Emne SIF 4070 Cellebiologi V2001 Labøving nr 1: Lysmikroskopi. Labøving nr. 1 LYSMIKROSKOPI

Transkript

1 Oppgavens mål: Labøving nr. 1 LYSMIKROSKOPI Gjøre studentene kjent med følgende aspekt av lysmikroskopi (LM): - Köhlers belysningsprinsipp - Lysfelt LM - Mørkefelt LM - Fasekontrast avbildning - Interferenskontrast avbilding 1

2 Lysmikroskopi (LM) Mye brukt til studier av levende celler. Nærmest en æressak for en biofysiker å kunne dette med lysmikroskopi ut og inn. Historikk Første lysmikroskop: Hans og Zaccharias Jansen ( ). Deres LM i prinsippet svært likt dagens LM, men pga linse kvalitet maks forstørrelse 20X - 30X: Objektlinse Øye Netthinne Objekt Reelt bilde Fokusering Lupe/okular Reelt bilde Anton van Leeuvenhock ( ): Stor personlighet innen LM studier av biologiske prøver. Han gjorde en rekke viktige oppdagelser innen celle- og mikrobiologi ved bruk av enkel linse, egentlig ei lupe. Hans hemmelighet bestod i sliping av asfæriske linseflater med lav aberrasjon. Forstørrelse 50X 300X. Det gikk mer enn ett hundre år før det ble rapportert arbeider med tilsvarende detaljrikdom. Carl Zeiss og E. Abbe (1886): Første apokromatiske linse, lateral oppløsning ca 0.2 µm som er nær det teoretisk sett maks oppnåelige. Teorien for geometrisk avbildning i LM nær fullt utviklet rundt For å få dannet et bilde trengs: Tilstrekkelig lateral oppløsning. Tilstrekkelig amplitudekontrast i det reelle bildet på netthinna i øyet. Fritz Zernike (1935): Utviklet fasekontrast LM. Fikk nobelprisen i 1953 for dette arbeidet. Nomarski (1969): Differensiell interferenskontrast Hoffmann (1975): Modulasjonskontrast 2

3 I løpet av siste halvdel av årene en ny teknologisk revolusjon innen LM: [I] Bruk av videokamera til registrering av bilde i stede for øyet eller film. [a] økt følsomhet (nattsikte utstyr fra det millitære) [b] Elektronisk økning av kontrast [II] Bruk av så kalt konfokal belysning av prøven ved hjelp av laser. [a] Skarp avbildning av tynne utvalgte snitt selv i tykke prøver. Standard moderne lysmikroskop Under er et Olympus invert mikroskop vist 3

4 Köhlers belysningsprinsipp 1 Lyskilden avbildes ved hjelp av kollektoren i aperturblenderen 2 Feltblenderen avbildes vha kondensor i objektet 3 Aperturblenderen plasseres i fokalplanet til kondensoren Strålegangen ved Köhlers belysning er vist i figuren under. a) Parallelle stråler gjennom objektet kommer fra samme punkt i lyskilden b) Parallelt lys fra kilden går gjennom samme punkt i objektet 4

5 Følgende viktige parametre er uavhengig justerbare når Köhlers belysningsprinsipp benyttes: Hvor stor del av objektet som belyses (pkt 2 over) Lateral oppløsning (θ (pkt 3 over)) Lysintensiteten inn på netthinna NB! punkt 3 påvirker også hvor lyst bildet virker. Pkt 3 skal imidlertid ikke benyttes til dette. Lysintensiteten skal varieres ved å variere spenningen på lyskilden. Lateral oppløsning Lateral oppløsning gir hvor tett punkter kan ligge i objektet og fortsatt sees som adskilte punkter i bildet. Lateral oppløsning er bestemt av: inn Maks vinkel ( θ ) mellom optisk akse og lys inn på objektet Brytningsindeksen, n k, mellom kondensor og objekt Maks vinkel θ mellom optisk akse og lys inn på objektivet ut Brytningsindeks, n 0, mellom objektiv og objekt. Objektiv ut θ Objekt ut θ y ut θ inn θ inn θ n0 inn θ Kondensor Betingelse for at gitterlinjene kan oppøses i bildet er at første konstruktive interferensmaksimum fanges opp av objektivet, dvs at y n inn sin θ inn + y n ut sin θ ut λ hvor λ er lysets bølgelengde. Dette gir: λ ymin = NA k + NA O hvor inn NA = sin θ = kondensorens numeriske apertur NA k n inn = O n ut ut sin θ = objektivets numeriske apertur 5

6 Ved lysmikroskopi er belysningen vanlgvis inkoherent og NA k =NA o. Ved inkoherent lys vil Raleights kriterium gjelde slik at den laterale opplsningen er gitt ved λ amin = NA Imersjonsobjektiv: spesialobjektiv laget for bruk av olje (imersjonsolje) med gitt brytningsindeks. Gode oljeimmersjons objektiv har NA=1.4. Dette fører til a min 0.2 µm for synlig lys med bølgelende 500 nm. Netthinnas laterale oppløsning 20 µm. Bruk av totalforstørrelse større enn 20 µm/0.2 µm= 100 tilfører derfor ingen ny informasjon til netthinna. Forstørrelsen av bildet utover det som svarer til netthinnas oppløsning kalles gjerne tom forstørrelse. Aksial oppløsning (Dybdeskarphet). Aksial oppløsning (dybdeskarphet) gir hvor tykt sjikt av objektet som avbildes skarpt, og er gitt ved: 2 λ D = 2 n sin θ I praksis desto høyere lateral oppløsning desto tynnere sjikt av objektet avbildes klart. For 100X imersjonsobjektiv er tykkelsen på dette skiktet ofte 0.5 1µm. I mange sammenhenger er dette svært uhensiktsmessig slik at oftest er et 40X ikke imersjonsobjektiv det mest hensiktsmessige. Mørkefelts mikroskopi Mørkefelts LM gir i prinsippet samme informasjon som lysfelt LM, men med invertert/negativ kontrast. Objektiv Direktestrålen fanges ikke opp av objektivet Objektplan Mørkefeltblender Innfallende lys Skjematisk illustrasjon av prinsippet for mørkefeltkontrast 6

7 Amplitudekontrast Både øyet og fotografisk film registrerer kun intensitets forskjeller over et bilde, dvs variasjoner i lysets amplitude, men ikke fase. I LM av biologiske prøver oppnås økt amplitudekontrast ved hjelp av selektiv farging. Fasekontrast Betrakt objekt som er transparent, ingen absorbsjon, men som har varierende brytningsindeks. Lys strålene I, II og III har samme amplitude inn som ut av objektet, men fasen til strålene vil kunne være forskjellig. Øyet eller en fotografisk film vil ikke registrere dette til tross for at objektet gir opphav til fasekontrast. I fasekontrast-, interferenskontrast- og modulasjonskontrastbasert-optikk blir disse faseforskjellene omgjort til amplitude kontrast. Faseobjekt som vist i figuren blir dermed synlige. I II III Fasekontrastmikroskopi ble utvikelt av Fritz Zernike i Arbeidet ble i 1953 belønnet med en Nobelpris. Fasekontrast oppnåes ved å benytte seg av En ringformet aperturblender i kondensoren til et standard lysmikroskop som er innstilt etter Köhlers belysnings prinsipp. En glassplate med en delvisgjennomskinnelig ring plassert i objektivets bakre fokalplan. Plata er videre slik utformet at lys som passerer denne ringen får en faseforskyvning π/2 relativt lys som passerer gjennom plate utenfor denne ringen. Mekanismene for bildedannelse for fasekontrast lysmikroskopi kan beregnes ved bruk av transferfunksjoner (Fourieranalyse). Hovedprinsippene kan imidlertid enkelt illustreres ved hjelp av vektor representasjon av fasen til lyset. Resultant Spredt lys Direktestråle Situasjon rett etter passering av objektet. 7

8 Fokallengde f Modulator Objektivlinse Objekt Fokallengde f Kondensorlinse Ringformet aperturblender Fra lyskilden Illustrasjon av apertur / modulator og lysvei i fasekontrast LM Ved rent faseobjekt vil lysintensiteten etter passering av objektet være: jϕ = 1+ ϕ 1+ ϕ ; når ϕ<<1. Ved 90 = π/2 dreining av direktestrålen og dempning med en faktor α får vi 2 α Direktestråle etter dreining og demping ϕ Direktestråle 8

9 I = ( α + ϕ ) 2 I I min 4 K = 1 2 ϕ ( I + I ) α når en har antatt ϕ = - ϕ min. min Fasekontrast lysmikroskopi er idag i utstrakt bruk når det gjelder studier av biologiske prøver. Dette har sammenheng med at den er enkel i bruk samtidig som det ekstrautstyr som kreves for å kunne benytte metoden er relativt rimelig i anskaffelse. Den eneste justeringen en bruker av et fasekontrast lysmikroskop vil måtte foreta i tillegg til de vanlige innstillingene, er å sentrere den ringformede aperturblenderen slik at bildet av den i objektivlinsas fokalplan faller sammen med faseringen i dette planet. Til dette trenges en kikkert som plasseres hvor okularet normalt er plassert og som er fokusert på objektivets bakre fokalplan. Med en slik hjelpekikkert kan brukeren direkte kontrollere om bildet av den ringformede aperturblenderen faller sammen med faseringen i objektivets fokalplan og eventuelt foreta en justering av aperturblenderens sentrering. Differensiell interferenskontrast Denne metoden ble utviklet av Nomarski (1969) og blir derfor ofte også referert til som Nomarski optikk. Hovedkomponentene ved differensiell interferenskontrast lysmikroskopi er vist i figuren på neste side. Anta monokromatisk lys inn på polarisatoren. Lysstrålen ut fra λ/4-plata vil bestå av to komponenter med polarisasjonsplan normalt hverandre, med relativ amplitude avhengig av vinkelposisjonen til polarisatoren relativt hovedaksene til λ/4-plata og med en faseforskjell mellom de to komponentene på π/2. De optiske aksene til λ/4-plata er orientert parallelle til de optiske hovedaksene til Wollaston prismene W 1 og W 2. Etter passasje gjennom Wollaston prismet W 1 og kondensoren vil de to komponentene S og S fra en og samme stråle S i ha fått en lateral separasjon x i. I praksis dimensjoneres det hele slik at alle x i er mindre enn oppløsningen til objektivet. Etter passasje gjennom objektet vil S og S ha fått en forskjell i fase lik φ(x). Etter passasje gjennom W 2 vil komponentene S og S igjen være koaksiale, men da den elektriske feltvektoren til S og S står normalt på hverandre vil de to komponentene ikke kunne interferere med hverandre. Etter passasje gjennom analysatoren derimot vil det nå planpolariserte lyset ha bidrag både fra S og S og man får interferens. Det forutsettes her at hovedaksen til analysatoren står 45 på hovedaksene til Wollaston prismene. Intensiteten i billedplanet pga stråle S er I A ( ωt + φ ) + A sin ( ωt φ ) sin + hvor symboliserer tidsmiddel. 9

10 Billedplan (reelt bilde i okularets synsfelt) Fokallengde Linse Analysator Fokallengde Wollastonprisme W 2 Objektiv Objektplan Fokallengde Kondensor Wollastonprisme W 1 λ-plate λ/4-plate Polarisator (roterbar) P 10

11 Når avstanden mellom strålene med de ulike polarisasjonsretningen er små, kan en skrive: φ( x) φ( x) x x For små ( φ( x) x) x kan en tilnærme sinus leddet med funksjonsverdien: φ( x) I x x og siden x er en instrumentkonstant, finner en at intensitetsvariasjonen er proporsjonal med den deriverte av objektets fase. Tidligere fant vi at for fasekontrast var I φ(x), og ikke den deriverte mht stedskoordinaten. φ( x) φ( x) Kontrasten i et objekt hvor = er: x x min I A A I min φ( x) K = 2 = 2 sin x 2 2 I + I min A + A x A = 2 A A + A 1 φ ( x) sin x x Her merker man seg at K ikke bare er bestemt av [ φ ( x) x], men også av A A og dermed vinkelposisjonen til polarisatoren P. Videre merker man seg at tolkningen av bildet φ( x ) x x 0, π 2. Det vil si at preparatet må ikke ha i billedplanet bare er enkel om [ ] [ ] altfor store fasegradienter. Det er ellers verdt å merke seg at φ(x) i noen utstrekning gjenspeiler de dobbeltbrytende egenskapene til objektet. I utledningen av uttrykket over for K ble det benyttet at λ/4-plata ga opphav til en relativ faseendring på π/2 mellom de to komponentene til lyset som kommer ut av W 1. Dersom denne fasedifferansen hadde vært forskjellig fra π/2 ville en ha fått ett annet uttrykk for K. Ved at man plasserer en λ-plate mellom polarisatoren og W 1 vil en for hvitt lys få at for en rekke bølgelengder vil den relative faseendringen være signifikant forskjellig fra π/2. Dette medfører i praksis at bildet blir sammensatt av en rekke bilder med forskjellig farge og kontrast. Bruk av λ-plate fører til at man får et farget bilde hvor fargene i bildet avhenger av vinkelposisjonen til polarisatoren og φ(x). Med differensiell interferenskontrast system kan man altså ved avbildning av objekt som er fullstendig uten amplitudekontrast for alle bølgelengder få et bilde av objektet som ikke bare inneholder gråtoner, men også farger. F.eks. kan man få kromosomene i en ufarget levende celle uten amplitudekontrast til å se ut som om kromosomene f.eks. er rødfaget! Differentiell interferenskontrast lysmikroskopi er derfor en meget elegant og slagkraftig 11

12 metode for studier av levende celler, men det nødvendige tilleggsutstyret er enda relativt kostbart. Av figuren foran følger også et meget viktig praktisk poeng som har sammenheng med at de optiske hovedaksene til W 1 og W 2 må være orientert paralelt med hverandre. Siden W 2 sitter i objektivet betyr dette at orienteringen til objektivet i et differensielt interferenskontrast mikroskop ikke er likegyldig. Dette innebærer at interferenskontrast objektivene ikke må tas ut av objektivholderne og f.eks. settes over til andre holdere. Orienteringen av interferenskontrast objektivene er nemlig justert av fabrikanten og lakkforseglet. Bryter man denne forseglingen er det i praksis meget vanselig uten spesialutstyr å få det hele skikkelig innjustert igjen. Konklusjon: Interferenskontrast objektiver må ikke løsnes eller skrues ut av objektivholderne! 12

13 Prøvepreparering Prøvepreparering for lysmikroskopi omfatter en rekke fremgangsmåter. Vi vil ikke detaljere alle muligheter som finnes her, men kun gi litt generell informasjon Utstryk Prepareringen består her i all enkelhet i at prøven legges på et objektglass, strykes til en tynn hinne f.eks. med et annet objektglass og så eventuelt dekkes med et dekkglass. Pga sin enkelhet er denne metoden meget brukt ved rutinestudier av enkelt celler i suspensjon, f.eks. blodceller. Fremstilling av vevssnitt Biologisk vev lar seg normalt ikke kutte i tilstrekkelig tynne skiver til at skivene kan studeres i standard lysmikroskopi. Problemet er at de fleste biologiske vev er så bløte at de gir etter for knivtrykket når en forsøker å skjære et tynt snitt og resultatet blir at vevet tar mer eller mindre skade. Den vanligste måten å unngå dette problemet på er ved å infiltrere vevet med ett eller annet støtte medium som etter infiltreringen kan gå over fra væskeform til fast form. Ved riktig valg av infiltreringsmedium vil en som regel kunne oppnå en prøve som tåler knivtrykket og som lar seg snitte i tilstrekkelig tynne skiver. Det historisk sett mest brukte infiltrasjonsmaterialet ved fremstilling av vevssnitt for lysmikroskopi, er vanlig parafin. I de senere år er det imidlertid også blitt tatt i bruk en rekke syntetiske polymerer som infiltreringsmedium. Fiksering En rekke av de vanlige infiltreringsmediene er ikke vannløselige. Dette gjelder f.eks. parafin. For å kunne infiltrere et støtte medium som paraffin er det derfor nødvendig å erstatte vannet i vevet med et organisk løsningsmiddel som f.eks. toluen. Dette gjøres normalt ved å gå vegen om etanol for så å erstatte etanolen med toluen. Dette ville imidlertid virke sterkt ødeleggende på de fleste vev om man ikke før infiltrering stabiliserte vevet på en eller annen måte. En slik stabilisering av vevet er et av hovedformålene med det som vanligvis refereres til som fiksering av vev. De ideelle fordringer til et fikseringsmiddel: 1 Inaktiverere enzym og da spesiellt de som fører til autokatalytiske forandringer av vevet. 2 Gjøre alle komponentene i vevet uløselige slik at de ikke på et senere trinn i behandlingen kan vaskes bort. 3 Endre cellemembranpermeabiliteten slik at en ikke får osmotisk svelling eller krymping i vevet under den påfølgende behandlingen. 4 Gjøre vev hardere slik at det lettere kan kuttes i tynne snitt med eller uten tilsats av støttemedium. 5 Beskytte vevet mot bakterie og soppangrep 6 Gi endringer i vevet som gjør at vevssnittene blir lettere å studere (gir bedre kontrast) i lysmikroskopet. 13

14 Få eller ingen fiksativer oppfyller alle disse ideelle fordringer i alle typer vev. Når det gjelder fiksering for lysmikroskopi har en lang rekke forskjellige fiksativer og fiksativblandinger vært brukt opp gjennom årene. De fleste av disse fiksativene virker ved at de denaturerer og koagulerer proteinene i vevet og dermed gjør de uløselige. Her kan nevnes fikseringsmiddel som metanol, etanol, salpetersyre, trikloreddiksyre, kvikksølvklorid, pikninsyre (NB! eksplosjonsfarlig) og kromsyre. I en rekke av de generelle klassiske fiksativeene for lysmikroskopi inngår en eller flere av disse fikseringsmidlene som viktige komponenter. Det gjelder f.eks. mye brukte fikseringsløsninger som Zenker, Carnoy og Bouin fikserings løsning. I de senere år har man gått stadig mere over til å bruke ikke-koagulerende, men denaturerende fiksativer som Osmium tetraokysd, kalium dichromat, formaldehyd og glutaraldehyd. Disse fiksativene virker ved at de gir opphav til kjemiske reaksjoner som resulterer delvis i danning av nye kovalente bindinger og delvis i endring av eksisterende kovalente bindinger i vevet. Et fiksativ som glutaraldehyd har vist seg særlig vel egnet ved at det stabiliserer celler og vev ved å gi opphav til nye tverrbindinger: Protein-CH 2 -NH 2 + Glutaraldehyd H 2 N-CH 2 -Protein H Protein CH 2 N C H (CH 2 ) 3 C N CH 2 Protein Shiff-baser Formaldehyd er ofte foretrukket ved fiksering av større vevsbiter for lysmikroskopi da formaldehyd diffunderer raskere inn i vev enn glutaraldehyd. Støttemedium Da de fleste vanlige støttemedier ikke er vannløselige, må man ofte erstatte vannet i prøven med f.eks. etanol i første omgang deretter erstattes etanol med toluen eller propyloksyd. Erstattningen (substitueringen) av vann med etanol foregår enten ved seriesubstitusjon eller frysesublimering. Trinnene ved seriesubstitusjon: Fiksering av vev 30% EtOH 70% EtOH 90% EtOH 96% EtOH 100% EtOH Hvor lenge vevet plasseres i de forskjellige løsningene avhenger av vevsbitenes størrelse og type. Typiske verdier for vevsbiter for lysmikroskopi er 2-4 timer pr. trinn. 14

15 Ved frysesublimering fryses vevsbiten raskt og plasseres i 100 % EtOH ved 80 C. Isen løser seg da sakte opp og resultatet er ofte en meget god bevaring av morfologi. Etter at vevet er kommet over i EtOH skiftes så EtOH ut med feks toluen hvorpå prøven plasseres i parafin. Etter at parafin har fullstendig infiltrert prøven kjøles prøven raskt ned, og den vil da være klar for snitting. Ved bruk av herdeplast, f.eks. araldit, som støttemedium er fremgangsmåten svært lik den som er beskrevet ovenfor. Ved bruk av vannløselig støttemedium som f.eks. gelatin kan infiltreringen foregå direkte i vanndig miljø uten å måtte gå om organiske løsningsmidler. Snitting Til snitting av vevsbiter i støttemedium brukes normalt et spesialkonstruert snitteinstrument med automatisk mating av vevsbiten mellom hvert snitt og med innstillbar snitt tykkelse. Disse instrumentene kalles mikrotomer. Ved bruk av paraffin som støttemedium kan man normalt relativt lett komme ned til snitt-tykkelser på ned til ca. 4-5 µm. Ved bruk av herdeplast som støttemedium er det mulig å fremstille vesentlig tynnere snitt. I en del tilfeller er det ønskelig å kunne snitte vevet uten på forhånd å måtte utsette vevet for den forbehandling som er beskrevet tidligere. I tillegg er prepareringer beskrevet over meget tidkrevende (strekker seg over flere dager). En måte å omgå dette problemet på er ved først å fryse vevsbiten raskt og så foreta snitting av den frosne prøven med kald mikrotom kniv. Denne fremgangsmåten gir oftest heller dårlig bevaring av detaljene i vevsmorfologien i større vevsbiter, men den er ofte benyttet i samband med: 1. Undersøkelser av prøver tatt fra en pasient under en operasjon, hvor man ønsker å få resultatet av den histologiske undersøkelsen før man går videre med operasjonen eller eventuelt avslutter den (metoden gir resultat i løpet av minutter). 2. Autoradiografi av diffunderbare substanser 3. Preparering av snitt for immunomerking 4. Histokjemi Farging De fleste typer vev er fargeløse slik at de er nødvendig å farge vevssnittene for at de skal få tilstrekkelig kontrast. Ideelt ønsker man å kunne gi de forskjellige cellekomponentene ulik farge for derved å lette lokalisering og identifisering av de forskjellige cellekomponentene. En stor del av de fargestoffene som blir benyttet til histologisk farging binder seg til de ulike delene av vevet pga ladningsvekselvirkninger. Forenklet kan man derfor betrakte et biologisk vev som en samling enheter som delvis oppfører seg som anionske og delvis som kationske ionebyttere. Et anionsk fargestoff som eosin (rødt) binder seg til kationske deler av vevet, mens et kationsk fargestoff som metylenblått binder seg til anionske deler av vevet. Farging med slike stoffer vil være sterkt avhengig av ph i prøven. 15

16 Noen fargestoffer fordeler seg i vevet ved partisjon, det vil si etter feks lipidløselighete. Et slik fargestoff som farger lipider er Nilblått. Andre fargestoffer gjennomgår spesifikke kjemiske reakjoner. Et klassisk eksempel på dette er Fenlgen farging. Fargestoffet som brukes er Fuchsin: NH 2 CH 3 H C NH 2 NH 2 Aminogruppene vil danne Schiffbaser med aldehyder, og dette fører til endret elektronstruktur i det konjugerte ringsystemet noe som resulterer i sterk absorbsjon av blått lys. Fuchsin gir derfor sterk rødfarge til vev som inneholder mange frie aldehydgrupper. Dette kan f.eks nyttes til å påvise DNA (etter oksydering av ribose med periodsyre). Histokjemi I lista over ideelle krav til fiksativer var nevnt inaktivering av enzymer. I visse tilfeller ønsker man imidlertid å bevare aktiviteten til visse enzymer og bruke dette til å lokalisere de i vevssnittene. Frysesublimering viser seg ofte å være en hensiktsmessig måte å starte prepareringen av slike snitt med. Klassiske eksempler på histokjemisk lokalisering av enzymer: [a] Lokalisering av sur fosfatase: Na glyserofosfat + Pb( NO PO [b] Lokalisering av ravsyre dehydrogenase (hvit felling) sur fosfatase 3 ) 2 glycerol + NaNO3 + Pb3 ( 4 ) 2 Pb 3 PO4) 2 + ( NH4) 2S PbS + ( NH4) 3 ( PO svart felling 4 Ravsyre dehydrogenase HOOC CH 2 CH 2 COOH HOOC C C COOH 2 H + FAD FADH 2 FADH 2 + tetrazolium FAD + formazansalt H H Rødbrun felling når ravsyre dehydrogenase er tilstede 16

17 Autoradiografi Dette er en mikroskopisk metode for påvisning av hvor i objektet eventuelle radioaktive elementer befinner seg. Deteksjon av radioaktivitet foregår ved at man over prøven plasserer en fotografisk film (emulusjon): Fotografisk emulsjon Objektglass Område i emulsjon med sølvkrom Objekt (snitt) Radioaktivt område Oppløsningen ved autoradiografi er i hovedsak bestemt av rekkevidden til den radioaktive strålingen fra de radioaktive elementene: Isotop Rekkevidde 32 P 5-10 µm 14 C 2-5 µm 35 S 2-5 µm 3 H 0.5-1µm 125 I 0.5-1µm I praksis et meget viktig poeng er at de radioaktive elementene må ikke kunne vaskes ut og/eller reassorteres under prepareringen av snittet og påleggingen av den fotografiske emulusjon. Autoradiografi av diffunderbare stoffer kan utføres ved å foreta frysesnitting og bruke tørr film istedet for emulusjon, men dette er en prosedyre som krever nøyaktighet og erfaring for å kunne utføres pålitelig. Riktig utført er det imidlertid en meget slagkraftig metode. 17

18 OPPGAVE Innstilling av mikroskopet i følge Köhlers belysningsprinsipp 1. Innstill kondensor for lysfelt Fokuser på et farget histologisk preparat med 40x objektivet. Lukk feltblenderen,og avbild feltblenderen i objektplanet ved å justere kondensoren (feltblenderen ses da skarpt) Sentrer feltblenderen i objektet Åpne feltblenderen slik at åpningen akkurat fyller bildefeltet. Når disse punktene er gjennomført er feltblenderen innstilt for normal bruk av mikroskopet (for å gi maksimal kontrast) Hva er fordelen med denne innstillingen av instrumentet hvis man f.eks. har et nesten fargeløst preparat som det kan være vanskelig å fokusere / finne? 2. Reduserer kondensorens aperturblender. Hvordan forandres bildet når aperturen endres, og hvorfor endres bildet? 3. Lag et preparat med plateepitelceller fra spytt. Observer i vanlig lysfelt og fasekontrast. Beskriv forskjellen mellom vanlig lysfelt og fasekontrast mikroskopi. 4. Observer det samme bildet ved hjelp av differensiell interferenskontrast. Juster polarisatoren. Hva ser du når polarisatoren dreies? Beskriv forskjellen mellom fasekontrast og differensiell interferenskontrast. Sett inn λ-plata og drei på polarisatoren. Beskriv det du nå observerer. 5. Innstill mikroskopet på mørkefelt mikroskopi. Juster apperturblenderen Hva ser du? 18