Mikrobiologisk diagnostikk av tuberkulose. Fagdag Helse Førde 16. mai 2017 Reidar Hjetland Mikrobiologisk avdeling

Transkript

1 Mikrobiologisk diagnostikk av tuberkulose Fagdag Helse Førde 16. mai 2017 Reidar Hjetland Mikrobiologisk avdeling

2 Agenda Generelt om mykobakteriar IGRA Direkte påvising av tuberkelbakterien Mikroskopi Dyrking PCR (Tonje B. Riste)

3 Generelt om mykobakteriar Mykobakteriane omfattar mange artar Mycobacterium tuberculosis-komplekset: Gir human tuberkulose Mycobacterium tuberculosis, M. bovis, M. africanum Atypiske mykobakteriar Nokre kan framkalle div. sjukdomar hos menneske, spesielt hos immunsvekka Mycobacterium avium og M. intracellulare, M. abscessus, M. chelonae, M. malmoense, M. kansasii, M. bohemicum, M. marinum., m.fl.

4 Mykobakteriar, forts. Mykobakteriar er syrefaste, aerobe, ikkjesporedannende, urørlege stavbakteriar M. tuberculosis rette eller lett bøygde 0,2 0,6 x 1,0 10,0 µm Veks seint 2-8 veker før synleg vekst

5 Tryggleik Helsepersonell kan bli utsett for tuberkulosesmitte ved pasientkontakt T.d. prøvetaking ved handtering av laboratorieprøvar. Størst i laboratorium der ein dyrker mykobakteriar Må føregå i særlege tryggleikslaboratorium (P3-lab.)

6 IGRA Interferon-Gamma (IFN-γ)Release Assays (IGRA) Langt på veg erstatta tuberkulintesting i Noreg Først og fremst for diagnostikk av latent Tb

7 Fredrik Oftung, FHI

8 Fredrik Oftung, FHI

9 Fredrik Oftung, FHI

10 Fredrik Oftung, FHI

11

12 Quantiferon i Sogn og Fjordane Analysen utførast no ved mikrobiologisk avdeling i Førde (frå nyttår 2017) Prøvetaking og forbehandlinga utførast ved sjukehuslaboratoria nokre kommunelegekontor etter nærare avtale og opplæring

13 Quantiferon - TB (IGRA-TB), prøvetaking og prøvehandtering Prøven skal takast med standard venepunksjon Frå kvar pasient skal det tappast blod på 4 spesialrøyr med høvesvis grå, grøn, gul og lilla kork Kvart røyr skal fyllast med 1 ml blod. Feil prøvevolum kan føre til feil analyseresultat. Vakuumet i røyret sikrar korrekt blodvolum Ved bruk av butterfly-kanyle skal det først tappast eit kasteglas for at vakuumet i prøverøyret ikkje skal bli øydelagt av lufta i slangen Røyra trekkjer blodet relativt sakte, så lat dei få 2 3 sekunder ekstra på nåla etter at dei tilsynelatande er fylt opp Ein svart strek på prøverøyret markerer korrekt fyllingsvolum Røyra kan fyllast i valfri rekkefølgje

14 Prøvehandtering etter at prøven er tatt Prøverøyret inneheld heparin og antigen. Det er viktig at blodprøven blir blanda godt med desse komponentane. Rett etter at prøven er tatt, skal røyra ristast 10 gonger. Ristinga skal vera så kraftig at den innvendige overflata av røyret er heilt dekka av blod, men ein må unngå å rista så kraftig at gelproppen slepp taket i røyret. Prøven skal inkuberast snarast mogeleg og seinast 16 timar etter prøvetaking. Dersom prøven ikkje blir inkubert med ein gang etter prøvetaking, skal den oppbevarast ståande ved 17 C 27 C. Innhaldet skal også blandast på nytt (sjå ovanfor) like før den blir sett inn i inkubatoren Inkubasjontemperatur: 37 C Inkubasjonstid: timar, ståande røyr

15 Transport Etter inkubering skal prøven som hovudregel sendast usentrifugert til Mikrobiologisk avdeling. Laboratorium som kan sørgja for kjøletransport av prøven og som gjer særskilt avtale med Mikrobiologisk avdeling om det, kan sentrifugere prøven før sending. Usentrifugert prøve skal oppbevarast mellom 2 C 27 C og er då haldbar i 72 timar etter avslutta inkubasjon. Sentrifugert prøve skal oppbevarast kjøleg (mellom 2 C 8 C), også under transport til laboratoriet og er då haldbar i 4 veker.

16 Tolking av funn Positiv: Infeksjon med Mycobacterium tuberculosis er sannsynleg. Testen skil ikkje mellom aktiv og latent tuberkulose. Positivt resultat kan også sjåast ved infeksjon med enkelte andre mykobakterieartar (M. kansasii, M. szulgai og M. marinum). Negativ: Infeksjon med M. tuberculosis er ikkje sannsynleg. Testen har relativt lav sensitivitet hos barn og personar med svekka immunsystem. Lav positiv: Resultatet er over cut-off, men på grunn av biologisk variasjon har funnet usikker klinisk betydning. Diagnostikk bør baserast på annan informasjon. Gråsone: Resultatet er nær cut-off, men på grunn av analytisk variasjon ved analysen kan ein ikkje konkludera endeleg. Ny prøve kan vera aktuelt for avklaring, alternativt må diagnostikken basera seg på annan informasjon. Inkonklusiv: Inkonklusivt resultat kan oppstå som følgje av tekniske forhold rundt prøvetaking og prøvebehandling eller som følgje av forhold hos pasienten, t.d. immunsvikt eller pågåande infeksjon. Ny prøve kan i enkelte tilfelle avklara situasjonen.

17 Rekvisisjon for Quantiferon Tb Førde (Legekontor, helst også dei som har elektronisk rekvirering)

18 Direkte mikrobiologisk diagnostikk Dvs. påvising av tuberkelbakterien ved Mikroskopi Dyrking PCR

19 Prøvemateriale generelt Alle typar prøvemateriale kan sendast inn til dyrking og direkte påvisning. Prøvane sendast til laboratoriet raskast mogleg. Representativ prøve: Må takast frå infeksjonsfokus Unngå tilblanding av andre mikrobar. Helst ikkje penselprøvar utilstrekkeleg prøvemengde. Ikke tilsetast noko form for konserveringsmiddel. Samvitsfullt utfylt rekvisisjon

20 Aktuelle prøvemateriale Ekspektorat Indusert sputum Bronkialskylleprøve Larynxavstryk Ventrikkelskyllevæske Urin Puss og sekret Evt. finnålsaspirasjon Lymfeknutar Vevsbitar (biopsi og obduksjonsmateriale) Kroppsvæsker (spinalvæske, pleuravæske osb.)

21 Ekspektorat Prøven takast helst om morgonen før pasienten har ete. Før prøvetaking bør munnen skyljast med vatn. Ein må instruere pasienten om å hoste kraftig slik at slimklattar kjem opp, og berre slike klattar skal spyttast ut i prøveglaset. Dyrking av munnspytt er formålslaust.

22 Ekspektorat, forts. Prøvetakingsutstyr Steril container med skrukork Oppbevaring før transport I kjøleskap. Prøven bør ikkje oppbevarast i romtemperatur.

23 Transport av prøvemateriale Raskast mogleg Unngå mykobakteriedød Unngå overvekst av andre mikroorganismar. Oppbevarast i kjøleskåp Skal ikke utsetjast for dagslys. Tuberkulosebakteriar er svært ømtålege for ultrafiolette (UV) strålar.

24 Laboratorieundersøkingar Direkte mikroskopi Dyrking Identifikasjon av mykobakteriar i kulturar Molekylærepidemiologisk karakterisering Resistensbestemming Genteknologiske metoder for direkte påvising i prøvemateriale (PCR)

25 Direkte mikroskopi Farging for syrefaste bakteriar Ziehl-Neelsens metode Auramin/rhodamin i UV-lys Krev bakt/ml Dvs. lite sensitiv (ca 50% ved lunge-tb) Indikerer høg smittefare Skil ikkje mellom M. tuberculosis og atypiske mykobakteriar Eignar seg best for ekspektorat Obligatorisk ved mistenkt lungetuberkulose Firda arkivfoto: Arne Stubhaug

26 Syrefaste stavar i Ziehl-Neelsen farging

27 Dyrking av Tb Er den ultimate undersøkinga Meir sensitiv enn mikroskopi og PCR Må føregå i tryggingslaboratorium Avd. for mikrobiologi, Haukeland Prøva såast ut på faste og flytande medier Vekst etter 2-8 veker Deretter identifikasjon og resistensbestemming

28 M. tuberculosis på Løwenstein- Jensen-medium M. tuberculosis dyrking på flytande medier Muddaiah RK, James PM, Lingegowda RK - J Res Med Sci (2013)

29 Molekylær deteksjon av Mycobacterium tuberculosis Realtime PCR Tonje Bøyum Riste M. Sc Molekylærbiologi Mikrobiologisk avd, Helse Førde

30 Tuberkulose sitt arvestoff; DNA DNA oppbygginga til tuberkulose er eineståande og spesifikk. Sidan DNA sekvensen til TB er kjend kan vi undersøke ukjende prøvar for å sjå om desse inneheld arvestoff frå tuberkulose.

31 1. Arvestoff vert reinsa frå prøvematerialet. 2. Tilsetter reagens som binder spesifikt til DNA for mycobacterium tuberculosis complex. 3. Kopierer opp DNA sekvens i mange millionar kopiar, og tilsetter farge til kopiane slik at desse vert oppdaga av instrumentet. Realtime PCR

32 Resistensgen i mycobacterium tuberculosis RpoB kodar for ei subeining på RNA polymerasen («proteinfabrikk» hos tuberkulose). Rifampicin behandling er retta mot RNA polymerasen, når denne blir hindra kan ikkje bakterien overleve. Mutasjonar i rpob genet hos tuberkulose hindrer binding av rifampicin, og fører til multiresistent stamme av tuberkulose (MDR-TB). Realtime PCR av Rpo-genet brukast til å avdekke rifampicinreistens hos tuberkulose.

33 Fordelar og ulemper ved molekylær deteksjon Detekterer spesifikt mycobacterium tuberculosis complex. Meir sensitiv enn Ziehl-Nilsen mikroskopi. Mogleg å detektere resistensgen samstundes. Deteksjon utførast direkte frå prøvemateriale, treng ikkje dyrkning først. Svar på deteksjon og resistens innan ein dag. Dyrkning er framleis gullstandard, og er meir sensitiv enn PCR

34 Kven gjer kva? Analyse Allmenn-praksis Helse Førde Quantiferon Førde Førde Tb.Spot Folkehelsa Folkehelsa Mikroskopi Haukeland Førde PCR Haukeland Førde Dyrking Haukeland Haukeland