun 23 av 90 kjente serotyper er dekket av eksisterende formuleringer. Dette vil gi beskyttelse mot 90% av serotypene funnet hos USAs befolkning, men kun mot tilnærmet 70% av serotypene funnet hos asiatisk befolkning. Nylig er en konjugert, sjuverdig vaksine blitt tilgjengelig, som likeledes har problemer med å beskytte mot alle pneumokokk-stammene. Pneumolysin (Ply) er et 3 kda thiol-aktivert cytolysin funnet hos alle stammer av S. pneumoniae, som frigjøres ved autolyse og bidrar til patogenesen ved S. pneumoniae. Den er meget konservert, med kun noen få aminosyresubstitusjoner som forekommer mellom Ply-proteinene hos forskjellige serotyper. Pneumolysins høye grad av konservering og dets immunogenisitet gjør det til en potensiell kandidat som vaksinebestanddel. Imidlertid er villtype-ply uegnet for innlemmelse i vaksiner for anvendelse til mennesker, på grunn av dets toksisitet. Ply forårsaker skade på cellemembraner ved å interagere med membranbundet kolesterol og oligomeriseres og danner porer i membranen. Et konservert cysteininneholdende motiv funnet nær C-terminus har vært implisert i lyse-aktiviteten. Mutasjoner av Ply er blitt foreslått for å redusere denne toksisiteten (WO 90/0691, WO 99/03884). En to-trinns fremgangsmåte for rensing av pneumolysin er blitt beskrevet av Lock et al (Microbial Pathogenesis (1996) 21; 71-83). Rekombinant pneumolysin blir renset fra en E. coli-kultur ved anvendelse av en kombinasjon av ionebytte- og gelfiltrerings-kromatografi. Fremgangsmåten innebærer trinnene å fremstille en ekstrakt og føre den ned en DEAE-Sepharose-kolonne, fulgt av en Sephacryl S0-HR-kolonne. Denne fremgangsmåten kan anvendes til å rense rekombinant eller nativt pneumolysin. Kuo et al beskriver en fremgangsmåte for rensing av rekombinant GSTpneumolysin-fusjonsprotein (Infection and Immunity (199) 63; ). Fusjonsproteinet blir uttrykt i en E. coli-kultur og et cellelysat blir satt på en glutationagarosegel. Fusjonsproteinet blir eluert med glutation og thrombin kan anvendes til å spalte fusjonsproteinet. Proteinene ble ført over en glutation-agarosekolonne igjen for å fjerne GST. Det affinitetsrensede pneumolysin ble videre renset ved anvendelse av en hydroksylapatitt-kolonne. Mitchell et al (BBA (1989) 07; 67-72) beskriver en fremgangsmåte for rensing av pneumolysin ved anvendelse av hydrofob interaksjons-kromatografi.

4 3 1 Under betingelsene som de anvender ( mm salt) sviktet pneumolysinet med hensyn til å binde seg tett til kolonnen, selv om dets progresjon var retardert og pneumolysinet ble eluert som en bred topp. Ytterligere trinn for å bestemme hvilke fraksjoner som inneholdt rent pneumolysin, konsentrering av de positive fraksjonene, ny påsetting på kolonnen og eluering med et lite volum av vann, var nødvendig for å overvinne problemet med at pneumolysin ikke binder seg tett til kolonnematerialet. Det gjenstår et fortsatt behov for forbedrede vaksiner mot S. pneumoniae. Innlemmelsen av en Ply-bestanddel gir løfter, selv om toksisiteten til proteinet gjenstår som et problem. Utviklingen av en rask og effektiv prosedyre for masserensing av pneumolysin er også nødvendig. Fremgangsmåter beskrevet tidligere innebærer anvendelse av mange rensetrinn, med analyse- og konsentreringstrinn innimellom. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en mer effektiv rensemetode som fordelaktig anvender ett enkelt kromatografitrinn, som kan anvendes til å rense store satser av pneumolysin. 2 Beskrivelse av figurene. Figur 1: SDS-PAGE-geler viser rensingen av pneumolysin. Følgende prøver ble kjørt på SDS-PAGE-geler: bane 1: molekylvekt-standarder, bane 2: supernatant av celle-ekstrakt, bane 3: fenyl-sepharose-gjennomstrømning, bane 4: fenyl-sepharose første vask, bane : fenyl-sepharose andre vask, bane 6: fenylsepharose-vask med 0,M NaCl, bane 7: fenyl-sepharose-eluering med lav saltbuffer, bane 8: pneumolysin etter denaturering/tilbakefoldingstrinn, bane 9: pneumolysin etter steriliseringsfiltrering. Panel A viser gelen etter coomassie blå-farging. Panel B viser gelen etter en Western blotting-prosedyre ved anvendelse av anti-e. coli-antistoffer for å probe for forurensende proteiner. Figur 2: SDS-PAGE-analyse av GMBS- (N-[ -maleimidobutyryloksy)suksinimidester) modifisert pneumolysin - coomassie blå-farget. Følgende prøver ble kjørt på en SDS-PAGE-gel: bane 1: molekylvektstandarder, bane 2: umodifisert pneumolysin, bane 3: PLY behandlet med GMBS i et molforhold mellom GMBS og lysin på 4:1, bane 4: PLY behandlet med GMBS i et molforhold mellom GMBS og lysin på 4:1 og inkubert i 7 dager ved 37 C, bane

5 4 1 : PLY behandlet med GMBS i et molforhold mellom GMBS og lysin på 8:1, bane 6: PLY behandlet med GMBS i et molforhold mellom GMBS og lysin på 8:1 etter inkubering i 7 dager ved 37 C, bane 7: PLY behandlet med Sulfo-NHS-acetat i et molforhold mellom NHS og lysin på :1, bane 8: PLY behandlet med NEM, bane 9: PLY behandlet med NEM etter 7 dagers inkubering ved 37 C. Figur 3: Toksisitet av GMBS-behandlet pneumolysin gitt intranasalt til mus. Linjen markert med romber indikerer overlevelsesrate for mus utfordret med 2 ug nativt pneumolysin. Linjen markert med firkanter indikerer overlevelsesraten for mus utfordret med ug GMBS-behandlet pneumolysin. Figur 4: Beskyttelse bevirket av GMBS-behandlet pneumolysin hos mus utfordret intranasalt med nativt pneumolysin. Linjen markert med rektangler viser overlevelsesrate for mus inokulert med adjuvans alene. Linjen markert med romber indikerer overlevelsesraten for mus inokulert med nativt pneumolysin. Linjen markert med firkanter indikerer overlevelsesrate for mus inokulert med GMBSbehandlet pneumolysin. Figur : Beskyttelse bevirket av inokulering med PhtD- og GMBS-behandlet pneumolysin hos mus utfordret intranasalt med type 2 D39-pneumokokk-stamme. Linjen markert med rektangler representerer overlevelsesrate for mus inokulert med adjuvans alene. Linjen markert med romber representerer overlevelsesraten for mus inokulert med PhtD. Linjen markert med firkanter representerer overlevelsesraten for mus inokulert med PhtD og GMBS-behandlet pneumolysin. 2 Detaljert beskrivelse. Prosesser. Prosessen ifølge oppfinnelsen er en fremgangsmåte for rensing av et bakterielt cytolysin, så som pneumolysin. Et cytolysin, for eksempel pneumolysin, blir renset ved anvendelse av kun ett enkelt kolonne-kromatografitrinn, uten behov for ny påsetting på kolonnen. Proteinet er bundet i en aggregert form til en hydrofob interaksjonkolonne i nærvær av vaskemiddel og salt. Få proteiner binder seg til kolonnen under disse betingelsene, og tillater rensing av et cytolysin i ett enkelt trinn. For formålene ifølge oppfinnelsen er et løselig aggregat av et cytolysin, fortrinnsvis pneumolysin, en aggregert form av cytolysinet som forblir i supernatanten

6 1 2 etter sentrifugering ved.000 g i minutter. Det løselige aggregatet blir holdt på hydrofobt interaksjons-kromatografimateriale, fortrinnsvis fenyl-sepharose, i nærvær av et høyt saltinnhold, fortrinnsvis 1M. Eventuelt er det løselige aggregatet kolloidalt. Cytolysinet, fortrinnsvis pneumolysin, er bundet til kolonnen som et løselig aggregat. Det er av forskjellige årsaker uvanlig å påsette aggregater på en kolonne, innbefattende tilstopping av filtre eller kolonner og tap av materiale. Imidlertid er det, ved anvendelse av et vaskemiddel som reduserer størrelsen på aggregatene som skal danne et løselig aggregat, funnet at disse aggregatene binder seg tett til kolonnen under betingelser med vaskemiddel, men kan elueres til en renhet på minst 0%, 60%, 70%, 80%, fortrinnsvis 90%, 9%, mer foretrukket 97%, 98% eller 99%, som fastslått ved SDS-PAGE-analyse, uten på ugunstig måte å påvirke kolonnefiltrene. Fremgangsmåten gir fortrinnsvis et utbytte på minst 0, 0, 00, 700, mer foretrukket 00, 100, 1700 eller 1900 mg cytolysin, fortrinnsvis pneumolysin, pr. liter fermentering. Fortrinnsvis blir minst 1%, 2%, %, 7%, 9% eller % av proteinet fra fermenteringskulturen gjenvunnet som renset cytolysin, fortrinnsvis pneumolysin. Prosessen utnytter evnen som cytolysiner, så som pneumolysin, har til å binde seg til kolesterol og andre aromatiske forbindelser. Denne bindingen er spesielt tett når cytolysinet er aggregert, noe som tillater cytolysinet å binde seg i nærvær av et vaskemiddel. Prosessen kan utvides til andre medlemmer av cytolysin-familien, siden alle medlemmene har evnen til å binde seg til aromatiske forbindelser og danne porer. Faktisk kan metoden anvendes til å rense andre familier av proteiner som binder seg til kolesterol eller andre aromatiske forbindelser og/eller danner porer, fortrinnsvis begge deler. Følgelig blir det, i en første utførelsesform, tilveiebragt en prosess for rensing av et bakterielt cytolysin, idet den omfatter trinnene: a) å dyrke en cellekultur som uttrykker bakterielt cytolysin; b) å fremstille et ekstrakt fra kulturen som inneholder bakterielt cytolysin; c) å binde løselig aggregert bakterielt cytolysin som finnes i ekstraktet i nærvær av et vaskemiddel til et hydrofobt interaksjons-kromatografimateriale under betingelser med høyt saltinnhold på 0,6-2 M salt;

7 6 d) å eluere bakterielt cytolysin i nærvær av et vaskemiddel under betingelser med lavt saltinnhold på 0-0,2 M salt. I en andre utførelsesform blir det tilveiebragt en prosess som videre omfatter trinnene: e) å fjerne vaskemiddel fra det bakterielle cytolysinet; f) å solubilisere det bakterielle cytolysinet ved å tilsette et denatureringsmiddel; g) å fjerne denatureringsmidlet fra det bakterielle cytolysinet. 1 2 Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan fordelaktig anvendes til å rense pneumokokk-pneumolysin. Andre cytolysiner som kan renses ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen innbefatter pyolysin fra A. pyogenes, cereolysin fra B. cereus, thuringiolysin O fra B. thuringiensis, laterosporolysin fra B. latersporus, bifermentolysin fra C. bifermentans, botukinolysin fra C. botulinum, chauveolysin fra C. chauvoel, histolyticolysin fra C. histolyticum, oedematolysin fra C. novyi type A, perfringolysin O fra C. perfringens, septicolysin O fra C. septicum, sordellilysin fra C. sordellii, tetanolysin fra C. tetani, ivanolysin O fra L. ivanovi, listeriolysin O fra L. monocytogenes, seeligerilysin O fra L. seeligeri, alveolysin fra P. alvei, streptolysin O fra S. pyogenes, S. canis eller S. equisimilis, intermedilysin fra S. intermedius, suilysin fra S. suis eller pneumolysin fra S. pneumoniae som kan være av villtypen eller være genetisk modifiserte toksiner med lavere nivåer av toksisitet, så som PdA og PdB beskrevet ovenfor. Med pneumolysin eller Ply menes det: nativt pneumolysin fra pneumokokk eller rekombinant pneumolysin, villtype-pneumolysin eller mutanter av pneumolysin (for eksempel dem beskrevet i WO 90/0691 og WO 99/03884). Eventuelt kan pneumolysin også bety et hvilket som helst fragment av pneumolysin eller en hvilken som helst variant av pneumolysin som deler minst 70, 80, 90 eller 9% aminosyresekvens-identitet med en villtype-pneumolysin-sekvens, som fremdeles har evnen til å bli renset ved fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen, slik det lett kan fastslås av en fagperson. I foretrukne utførelsesformer av oppfinnelsen er det samme vaskemidlet til stede i trinn b) og c), b) og d), c) og d), mer foretrukket i trinn b), c) og d), fortrinnsvis i en konsentrasjon på 0,1%-% (vekt/volum). For formålene ifølge opp-

8 7 1 2 finnelsen er et alifatisk vaskemiddel definert som et i det vesentlige alifatisk vaskemiddel med utilstrekkelig aromatisk karakter til å forhindre binding av cytolysin til kolonnen i trinn c). Fortrinnsvis vil vaskemidlet ha én eller flere aromatiske ringer, mest foretrukket har det ingen aromatiske ringer. I løpet av trinn b) er det fordelaktig at vaskemidlet bryter opp større aggregater av cytolysin til mindre aggregater som danner et løselig aggregat. I løpet av trinnene c) og d) beholder vaskemidlet fordelaktig den løselige, aggregerte tilstanden av cytolysinet, noe som tillater det å binde seg til kolonnen, under betingelser med høyt saltinnhold, med høy affinitet. Cytolysinet, fortrinnsvis pneumolysin, blir uttrykt i en kultur av bakterieceller, fortrinnsvis S. pneumoniae, E. coli, eller alternativt i gjærceller, insektceller, pattedyrceller, eller et hvilket som helst annet ekspresjonssystem som er egnet for dets ekspresjon. I ekspresjonssystemer som gir høye utbytter av pneumolysin, blir pneumolysinet ofte aggregert av seg selv, og prosessen ifølge oppfinnelsen er ideéll for rensing av det. Fortrinnsvis blir pneumolysin uttrykt i høye utbytter, slik at det utgjør mer enn 2, 3, 4,, 7 eller % av totalt protein i ekspresjonssystemet. Fortrinnsvis er pneumolysinet i aggregert form, og dermed for det meste fritt for hemolytisk aktivitet. For eksempel er ekspresjon av E. coli i en fermentor under en fag -promoter, eller andre promotere som tillater høy ekspresjon, velkjent for en person med kunnskap på fagområdet. Fortrinnsvis blir cytolysinet ekstrahert fra ekspresjonssystemet som et aggregat. Alternativt kan et ekspresjonssystem med lavere utbytte gi løselig cytolysin. I dette tilfelle blir ekstrakten som inneholder cytolysin, fortrinnsvis pneumolysin, justert til en ph under 7,, noe som tillater cytolysinet å aggregeres i løpet av en periode på minst 8 timer, fortrinnsvis minst 24 timer. Fremstillingen av en ekstrakt i trinn b) innebærer fortrinnsvis ett eller flere trinn med mekanisk ødeleggelse av cellene og/eller behandling av cellene med vaskemiddel. Hvis utført med en fremgangsmåte med høyt utbytte, forblir pneumolysinet i form av aggregater, men aggregatene bør være små nok, slik at de forblir i supernatanten etter sentrifugering av prøven under betingelser som er nødvendig for å pelletere uløselige cellerester. Fortrinnsvis er vaskemidlet anvendt i oppfinnelsen et alifatisk vaskemiddel som ikke inneholder aromatiske ringer, fortrinnsvis et ionisk vaskemiddel, mer foretrukket et kationisk eller anionisk vaskemiddel, og mest foretrukket er vaskemidlet natriumlaurolysarcosinat. Fore-

9 8 1 2 trukne vaskemidler er i stand til å solubilisere pneumolysin, samtidig som de etterlater det i form av små aggregater som binder seg til den hydrofobe interaksjonskolonnen uten å forårsake blokkering av filtre festet til kolonnen. Foretrukne vaskemidler er i stand til å redusere størrelsen på pneumolysin-aggregater, noe som tillater pneumolysin-aggregatene å bli tilstrekkelig små slik at de forblir i supernatanten etter sentrifugering av prøven ved.000 g i minutter. Slike løselige aggregater kan renses som sådanne på den hydrofobe interaksjonskolonnen. Vaskemidlet er til stede i en konsentrasjon på mellom 0,1% og %, fortrinnsvis 0,% og 3% (vekt/volum), fortrinnsvis mellom 0,7% og 2%, mer foretrukket rundt 1%. Fortrinnsvis er vaskemidlet dialyserbart. Etter mekanisk og/eller vaskemiddel-sprengning av kulturen i trinn b), innbefatter prosessen ifølge oppfinnelsen sentrifugering av cellematerialet og oppsamling av supernatanten som ekstrakten som skal påsettes kromatografimaterialet i trinn c). Pneumolysin er fortrinnsvis til stede i supernatanten som et løselig aggregat. Prosessen ifølge oppfinnelsen anvender hydrofob interaksjons-kromatografi for å rense pneumolysin i ett enkelt trinn. Kolonnematerialet anvendt i trinn c) inneholder fortrinnsvis aromatiske grupper, fortrinnsvis fenylgrupper, og er mer foretrukket fenyl-sepharose. Løsningen anvendt i trinn c) og/eller trinn d) under påsetting og eluering av kolonnen, omfatter et ionisk vaskemiddel, fortrinnsvis et kationisk eller anionisk vaskemiddel, fortrinnsvis et vaskemiddel som er løselig ved saltkonsentrasjoner over 0,M, mest foretrukket er vaskemidlet natriumlaurolysarcosinat. Vaskemidlet anvendt er et som vil redusere størrelsen på cytolysin-, fortrinnsvis pneumolysin-, aggregater, noe som tillater at cytolysinet kan være til stede i prøven som et løselig aggregat, slik at det vil binde seg til det hydrofobe interaksjons-kolonnematerialet uten å bli irreversibelt fanget på kolonnen. Vaskemidlet er til stede i en konsentrasjon på fortrinnsvis mellom 0,1% og %, fortrinnsvis 0,% og 3% (vekt/- volum), mer foretrukket mellom 0,7% og 2%, mest foretrukket rundt 1%. Løsningen anvendt i trinn c) og/eller d) inneholder et salt, fortrinnsvis et salt valgt fra gruppen som består av natriumklorid, magnesiumklorid, ammoniumklorid, natriumsulfat, magnesiumsulfat, ammoniumsulfat, natriumfosfat, magnesiumfosfat, ammoniumfosfat, og er fortrinnsvis bufret til ph 6-8, fortrinnsvis rundt ph 7. Enhver buffer som er i stand til å holde ph mellom ph og 9 kan anvendes.

10 9 1 2 Løsningen anvendt til å binde pneumolysin til kolonnen i prosessen ifølge oppfinnelsen inneholder en høy saltkonsentrasjon, fortrinnsvis 0,6-2M, mer foretrukket rundt 1M. Saltkonsentrasjonen er valgt slik at pneumolysin er i en løselig, aggregert form og er i stand til å binde seg til det hydrofobe kromatografimaterialet. Eventuelt kan trinn c) inneholde et ekstra trinn med å vaske kolonnen i mellomliggende saltbetingelser på rundt 0,M salt, eller en saltkonsentrasjon som er i stand til å fjerne eventuelle urenheter som binder seg dårlig. Prosessen ifølge oppfinnelsen anvender en synkende saltgradient til å eluere pneumolysin fra kolonnen. Fortrinnsvis inneholder den lave saltløsningen som anvendes til å danne saltgradienten i trinn d) mellom 0 og 0,1M salt, mer foretrukket 0-40 mm salt. Alternativt kan trinnvis eluering anvendes med den lave saltbufferen anvendt i trinn d), som inneholder mellom 0 og 0,2M salt, mer foretrukket 0-40 mm salt. Valgfrie trinn kan legges til prosessen ifølge oppfinnelsen hvis det er foretrukket å denaturere pneumolysinet og deretter tilbakefolde det ved fjerning av denatureringsmidlet. Disse valgfrie trinnene sikrer at rent cytolysin, fortrinnsvis pneumolysin, med en nativ struktur, blir oppnådd. Det første valgfrie trinnet e) innebærer fjerning av vaskemiddel ved hjelp av diafiltrering, dialyse eller fortynning. Dette trinnet innebærer fortrinnsvis diafiltrering/dialyse mot en buffer med ph 8-, fortrinnsvis rundt 9, idet det er mer foretrukket at bufferen er én som er i stand til å bufre til alkaliske ph-verdier, idet det er mest foretrukket at bufferen er DEA. Løsningen har fortrinnsvis lav ionestyrke, fortrinnsvis -0 mm, mest foretrukket rundt 2 mm. Diafiltrering eller dialyse blir fortrinnsvis utført ved 4 C, men blir alternativt utført ved romtemperatur. I et andre trinn blir cytolysin, fortrinnsvis pneumolysin, denaturert og solubilisert ved tilsetning av et denatureringsmiddel. Fortrinnsvis er denatureringsmidlet anvendt i trinn f) guanidinhydroklorid, mer foretrukket -8M guanidinhydroklorid, mest foretrukket rundt 6M guanidinhydroklorid. Pneumolysinet blir inkubert med guanidinhydroklorid i minst minutter, fortrinnsvis minst 1 time, mer foretrukket i omtrent én time. Cytolysinet, fortrinnsvis pneumolysin, blir deretter fortrinnsvis bragt i kontakt med -9M urinstoff, fortrinnsvis rundt 8M urinstoff, i trinn f). Dette oppnås ved diafiltrering eller dialyse av cytolysinet, fortrinnsvis pneumolysin, mot urinstoff. Fort-

11 1 2 rinnsvis blir den samme bufferen og ph opprettholdt under utvekslingen av denatureringsmiddel. Fortrinnsvis blir et reduksjonsmiddel (DTT, 2-merkaptoetanol eller glutation tilsatt under utvekslingen av denatureringsmiddel. Fortrinnsvis innebærer trinn f) å bringe cytolysin, fortrinnsvis pneumolysin, i kontakt med -8M guanidinhydroklorid, fulgt av utveksling av guanidinhydrokloridet med -9M urinstoff. For å forhindre at det dannes upassende disulfidbindinger mens cytolysinet, fortrinnsvis pneumolysin, blir denaturert, er det fordelaktig å sikre at et reduksjonsmiddel er til stede under minst noe av trinn f) og g). Et foretrukket reduksjonsmiddel er 0,1- mm DTT, fortrinnsvis rundt 1 mm DTT. Alternativt anvendes glutation eller 2-merkaptoetanol. Foretrukket konsentrasjon av glutation er 1-0 mm, mer foretrukket - mm. Valgfritt trinn g) innebærer fjerning av denatureringsmidlet for å tilbakefolde cytolysin, fortrinnsvis pneumolysin, fortrinnsvis ved diafiltrering eller dialyse mot en lav saltbuffer på ph 6-11, fortrinnsvis rundt ph 9. Fortrinnsvis blir cytolysin-, fortrinsvis pneumolysin-, konsentrasjonen opprettholdt på minst 0 ug/ml, fortrinnsvis mellom 0 ug/ml og 00 ug/ml, mer foretrukket på rundt 00 ug/ml. Eventuelt er diafiltrering eller dialyse mot en buffer inneholdende propylenglykol på mellom og %, fortrinnsvis på rundt 1%. Fortrinnsvis blir et reduksjonsmiddel som beskrevet ovenfor opprettholdt i trinn g). Diafiltrering eller dialyse blir fortrinnsvis utført ved 4 C, men blir alternativt utført ved romtemperatur. Et ytterligere, valgfritt trinn h) innebærer fjerning av reduksjonsmidlet etter at cytolysin, fortrinnsvis pneumolysin, er blitt tilbakefoldet. Dette oppnås fortrinnsvis ved diafiltrering eller dialyse mot en lav saltbuffer på ph 6-11, fortrinnsvis rundt ph 9. Eventuelt er diafiltrering eller dialyse mot en buffer inneholdende propylenglykol på mellom og %, fortrinnsvis på rundt 1%. Diafiltrering eller dialyse blir fortrinnsvis utført ved 4 C, men blir alternativt utført ved romtemperatur. I foretrukne fremgangsmåter ifølge oppfinnelsen blir cytolysinet, fortrinnsvis pneumolysin, tilbakefoldet, slik at dets hemolytiske aktivitet blir gjenopprettet til over 2%, 0%, 7%, mest foretrukket til over 90% av den til det riktig foldede proteinet. For formålene ifølge oppfinnelsen, er et foldet protein et protein som har den tertiære strukturen til proteinet dannet ved en ikke-denatureringsprosess. I tilfelle av vill-type-pneumolysin vil den forventede hemolytiske aktivitet til tilbake-

12 11 foldet pneumolysin være hemolyse-enheter/mg pneumolysin. I tilfelle av punktmutert pneumolysin med en lavere hemolyseaktivitet, vil hemolyseaktiviteten til det tilbakefoldede pneumolysin være tilsvarende lavere. 1 2 Detoksifisering av et toksin. Cytolysinet renset ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, fortrinnsvis pneumolysin, kan bli utsatt for et ytterligere, valgfritt trinn med detoksifisering ved kjemisk behandling. Dette ytterligere trinnet er spesielt fordelaktiv hvis cytolysinet, fortrinnsvis pneumolysin, skal administreres til et dyr eller et menneske. Vill-typepneumolysin er meget toksisk. Flere muterte pneumolysin-proteiner er blitt isolert som har redusert toksisitet, men allikevel har disse fremdeles rest-toksisitet som kan være problematisk når penumolysin blir administrert internt (WO 99/03884, WO 90/0691). Alternativt kan det bli detoksifisert ved konjugering til polysakkarider (WO 96/089). Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan detoksifisere enten villtype- eller mutert cytolysin, for eksempel pneumolysin, ved kjemisk behandling. Foretrukne utførelsesformer anvender et kryssbindingsmiddel, mer foretrukket inneholdende ett eller flere kjemikalier valgt fra gruppen som består av formaldehyd, glutaraldehyd og et kryssbindings-reagens inneholdende en N-hydroksysuksinomidoester og/eller en maleimidgruppe (for eksempel GMBS). Detoksifiseringsprosessene er i seg selv et aspekt av oppfinnelsen og kan anvendes til å detoksifisere bakterietoksiner, fortrinnsvis pneumolysin fremstilt med andre fremgangsmåter. I én utførelsesform beskriver detoksifiseringsprosessen ifølge oppfinnelsen detoksifiseringen av et bakterietoksin, som omfatter å behandlet toksinet med en kjemisk forbindelse, fortrinnsvis et kryssbindingsmiddel som er reaktivt, fortrinnsvis preferanse-reaktivt, mest foretrukket spesifikt reaktivt med amingrupper, mer foretrukket primære amingrupper. For formålene for denne oppfinnelsen er et kryssbindingsmiddel definert som en forbindelse med minst to reaktive grupper, hvorav minst én er i stand til å reagere med minst én gruppe i bakterietoksinet. En ytterligere, reaktiv gruppe er i stand til å reagere med enten en gruppe på bakterietoksinet, eller en separat forbindelse (for eksempel en aminosyre, peptid, polypeptid, sukker eller polysakkarid).

13 Fortrinnsvis er den kjemiske forbindelsen eller kryssbindingsmidlet reaktivt, mer foretrukket preferanse-reaktivt, mest foretrukket spesifikt reaktivt med aminog sulhydrylgrupper. Fortrinnsvis reagerer den kjemiske forbindelsen med en primær amingruppe i lysin, mer foretrukket reagerer kryssbindingsmidlet med en primær amingruppe i lysin og sulhydrylgruppen i cystein. Denne fremgangsmåten er spesielt fordelaktig når pneumolysin blir detoksifisert, siden modifisering av både cystein- og lysinrester fører til en synergistisk reduksjon av hemolysenivået, sammenlignet med rest-hemolyseaktiviteten der kryssbindingsreagenset reagerer med bare lysin eller cystein. Således tilveiebringer en alternativ utførelsesform en fremgangsmåte for detoksifisering av bakterietoksiner, som omfatter å modifisere en cysteinrest (eventuelt nær C-terminus til toksinet) som er involvert i den toksiske aktiviteten til toksinet (fortrinnsvis lyse-aktiviteten), som omfatter å behandle toksinet med et kryssbindingsreagens (fortrinnsvis et heterobifunksjonelt kryssbindingsreagens) som kryssbinder sulfhydrylgruppene med en annen aminosyre av toksinet, fortrinnsvis mer enn 2,,, 1,,, 40 aminosyrer bort fra cysteinet i den primære strukturen. Fortrinnsvis inneholder den andre aminosyren en primær amingruppe, og mer foretrukket er aminosyren lysin. I noen utførelsesformer beholder over 0%, 60%, 70%, 80%, 90% eller 9% av toksinet en molekylvekt innen %, %, %, %, 40%, 0%, 60%,70%, 80% eller 90%, mer foretrukket mellom 1 og 0%, mest foretrukket mellom og %, av sin opprinnelige molekylvekt etter behandlingen, som anslått ved hjelp av SDS-PAGE. Fortrinnsvis får toksinet en noe høyere molekylvekt etter detoksifiseringsbehandlingen, på grunn av at flere aminosyrerester blir modifisert ved kovalent binding til den kjemiske forbindelsen. Imidlertid involverer fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen fortrinnsvis ikke omfattende konjugering av toksinet, verken ved kovalent binding av det til andre toksinmolekyler slik at et toksin med en multimer kvaternær struktur blir dannet, eller ved kovalent binding av toksinet til andre store proteiner, polysakkarider eller lipopolysakkarider. Mest foretrukket er fremgangsmåtene, proteinene eller produktene beskrevet i WO 96/089 ikke dekket av denne oppfinnelsen. Fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen kan anvendes til å detoksifisere bakterietoksiner. Foretrukne toksiner innbefatter de tiol-aktiverte cytolysinene pyolysin fra A. pyogenes, cereolysin fra B. cereus, thuringiolysin O fra B. thuringiensis,

14 laterosporolysin fra B. latersporus, bifermentolysin fra C. bifermentans, botukinolysin fra C. botulinum, chauveolysin fra C. chauvoel, histolyticolysin fra C. histolyticum, oedematolysin fra C. novyi type A, perfringolysin O fra C. perfringens, septicolysin O fra C. septicum, sordellilysin fra C. sordellii, tetanolysin fra C. tetani, ivanolysin O fra L. ivanovi, listeriolysin O fra L. monocytogenes, seeligerilysin O fra L. seeligeri, alveolysin fra P. alvei, streptolysin O fra S. pyogenes, S. canis eller S. equisimilis, intermedilysin fra S. intermedius, suilysin fra S. suis eller pneumolysin fra S. pneumoniae som kan være av villtype eller kan være genetisk modifiserte toksiner med lave toksisitetsnivåer, så som PdA og PdB beskrevet ovenfor (WO 90/0691, WO 99/03884). Fremgangsmåten kan også anvendes til å detoksifisere Neisserialtoksinene FrpA, FrpC (WO 92/01460), FrpB (Microbiology 142; , (1996); J. Bacteriol. 181; (1999)) NM-ADPRT (13 th International Pathogenic Neisseria Conference 02 Masignani et al s. 13). FrpA og FrpC inneholder en region som blir konservert mellom disse to proteinene, og et foretrukket fragment av toksinene ville være et polypeptid som inneholder dette konserverte fragmentet, fortrinnsvis omfattende aminosyrer i sekvensen FrpA/C. Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan også anvendes til å detoksifisere Bordetella-toksiner, innbefattende adenylat-cyklase (CyaA) (Glaser (1988) Mol. Microbiol. 2; 19-), dermonekrotisk toksin (Livey (1984) J. Med, Microbiol. 17; 91-3) og pertussis-toksin (PT) (Munoz et al (1981) Infect Immun 33; 8-826). Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er også nyttig for detoksifisering av tetanustoksin (TT) og difteri-toksin (DT) og toksin fra S. aureus og S. epidermidis, innbefattende autolysin og hemolysin (WO 01/98499, WO 02/9148). Fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen fører til en reduksjon av mengden av toksisitet og/eller hemolytisk aktivitet av toksinet på minst 90%, fortrinnsvis 9%, 96%, 98%, 99%, 99,%, 99,9% eller 99,99%. (Hemolytisk aktivitet blir målt ved anvendelse av fremgangsmåten i eksempel 3, og toksisitet kan måles ved fremgangsmåten i eksempel ). Nativt pneumolysin har en hemolytisk aktivitet på enheter pr. mg pneumolysin. Noen punkt-muterte varianter av pneumolysin har redusert toksisitet og hemolytisk aktivitet. Detoksifisering av en variant av pneumolysin er kanskje ikke i stand til å oppnå så stor prosentvis reduksjon av hemolytisk aktivitet, på grunn av det lavere startpunktet som hemoly-

15 tisk aktivitet blir redusert fra, men man forestiller seg at hoveddelen av den gjenværende hemolytiske aktivitet blir fjernet ved fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen. Detoksifiseringstrinnet i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen tilveiebringer fortrinnsvis en kryssbindingsreaksjon som er i det vesentlige ikke-reversibel. Reverserbarhet blir anslått ved overvåkning av nivået av hemolytisk aktivitet av det detoksifiserte toksinet rett etter detoksifisering og etter inkubering ved en temperatur over 2 C, fortrinnsvis over C, mer foretrukket over 3 C, mest foretrukket over 37 C, i minst, 6, 7, 8, 9 eller dager. En i det vesentlige ikke-reverserbar reaksjon resulterer i vesentlig ikke-reversibel detoksifisering, og er definert som en reaksjon hvor nivået av hemolytisk aktivitet stiger med mindre enn 0%, 0%, 40%, %, %, % etter inkubering ved en forhøyet temperatur som beskrevet ovenfor. Mange fremgangsmåter for detoksifisering, for eksempel ved anvendelse av formaldehydbehandling, resulterer i detoksifisering som ikke er stabil, men øker i toksisitet over tid. I et foretrukket detoksifiseringstrinn i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, beholder over 0%, 60%, 70%, 80%, 90%, 9% eller 98% av toksinene en monomer kvaternær struktur etter kryssbindingsreaksjonen. Mange kryssbindingsreagenser danner intermolekylære kryssbindinger (for eksempel formaldehyd og glutaraldehyd). Dette kan påvirke de immunologiske egenskapene til toksinet, siden noen epitoper vil være skjult inne i aggregatet. Fremgangsmåter ifølge oppfinnelsen innebærer fortrinnsvis ganske enkelt å modifisere aminosyrerester, fortrinnsvis sulfhydryl- og/eller primære amingrupper av aminosyrer og/eller dannelse av hovedsakelig intramolekylære kryssbindinger. Den resulterende, monomere, kvaternære struktur tillater at epitoper forblir eksponert på overflaten av toksinet. I en foretrukket utførelsesform av detoksifiseringstrinnet, er kryssbindingsmidlet heterobifunksjonelt. Foretrukne kryssbindingsreagenser inneholder en N- hydroksysuksinimid-estergruppe som reagerer preferensielt, mer foretrukket spesifikt, med primære amingrupper. Fortrinnsvis inneholder kryssbindingsreagenset en maleimidgruppe som reagerer preferensielt, mer foretrukket spesifikt, med sulfhydrylgrupper. Ved en ph rundt 7 reagerer en maleimidgruppe 00 ganger raskere med sulfhydrylgrupper enn den gjør med aminer. Fortrinnsvis inneholder kryssbindingsreagenset både en N-hydroksysuksinimid-estergruppe og en malei-

16 1 1 2 midgruppe. Kryssbindingsmidlet er fortrinnsvis ikke spaltbart ved anvendelse av et reduksjonsmiddel, siden dette fører til mindre effektiv detoksifisering. Avstanden mellom de reaktive gruppene i kryssbindingsreagenset er i stand til å påvirke effektiviteten av detoksifiseringen. Fortrinnsvis er avstanden mellom gruppene i kryssbindingsreagenset som er reaktivt med amin- og sulfhydrylgrupper mellom 1, og Ångstrøm, mer foretrukket mellom og 1 Ångstrøm, og mest foretrukket rundt Ångstrøm, i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Fortrinnsvis blir aminosyrerestene på det bakterielle toksinet modifisert ved tilsetning av en gruppe som er over, 7,, 12, 1, 18,, 0, 0, 00 Ångstrøm lang. Fortrinnsvis er modifiseringsgruppen mellom og 0 Ångstrøm, mer foretrukket mellom og Ångstrøm av størrelse. Detoksifiseringstrinnet i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen tillater at tilstrekkelige rester blir modifisert, slik at sterisk interferens og/eller konformasjonelle endringer hemmer funksjonen til bakterietoksinet. Fortrinnsvis blir minst, 7,, 12, 14, 1, eller 2 aminosyrerester av bakterietoksinet modifisert. Når uomsatte maleimidgrupper er til stede på kryssbindingsreagenset, kan en Ellmanreaksjon anvendes til å anslå (indirekte) antall kryssbindingsmolekyler som er bundet til hvert toksinmolekyl (Ellman 199 Arch. Biochem. Biophys. 82; 70). Foretrukne kryssbindingsreagenser er SMPT, Sulfo-LC-SMPT, Sulfo- KMUS, LC-SMCC, KMUA, Sulfo-LC-SPDP, LC-SPDP, SMPB, Sulfo-SMPB, SMPH, Sulfo-SMCC, SMCC, SIAB, Sulfo-SIAB, GMBS (N-( -maleimidobutyryloksy)suksinimidester), Sulfo-GMBS, MBS, Sulfo-MBS, Sulfo-EMCS, EMCA, EMCS, BMPS, SPDP, SBAP, BMPA, AMAS, SATP og SIA (Pierce). I en foretrukket fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen blir toksinet behandlet med den kjemiske forbindelsen eller kryssbindingsreagenset under ph-betingelser på mellom,0 og 9,0, fortrinnsvis 6, til 8,0, mest foretrukket 7,0 til 7,8. I behandlinger hvor omsetningen av en maleimidgruppe til en sulfhydrylgruppe blir befordret, er den foretrukne ph ved omsetningen 6,0 og 8,0, mer foretrukket 6, og 7,. Den foretrukne konsentrasjonen av salter under omsetningen er mellom 0 mm og 1M, mer foretrukket 10 mm og 00 mm, mest foretrukket mellom 0 mm og 0 mm. Imidlertid har oppfinnerne funnet at det noen ganger er foretrukket å utføre omsetningen ved en lav saltkonsentrasjon hvor ikke noe natriumklorid eller annet salt er tilsatt. Når omsetningen blir utført ved en ph på mellom 7,6 og 7,8, kan omsetningen eventuelt bli utført uten tilsetning av salt. Likeledes kan anven-

17 delsen av høyere forhold mellom GMBS og toksin utføres uten tilsetning av salt ved ph-verdier mellom 7,0 og 8,0. Fortrinnsvis blir et 0-00, mer foretrukket 1- eller -900, mest foretrukket rundt ganger molart overskudd av den kjemiske forbindelsen eller kryssbindingsreagenset i forhold til hvert toksin anvendt. Pneumokokk-pneumolysin inneholder 31 lysinrester. Derfor er et 248 ganger molart overskudd av kjemisk forbindelse eller kryssbindingsreagens i forhold til pneumolysin ekvivalent med et 8 ganger molart overskudd av kjemisk forbindelse eller kryssbindingsreagens i forhold til hver lysinrest. Fortrinnsvis anvendes et 2-, mer foretrukket et 4-1 eller 1-, mest foretrukket rundt 8 ganger molart forhold mellom kjemisk forbindelse eller kryssbindingsmiddel og lysinrester i fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen. Behandlingen med kryssbindingsreagens foregår i minst 1 minutter, fortrinnsvis i minst minutter, mest foretrukket rundt én time, ved mellom 4 C og 40 C, fortrinnsvis mellom 1 C og 2 C, mest foretrukket ved romtemperatur. Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan videre omfatte et behandlings- ( quenching ) trinn ved anvendelse av en forbindelse som inneholder en sulfhydrylgruppe, fortrinnsvis har behandlingsforbindelsen en molekylvekt på over 0, 0 eller 1, og mer foretrukket er behandlingsreagenset en aminosyre, så som cystein. Alternativt kan gruppen bli omsatt med en peptid- eller polysakkarid-enhet som er i stand til å reagere med maleimid, for eksempel et peptid inneholdende en cysteinrest. Dette er spesielt passende der en uomsatt maleimidgruppe er til stede før behandlingstrinnet. Detoksifiseringstrinnet er egnet for anvendelse på bakterietoksiner som beskrevet ovenfor. Fortrinnsvis er bakterietoksinet fra Streptococcus pneumoniae, mest foretrukket er toksinet pneumolysin. Pneumolysinet er et nativt eller rekombinant protein, eller et protein som er blitt genetisk konstruert for å redusere dets toksisitet (som beskrevet ovenfor). Fusjonsproteiner av toksiner, fortrinnsvis pneumolysin eller fragmenter av toksiner, fortrinnsvis pneumolysin, kan detoksifiseres ved anvendelse av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Således, i en foretrukket utførelsesform, blir et toksin (så som pneumolysin) detoksifisert med et kryssbindingsreagens som fortrinnsvis er heterobifunksjonelt og som har grupper som er reaktive med lysin- og cysteinrester og som har en

18 17 1 viss størrelse, og har mest foretrukket de reaktive gruppene i en avstand på - Ångstrøm fra hverandre, slik at ett eller begge av følgende skjer: a) mellom og, fortrinnsvis rundt aminosyrerester av toksinet blir modifisert ved hjelp av et kryssbindingsmolekyl som kovalent binder seg fortrinnsvis til en lysin- eller argininrest (fortrinnsvis, som målt indirekte ved en Ellman-reaksjon), idet den andre enden er blitt behandlet (fortrinnsvis med cystein) og/eller; b) en cystein-sidekjede involvert i den toksiske aktiviteten til toksinet (fortrinnsvis mot C-terminus av toksinet) blir kryssbundet til en annen sidekjede av toksinet (fortrinnsvis til en lysin- eller argininrest) som fortrinnsvis er skilt med mer enn 2,,,, eller 40 aminosyrer fra cysteinresten i den primære sekvensen av toksinet. I en ytterligere, foretrukket utførelsesform blir et toksin (fortrinnsvis pneumolysin) detoksifisert med en monofunksjonell, kjemisk forbindelse som fortrinnsvis reagerer med aminosyrer som inneholder en primær amingruppe, mer foretrukket lysin, og som har en viss størrelse, mest foretrukket -0 Ångstrøm, slik at toksinet blir dekket med mellom og, mer foretrukket rundt 14 kjemiske forbindelser bundet til aminosyrerester. 2 Polysakkaridkonjugater. Et problem forbundet med polysakkarid-tilnærming til vaksinering, er det faktum at polysakkarider per se er dårlige immunogener. For å overvinne dette, kan polysakkarider bli konjugert til proteinbærere, som gir tilskuer-t-cellehjelp. Prosessen ifølge oppfinnelsen kan fordelaktig inneholde et ytterligere trinn med konjugering av cytolysinet, fortrinnsvis pneumolysin, til et bakterie-polysakkarid, for eksempel et lipo-oligosakkarid, eller fortrinnsvis et kapsel-polysakkarid. En foretrukket konjugat ifølge oppfinnelsen omfatter cytolysin, fortrinnsvis pneumolysin oppnådd ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, konjugert til kapsel-polysakkarider avledet fra Streptococcus pneumoniae. Pnemokokk-kapselpolysakkarid-antigenene er fortrinnsvis valgt fra serotyper 1, 2, 3, 4,, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, A, 11A, 12F, 14, 1B, 17F, 18C, 19A, 19F,, 22F, 23F og 33F (mest foretrukket fra serotyper 1, 3, 4,, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F og 23F), eller blandinger av to eller flere av de nevnte konjugatene (4, 7, 9, 11, 13 eller 23).

19 18 1 Cytolysin, fortrinnsvis pneumolysin, renset ved prosessen ifølge oppfinnelsen, blir også fortrinnsvis konjugert til kapsel-polysakkarider fra andre stammer av bakterier. Slike polysakkarider kan være isolert fra for eksempel H. influenzae, H. influenzae type B (Hib), N. meningitidis-grupper A, C, W, Y, streptokokker forskjellig fra S. pneumoniae (for eksempel gruppe B-streptokokker, S. pyogenes, etc.), stafylokokker (for eksempel S. aureus, S. epidermidis), E. coli, enterokokker (for eksempel E. faecalis og E. facecium), etc. Fortrinnsvis er polysakkaridene fra H. influenzae type B (Hib), og/eller N. meningitidis-grupper A, C, W13 og/eller Y. Polysakkaridet kan bli bundet til cytolysin, fortrinnsvis pneumolysin, ved en hvilken som helst kjent metode (for eksempel av Likhite, US-patent nr og av Armor et al., US-patent nr ). Fortrinnsvis blir CDAP-konjugering utført (WO 9/08348). For å øke immunogenisiteten kan polysakkaridene bli tilsatt adjuvans ( adjuvanted ) og/eller lyofilisert. Polysakkaridene ifølge oppfinnelsen kan være i full størrelse, eller få en størrelse etter rensingen som mindre polysakkarider eller oligosakkarider. Prosessen ifølge oppfinnelsen omfatter fortrinnsvis et ytterligere trinn med å formulere cytolysin, fortrinnsvis pneumolysin, til en vaksine. 2 Proteiner og immunogene preparater. Et pneumolysin-bakteriekapsel-polysakkaridkonjugat kan bli dannet ved prosessen ifølge oppfinnelsen. Et immunogent preparat som omfatter cytolysin, fortrinnsvis pneumolysin eller pneumolysin-bakteriekapsel-polysakkarid kan bli oppnådd ved prosessen ifølge oppfinnelsen (som beskrevet ovenfor). Det immunogene preparatet kan videre omfatte fortrinnsvis ett eller flere medlemmer av pneumokokk-cholinbindingsprotein-familien, fortrinnsvis cholinbindingsprotein A eller et immunogent fragment derav, og/eller ett eller flere medlemmer av polyhistidin-triad-familien (innbefattende fusjonsproteiner derav), fortrinnsvis PhtA, PhtB, PhtD eller PhtE, eller et immunogent fragment derav. Vedrørende Choline Binding Protein-familien (CbpX), ble medlemmer av denne familien opprinnelig identifisert som pneumokokk-proteiner som kunne renses ved cholin-affinitetskromatografi. Alle cholinbindingsproteinene er ikke-kovalent bundet til fosforylcholin-enheter av cellevegg- teichoic -syre og membranbundet lipo- teichoic -syre. Strukturelt har de flere regioner felles i hele familien,

20 selv om den nøyaktige naturen til proteinene (aminosyresekvens, lengde, etc.) kan variere. Generelt omfatter cholinbindingsproteiner en N-terminal region (N), konserverte repetisjonsregioner (R1 og/eller R2), en prolin-rik region (P) og en konservert cholinbindingsregion (C), som utgjøres av multiple repetisjoner, som omfatter tilnærmet den ene halvparten av proteinet. Som anvendt i denne søknaden, er betegnelsen Choline Binding Protein-familie (CbpX) valgt fra gruppen som består av Choline Binding Protein er som identifisert i WO 97/4111, PbcA, SpsA, PspC, CbpA, CbpD og CbpG. CbpA er beskrevet i WO 97/4111. CbpD og CbpG er beskrevet i WO 00/ PspC er beskrevet i WO 97/ PbcA er beskrevet i WO 98/ SpsA er et Choline-bindingsprotein beskrevet i WO 98/3940. Fortrinnsvis er Choline Binding Protein er valgt fra gruppen som består av CbpA, PbcA, SpsA og PspC. En annen, foretrukket utførelsesform er CbpX-trunkater hvor CbpX er definert ovenfor og trunkater refererer til CbpX-proteiner som mangler 0% eller mer av Choline-bindingsregionen (C). Fortrinnsvis mangler slike proteiner hele cholinbindingsregionen. Mer foretrukket mangler slike protein-trunkater (i) cholinbindingsregionen og (ii) en del av den N-terminale halvparten av proteinet også, men bibeholder likevel minst én repetisjonsregion (R1 eller R2). Enda mer foretrukket har trunkatet 2 repetisjonsregioner (R1 og R2), mer foretrukket bibeholder trunkatet den prolinrike regionen (P). Eksempler på slike foretrukne utførelsesformer er NR1xR2 og R1xR2, som illustrert i WO 99/1266 eller WO 99/1188 og NR1XR2P, men andre cholinbindingsproteiner som mangler en lik cholinbindingsregion er også beskrevet. LytX-familien er membranbunde proteiner forbundet med cellelyse. Det N- terminale domenet omfatter cholinbindingsdomene(r), men LytX-familien har ikke alle trekkene som er å finne hos CbpA-familien angitt ovenfor, og således anses LytX-familien som forskjellig fra CbpX-familien. I motsetning til CbpX-familien, inneholder det C-terminale domenet det katalytiske domenet til LytX-proteinfamilien. Familien omfatter LytA, B og C. Med hensyn til LytX-familien, er LytA beskrevet i Ronda et al., Eur J Biochem, 164: (1987). LytB er beskrevet i WO 98/189, og er også referert til som Sp46. LytC er også beskrevet i WO 98/189, og er også referert til som Sp91. Et foretrukket medlem av denne familien er LytC.

21 1 2 En annen, foretrukket utførelsesform er LytX-trunkater hvor LytX er definert ovenfor og trunkater refererer til LytX-proteiner som mangler 0% eller mer av Choline-bindingsregionen. Fortrinnsvis mangler slike proteiner hele cholinbindingsregionen. Et eksempel på slike trunkater er å finne i eksempeldelen i denne oppfinnelsen. Videre er CbpX-trunkat-LytX-trunkat-kimære proteiner (eller fusjoner) beskrevet. Fortrinnsvis omfatter dette NR1xR2 (eller R1xR2, eller NR1XR2P) av CbpX og den C-terminale delen (Cterm, dvs. mangler cholinbindingsdomenene) i LytX (for eksempel LytCCterm eller Sp91Cterm). Mer foretrukket er CbpX valgt fra gruppen som består av CbpA, PbcA, SpsA og PspC. Enda mer foretrukket er det CbpA. Fortrinnsvis er LytX LytC (også referert til som Sp91). Videre er et PspA eller PsaA, eller trunkater som mangler cholinbindingsdomenet (C), eventuelt uttrykt som et fusjonsprotein med LytX beskrevet. Fortrinnsvis er LytX LytC. Pht- (Poly Histidine Triad) familien omfatter proteiner PhtA, PhtB, PhtD og PhtE. Familien er kjennetegnet ved en lipidasjonssekvens, to domener adskilt av en prolinrik region og flere histidin-triader, muligens involvert i metall- eller nukleosidbinding eller enzymatisk aktivitet, (3-)-kveilede kveile-regioner, en konservert N-terminus og en heterogen C-terminus. Den er til stede i alle stammer av pneumokokker som er testet. Homologe proteiner er også blitt funnet i andre Streptococci og Neisseria. Foretrukne medlemmer av familien omfatter PhtA, PhtB og PhtD. Mer foretrukket omfatter den PhtA eller PhtD. Det skal imidlertid forstås at betegnelsene Pht A, B, D og E refererer til proteiner som har sekvenser beskrevet i publikasjonene nedenfor, så vel som naturlig forekommende (og menneskelagde) varianter derav som har en sekvenshomologi som er minst 90% identisk med de refererte proteinene. Fortrinnsvis er den minst 9% identisk, og mest foretrukket er den minst 97% identisk. De immunogene preparatene beskrevet kan innlemme fusjonsproteiner av histidin-triad-proteiner. Foretrukne fusjonsproteiner inneholder i) PhtD eller et fragment derav bundet til PhtE eller et fragment derav, eller ii) PhtB eller et fragment derav bundet til PhtE eller et fragment derav. Med hensyn til PhtX-proteiner, er PhtA beskrevet i WO 98/189, og er også referert til Sp36. Som angitt ovenfor, er det et protein fra polyhistidin-triadfamilien, og har type II-signalmotivet til LXXC.

22 PhtD er beskrevet i WO 00/37, og er også referert til Sp036D. Som angitt ovenfor, er det også et protein fra polyhistidin-triad-familien, og har type II LXXC-signalmotivet. PhtB er beskrevet i WO 00/37, og er også referert til Sp036B. Et annen medlem av PhtB-familien er C3-Degrading Polypeptidet, som beskrevet i WO 00/ Dette proteinet er også fra polyhistidin-triad-familien, og har type II LXXC-signalmotivet. En foretrukket, immunologisk, funksjonell ekvivalent er proteinet SP42 beskrevet i WO 98/189. Et PhtB-trunkat (tilnærmet 79 kd) er beskrevet i WO 99/167, som også betraktes som et medlem av PhtXfamilien. PhtE er beskrevet i WO 00/299, og er referert til som BVH-3. For å frembringe et immunogent preparat som er i stand til å utløse en immunrespons mot mer enn ett patogen involvert i otitis media, er det fordelaktig for immunogene preparater å ytterligere omfatte et antigen fra én eller flere (2, 3, 4,, 6) av S. pneumoniae, ikke-typbar ( non-typable ) Haemophilus influenzae Moraxella catarrhalis, RSV, parainfluensa-virus og/eller influensavirus. Kombinasjonsvaksiner som gir beskyttelse mot en rekke forskjellige patogener kan dannes. Mange pediatriske vaksiner gis nå som en kombinasjonsvaksine, for å redusere antall injeksjoner som et barn må få. Således kan, for pediatriske vaksiner, andre antigener fra andre patogener bli formulert med vaksinene. For eksempel kan vaksinene bli formulert med (eller administrert separat, men samtidig) den velkjente treverdige kombinasjonsvaksinen som omfatter Diphtheria toxoid (DT), tetanus-toxoid (TT), og pertussis-bestanddeler [typisk detoksifisert Pertussis-toxoid (PT) og filamentært hemagglutinin (FHA) med valgfritt pertactin (PRN) og/eller agglutinin 1+2], for eksempel den markedsførte vaksinen INFANRIX- DTPa TM (SmithKlineBeecham Biologicals) som inneholder DT-, TT-, PT-, FHA- og PRN-antigener, eller med en helcelle-pertussis-bestanddel, for eksempel som markedsført av SmithKlineBeecham Biologicals s.a., som Tritanrix TM. Den kombinerte vaksinen kan også inneholde et annet antigen, så som Hepatitt B-overflateantigen (HBsAg), Poliovirus-antigener (for eksempel inaktivert, treverdig poliovirus IPV), ytre Moraxella catarrhalis-membranproteiner, ikke-typbar Haemophilus influenzae-proteiner, ytre N. meningitidis B-membranproteiner. Eksempler på foretrukne Moraxella catarrhalis-protein-antigener som kan innbefattes i en kombinasjonsvaksine (spesielt for å forhindre otitis media) er: OMP6 [WO 97/41731 (Antex) & WO 96/34960 (PMC)]; OMP21; LbpA &/eller