En undersøkelse av rollen til WNT/β-cateninsignalering i pankreatisk adenokarsinom, ved bruk av en målrettet genforandring

Transkript

1 En undersøkelse av rollen til WNT/β-cateninsignalering i pankreatisk adenokarsinom, ved bruk av en målrettet genforandring Av Petter Angell Olsen, ph.d., seksjon for cellesignalering, Rikshospitalet, Oslo universitetssykehus Stefan Krauss, lege, seksjon for cellesignalering, Rikshospitalet, Oslo universitetssykehus Pankreatisk adenokarsinom (PA) er en aggressiv krefttype, hvor de tilgjengelige behandlingene er lite effektive. Den forventede overlevelsen etter fem år for personer diagnostisert med PA, er mindre enn 10 prosent. Denne statistikken har holdt seg nærmest uforandret de siste 40 årene. 1 Globale sekvenseringsanalyser har vist at PA er svært heterogen. Likevel kan de fleste PA karakteriseres med mutasjoner i genene Kras (90 prosent), CD- K2NA (90 prosent), TP53 (75-90 prosent) og Smad4/ DPC4 (50 prosent). I tillegg har genetiske analyser vist at sentrale signaloverføringsveier ofte er deregulert i PA. 2 En av disse sentrale signaloverføringsveiene, er WNT/β-cateninsignalering. Denne signalkaskaden kan styre cellevekst, metabolisme, metastasering og differensiering. Selv om WNT/β-cateninsignalering ofte er vist å være deregulert i PA, er den nøyaktige rollen til β-catenin i PA uklar. Målrettet genforandring (genkirurgi) For å studere funksjonen til WNT-signalveien i PA, ble det etablert kreftcellelinjer hvor genet for det sentrale intracellulære proteinet i signalkaskaden - β-catenin - spesifikt var forandret slik at cellene ikke lenger kunne produsere β-cateninprotein. 3 Dette ble gjort ved hjelp av målrettet genforandring, også kalt genkirurgi. Metoden bruker programmerbare nukleaser til å lage spesifikke dobbelttrådbrudd i den genomiske DNA-sekvensen, der det er ønskelig å introdusere en forandring (figur 1). 4 Dannelsen av genomiske dobbelttrådbrudd vil bli gjenkjent av, og aktivere, cellenes endogene DNA-reparasjonsmaskineri for reparasjon av det introduserte DNA-trådbruddet. Uten tilgang til en homolog donor som templat for «homologi mediert reparasjon», vil reparasjon av det introduserte DNA-trådbruddet føre til korte tilfeldige insersjoner eller delesjoner i området rundt trådbruddet. Følgelig er det mulig å introdusere forandringer i en gensekvens, slik at genets proteinprodukt ikke kan uttrykkes, ved å bruke nukleaser som danner spesifikke DNA-dobbelttrådbrudd. I motsetning til for eksempel «RNA interferes» vil genkirurgi introdusere permanente genomiske forandringer, som ved celledeling overføres til dattercellene. Utviklingen av det som nå anses som en enkel og svært effektiv metode, har skjedd i flere 58 BestPractice april 2016

2 Figur 1 Prinsippene for målrettet genforandring (genkirurgi) trinn (sinkfingernukleaser, TALEN-nukleaser og det revolusjonerende CRISPR/Cas9-systemet). Bruken av genkirurgi har økt eksplosivt både i forskningsog terapeutisk øyemed. 5,6 Eksempelvis er genkirurgi av CCR5-genet i CD34-positive hematopoetiske stamceller, for å gjøre stamcellene resistente mot hiv infeksjon, nå til klinisk utprøving i fase II. 7 Funksjonen til β-catenin i BxPC-3-PA-celler Karakteriseringen av rollen til β-catenin i PA ble undersøkt ved å sammenlikne villtype- og genmodifiserte PA-celler som manglet β-cateninprotein. 3 På tross av mange forsøk i flere ulike PA-cellelinjer var etablering av β-catenin-genmodifiserte celler kun vellykket i BxPC-3-PA-cellelinjen. Dette antyder at i visse PA-celler er tilstedeværelsen av β-catenin essensielt for cellenes vekst og overlevelse. I BxPC-3-celler derimot, på tross av et totalt fravær av β-cateniprotein, hadde de genmodifiserte cellene en uforandret cellesyklusfordeling, normal morfologi og ingen økning av apoptosenivåer. Ved globale ekspresjonsanalyser av både mrna og proteinnivåer, ble det likevel påvist at BxPC-3-cellene à BestPractice april

3 Figur 2 BxPC-3-PA-celler som mangler både β-catenin og plakoglobin kan ikke danne normale cellekontakter uten β-catenin hadde forandret uttrykk av komponenter med sentrale funksjoner i celleadhesjon. Et fellestrekk hos alle cellene uten β-catenin var en økt mengde av proteinet plakoglobin, som var lokalisert ved cellemembranen på samme måte som β-cateninproteinet i BxPC-3-villtype celler. Videre analyser viste at en reduksjon av mengden plakoglobinprotein (ved bruk av sirna) i de genmodifiserte cellene, slik at de manglet både β-catenin og plakoglobin, forårsaket tydelige morfologiske forandringer. Det fore- 60 BestPractice april 2016

4 Figur 3 En forandret lokalisering av E-cadherin fra membran til cytoplasma i BxPC-3-PA-celler som mangler både β-catenin og plakoglobin kom opprundede celler, som ikke dannet normale kontakter med nabocellene (figur 2). En viktig type kontaktpunkter mellom epiteliale celler er såkalte «adherens junctions». Dette er dynamiske strukturer, som kontinuerlig settes sammen og tas fra hverandre i prosesser regulert av tilgangen til E-cadherin ved cellemenbranen. 8 Redusert ekspresjon av E-cadherin er en markør for epitelial-mesenkymal transisjon (EMT), og er assosiert med en økt à BestPractice april

5 cellemigrasjon. 9 Når nivåene av E-cadherin ble analysert i vårt system, ble det ikke observert forandringer i mengden E-cadherinprotein. Dette var uavhengig av om cellene manglet β-catenin, plakoglobin eller begge. Likevel viste undersøkelsene av E-cadherins intracellulære lokalisasjon tydelige forskjeller, avhengig av cellenes β-catenin og plakoglobin status (figur 3). I cellene som manglet enten β-catenin eller plakoglobin hver for seg, var E-cadherin primært lokalisert ved cellemembranen. I cellene som manglet både β-catenin og plakoglobin, var E-cadherin hovedsakelig relokalisert til cytoplasma i aggregater. Det er kjent at β-catenin, i tillegg til sin rolle i reguleringen av gentranskripsjon, har viktige roller i celleadhesjon. Vi har etablert at i enkelte typer PA er hovedfunksjonen til β-catenin i cellemembranen som en del av adhesjonskompleksene. Videre har vi vist at cellene kan kompensere for tapt β-catenin ved å øke mengden av plakoglobinprotein. Dannelsen av normale celle-til-cellekontakter var avhengig av at enten β-catenin eller plakoglobin var tilstede. Cellene som manglet begge proteinene kunne ikke etablere ordinære interaksjoner mellom nabocellene. Forandringen i lokalisasjonen til E-cadherin fra cellemembranen til en akkumulering i cytoplasma i cellene som manglet både β-catenin og plakoglobin, viser at disse proteinene har viktige overlappende funksjoner i reguleringen av E-cadherins cellefordeling. En oppregulering av plakoglobinprotein kan ses på som en tilpasningsprosess, som kan hjelpe PA-celler til å overleve i fraværet av β-catenin. KONKLUSJON Ved hjelp av en målrettet genforandring (genkirurgi), har vi etablert at i enkelte PA-cellelinjer er hovedfunksjonen til β-catenin i celleadhesjonen både det å utgjøre en del av «adherens junction»-kompleksene og regulere E-cadherins cellulære lokalisasjon. Vi har videre vist at celler kan svare på fraværet av β-catenin ved å øke proteinnivået av plakoglobin. Dette kan overta funksjonene til β-catenin i celleadhesjon. Det å kartlegge de kompensatoriske mekanismene som tumorceller kan aktivere som svar på elimineringen av sentrale komponenter, er viktig når terapeutiske strategier basert på spesifikke signalveiinhibitorer skal utvikles. Referanser 1. Vincent A, Herman J, Schulick R, Hruban RH, Goggins M. Pancreatic cancer. Lancet 2011 Aug 13;378(9791): Jones S, Zhang X, Parsons DW, Lin JC, Leary RJ, Angenendt P, Mankoo P, Carter H, Kamiyama H, Jimeno A, et al. Core signaling pathways in human pancreatic cancers revealed by global genomic analyses. Science 2008 Sep 26;321(5897): Olsen PA, Solberg NT, Lund K, Vehus T, Gelazauskaite M, Wilson SR, Krauss S. Implications of targeted genomic disruption of beta-catenin in BxPC-3 pancreatic adenocarcinoma cells. PloS One (12):e Kim H, Kim JS. A guide to genome engineering with programmable nucleases. Nature reviews Genetics 2014 May;15(5): Cox DB, Platt RJ, Zhang F. Therapeutic genome editing: prospects and challenges. Nature Medicine 2015 Feb;21(2): Ledford H. CRISPR, the disruptor. Nature 2015 Jun 4;522(7554): Pellagatti A, Dolatshad H, Yip BH, Valletta S, Boultwood J. Application of genome editing technologies to the study and treatment of hematological disease. Advances in Biological Regulation 2016 Jan;60: Harris TJ, Tepass U. Adherens junctions: from molecules to morphogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology 2010 Jul;11(7): Beuran M, Negoi I, Paun S, Ion AD, Bleotu C, Negoi RI, Hostiuc S. The epithelial to mesenchymal transition in pancreatic cancer: A systematic review. Pancreatology : official journal of the International Association of Pancreatology 2015 May-Jun;15(3): BestPractice april 2016