Diagnostikk av Helicobacter pylori. Astri L. Larsen Lege i spesialisering Mikrobiologisk avdeling Sykehuset Østfold Fredrikstad

Transkript

1 Diagnostikk av Helicobacter pylori Astri L. Larsen Lege i spesialisering Mikrobiologisk avdeling Sykehuset Østfold Fredrikstad

2 Disposisjon Historikk Anatomi/fysiologi Patogenese Virulensfaktorer Diagnostikk invasive tester ikke-invasive tester Behandling/resistensforhold 2

3 Historikk Første observasjon av Helicobacter pylori kan ha vært av Walter Krienitz, som i 1906 beskrev 3 ulike typer spirocheter i magesekken til en pasient med cancer i curvatura minor Krienitz, W Ueber das Auftreten von Spirochaeten verschiedener Form im Mageninhalt bei Carcinoma ventriculi. Dtsch. Med. Wochenschr. 32:872 3

4 Historikk Robin Warren og Barry Marshall mottok i 2005 Nobelprisen i medisin for oppdagelsen av Helicobacter pylori i

5 Historikk Helicobacter pylori har sannsynligvis utviklet seg i pattedyr fra en forhistorisk bakterie som levde i den primitive tarmen. Da magesekken oppsto for mange millioner år siden utviklet noen helicobactere evnen til å overleve i denne nisjen ved å tilpasse seg det sure miljøet. Helicobacter pylori er bare funnet hos mennesker. Ca halvparten av verdens befolkning er infisert (i utviklingsland >70%) 5

6 Helicobacter pylori er en av få kjente bakterier som har fulgt menneskene fra slektsledd til slektsledd HP stammer fra ulike geografiske områder er genetisk svært ulike Genotypiske metoder, spesielt MLST av husholdningsgener gjør at forskere kan spore migrasjonen Gir mer detaljert informasjon om human migrasjon enn analyser av humant genom 6

7 Nomenklatur Epsilonproteobacteria Helicobacter Campylobacter Arcobacter Wolinella 7

8 Litt om magesekkens anatomi og fysiologi 8

9 Mukøse celler: skiller ut et alkalisk mukus som beskytter epitelet bl.a.mot syre Parietal celler: utskiller saltsyre Chief celler: utskiller pepsin, et proteolytisk enzym G celler: skiller ut hormonet gastrin 9

10 3 histologiske områder i magesekken Junqueira and Carneiro, Basic Histology 10

11 Patogenese og virulensfaktorer Helicobacter pylori er godt adaptert til et liv som magesekkspatogen Viktig for suksess: -Evnen til å kolonisere og bestå i magesekken Ulike virulensfaktorer bidrar til de 3 viktigste patogene effektene -Inflammasjon -Forstyrrelse av mukosa barrieren -Endret fysiologi i magesekken 11

12 Hvordan kan Helicobacter pylori overleve i magesekken? Liker seg best i antrum-delen, hvor det er lite syreproduserende parietalceller Flagellene gjør H.pylori svært mobil, slik at den kan borre seg gjennom det tykke mucuslaget, der den til en viss grad er beskyttet mot magesyren H.pylori produserer store mengder urease som frigjør ammoniak og karbondioksid fra transudert plasma urea Ammoniak nøytraliserer cytosol og miljøet rundt bakterien Katalase og superoxid dismutase Enzymer som beskytter bakterien mot oksygen radikaler som frigjøres fra aktiverte nøytrofile leukocytter 12

13 Living dangerously: how helicobacter pylori survives in the human stomach Cesare Montecucco & Rino Rappuoli Nature Reviews Molecular Cell Biology 2, (June 2001) 13

14 Den gastrointestinale barriere (mukosa barrieren) To komponenter: Den indre barrieren består av epitelceller og tight junctions som binder dem sammen Den ytre barrieren består av et beskyttende lag bikarbonatbufret mukus, som er elastisk, hydrofobt og resistent mot proteolyse 14

15 Patogenese Ulcus ventriculi H.pylori bryter ned mukosa barrieren. Endret struktur av mukus -mer mekanisk ustabilt -mindre i stand til å opprettholde beskyttende ph gradient Når mucosa-barriæren er brutt, diffunderer bl.a HCl og pepsin inn i mukosa og submukosa. -inflammasjon og mucosacelle død. -Økt epitel turnover: dårligere mukusproduksjon og fokalt manglende barriere. -Fortsatt tilstrømning av HCl/pepsin: ventrikkelveggen ødelegges, ulcus utvikling 15

16 Patogenese Ulcus duodeni HP gastritt i antrum fører ofte til økt gastrin utskillelse. Gastrin stimulerer parietalcelene i corpus, som dermed utskiller for mye syre. hyperplasi av parietalceller øker syresekresjonen ytterligere. Det kommer mer syre ned i duodenum -metaplasi i bulbus duodeni 16

17 Patogenese Ulcus duodeni Intestinal metaplasi forutsetning for H. pylori kolonisering i bulbus duodeni. Kolonisering med H. pylori fører til kraftig inflammatorisk respons aktiv duodenitt svekket bikarbonat sekresjon. Ulcusdannelse i duodenum. 17

18 Patogenese Økt syresekresjon spiller først og fremst en viktig rolle ved ulcus doudeni. Pasienter med ulcus duodeni er nesten alltid infisert med H.pylori, mens pasienter med ulcus ventriculi er infisert i ca.70% av tilfellene. Andre risikofaktorer er arv, røyking, alkohol, og NSAIDs. 18

19 Patogenese -Kronisk gastritt forårsaket av H.pylori øker signifikant risikoen for intestinal metaplasi og atrofisk gastritt -kjente forløpere for cancer ventriculi -H.pylori risikofaktor for adenocarcinom i ventrikkelen, men bevisene er stort sett epidemiologiske -H.pylori viktig risikofaktor for MALT (mucosa-associated lymphoid tissue) lymfom i magesekken 98% av pasientene er infisert med H.pylori Det er vist at eradikasjon av bakterien medfører tumorregresjon i majoriteten av pasientene med lavgradig lymfom 19

20 Patogenese Kronisk inflammasjon likevel mest karakteristisk De fleste utvikler ikke ulcus eller cancer Usikkert hvorfor noen utvikler mer alvorlig sykdom Skyldes trolig en kombinasjon av genetiske faktorer hos vert, miljøfaktorer og virulensfaktorer 20

21 Virulensfaktorer caga -cytotoxin associated gene (caga) -ca 70% av isolatene -markør for tilstedeværelse av en genomisk patogenitets øy (cagpai) CagA er proteinproduktet av genet caga -CagA proteinet induserer morfologiske endringer i ventrikkelens epitelceller -Andre gener i cagpai fører til IL-8 produksjon som trolig bidrar til økt inflammasjon og sykdomsutvikling -caga positive isolater er epidemiologisk assosiert med mer alvorlig sykdom -caga status alene kan ikke brukes til å predikere sykdomsutvikling hos enkeltpasienter 21

22 Virulensfaktorer vaca Vakuoliserende cytotoxin Exotoxin som induserer vakuoler i eukaryote cellelinjer Genet som koder for cytotoxinet kalles vaca og finnes hos alle isolater Ca 50% av isolatene uttrykker toxinet, og ulike undertyper av genet produserer toxin i varierende mengde 22

23 Virulensfaktorer vaca I befolkningen i vestlige land er spesielle undertyper av vaca antatt å være risikofaktorer for alvorlig sykdom Denne assosiasjonen ikke like tydelig i utviklingsland Geografiske områder f.eks i Afrika hvor prevalens av H.pylori ikke korrelerer med insidens av adenocarcinom i ventrikkelen Sammenheng mellom ulike genotyper og mer alvorlig sykdom er altså kontroversiell Bedre dokumentert at noen genotyper er nontoksigene og gir mindre inflammasjon 23

24 Virulensfaktorer Adhesiner spesifikk adheranse til ventrikkelens epitelceller in vivo ulike typer adhesiner involvert, tilhører en stor gruppe yttermembran proteiner best kjent er BabA som binder seg til Lewis b blodgruppe antigen tilstedeværelse av BabA korrelerer med ulcus duodeni og adenokarcinom 24

25 Virulensfaktorer Lewis antigener H.pylori uttrykker blodgruppe antigener lignende vertens egne antigener mekanisme for å unnslippe immunsystemet? Urease Ureaseaktivitet trolig viktig årsak til inflammasjon i lamia propria viktig kjennetegn på kronisk HP infeksjon 25

26 26

27 Diagnostikk Vanlig inndeling Invasive metoder Ikke-invasive metoder 27

28 Invasive metoder Endoskopi varierende funn makroskopisk ved endoskopi endomikroskopi (kan se HP i levende vev) biopsier optimalt prøvemateriale til dyrkning (må ikke ha tatt antibiotika eller PPI de siste ukene før prøvetaking) 28

29 Invasive metoder (enklere metoder) Orogastrisk børste svelges, børster mucosa og trekkes opp String test gelatinkapsel på en nylontråd svelges. Trekkes etter 1 time når gelatinkapselen er fordøyd. Distale del kan testes for urease evt dyrkes Mageinnhold enklere enn biopsi, men fortsatt invasiv prosedyre dårligere sensitivitet enn biopsi 29

30 Ureasetest Biopsier plasseres direkte i urealøsning indikator, f.eks fenolrødt slår om til rødt når positiv andre ureasepositive bakterier (f.eks fra munnhule) som kan kontaminere prøven kan gi falskt positivt resultat Best spesifisitet ved avlesning innen 1 time 30

31 Direkte mikroskopi Hurtigdiagnostikk Kan gjøres f.eks på materiale fra børsteprøve Alternativ til urease test Her farget med acridinorange 31

32 Histologi God sensitivitet og spesifisitet Fikseres umiddelbart fikseringen beholder morfologien Kan transporteres ved romtemp, vanlig post, ikke lenger infeksiøst Kan også finne H.heilmannii zoonose også assosiert med gastritt kan ikke dyrkes typisk morfologi, lengre enn H.pylori 6-8 spiraler, adhererer ikke til epitel celler 32

33 PCR Påviser bakterien Raskt svar Biopsier, men kan også benyttes på andre prøvematerialer f.eks magesaft eller string test Kan brukes til kvantitering Kan påvise virulensgener cagpai vaca gen andre gener involvert i adheranse eller patogenitet kan også påvises med PCR Kan påvise punktmutasjoner assosiert med antibiotikaresistens Problem: Høyt krav til rengjøring av teknisk utstyr (endoskoper, morterutstyr) -falskt positive resultater Kommersielle kit? 33

34 Dyrkning Dyrkning viktig for resistensbestemmelse og typing -Biopsier -Andre dyrkningsmaterialer: (Enklere, men dårligere sensitivitet) Mageinnhold HP finnes her pga turnover av gastrisk mukosa, men mye lavere sensitivitet enn biopsi, 60% String test gelatinkapsel på en nylontråd svelges. Trekkes etter 1 time når gelatinkapselen er fordøyd. Distale del kan testes for urease evt dyrkes (87% sens) Oppkast kan brukes, men må bufres eller brukes med en gang 34

35 Dyrkning Blodkultur H.pylori kan nå blodstrømmen ved ulcerasjon og blødning sjeldent isolert fra blodkultur 1 rapport hvor isolatet vokste etter 5 døgn i Bactec-system aerob flaske pasient med ventrikkel lymfom vanlige kommersielle blodkultursystemer trolig ikke optimalt for vekst men forsøk har vist god vekst i spesielle blodkultursystemer for fastidiøse bakterier 35

36 Dyrkning 1 biopsi fra antrum god sensitivitet, men ikke nok for pålitelig diagnose H.pylori kan ha en flekkvis distribusjon, slik at flere biopsier er bedre 2 biopsier fra antrum og 2 fra corpus anteriort og 2 fra corpus posteriort anbefales i review artikkel I sjeldne tilfeller kan infeksjonen kun være lokalisert til corpus 36

37 Dyrkning H.Pylori er en sårbar organisme Må ikke være i kontakt med luft Biopsier fra inneliggende pasienter kan transporteres på saltvann, men må sås ut innen kort tid (få timer) Biopsier med lengre transporttid til mikrobiologisk avdeling må tas på egnet transportmedium F.eks Portagerm pylori (PORT-PYL) transportmedium Oppbevares ved 4 C Bør nå lab innen 24, senest 48 timer, evt fryses Mortring Viktig at biopsiene mortres godt Urease test Urea/indol-rør 37

38 Dyrkning Utsæd på selektive skåler viktig Agar base, vekstsupplement (blod eller serum) og selektivt supplement. Blod 5, 7 eller helst 10%. Vi bruker Columbia blod agar med 10% hesteblod, vitox og HP-supplement I tillegg anbefales ofte ikke-selektive skåler for å sikre optimal vekst Buljong anbefales vanligvis ikke vokser dårlig Vokser best ved ph 5-6 Ferske medier (helst <1 uke) viktig 38

39 Dyrkning Helocibacter pylori strengt mikroaerofil 5-20% CO2 og fuktighet nødvendig for vekst ingen vekst i romluft Ulike systemer kan brukes for å oppnå mikroaerofil atmosfære f.eks gassgenererende pakker som forsegles sammen med skålene i en pose 39

40 Dyrkning Optimal dyrkningstemperatur 37 C Synlige kolonier etter 3-4 dager ved primærkultur inkubering i 7-10 dager anbefales i tilfelle svært få bakterier til stede Kvantitering? Veie biopsiene. De fleste laber nøyer seg med semikvantitering 40

41 Fenotypisk identifikasjon Kolonimorfologi Små, blanke kolonier etter 3-4 dagers inkubasjon Ingen hemolyse Grampreparat Mikroskopisk ikke alltid typisk morfologi, kan være vanskelig å se spiralform Ofte buede gram-negative staver 41

42 42

43 Fenotypisk identifikasjon Oxidase + Katalase + Urease + 1 øseskje kolonier i ureasemedium: umiddelbar fargeforandring (innen 2 minutter) urease viktigst for identifikasjon Svak eller manglende motilitet ved dyrkning på fast medium Eventuelt µ-gt LAP ALP APICampystrip (Enkelte reaksjoner) Fenotypiske metoder godt nok bare ved isolat fra øvre GI-traktus 43

44 Kokkoide former Ved manglende næringstilgang mister HP sin spiralform og blir stadig mer kokkoid i formen Usikkert hvorvidt disse formene er levende eller evt en resistent form av bakterien Kan medføre diskrepans mellom molekylære tester og dyrkning Viktig at kolonier subkultiveres ved optimal størrelse 44

45 Ikke-invasive tester Urea puste test Antigentest i faeces Serologi 45

46 Urea puste test Testen er standardisert og gir god reproduserbarhet og nøyaktighet Egnet til diagnostikk både før behandling og til kontroll av behandlingseffekt (2-3 måneder etter beh) Andre urease positive bakterier kan gi falskt positivt resultat f.eks h:heilmannii (kan også ha nytte av eradikasjonsterapi) ved hypoklorhydri og bakteriell overvekst kan f.eks proteus være til stede usikkert hvor vanlig denne problemstillingen er Falskt negative resultater kan forekomme ved nylig antibiotikabehandling, PPI eller blødning 46

47 Urea puste test Pasienten drikker en oppløsning med urea som er merket med en karbon isotop C 13 eller C 14 merket urea Urea hydolyseres raskt av HP urease dersom HP til stede Merket CO2 absorberes til blod og frigjøres med utåndingsluft som analyseres Dersom pasienten ikke er infisert produseres ikke merket CO2 og størstedelen av isotopen elimineres umodifisert i urin C 13 : prøve før og etter inntak, ettersom nivået av C 13 merket urea kan variere avhengig av diett 47

48 Fæces antigentest HP elimineres i fæces, men som regel ikke mulig å dyrke følsomhet for gallesalter konkurranse fra andre bakterier vanskelig å skille fra annen vekst -Antigentest 48

49 Antigentest ELISA-tester Putetest (Lateral flow immunoassay) poly-/monoklonale antistoffer Transittid påvirker sensitiviteten upålitelig resultat hos pasienter med obstipasjon ofte godt egnet for barn pga kortere transittid 49

50 Antigen test Faeces fortynnet med sample diluent tilsettes prøvebrønnen Rød/rosa testlinje positivt resultat 50

51 Antigen test Alternativ til urea pusteprøve og serologi Ikke antibiotika eller syrehemmer 2 uker før test Testen kan ikke brukes ved gastrointestinal blødning Fordel: Enkel prøvetaking som pasienten kan ordne selv hjemme. Påviser aktiv infeksjon (som serologi ikke nødvendigvis gjør) Fæces uten tilsetning, noen få skjeer Transporttid helst ikke mer enn 1 døgn Kan oppbevares i kjøleskap 3 døgn, ellers fryses 51

52 PCR-undersøkelse i fæces Mulig, men komplisert ekstraksjon pga hemmere i prøvematerialet Viktig med veldig spesifikke primere pga andre, lignende bakterier som også finnes i fæces Minst 2 PCR reaksjoner mot 2 ulike target må være positive samtidig 52

53 Serologi H.pylori infeksjon medfører en spesifikk immunrespons, bare ca2% av pasientene serokonverterer ikke Kronisk infeksjon, IgG er viktigste immunglobulinklasse IgM påvises sjelden, men trolig fordi akutt HP infeksjon sjelden er tilgjengelig for undersøkelse De fleste har også forhøyet IgA, men ikke alle IgG nivået faller etter eradikasjon, men kan ta måneder eller år for å nå baseline 53

54 Serologi Positivt resultat skiller ikke mellom nåværende eller tidligere sykdom eller kolonisering Positivt testersultat behøver ikke nødvendigvis indikere gastrointestinal sykdom Når brukt som behandlingskontroll -0-prøve -ny prøve 4-6 mndr etter behandling Kvantitativ test titerfall >40% indikerer eradikasjon 54

55 Immunoblot Lite brukt? Brukes mest for å identifisere pasienter med falsk positiv serologi Gir også anledning til å vurdere immunrespons mot ulike antigener f.eks antistoffer mot CagA Man har sett sammenheng mellom immunrespons mot CagA og mer alvorlig sykdom CagA imidlertid ingen god prediktor for dette på individuell basis 55

56 Comparison of the performances of diagnostic tests for Helicobacter pylori detection in adult patients Sensitivity (%) Specificity (%) PPV (%) NPV (%) Test A B A B A B A B Culture Histology ,4 Urease (24 h) ,5 PCR ,3 UBT , , , Serology ,2 Immunoblot 95,6 92,6 91,5 96,2 Stool antigen test 88,9 94,4 90,9 90,7 PPV, positive predictive value; NPV, negative predictive value; study A, 105 patients tested; study B, 99 patients tested. From: Clin Microbiol Rev April; 20(2): doi: /CMR Copyright 2007, American Society for Microbiology 56

57 Dyrkning referansemetode når man sammenligner nøyaktigheten til ikke-invasive metoder Men en pasient med negativ dyrkningsprøve regnes som positiv dersom både histologi og urease-test er positiv 57

58 Når bruke de ulike testene? Pasienter >45 år: Pasienter <45 år: gastroskopi ulike strategier - Test and treat -evt. non-invasiv test, gastroskopi hvis positiv Behandlingskontroll urea pustetest serologi (om man har 0-prøve) antigentest (hvis pustetest er praktisk vanskelig) gastroskopi i spesielle kliniske situasjoner, f.eks ulcus ventriculi, blødende ulcus 58

59 Behandling Anbefalt behandling i Norge (legemiddelhåndboka.no): Den mest effektive behandlingen gir ca 90% utryddelse og består av to antibakterielle midler og protonpumpehemmer ( trippelkur ): A) PPI + amoxicillin og klaritromycin i 7 dager B) PPI og metronidazol + ett av følgende midler: amoksicillin eller klaritromycin Behandlingstid 7 dager 59

60 Resistensbestemmelse For valg av behandling spesielt hos feilslagere For epidemiologisk oversikt 60

61 Resistensforhold i Norge Sensitiv % Intermediær % Resistent % Klaritromycin 94,1 5,9 Amoxicillin 98,0 2,0 0 Tetracyklin Metronidazol 92,2 7,8 Inndeling i følsomhetskategorier basert på brytningspunkter fra AFA (januar 09) RESISTENSFORHOLD HOS HELICOBACTER PYLORI (HP) HOS UBEHANDLEDE PASIENTER Astri Lervik Larsen, Eivind Ragnhildstveit, Berouz Moayeri, Lisbeth Eliassen & Kjetil K. Melby. (Poster, FHI årskonferanse 2009) 61

62 Referanser -Topley & Wilson`s Mikrobiology & Microbial Infections -Helicobacter pylori Detection and Antimicrobial Susceptibility Testing Francis Mégraud and Philippe Lehours Clin Microbiol Rev April; 20(2):