IMMUNTERAPI MOT KREFT

Transkript

1 IMMUNTERAPI MOT KREFT Thor Brevik kull V12 En prosjektoppgave ved Det Medisinske Fakultet Veileder: Erik Dissen UNIVERSITET I OSLO Februar 2017

2 INNHOLDSFORTEGNELSE ABSTRACT... 3 METODE... 3 IMMUNTERAPI MOT KREFT... 4 KREFT... 4 IMMUNFORSVARETS ROLLE VED KREFT... 5 KREFTCELLER KAN UNNSLIPPE IMMUNFORSVARET... 7 ANTISTOFFBASERT IMMUNTERAPI... 9 IMMUNSJEKKPUNKT-TERAPI CTLA4 OG PD CTLA4-HEMMERE SOM KREFTTERAPI PD-1-HEMMERE SOM KREFTTERAPI BIVIRKNINGER KOMBINASJONSTERAPI CAR-CELLETERAPI TUMORVAKSINER IMMUNTERAPI I FREMTIDEN REFERANSELISTE

3 Abstract Cancer is the second most common cause of death in Norway. The calculated lifetime risk of developing cancer is 36 % for men and 29 % for women. The traditional cancer therapies surgery, chemotherapy and radiation in many cases are insufficient to cure cancer, with considerable adverse effects. Thus, one has been looking for new therapeutic approaches for cancer. This project thesis reviews current literature concerning cancer immunotherapy, including basic mechanisms in immunology and tumor development as well as clinical studies. Examples of novel immunotherapies, such as antibody based immunotherapy, immune checkpoint inhibitors, chimeric antigen receptor T-cell therapy and cancer vaccines are discussed. The study is based on a nonsystematic literature search in PubMed which includes reviews and original articles. For many years, immunotherapy has been regarded as potentially promising, but also with a degree of skepticism regarding its efficiency. However, recent advances in technology and increased insight into basic immune and cancer immune evasion have changed this. The journal Science highlighted cancer immunotherapy as Breakthrough of the Year for Although the main purpose of the immune system is to protect against pathogenic microorganisms, it also plays an important role against cancer. Cancer immunotherapy builds upon natural antitumor immune mechanisms, to harness and boost the effects against cancer. Because of its specificity and capacity for memory, immunotherapy against cancer have the potential to achieve complete, long-lasting remissions. Now considered the fourth main therapy against cancer, new immunotherapies are launched at a rapid pace, offering considerable improvements over previous therapies in several types of cancer. Metode Denne oppgaven følger formatet til en oversiktsartikkel. Arbeidet med oppgaven tok sikte på å dekke over både basale immunologiske mekanismer og data fra kliniske studier. I dette feltet har det vært kort vei fra ny innsikt i grunnforskning til klinisk utprøving og etablering av immunterapier som godkjent behandling. Oppgaven baserer seg på et ikke-systematisk søk og utvalg av artikler. Systematiske stikkordsledede søk er ikke velegnet til å dekke over et så stort fagfelt. Et enkelt søk i PubMed-databasen med søkeord checkpoint inhibitor gav 6816 treff, og et søk på PD-1 gav 4995 treff. Det finnes altså svært mye faglitteratur om temaene. Jeg har derfor tatt utgangspunkt i oversiktsartikler fra anerkjente tidsskrift og forfattere, og deretter lest originalartikler som disse har henvist til. I noen tilfeller der ulike artikler tenderer til å vise motstridende resultater er dette kort diskutert. Det finnes mange ulike terapiformer ved immunterapi, men jeg har valgt å kun beskrive noen av dem i en viss detalj; antistoffbasert immunterapi, immunsjekkpunkt-terapi, CAR-celleterapi og tumorvaksiner. I tillegg inneholder oppgaven en gjennomgang av basale mekanismer ved tumorutvikling, immunovervåkning mot kreft og kreftcellers mekanismer for å unnslippe immunsystemet. 3

4 Immunterapi mot kreft Kreft Kreft er den nest vanligste dødsårsaken i Norge. Omlag dør årlig av sykdommen. De vanligste kreftformene i Norge er prostata-, bryst- og føflekkreft. Lungekreft er den mest alvorlige krefttypen, målt etter antall døde, og er ansvarlig for 1 av 5 kreftrelaterte dødsfall. Beregnet livstidsrisiko for å få kreft er 36 % for menn og 29 % for kvinner. Tre av fire krefttilfeller diagnostiseres hos pasienter over 60 år(1). Karsinogenese er en kompleks prosess med flere trinn der en enkelt celle med mutert DNA ikke dør når den skal (redusert apoptose) eller deler seg for mye (mangel på normale kontrollmekanismer). Mutasjoner er endringer i DNA. Det inkluderer substitusjoner, insersjoner, delesjoner, rekombinasjoner og kromosomale translokasjoner(2). Det er et mye større antall mutasjoner hos kreftceller enn hos normale celler. Dette forklares ved at kreftceller utviser mutatorfenotype, blant annet med mangler i DNA-reparasjonsmaskineriet. Mutasjonene oppstår tilfeldig (spontane mutasjoner) i genomet og ikke etter et fast mønster(3). En celle trenger flere uavhengige mutasjoner for å utvikle en malign svulst(2). Kreftcellene kan vokse på stedet eller spre seg videre til andre steder i kroppen via blod eller lymfe. Hyppige metastaseringsstasjoner er lymfeknuter, skjelett, lever, lunge og hjerne. Det er to hovedklasser av gener som bidrar til malign transformasjon når de muteres; protoonokogener og tumorsuppressorgener. Onkogener er muterte protoonkogener, og kan bidra til kreft gjennom økt nivå eller aktivitet av genproduktet. Mutasjon i tumorsuppressorgener kan bidra til kreft hvis de medfører at genproduktets normale funksjon tapes. En hovedgrunn til at det er vanskelig å behandle kreft er at kreftceller utviser heterogenitet. Det gjelder for alle fenotypiske egenskaper som cellulær morfologi, genekspresjon, metabolisme, immunogenitet og potensiale for proliferasjon og metastasering. Det er heterogenitet mellom ulike pasienter (interpasient-heterogenitet), men også hos den enkelte pasient (intertumor-heterogenitet), og hos tumoren selv (intratumor-heterogenitet). Dette gjør det vanskeligere å sette en helt korrekt diagnose og vurdere prognose. Cellulær genetisk heterogenitet er forskjeller hos de enkelte kreftcellene. Klonal genetisk heterogenitet er forskjeller som oppstår etter klonal ekspansjon(4). Ved tumorevolusjon gjennomgår kreftcellepopulasjonen en seleksjonsprosess. Det er ulike modeller for tumorevolusjon. Lineær evolusjon er at mutasjoner oppstår lineært i en stegvis prosess som driver maligniteten videre. De nyeste mutasjonene bidrar til at nye kreftceller utkonkurrerer de gamle og erstatter disse. Det gir lite heterogenitet. Grenevolusjon er at kreftcellenes kloner stammer fra samme opprinnelse og utvikles parallelt. Mutasjonene oppstår tilfeldig grunnet genomisk instabilitet. Det resulterer i flere populasjoner med subkloner, og derfor stor heterogenitet. Nøytral evolusjon er en ekstremvariant av grenevolusjon, men uten seleksjon av de sterkeste klonene, og derfor enda større heterogenitet. Punktuert evolusjon er at de fleste mutasjonene skjer tidlig i tumorprogresjonen og resulterer i en eller få dominerende kloner(5). I alle vev finnes det stamceller som er selvfornyende og gjennomgår celledifferensiering. Voksne stamceller er multipotente og har muligheten til å utvikle seg til ulike typer celler. Mye tyder på at dette også kan gjelde for kreftceller, såkalte kreft-stamceller. De representerer en liten subpopulasjon som er ansvarlige for opprettholdelse av tumorvekst og spredning. Kreft-stamceller er også mer resistente mot kjemoterapi og stråling enn andre tumorceller. 4

5 Seleksjon av de individuelle kreftcellene som er mest levedyktige gjør at kreftcellene kan forandre seg slik at de kan unngå kroppens immunforsvar, eller påvirke immunceller til å sende hemmende signaler til hverandre(4, 6). Klassiske behandlingsmetoder mot kreft er kirurgi, stråling og kjemoterapi. Kirurgi er effektivt hvis en vet akkurat hvor tumoren er lokalisert og at den er tilgjengelig for kirurgi. En er avhengig av frie reseksjonsrender og full fjerning av tumoren. Gjenværende maligne celler vil kunne utvikle nye svulster eller spre seg til andre organer. Stråling og kjemoterapi tar utgangspunkt i å skade celler som er i aktiv deling. Kreftceller deler seg ofte hurtig, og er derfor mer følsomme enn de fleste andre celler. Disse terapiformene skader også normale celler, spesielt i vev med rask celledeling, som i hårsekker, tarmepitel og benmarg. Det kan gi håravfall, diare, tarmskader, redusert antall immunceller og anemi. Bivirkningene begrenser behandlingen, og en har derfor lett etter nye behandlingsmuligheter mot kreft. Immunterapi tar utgangspunkt i å utnytte og manipulere kroppens eget immunforsvar for å bekjempe kreftcellene. Med forbedret teknologi og en bedre forståelse av mekanismer i immunforsvaret er immunterapi mot kreft en raskt voksende behandlingsmetode. Immunforsvarets rolle ved kreft Hovedfunksjonen til immunforsvaret er å beskytte kroppen mot patogene mikroorganismer. Det skal fjerne døde og skadede celler, og reparere skadet vev. Hovedsakelig deles immunforsvaret inn i to deler; det medfødte immunforsvaret og det adaptive immunforsvaret. Immunforsvaret har i tillegg i oppgave å beskytte mot kreft. En metode er å oppdage molekylære endringer på overflaten av kreftceller. Dette kalles immunovervåking og involverer både det medfødte og det adaptive immunforsvaret. Immunforsvaret vil også beskytte verten mot virusinfeksjon og kan derfor hindre virusinduserte tumorer. Eliminering av patogener forhindrer utvikling av et kronisk inflammatorisk miljø, som ville fasilitere karsinogenese. Immunforsvaret kan også bekjempe kreftceller direkte ved at lymfocytter i det adaptive immunforsvaret gjenkjenner ligander uttrykt på kreftcellene. Det medfødte immunforsvaret er et førstelinjeforsvar mot patogene mikroorganismer. Patogener elimineres gjennom fagocytose eller toksiske mekanismer som for eksempel komplementmediert lyse. Intracellulære infeksjoner bekjempes ved at infiserte celler drepes av NK-celler (naturlige drepeceller). Alle NK-celler er CD56-positive(+) og CD3-negative(-). De uttrykker både aktiverende og inhibitoriske reseptorer. Eksempler på aktiverende reseptorer er NKp30, NKG2D (som også finnes på noen T-celler) og DNAM-1. Eksempler på inhibitoriske reseptorer er CD94/NKG2A, KIR2DL1-3 og KIR3DL1. Det finnes over 30 ulike reseptorer, og hver enkelt NK-celle uttrykker kun et fåtall av disse. Ved å ha begge typer reseptorer vil cellene oppnå en balanse med både aktiverende og inhiberende signaler som kan gi toleranse ovenfor friske celler og en rask respons mot syke celler(2). I modningsprosessen får enkelte NK-celler en inhibitorisk reseptor som gjenkjenner MHC. Hvis en NK-celle treffer en syk celle med redusert MHC-uttrykk vil signalene til de inhibitoriske reseptorene kunne være svakere enn de aktiverende, slik at NK-cellen dreper den syke cellen. NK-celler kan derfor oppdage patologisk endring i MHC klasse I-ekspresjon. KIR-familien gjenkjenner polymorfe epitoper av HLA-A, -B og C. Den aktiverende reseptoren NKG2D gjenkjenner stressinduserte molekyler (MICA, MICB og ULBP 1-4). Disse stressligandene uttrykkes på overflaten ved intracellulær infeksjon eller andre forstyrrelser i cellens homeostase(2). 5

6 Det adaptive immunforsvaret består av T-celler og B-celler. Ved en adaptiv immunrespons må patogen-spesifikke lymfocytter gjennomgå klonal seleksjon og ekspansjon. Etter en adaptiv respons vil enkelte av disse lymfocyttene bli igjen i kroppen som hukommelsesceller og gi langvarig immunologisk beskyttelse mot patogenet. MHC-molekyler presenterer peptider for T-celler. De binder til antigen-peptid inne i cellen og bringer det til overflaten. Der vil en spesifikk T-celle-reseptor kunne gjenkjenne og binde peptid-mhc komplekset. MHC klasse I presenterer peptider hovedsakelig fra intracellulære proteiner mens MHC klasse II presenterer peptider fra ekstracellulære patogener, tatt opp ved endocytose eller fagocytose. T-celler aktiveres når en T-celle-reseptor gjenkjenner et kompleks med MHC og peptid-antigen på en dendrittisk celle. T-cellene vil da gjennomgå proliferasjon og differensiering. CD8 + T-celle vil binde MHC I. CD4 + T-celle vil binde MHC II(2). Aktivering av naive T-celler foregår gjennom to ulike hendelser som skjer samtidig. Den første (signal 1) er at T-celle reseptor binder til MHC med peptid, og utløser en aktiverende signalvei. Den andre (signal 2) skjer gjennom et ko-stimulerende signal. Det kan for eksempel være CD28 på T-cellen mot CD80 eller CD86 på den antigenpresenterende cellen. Signal 1 og 2 er begge nødvendige for å aktivere T-cellen, som produserer IL-2 for å drive aktivering og proliferasjon videre (signal 3)(7). Sentralt i kontakten mellom immunceller og målceller/antigenpresenterende celler er dannelsen av en immunologisk synapse. En immunologisk synapse drar relevante membranmolekyler inn både på immuncellesiden og på målsiden. For T-celler inkluderer dette signal 1 og 2, og adhesjonsmolekyler som for eksempel integrinet LFA1 mot IgSF-molekylet ICAM på målcellen. Dette er en aktiv og dynamisk mekanisme som gjør at T-celler kan skille mellom ulike celler og avgjøre utfallet av kontakten(8). Hele dynamikken i synapsedannelsen er ikke fullstendig kartlagt, men involverer ulike signalveier intracellulært. NK-celler, T-celler og B-celler må forstå sine omgivelser på en korrekt måte. Derfor har de to klasser av overflatereseptorer; aktiverende reseptorer og inhibitoriske reseptorer. De aktiverende reseptorene skrur på effektormaskineriet hos cellene, og de inhibitoriske reseptorene blokkerer denne aktiveringen. Målet er å kunne beskytte verten ved samtidig å opprettholde immunologisk toleranse og å unngå autoimmune sykdommer. Immunsjekkpunkt-molekyler kontrollerer T-celle-respons ved å skru på eller av signaler. Balansen mellom positive og negative signaler bestemmer immunforsvarets respons(2). De komplekse responsene er avhengige av to korte motiver som finnes i det intracellulære domenet hos signalerende proteiner. De kalles ITAM (immunreseptor tyrosin-basert aktiverende motiv) og ITIM (immunreseptor tyrosin-basert inhibitorisk motiv). ITAM finnes blant annet i CD3 og NK-celle-reseptorkomplekser. ITAM blir fosforylert og rekrutterer og aktiverer tyrosinkinasene Syk og Zap 70, som aktiverer nedstrøms signalveier. ITIM rekrutterer og aktiverer tyrosin-fosfatasene SHP-1 og SHP-2 som motvirker ITAM-signalene ved å defosforylere ulike signalmolekyler(9). Immunforsvaret benytter seg av ulike metoder for å gjenkjenne kreftceller. CD8+ og CD4 + T- celler gjenkjenner tumor-spesifikke peptid presentert på celleoverflaten ved hjelp av MHC. NK-celler kan gjenkjenne kreftceller ved at ulike trinn i karsinogenesen kan oppregulere ekspresjon av ulike ligander for NK-celle-reseptorer. DNA-skade og proliferasjon av kreftceller vil gi økt ekspresjon av stressligandene MICA, MICB og ULBP 1-3 hos mennesker(10). Disse ligandene binder alle til NKG2D. Replikasjonsstress vil aktivere DNAskaderespons (DDR) hos kreftceller. Dette oppregulerer ekspresjon av ligander for DNAM-1. Kreftceller vil også kunne uttrykke B7-H6, en ligand for NKp30. NK-celler aktiveres i tillegg 6

7 av kreftceller uten MHC (missing self), og ved at andre immunceller produserer aktiverende cytokiner (IFN-α/-β, IL-12, IL-15)(11). Aktiverte NK- og T-celler kan skade og drepe kreftceller gjennom ulike mekanismer. Begge celletypene kan drepe direkte med granzymer og perforinmediert cytotoksisitet og eliminere kreftceller gjennom dødsreseptormedierte signalveier som TRAIL (tumornekrose-faktor relatert apoptose-induserende ligand) og FasL (Fas ligand). Indirekte kan de skade kreftceller via utslipp av inflammatoriske cytokiner og makrofagaktivering. Viktige cytokiner er IFN-γ og TNF-α. IFN-γ kan indusere MHC I ekspresjon. TNF-α har en cytotoksisk effekt gjennom å trigge apoptose(11). Kreftceller kan unnslippe immunforsvaret Kreft-immuneditering er en mekanisme som foregår i løpet av malign transformasjon. Kreftceller utsettes for et seleksjonspress, og klarer å mutere og endre egenskaper for å unnslippe immunforsvaret. Normalt leder DNA-skade til apoptose hvis den ikke repareres. I kreftutvikling er denne apoptosemekanismen satt til side. Da er immunsystemet neste barriere. NK-celler og T-celler kan oppdage molekylære endringer på overflaten av forstadier til kreft. Det er uklart hvor hyppig dette skjer og hvor viktig det er for å hindre kreftutvikling. Kreftceller kan endre hvilke molekyler de bærer på overflaten. Det er viktig med tanke på å unngå direkte gjenkjenning av NK-celler eller T-celler. Kreftcellene kan også påvirke immuncellene i og rundt svulsten. Det inkluderer å kunne interferere med antigenpresentering fra dendrittiske celler og hindre direkte inhibering av aktivert lymfocyttfunksjon. De kan for eksempel produsere cytokiner som IL-6 og IL-10 som kan forhindre normal differensiering og proliferasjon hos dendrittiske celler. Alle immunresponser har en fase der cellene aktiveres og gjør den jobben de skal. Deretter følger en fase der cellene skrus av og dør, eller blir hukommelsesceller. Inhibisjon er derfor en helt naturlig del av immunsystemet, som kreftcellene, i mange tilfeller har lært seg å manipulere. Med sine nye egenskaper kan kreftcellene unngå å bli gjenkjent av det adaptive immunforsvaret, unngå immun-effektormekanismer, og indusere en immunsuppressiv tilstand(12). I et immunsuppressivt miljø går immuncellene fra en aktivert, drapsinnstilt modus, til en bremsemodus der immuncellene hemmer hverandre ved produksjon av ulike signalstoffer. Sentralt er en makrofagtype kalt M2, myeloid-deriverte supressorceller (MDSC), og regulatoriske T-celler (Treg). Svulstvev inneholder mange makrofager, ofte kalt tumorassosiserte makrofager (TAM). Disse har i mange tilfeller en M2-likende fenotype. Mens M1- makrofager induserer inflammasjon og en cellulær immunrespons, er M2-makrofager mer dedikert til å reparere skadet vev og bremse inflammasjonen ved å skille ut cytokiner (IL-10, TGF-β) som motvirker cytotoksiske T- og NK-celle-responser. Myeloid-deriverte supressorceller hemmer T-celle-proliferasjon og induserer T-celle-apoptose. Økt aktivitet av regulatoriske T-celler nedregulerer funksjonen til tumorspesifikke CD4+ og CD8+ T-celler og NK-celler. Oppregulering av PD-L1 gir inhibisjon av T-celle-funksjon(13). Enkelte kreftceller kan klippe av MICA fra overflaten. Det skaper en løselig MIC som fortsatt binder NKGD2, og bidrar til nedregulering av reseptoren. Slik kan kreftceller unngå angrep fra NKceller(2). 7

8 Figur 1: Tumorvevet danner et eget mikromiljø, som påvirker immuncellene og avgjør om immunsystemet klarer å eliminere svulsten eller ikke. Figuren er hentet fra Wikipedia. 8

9 Antistoffbasert immunterapi Antistoff er benyttes på to forskjellige måter i kreftbehandling. I det enkleste prinsippet binder antistoffer til reseptorer og blokkerer deres funksjon, men uten å igangsette immunologiske mekanismer. Det andre prinsippet baserer seg på antistoffmediert aktivering eller inhibisjon av cellemediert drap eller aktivering av komplementsystemet. I antistoffbasert immunterapi mot kreft benyttes monoklonale antistoffer, identiske immunglobulinmolekyler som har sitt opphav i samme B-celle. De første terapeutiske monoklonale antistoffene var laget fra mus, og immunforsvaret hos mennesket kunne oppfatte dette som fremmed og initiere en immunrespons. Kimære antistoff inneholder elementer fra både mus og menneske. Humanisert antistoff er laget ved å bytte ut de konstante regionene med gener fra menneske, og kun bruke V-region fra mus eller rotte. Som kreftterapi kan antistoffer være spesifikt rettet direkte mot tumorantigen eller motvirke ulike signalveier. Det er ulike mekanismer som står bak gir disse effektene. Det inkluderer antistoff-avhengig cellulær cytotoksisitet (ADCC), komplement-avhengig cytotoksisitet, samt blokkering av binding til overflatereseptorer(14). Figur 2: Antistoffer mot tumorantigen kan drepe kreftceller gjennom direkte binding til Fc-reseptorer på NKceller, makrofager eller granulocytter. I tillegg vil aktivering av komplementsystemet resultere i lytiske porer (membrane attack complex) i kreftcellemembranen og fagocytose eller cytotoksisitet gjennom complementreseptorer på overflaten av makrofager. Figuren er hentet fra Nature Reviews Cancer. Ved ADCC brukes antigen-spesifikke antistoff mot et spesifikt antigen på kreftceller for å rekruttere immunceller og drepe kreftcellene. Dette er avhengig av binding mellom Fc-delen 9

10 på antistoffet og Fc-reseptorer på immuncellene. Fc-reseptorene aktiverer effektorceller (NKceller og makrofager). IgG1-antistoff er mest effektive i Fc-reseptor-binding. Den andre metoden er å aktivere komplementsystemet. Fab-delen (variabel del) av antistoffet binder overflaten på kreftceller og aktiverer komplementfaktorer som resulterer i dannelse av lytiske porer i membranen(14). I 1982 ble den første vellykkede behandlingen med monoklonalt antistoff mot B-celle lymfom beskrevet. Pasienten ble værende i remisjon etter at behandlingen var avsluttet og det var lite bivirkninger(15). Det var første trinn i utviklingen av Rituximab, et kimært monoklonalt antistoff mot CD20, et overflatemolekyl uttrykt på B-celle leukemiceller(16). Rituximab ble godkjent som behandling av FDA i Suksessen med Rituximab som behandling av lymfom viste at en kunne utnytte immunforsvaret til ulike terapiformer(17). Rituximab oppnår antitumor-effekt ved å aktivere komplementsystemet(14). Antistoffbasert kreftterapi med fokus på NK-celler er under utvikling, og flere studier er i gang. BiKE (bispecific killer cell engagers) er antistoff-molekyler designet for å kryssbinde NK-celler og tumorer. De består av to antistoff-fragmenter. Det første gjenkjenner tumorantigen og det andre er rettet mot CD16 på NK-celler. Sammen trigger dette ADCC. TriKE (trispecific killers cell antigen) er en oppgradert variant av BiKE, og har tre nøkkelfunksjoner. Den første er å binde tumorantigen. Den andre er å binde CD16 på NKceller for å trigge ADCC. Den tredje er å drive in vivo NK-celle-ekspansjon ved å vise frem et cytokin til NK-cellen. En vil da oppnå sterkere effekt ved ADCC enn ved bruk av monoklonale antistoff(18). Noen antistoffer er konstruert for å binde reseptorer på celleoverflaten. Eksempler er blokade av epidermal vekstfaktor-reseptor (EGFR) og human epidermal vekstfaktor-reseptor 2 (HER2/neu). Antistoff kan også brukes til å hemme inhibering av sjekkpunktmolekyler hos T- celler. Dette motvirker inhibisjon av T-celle-respons og blir omtalt senere. Agonist-antistoff mot ko-aktiverende kan stimulerende T-celler. Det inkluderer CD137, CD27, Ox40, GITR (glukokortikoid-indusert TNF-relatert protein) og CD40. Antistoff kan også brukes mot tumorvaskularisering. Bevacizumab (IgG1-antistoff) som brukes mot tykktarmkreft, binder VEGF, og hindrer denne fra å binde VEGF-reseptor og forhindrer vaskulær vekst(19). 10

11 Immunsjekkpunkt-terapi CTLA4 og PD-1 Som beskrevet tidligere trenger naive T-celler to signaler for å kunne aktiveres. De kostimulerende molekylene som er ansvarlige for signal 2 er en del av CD28-familien. Uten kostimulering vil T-cellen gå inn i en irreversibel tilstand som kalles anergi. Cellen kan ikke lage IL-2 og kan dermed ikke aktiveres. Ligander for CD28-familien er eksempelvis CD80 (B7-1) og CD86 (B7-2), som begge binder reseptoren CD28. Andre reseptorer i CD28- familien er CTLA4, PD-1, NKp30 og ICOS. Disse reseptorene vil binde ligander i B7- familien (CD80, CD86, ICOS-ligand, PD-ligand 1, PD-ligand 2, B7-H3 og B7-H6). Sammen omtales CTLA4 og PD-1 som immunologiske sjekkpunkt-molekyler. CTLA4 (cytotoksisk T-lymfocytt-assosiert protein 4) er en uekte inhibitorisk reseptor i CD28-familien. Normalt oppreguleres CTLA4 på celleoverflaten av aktiverte T-celler sent i immunresponsen når celler skal skrus av, for å kontrollere T-celle-responsen(20). CTLA4 er homolog med CD28, men har høyere affinitet for ligandene CD80/CD86. Dermed vil CTLA4 utkonkurrere CD28 og hindre et aktiverende signal(7). CTLA4 ble først omtalt som en kostimulerende reseptor med samme effekt som CD28(21), men senere studier viste at CTLA4 og CD28 hadde motsatt virkning, og at CTLA4 inhiberer aktiveringen av T-celler(22). Mus uten CTLA4 utviklet ukontrollert proliferasjon av lymfocytter med tidlig død(23). De spesifikke detaljene angående funksjonen til CTLA4 er fortsatt ikke fullstendig klarlagt og det er usikkert om CTLA4 har egne inhibitoriske signalmekanismer. Figur 3: Overflatemolekyler i CD28-familien og deres ligander i B7-familien. Foreløpig er ikke reseptorene som binder B7-H3 og B7-H4 identifisert. CD28, ICOS og NKp30 er aktiverende reseptorer og PD1 er en inhibitorisk reseptor. PD-1 (programmert celledød-1) er en ekte inhibitorisk reseptor i CD28-familien. PD-1 finnes blant annet på makrofager og aktiverte NK-, T- og B-celler. PD-1 inneholder ITIM-motiv i sin cytoplasmiske hale. Den har to ulike ligander, PD-L1(PD-ligand 1/B7-H1) og PD-L2(PDligand 2/B7-DC)(24). PD-1 binding til en av sine ligander vil inhibere T-celle-aktivering(17). 11

12 I motsetning til CTLA4 vil ikke PD-1 påvirke selve ko-stimuleringssignalet, men signalene som medieres av T-celle antigen-reseptor (signal 1)(7). Interaksjonen PD-1 og PD-L2 vil også hemme T-celle-aktivering, men interaksjonen er mindre potent enn med PD-L1(24). Ligandene utviser ulik ekspresjon. PD-L1 finnes på både hematopoetiske celler og ikkehematopoetiske celler (endotel-/epitel-/ og muskelceller). PD-L2 finnes på dendrittiske celler, makrofager og benmargderiverte mastceller(25). CTLA4-hemmere som kreftterapi Antistoff mot CTLA4 ble for første gang forsøkt som kreftterapi i 1995, og ga redusert tumorvekst hos mus. Det kunne også gi immunitet mot sekundær eksponering av kreftceller(26). Antistoffet brukt mot CTLA4, ipilimumab, er et fullt humant monoklonalt IgG1-antistoff. Det blokkerer interaksjonen mellom CTLA4 og CD80 eller CD86(7). I en fase 3-studie publisert i New England Medical Journal i 2010 ble det vist at ipilimumab ga forlenget overlevelse for pasienter med metastaserende malignt melanom. Pasientgruppen inkluderte pasienter med malignt melanom i stadium III eller IV, som hadde fått behandling for metastaserende sykdom. Studien var dobbeltblindet og inkluderte 676 pasienter. Pasientene ble randomisert inn i tre grupper der de enten fikk ipilimumab og gp100 (glykoprotein-100-peptid) vaksine, ipilimumab alene eller gp100 alene. Median overlevelsestid med gp-100 alene var 6,4 måneder. Med ipilimumab alene var overlevelsestiden 10,1 måneder og med ipilimumab sammen med gp100 var overlevelsestiden 10,0 måneder. 2-års overlevelsestid var 23,5% med ipilimumab alene, 21,6% med ipilimumab og gp100, og 13,7% med gp100 alene(27). De gode resultatene gjorde at FDA (Food and Drug Administration) i USA godkjente ipilimumab for behandling av pasienter med metastaserende malignt melanom i 2011(28). Et annet antistoff mot CTLA4, tremelimumab (IgG2-antistoff), har ikke vist like gode resultater som ipilimumab. En fase 3-studie i 2013 inkluderte 655 pasienter med malignt melanom. Halvparten ble randomisert til å få tremelimumab, og den andre halvparten fikk kjemoterapi. Studien fant ingen statistisk signifikant forskjell mellom tremelimumab og kjemoterapi(29). PD-1-hemmere som kreftterapi Kreftceller kan gjennom mutasjoner eller epigenetiske endringer uttrykke PD-L1 på overflaten. Dette gjelder blant annet malignt melanom, lungekreft og tykktarmskreft. PD-L1 på kreftceller vil inhibere T-celle reseptor-mediert proliferasjon av lymfocytter og cytokinsekresjon(30). Det er disse effektene som kan motvirkes ved terapeutisk PD-1- blokade. Studier i 2005 viste at antistoffer mot PD-1 kunne aktivere immunresponser og gi reduksjon av tumormetastaser. Resultatene viste at PD-1-blokade kunne være et viktig verktøy for å hindre hematogen spredning av kreftceller. Effekten av PD-1-blokade ble beskrevet som en kombinasjon av flere momenter; forlenget T-celle-aktivering, økning i antall effektor T-celler, samt økt rekrutering av effektorceller til tumormiljøet(31). En fase 3-studie viste gode resultater for nivolumab sammenliknet med kjemoterapi (dacarbazine) for pasienter med malignt melanom uten BRAF-mutasjon. Dacarbazine ble valgt fordi det tidligere har vært førstelinjeterapi for pasienter med malignt melanom uten BRAF-mutasjon. Studien var randomisert og dobbeltblindet. Etter ett år var overlevelsesraten 12

13 73% i gruppen som fikk nivolumab og 42% i gruppen som fikk kjemoterapi. Risikoen for død var 58% mindre med nivolumab enn med kjemoterapi. Median tid før sykdomsprogresjon eller død for nivolumab var 5,1 måneder, og 2,2 måneder for kjemoterapi(32). I desember 2014 fikk nivolumab godkjennelse av FDA som behandling av metastaserende melanom(33). En annen PD-1-hemmer er pembroluzimab, et monoklonalt IgG4 antistoff mot PD-1. Studier viste sterk antitumor-effekt hos pasienter med avansert malignt melanom(34), og pembroluzimab ble godkjent av FDA i september 2014 for behandling av malignt melanom(35). Senere ble pembroluzimab godkjent i oktober 2015 for behandling av ikkesmåcellet-lungekreft som uttrykker PD-L1(36). Bivirkninger Det er knyttet bivirkninger til bruken av immunsjekkpunkt-terapi. Dette er i hovedsak autoimmune reaksjoner, og inkluderer affeksjon av hud (utslett, kløe), lever (hepatitt, økning av leverenzymer), tarm (diare, colitt) og det endokrine systemet (hypofysitt, tyreoiditt). I en studie opplevde 60% i ipilimumab-gruppen immunrelaterte bivirkninger. Av andre bivirkninger opplevde 40% slapphet, 15-30% hodepine, 16% hoste og 15% dyspne(27). En annen studie med ipilimumab viste at 85% opplevde en eller annen form for bivirkninger. Hudrelaterte bivirkninger kom etter 2-3 uker, affeksjon av lever og gastrointestinal-tractus etter 6-7 uker og endokrinologiske bivirkninger etter 9 uker(37). Studier viste også at ipilimumab kunne gi T-celleinfiltrasjon til dermis og epidermis. Dette viste seg klinisk som asymptomatisk, erytematøst, retikulært utslett(38). I en retrospektiv studie som så på behandling av bivirkningene fra ipilimumab-terapi trengte en tredjedel av pasientene behandling med systemiske kortikosteroider. En tredjedel av disse igjen trengte også behandling med TNF-α-hemmere. 19% måtte avbryte behandlingen med ipilimumab, den hyppigste årsaken var diare. Studien konkluderte med at tidlig og aggressiv behandling av bivirkninger er nødvending, og at denne tilleggsbehandlingen ikke hadde noen innvirkninger på resultatet av selve kreftbehandlingen(39). Som med CTLA4-hemmere er det også registrert bivirkninger blant PD-1-hemmere. For nivolumab var de potensielle immunrelaterte bivirkningene diare, kolitt, økte ALAT- og ASAT-verdier, pneumoni, nyresvikt, kløe, utslett, vitiligo, hypo- og hypertyroidisme(32). For pembroluzimab var de vanligste bivirkningene slapphet, diare, ustlett, kløe, muskelsmerter, hodepine og økning i ALAT- og ASAT-verdier. 4% av pasientene i studien fikk pneumoni grunnet kreftterapien. Studien konkluderte med at pembrolizumab viste lavere insidens av bivirkninger sammenliknet med CTLA4-hemmere(34). Siden immunterapi er et nytt behandlingsalternativ i stor utvikling har en trolig ennå ikke sett alle bivirkningene. Monoterapi med henholdsvis ipilimumab og PD-1-hemmere hos pasienter med avansert malignt melanom og en pre-eksisterende autoimmun sykdom før behandlingsstart er undersøkt med tanke på bivirkninger. Det inkluderte revmatisk artritt, inflammatorisk tarmsykdom, psoriasis, systemisk lupus, multippel sklerose og autoimmun tyreoiditt. For ipilimumab opplevde 27% (av totalt 30 pasienter) forverring av sin autoimmune sykdom. En person døde etter det som ble rapportert til å være immunrelatert kolitt. For antistoff mot PD-1 opplevde 38% (av totalt 139 pasienter) forverring av sin autoimmune lidelse. Dette gjaldt spesielt for pasientene med revmatologisk sykdom. Forfatterne mente likevel at dette var milde reaksjoner som kunne behandles og at pasientene trengte ikke å stoppe immunterapi-behandlingen. Konklusjonen ble at ipilimumab og PD-1-13

14 hemmere kan brukes hos pasienter med allerede eksisterende autoimmun sykdom, men med tett klinisk monitorering og oppfølgning(40, 41). Det var stor diskusjon angående ipilimumab i Norge etter at dette ble godkjente som legemiddel i USA. Mange mente at det burde bli innført som kreftmedisin i Norge med en gang, men Helsedirektoratet sa i 2013 nei grunnet høy pris (ca kroner pr pasient årlig)(42), men i oktober 2014 godkjente Beslutningsforum bruk av legemiddelet ved lokalavansert og metastatisk malignt melanom(43). I november 2015 ble nivolumab (Opdivo) og pembroluzimab (Keytruda) innført som medisiner mot lokalavansert og metastaserende føflekkreft i Norge. Det ble ikke åpnet for samtidig behandling med PD-1-hemmer og ipilimumab(44). Kombinasjonsterapi Grunnet kreftcellenes kompleksitet og evne til å unngå immunforsvaret kan det være nødvendig å kombinere ulike kreftterapier for å oppnå bedre behandlingsresultat. Dette gjelder også for PD-1-hemmer og CTLA4-hemmere. Teorien bak å bruke disse sammen er at PD-1 og CTLA4 regulerer forskjellige signalveier(7). En fase 2-studie fra 2016 undersøkte kombinasjonsterapi med nivolumab og ipilimumab sammenlignet med monoterapi med ipilimumab hos pasienter med avansert malignt melanom. Prekliniske studier med felles blokade av PD-1 og CTLA-4 har vist sterkere antitumor-effekt enn ved monoterapi. Studien inkluderte 142 pasienter med en median oppfølgingstid på 24,5 måneder. 2-års overlevelse var 63,8% for gruppen med kombinasjonsterapi og 53,6 i gruppen med monoterapi. 45% av pasientene i kombinasjonsgruppen opplevde sykdomsprogresjon eller død mot 74% i monoterapigruppen. Etter ett år var det 52% uten sykdomsprogresjon eller død i kombinasjonsgruppen sammenliknet med 16% i monoterapigruppen. Det ble observert høyere insidens av bivirkninger hos pasientene med nivolumab og ipilimumab enn hos ipilimumab alene. De hyppigste og mest alvorlige bivirkningene for begge gruppene var kolitt, økt ALAT, diare og hypofysitt(45). En metaanalyse undersøkte pneumoni som bivirkning av monoterapi med anti-pd-1/anti-pd- L1 og kombinasjonsterapi med CTLA4-hemmere i tillegg. Pneumoni etter behandling med sjekkpunkt-terapi er en sjelden, men potensielt livstruende bivirkning. Behandlingsindusert pneumoni er en eksklusjonsdiagnose. Av 915 pasienter behandlet med monoterapi fikk 43 (5%) pneumoni. Insidensen ved kombinasjonsterapi 10% sammenliknet med 3% ved monoterapi. 5 pasienter døde totalt(46). Kombinasjonsterapi med tremelimumab (CTLA4- hemmer) og durvalumab (IgG1-antistoff som blokkerer bindingen fra PD-L1 til PD-1) ble brukt hos 102 pasienter med ikke-småcellet lungekreft. Studien viste flere og mer alvorlige bivirkninger med kombinasjonsterapi enn monoterapi med durvalumab. I kombinasjonsgruppen var det tre dødsfall grunnet behandling mot ingen i monoterapigruppen. Pasientene døde av komplikasjoner som følge av myasthenia gravis, væske i perikard og nevromuskulær sykdom(47). 14

15 CAR-celleterapi En relativt ny behandlingsstrategi i kreftterapi er T-celler med en genetisk konstruert overflatereseptor, CAR (kimær antigen-reseptor). Kimær-betegnelsen kommer av at den er satt sammen av deler fra ulike proteiner. Prinsippet for behandlingen er at en transfekterer T- celler fra pasienten, eller fra en allogen donor, med et CAR. CAR består av et ekstracellulært antigen-gjenkjennende domene, som er bundet til en intracellulær signalerende region som aktiverer T-cellen(48). CAR gjenkjenner sitt målantigen, for eksempel et overflatemolekyl på kreftceller, og kan aktivere T-celler uavhengig av MHC-presentasjon(49). Det signalerende domenet stimulerer T-celle-proliferasjon, cytokinsekresjon, og cytoksisitet mot kreftcellene(48). Det er laget ulike utgaver av CAR. Noen lages gjennom å klone lett- og tungkjeder fra et monoklonalt antistoff. Deretter settes de sammen med et kort peptid til et tumor-spesifikt antistoff, kalt scfv (enkeltkjede, variabelt fragment). Dette settes sammen med en region fra CD3ζ eller en annet intracellulær signalerende region fra ko-stimulerende reseptorer. Førstegenerasjons CAR består kun av en intracellulær signalerende region, CD3ζ, som gir signalering fra T-celle reseptor. Andregenerasjon består av CD3ζ pluss en ko-stimulerende region, CD28 eller 4-1BB(CD137). Tredjegenerasjon har CD3ζ, CD28/4-1BB, og en andre ko-stimulerende region, enten fra CD28, 4-1BB eller OX40(CD134). Fjerde generasjons CAR kombinerer andregenerasjons CAR med genomredigering av T-celler der hensikten å slå ut PD-1(17). Figur 4: Skjematisk oppbygning av CARs. Den ekstracellulære delen binder et antigen på kreftcellen (her et scfv element). Den intracellulære delen kan inneholde ulike signaleringselementer hentet fra aktiverende reseptorer. Øverst: 1. generasjons CAR, nederst: 3. generasjons CAR. Tidlige kliniske studier på slutten av 80-tallet og begynnelsen av 90-tallet beskrev førstegenerasjons CAR laget mot ulike målantigen. CAR rettet seg mot folatreseptor i ovarialkreft, karbonsyreanhydrase IX i nyrecellekarsinom og CD171/L1-CAM i neuroblastom hos barn. Studiene viste lite langvarig anti-tumor effekt(50). Førstegenerasjons CAR konstruert for å gjenkjenne GD2-antigen på overflaten av kreftcellene hos barn med neuroblastom, ga komplett remisjon hos tre av elleve pasienter med aktiv sykdom(51). CD19 og CD20 finnes normalt på overflaten av B-celler. CD19 finnes også på overflaten av de fleste B-celle svulster(50). Andregenerasjons CAR-terapi med CD28 som ko-stimulerende domene rettet mot CD19 viste først effekt hos en pasient med avansert follikulært lymfom. Pasienten opplevde regresjon av tumoren, samt at forløpere til B-celler ble eliminert fra 15

16 benmargen(52). Deretter har det blitt gjennomført flere studier med CAR-terapi mot CD19- antigen hos et stort antall pasienter med follikulært lymfom, kronisk lymfatisk lymfom og akutt lymfatisk lymfom vist gode resultater(50). Etter CAR-terapi mot CD19 ved B-celle akutt lymfatisk leukemi i et sent stadium hadde 93% (av totalt 29) ingen detektbar leukemi målt ved flowcytometri. Tilbakefall ble observert og det var bivirkninger. Pasientene opplevde blant annet CRS (Cytokin Release Syndrome) med feber og hypotensjon, neurotoksisitet med encefalopati og anfall, og nøytropen feber(53). CRS har vært et problem i flere studier med CAR-terapi og en har funnet at terapi med blokade mot IL-6 kan være effektiv behandling mot CRS(50). Per januar 2017 er det nesten 40 pågående kliniske studier med CAR, rettet mot målantigen som human epidermal vekstfaktor-reseptor (HER2), gangliosid G2 (GD2), tyrosinproteinkinase Met (cmet), mucin 1 (MUC1) eller epidermal vekstfaktor-reseptor (EGFR). Andre er mot antigener som er essensielle for tumorvekst, som vaskulær endotelial vekstfaktor-reseptor (VEGFR) og fibroblastaktiverende-protein (FAP)(50). Tumorvaksiner Med tumorvaksiner prøver en å utnytte de tradisjonelle vaksineprinsippene til å lage vaksiner mot kreftceller. Tumorvaksiner aktiverer immunforsvaret og forsøker å oppnå langvarig kontroll over kreftcellene. Det finnes ulike typer tumorvaksiner. Det inkluderer antigenvaksine, kreftcellevaksine, dendrittisk celle-vaksine, DNA-vaksine og viral vektorvaksine. En antigen-vaksine kan bestå av kjente tumorantigen som aktiverer tumorantigen-spesifikke cytotoksiske T-celler, T-hjelpeceller eller B-celler. Tumorassosierteantigen (TAA) kan eksponeres av MHC I på overflaten av tumorceller. Dette kan aktivere TAA-spesifikke CD8-celler til å slippe fri cytokiner som kan lysere tumoren eller rekruttere andre celler. En tumorvaksine vil derfor presentere tumorassosierte-antigen til dendrittiske celler. Vaksinene er basert på spesifikke, kjente tumorantigen, som kan manipuleres på forhånd for å øke immunogentiten(54, 55). Kreftcellevaksine kan lages av faktiske kreftceller som kan inneholde mange antigen. De er fjernet under kirurgi og deretter inaktivert med stråling i laboratoriet. Så injiseres de inn i pasienten igjen og angripes av immunforsvaret. Dendrittisk celle-vaksine bruker dendrittiske celler generert fra pasienten og deretter settes inn igjen som aktive celler. Dendrittiske celler er kroppens mest effektive antigenpresenterende celler. DNA-vaksiner er basert på gener for kreft-assosierte antigener. Vaksinen kan injiseres som en naken vaksine eller med et ufarlig virus. Virale vektorvaksiner inneholder også DNA som kan produsere antigenproteiner som kan stimulere en immunrespons(55). En vellykket tumorvaksine er den kjente profylaktiske vaksinen mot HPV(56). Gardasil er vaksine mot HPV 6, 11, 16 og 18, og ble godkjent av FDA i Studier viste at Gardasil var nesten 100% effektiv for å forhindre kreft i cervix og vulva, samt genitale vorter, hos kvinner som tidligere ikke var infisert med HPV. Vaksinen gis gjennom tre injeksjoner over seks måneder. Cervarix er vaksine mot HPV 16 og 18, og ble godkjent av FDA i 2009(55). Tumorvaksiner har ikke alltid hatt ønsket effekt. Selv om enkelte vaksiner har vist gode resultater i dyreforsøk, har den kliniske effekten hos mennesker ikke vært tilstrekkelig. Selv om andre immunbaserte terapier har vist god effekt, har en likevel ikke gitt opp forskningen på tumorvaksiner. Av praktiske grunner er vaksiner enkle å administrere til pasienter og har 16

17 generelt mindre bivirkninger enn andre metoder for å behandle kreft. Derfor er dette et viktig satsingspunkt(54). Et eksempel på en nyere terapeutisk tumorvaksine er vaksinen Sipuleucel-T mot avansert prostatakreft. Vaksinen er en dendrittisk celle-vaksine og lages individuelt for hver pasient. Pasientens dendrittiske celler ekstraheres og inkuberes med et fusjonsprotein før det deretter injiseres inn i pasienten igjen. Fusjonsproteinet består av prostatasyre-fosfatase (PAP), som finnes i 90% av prostatakreft-celler, og immunsignalerende faktorer som hjelper de dendrittiske cellene til å modnes. Dette gir en immunrespons mot kreftceller med PAPantigen(55). En studie viste at menn med prostatakreft som ble behandlet med Sipuleucel-T hadde 4,1 måneder lenger overlevelsestid enn menn i placebo-gruppen(57). Immunterapi i fremtiden Mange år med intensiv forskning på immunforsvaret, immunovervåkning og immuneditering har gitt muligheten til å utnytte kroppens eget immunforsvar som behandling mot kreft. I denne oppgaven har jeg valgt å fokusere på noen aktuelle terapiprinsipper; antistoffbasert immunterapi, immunsjekkpunkt-terapi, CAR-celleterapi og tumorvaksiner. Dette er bare et lite utvalg av ulike immunterapier som eksisterer og kan bli viktige i fremtiden. Andre aktuelle temaer er eksempelvis autolog/allogen stamcelletransplantasjon, ex vivo T- og NKcelle-terapi, onkolytiske virus, nye sjekkpunktmolekyler (TIM-3 og LAG-3) og makrofagsjekkpunkt-terapi. Dette er et fagfelt i rask utvikling, både hva gjelder basale mekanismer og klinisk anvendelse. Det er vanskelig å forutse i hvilken grad immunterapi vil kunne erstatte de tradisjonelle behandlingsmetodene og i hvilken grad immunterapi gir fordeler i kombinasjon med stråling, kirurgi eller cytostatika. Det er forhåpninger til at kombinasjonsbehandling med samtidig bruk av flere immunterapeutiske angrepspunkter vil gi gode effekter. Et mulig eksempel er kombinasjon av sjekkpunktblokade og tumorvaksine, som vil kunne gi synergistiske effekter, maksimal tumorrespons og minimalt med bivirkninger. Kliniske studier med immunterapi har vist gode resultater, og legemidler som ipilimumab og nivolumab har allerede blitt førstelinjeterapi. Studiene har også vist bivirkninger, og da spesielt autoimmune reaksjoner. Siden en er tidlig i utviklingen kan eventuelle sjeldne langsiktige bivirkninger fortsatt være uoppdaget. Mer personlig tilpasset terapi er et generelt trekk i moderne kreftbehandling, og også immunterapier vil ventelig følge et mønster der valg av behandling baseres på individuelle analyser av pasientene. Ulike pasienter reagerer ikke likt på immunterapi, og et viktig område i fremtiden blir å finne biomarkører som kan guide optimale individuelle terapivalg. Selv om utviklingen i alle områder av kreftbehandling går raskt, og er vanskelig å forutse, synes det helt klart at immunterapi vil ha en stor og viktig plass i fremtidens kreftbehandling. 17

18 Referanseliste 1. Kreftregisteret. Fakta om kreft Available from: 2. Parham P. The Immune System. Fourth ed. USA: Garland Science; Loeb LA. A mutator phenotype in cancer. Cancer research. 2001;61(8): Diaz-Cano SJ. Tumor heterogeneity: mechanisms and bases for a reliable application of molecular marker design. International journal of molecular sciences. 2012;13(2): Davis A, Gao R, Navin N. Tumor Evolution: Linear, Branching, Neutral or Punctuated? Biochimica et biophysica acta Tang DG. Understanding cancer stem cell heterogeneity and plasticity. Cell research. 2012;22(3): Sharma P, Allison JP. The future of immune checkpoint therapy. Science (New York, NY). 2015;348(6230): Grakoui A, Bromley SK, Sumen C, Davis MM, Shaw AS, Allen PM, et al. Pillars article: The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science : Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950). 2015;194(9): Billadeau DD, Leibson PJ. ITAMs versus ITIMs: striking a balance during cell regulation. The Journal of clinical investigation. 2002;109(2): Raulet DH, Gasser S, Gowen BG, Deng W, Jung H. Regulation of ligands for the NKG2D activating receptor. Annual review of immunology. 2013;31: Marcus A, Gowen BG, Thompson TW, Iannello A, Ardolino M, Deng W, et al. Recognition of tumors by the innate immune system and natural killer cells. Advances in immunology. 2014;122: Schreiber RD, Old LJ, Smyth MJ. Cancer immunoediting: integrating immunity's roles in cancer suppression and promotion. Science (New York, NY). 2011;331(6024): Fong L, Small EJ. Anti-cytotoxic T-lymphocyte antigen-4 antibody: the first in an emerging class of immunomodulatory antibodies for cancer treatment. Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology. 2008;26(32): Borghaei H, Smith MR, Campbell KS. Immunotherapy of cancer. European journal of pharmacology. 2009;625(1-3): Miller RA, Maloney DG, Warnke R, Levy R. Treatment of B-cell lymphoma with monoclonal anti-idiotype antibody. The New England journal of medicine. 1982;306(9): Maloney DG, Grillo-Lopez AJ, White CA, Bodkin D, Schilder RJ, Neidhart JA, et al. IDEC-C2B8 (Rituximab) anti-cd20 monoclonal antibody therapy in patients with relapsed low-grade non-hodgkin's lymphoma. Blood. 1997;90(6): Batlevi CL, Matsuki E, Brentjens RJ, Younes A. Novel immunotherapies in lymphoid malignancies. Nature reviews Clinical oncology. 2016;13(1): Tay SS, Carol H, Biro M. TriKEs and BiKEs join CARs on the cancer immunotherapy highway. Human vaccines & immunotherapeutics. 2016;12(11): Nicodemus CF. Antibody-based immunotherapy of solid cancers: progress and possibilities. Immunotherapy. 2015;7(8): Sharpe AH, Freeman GJ. The B7-CD28 superfamily. Nature reviews Immunology. 2002;2(2):

19 21. Linsley PS, Greene JL, Tan P, Bradshaw J, Ledbetter JA, Anasetti C, et al. Coexpression and functional cooperation of CTLA-4 and CD28 on activated T lymphocytes. The Journal of experimental medicine. 1992;176(6): Krummel MF, Allison JP. CD28 and CTLA-4 have opposing effects on the response of T cells to stimulation. The Journal of experimental medicine. 1995;182(2): Waterhouse P, Penninger JM, Timms E, Wakeham A, Shahinian A, Lee KP, et al. Lymphoproliferative disorders with early lethality in mice deficient in Ctla-4. Science (New York, NY). 1995;270(5238): Latchman Y, Wood CR, Chernova T, Chaudhary D, Borde M, Chernova I, et al. PD- L2 is a second ligand for PD-1 and inhibits T cell activation. Nature immunology. 2001;2(3): Butte MJ, Keir ME, Phamduy TB, Sharpe AH, Freeman GJ. Programmed death-1 ligand 1 interacts specifically with the B7-1 costimulatory molecule to inhibit T cell responses. Immunity. 2007;27(1): Leach DR, Krummel MF, Allison JP. Enhancement of antitumor immunity by CTLA-4 blockade. Science (New York, NY). 1996;271(5256): Hodi FS, O'Day SJ, McDermott DF, Weber RW, Sosman JA, Haanen JB, et al. Improved survival with ipilimumab in patients with metastatic melanoma. The New England journal of medicine. 2010;363(8): ADMINISTRATION USFD. FDA approves new treatment for a type of late-stage skin cancer Available from: Ribas A, Kefford R, Marshall MA, Punt CJ, Haanen JB, Marmol M, et al. Phase III randomized clinical trial comparing tremelimumab with standard-of-care chemotherapy in patients with advanced melanoma. Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology. 2013;31(5): Freeman GJ, Long AJ, Iwai Y, Bourque K, Chernova T, Nishimura H, et al. Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation. The Journal of experimental medicine. 2000;192(7): Iwai Y, Terawaki S, Honjo T. PD-1 blockade inhibits hematogenous spread of poorly immunogenic tumor cells by enhanced recruitment of effector T cells. International immunology. 2005;17(2): Robert C, Long GV, Brady B, Dutriaux C, Maio M, Mortier L, et al. Nivolumab in previously untreated melanoma without BRAF mutation. The New England journal of medicine. 2015;372(4): ADMINISTRATION USFD. FDA approves Opdivo for advanced melanoma Available from: Hamid O, Robert C, Daud A, Hodi FS, Hwu WJ, Kefford R, et al. Safety and tumor responses with lambrolizumab (anti-pd-1) in melanoma. The New England journal of medicine. 2013;369(2): ADMINISTRATION USFD. FDA approves Keytruda for advanced melanoma Available from: ADMINISTRATION USFD. FDA approves Keytruda for advanced non-small cell lung cancer Available from: 19