Medisin, stadium 1A, Geir Slupphaug, IKM Sitronsyresyklus

Transkript

1 Medisin, stadium 1A, Geir Slupphaug, IKM Sitronsyresyklus Når cellene har tilstrekkelig tilgang på oksygen, vil ikke pyruvat dannet i glykolysen omdannes til laktat, men vil i stedet omdannes til Acetyl- oa og kanaliseres inn i sitronsyresyklus (Krebs syklus) Dette gir en fullstendig nedbrytning av pyruvat til H 2 O og O 2. Denne aerobe prosessen kalles respirasjon

2 Oksydativ nebrytning av pyrodruesyre skjer i mitokondriene

3 Under normale aerobe forhold vil det meste av pyrodruesyren som dannes i glykolysen transporteres (aktivt) inn i mitokondriene, og oksyderes videre gjennom sitronsyresyklus Det er imidlertid bare acetylgruppen i pyruvat, som går inn i sitronsyklusen, og denne må først kobles på coenzym A (oa), og danne acetyl-oa. Acetylgrupper fra fettsyrer og de fleste aminosyrer kanaliseres også inn i sitronsyresyklus via acetyl-oa Totalreaksjon for omdanning av pyruvat til Acetyl-oA ved pyruvat dehydrogenase

4 Pyruvat dehydrogenase er et multienzymkompleks Pyruvat dehydrogenase er det største multienzymkomplekset som er kjent, og består av: Pyruvat dekarboksylase (E1) (x60) Dihydrolipoamid acetyltransferase (E2) (x60) Dihydrolipoamid dehydrogenase (E3) (x12) I tillegg inneholder komplekset to regulatorenzymer og 5 koenzymer, alle fra vannløselige vitaminer De ulike subenhetene er ordnet slik at mellomproduktene i katalysen kan dirigeres fra reaksjon til reaksjon, uten å forlate enzymets overflate Elektronmikrografi av pyruvat dehydrogenasekompleks fra E. coli

5 Pyruvat dehydrogenase (irreversibel reaksjon) TPP E1 TPP L S S FADH 2 NAD + -L- SH E2 E3 L SH SH FAD NADH oa Pyrodruesyre Acetyl- oa Bindingen mellom oa og acetylgruppen fra pyruvat kalles en tioester-binding, og er svært energirik -vi sier at den er aktivert. Dette gjør at acetylgruppen kan doneres til en rekke ulike akseptormolekyler Både arvelige defekter i enzymkomplekset, og vitaminmangel (f. eks fra høyt alkoholinntak) kan føre til tap av pyruvat dehydrogenasefunksjon Prostetiske gruppervitamin prekursor Tiamin pyrofosfat Tiamin Lipoamid FAD Riboflavin Hemmer enzymet via produktinhibering og via aktivering av pyruvat dehydrogenase kinase oenzymer NAD oenzyma Vitamin prekursor Niacin Pantotensyre

6 E1 E1 E3 E2 E3 Lipoyldomener i E2 Organisering av E2-delen E2 Selve strukturen av enzymkomplekset er modellert med en kombinasjon av cryoelektronmikroskopi, og strukturinformasjon av mindre subenheter med X-ray og NMR analyse Modell av hvordan lipoylgruppene i pyruvat dehydrogenasekomplekset fra Bacillus stereothermophilus er plassert. (Milne et al., J. Biol. hem. 2006)

7 dimethylisoalloxazine H 3 H N O NH 2 e + 2 H + H 3 H H N O NH H 3 H N H 2 N O H 3 H N H 2 N H O H OH H OH H H OH FAD FADH 2 OH O O Adenine H H OH OH O O Adenine H 2 O P O P O Ribose H 2 O P O P O Ribose O- O- O- O- FAD (Flavin Adenin Dinukleotid) er derivert fra vitaminet riboflavin. Det er ringsystemet i dimetylisoalloxazin som gjennomgår oksydason/reduksjon. FAD is en prostetisk gruppe, permanent bundet til E3

8 Regulering av pyruvat dehydrogenase Begge produktene i enzymreaksjonen Acetyl-oA, og NADH, virker inhiberende på enzymaktiviteten Aktiviteten reguleres imidlertid også via fosforylering av enzymkomplekset. Fosforyleringen skjer i E1-komplekset, og styres av: Pyruvat dehydrogenase kinase (hemmer enzymkomplekset) -Aktiveres av acetyl-oa, ATP og NADH -Hemmes av pyruvat, coenzyma og NAD+ Pyruvat dehydrogenase fosfatase (aktiverer enzymkomplekset) -Aktiveres av a2+. I skjelettmuskulatur frigjøres a2+ ved trening -Dette aktiverer pyruvat dehydrogenase og energiproduksjonen

9 Under faste vil: Nivået av pyruvat dehydrogenase kinase øke i de fleste vev (blant annet skjelettmuskulatur) samtidig som pyruvat dehydrogenase-nivået synker Dette hindrer musklene i å forbruke glukose og prekursorer for glukoneogenese Metabolismen dreies derfor mot fettforbrenning Nedbrytning av muskelprotein for å drive glukoneogenesen nedsettes Tilgjengelig glukose spares for bruk i hjernen

10 Acetyl-coenzym A er en nøkkelintermediat i metabolismen Acetyl-oA er et energirikt tioester som produseres fra nedbrytning av både fettsyrer og andre lipider, aminosyrer, karbohydrater mm. Det er derfor det viktigste skjæringspunktet i katabolske og anabolske reaksjoner. I animalske celler, i motsetning til planter, kan ikke acetyl- oa omdannes til karbohydrater Glukose O 2 Kolesterol og steroider Heme Acetyl- oa Fettsyrer Ketogene aminosyrer Ketonlegemer

11 Sitronsyresyklus (TA-syklus) Acetyl-oA donerer acetylgruppen inn i sitronsyresyklus, hvor energien i molekylet trekkes ut via en rekke oksydasjons- og dekarboksyleringsreaksjoner (frigjør O 2 ). Energien som frigjøres, fanges hovedsakelig opp i form av de reduserte kofaktorene NADH og FADH 2. Disse kan så i siste omgang brukes til dannelse av ATP via såkalt oksydativ fosforylering.

12 I sitronsyresyklus doneres 2 karbonatomer inn fra acetyl-oa, og to karbonatomer spaltes av i form av O 2 i hver runde. Karbonatomene som frigjøres i form av O 2 er ikke de samme som blir donert av acetyl-oa.

13 1 Sitrat syntase starter syklusen Binding av oksaleddiksyre induserer en stor konformasjonsendring i enzymet (grønn=før binding). Dette åpner et bindingssete for acetyl-oa Begge molekylene begraves inne i enzymet, og beskyttes mot det ytre løsningen. Dette favoriserer kondensasjonen

14 2 Aconitase omorganiserer sitratmolekylet Sitronsyren binder til et jernsvovelkompleks som sitter dypt nede i en kløft på enzymet. Ved substratbinding lukkes enzymet, og Fe4S4-komplekset deltar i a) fjerning av vann, og b) tilbakeaddering av vann for å danne isositronsyre

15 3 Isositrat dehydrogenase fjerner første O 2 NAD + Dette trinnet er en oksydativ dekarboksylering. Isositrat oksyderes til -ketoglutarat, samtidig som O 2 spaltes av. Når isositrat oksyderes, blir samtidig kofaktoren NAD + redusert til NADH + H +.

16 4 -ketoglutarat dehydrogenase fjerner andre O 2 -ketoglutarat dehydrogenase er svært likt pyruvat dehydrogenase, og består at tre subenheter E1, E2 og E3. Det har også samme kofaktorer, TPP, lipoat, FAD, NAD og oenzyma. Selve reaksjonen er nesten identisk bortsett fra at subenheten E1 binder -ketoglutarat i stedet for pyruvat. Dette trinnet er også en oksydativ dekarboksylering, hvor NAD + samtidig reduseres til NADH + H +. Energirik tioesterbinding

17 5 Succinyl-oA syntetase danner GTP Energien i tioesterbindingen dannet i forrige trinn er tilstrekkelig til å danne ett molekyl GTP fra GDP. Reaksjonen er reversibel, og enzymet har sitt navn fra den omvendte reaksjonen Merk at en syntetase foretar kondensasjonsreaksjoner ved bruk av ATP eller GTP, mens en syntase (eks. sitrat syntase) ikke trenger en slik energikilde. IUB fastslo i 1984 at navnet ligase burde brukes for reaksjoner hvor en syntese foregikk under samtidig spalting av en nukleotid trifosfat

18 6 Succinat dehydrogenase danner FADH 2 Succinat (ravsyre-) dehydrogenase er det eneste enzymet i Krebs-syklus som ligger bundet i den indre mitokondriemembranen Indre mitokondriemembran Det består av 4 subenheter. A inneholder FAD som oksyderer succinat, B inneholder 3 FeS-kompleks, som transporterer elektronene fra FADH2 til Ubiquinon (oenzym Q 10 ). Ubiquinon transporterer så elektronene videre til den endelige elektronakseptoren - O 2 (vil bli behandlet under oksydativ fosforylering). Subenhet og D forankrer enzymet i den indre mitokondriemembranen.

19 7 Fumarase adderer H 2 O Enzymet består av to like subenheter (homodimer), som hver kan binde ett molekyl fumarat. Fumarat hydreres (vann adderes) til L-malat

20 8 Malat dehydrogenase danner NADH Enzymet katalyserer det siste trinnet i sitronsyresyklus Oksaleddiksyre som dannes blir imidlertid fort omsatt videre i en ny runde, og nivået av oksaleddiksyre i cellen er derfor svært lavt

21 Energiutbytte i sitronsyresyklus

22

23 Det totale energiutbyttet fra glukosenedbrytning kan variere alt etter hvilken måte redusert NADH fra glykolysen transporteres inn i mitokondriene Her benyttes en av to shuttle -mekanismer, hvor malat-aspartat shuttle er viktigst i lever og hjerte

24 Mellomprodukter i sitronsyresyklus brukes som utgangspunkt for mange syntesereaksjoner. For at syklusen ikke skal stoppe opp, kan mellomprodukter fylles på på to steder - malat og oksalacetat. Slike påfyllingsreaksjoner kalles anaplerotiske reaksjoner Anaplerotiske reaksjoner

25 Hvorfor kan ikke cellene bryte ned pyrodruesyre direkte til O2 uten å måtte bygge opp et mer komplisert molekyl (sitronsyre) før endelig nedbrytning? Mulig rute O O O H 3 O OH H 3 H H 3 OH H 4 O 2 O 2 Pyrodruesyre Acetaldehyd Eddiksyre Metan I praksis ville dette ha blitt et problem, da cellene ikke lett kan omsette metan videre. Dessuten er eddiksyre et relativt stabilt molekyl, som ikke lett omsettes i cellene. Løsningen blir derfor å aktivere eddiksyremolekylet (Acetyl-oA) og derfra kondensere det til et annet molekyl (oksaleddiksyre), slik at sistnevnte tjener som bærer av eddiksyremolekylet mens det brytes ned i en syklisk prosess. Dessuten vil en slik syklus tjene som mottakssentral for produkter dannet fra andre katabolske prosesser.

26 Transport av elektroner kan utføre arbeid Når vi kobler et batteri til en motor, vil strømmen av elektroner fra den ene polen til den andre polen kunne få motoren til å utføre arbeid Tilsvarende vil elektroner som doneres fra ett molekyl til et molekyl med høyere elektronaffinitet (mer stabilt), avgi energi. Denne energien kan benyttes av cellene til å utføre arbeid. Det er dette prinsippet som benyttes for å syntetisere ATP fra de reduserte elektronbærerne NADH og FADH 2.

27 Elektrontransportkjeden i den indre mitokondriemembranen Elektroner overføres fra NADH til flavin mononukleotid (FMN), og via jern-svovel bærere til coenzymq (Q) Elektronene overføres til cytokrom (), som overfører dem til kompleks IV Elektronene brukes til slutt til å redusere O 2 til H 2 O F0F1 ATP syntase Intermembranrommet Elektroner fra FADH 2 går inn i elektrontransportkjeden på et lavere energinivå FMN FeS Q cytb FeS ytc 1 u2 + yta 3 yta Matrix

28 Kompleks I: NADH-ubiquinon oksydoreduktase Dette er et stort proteinkompleks med 42 subenheter Enzymet har to oppgaver: Overføre et hydridion fra NADH og ett proton fra matrix, til ubiquinon Bruke energien som frigjøres til å pumpe 4 protoner ut til intermembranrummet

29 PNAS Okt 2010

30 Komplett reduksjon av ubiquinon til ubiquinol krever to elektroner og to protoner Ubiquinon er et lite, fettløselig molekyl, som kan flyte fritt inne i mitokondriemembranen, og transportere elektroner mellom de ulike kompleksene

31 Kompleks II: Succinat dehydrogenase Det eneste proteinet i Krebs syklus som sitter i mitokondriemembranen Elektroner tatt opp fra succinat passerer via FADH2 og 3 FeSkompleks til ubiquinon. Merk at elektroner overført til kompleks II ikke kan bidra til protonpumping i kompleks I

32 Kompleks III: ytokrom bc 1 -komplekset I dette komplekset overføres de to elektronene fra ubiquinol (QH 2 ) til to ulike jern-svovel kompleks inne i proteinet. Derfra følger en komplisert overføring via cytokrom b og cytokrom c 1, før de to elektronene overføres til to molekyler cytokrom c, som sitter løst bundet på overflaten ut mot intermembranrummet. Under denne prosessen pumper kompleks III 4 protoner ut til intermembranrummet. 4H + ytokrom

33 Kompleks IV: ytokrom oksydase Dette er det siste trinnet i elektrontransportkjeden. Her overføres to elektroner fra cytokrom c til to kopperioner bundet til proteinet. Deretter passerer elektronene cytokrom a, og til slutt cytokrom a3 bundet til enda et kopperion. Elektronene tas derfra opp av molekylært oksygen. For hver 4 elektroner som passerer kompleks IV, brukes 4 protoner fra matrix til å danne 2 molekyler vann, samtidig som 4 protoner pumpes ut i intermembranrummet

34 Protonpumpen i kompleks IV nylig klarlagt En glutaminsyre i det aktive setet peker nedover mot matrix når den er uprotonert. Ved protonering, vil denne aminosyren ikke ha noen retningspreferanse, og peke like ofte opp som ned. Nettoresultatet er at protonering øker preferansen for denne protonbæreren til å peke ut mot intermembranrommet, og effektivt utgjøre en ventil som ikke slipper protoner tilbake til matrix I opp -konformasjon vil protonet redusere O 2 til H 2 O, og frigjøres fra glutaminsyren, som straks flipper tilbake til ned -posisjon Kaila et al., PNAS 2008

35 Oppsummering av elektrontransporten For hvert elektronpar som doneres inn via NADH, pumpes 10 protoner ut. For elektronpar som donerers inn direkte til kompleks II fra succinattrinnet i Krebs-syklus, pumpes 6 protoner ut.

36 Mange stoffer kan koble ut elektrontransporten

37 Akkumulering av protoner genererer en kjemiosmotisk gradient Både forskjellen i protonkonsentrasjonen og ladningsforskjellen bidrar til denne gradienten, og utgjør en kraft som er i stand til å utføre arbeid.

38 Gradienten er koblet til ATP-syntese

39 F 0 F 1 er en kompleks ATPase Når protoner strømmer gjennom F 0 -delen, roterer denne og hele - skaftet. Dette får de tre aktive setene på -enhetene til å endre konformasjon etter tur Høy ADP/Pi-binding Kraftig binding av ATP (forskyver likevekten mot ATP) Svak binding av ATP (ATP frigjøres Det dannes derfor 3 ATP pr runde

40 Komplett energiutbytte for oksydasjon av glukose

41 Naturlige utkoblere av ATP-syntesen I brunt fett hos spedbarn og dyr som går i dvale, finnes et protein - termogenin, som kan koble ut ATP-syntesen. Dette gjøres ved å returnere protoner til matrix under produksjon av varme. Dette bidrar til å opprettholde kroppstemperaturen