BAKGRUNN METODIKK Tabell 1 Prøvemateriale Län

Transkript

1 Hiiovervåkniing ved hjjellp av DNA-anallyse fra jjervekskrementter AAVV: : Ø YYSS TTEE IINN I FFLLAAGGSSTTAADD,, HEENNRRI IIKK BBRRØØSSEETTHH,, EEVVAA HEEDDMMAARRKK,, HAANNSS EELLLLEEGGRREENN 1

2 BAKGRUNN Den skandinaviske jervbestanden er i dag gjennom yngleregistreringer estimert til 595 ± 69 individer og må ansees som sårbar. Omfattende overvåkning av populasjonen er av betydning for å kunne følge bestandsutviklingen på den Skandinaviske halvøy. Nyere forskning har vist at det er mulig å identifisere individer basert på DNA isolert fra ekskrementer. Dette åpner opp for en ny metodisk tilnærming i populasjonsovervåkningssammenheng som kan supplere kunnskap basert på sporing og ynglehiregistrering. Vi vil i denne rapporten redegjøre for resultatene fra alle ekskrementprøver samlet inn i Västerbotten og Norrbotten i 2002 og 2003, samt prøver samlet inn på eller i umiddelbar nærhet av ynglehi i Jämtland og Dalarna. Resultatene fra prøver som er samlet inn utenom ynglehi i Jämtland/Dalarna blir formidlet i en rapport som også tar for seg ekskrementprøver fra Sør-Norge samt Nord-Trønderlag. Hovedformålet ved innsamlingen i Västerbotten og Norrbotten har vært å kartlegge ynglehilokaliteter, mens man i Jämtland og Dalarna både ønsker å kartlegge ynglelokaliteter, samt å generere data som kan bidra til økt kunnskap om populasjonsstruktur og bestandsstørrelse. I denne rapporten vil vi kun redegjøre for hiovervåkningsdelen av prosjektet. Et viktig spørsmål i denne sammenhengen har vært å se på ynglehibruken for ynglende hunner, og kartlegge hvorvidt reproduserende hunner normalt opererer med ett eller flere ulike ynglehi. METODIKK Laboratoriearbeid og dataanalyse Totalt 90 antatte jervekskrementer og hårprøver (+ 2 vevsprøver) ble samlet inn i Västerbotten og Norrbotten i 2002 og I tillegg ble det samlet inn 138 ekskrementprøver i Jämtland og Dalarna (Tabell 1). I tilfeller av vellykket ekstraksjon av jervspesifikt kjerne-dna, har vi gjennomført genotyping på tvers av 10 mikrosatelitt markører som følger: Gg7 (Davies and Strobeck 1998), Ggu14, Ggu42, Gg443, Gg454, Gg465 (Walker et al. 2001), Gg216, Gg234 (Duffy et al. 1998), Mvis072, Mvis075 (O Connell et al. 1996). Minst tre uavhengige replikater per prøve ble kjørt for alle 10 markører. Alle fungerende prøver ble også kjønnsbestemt ved hjelp av to kjønnsmarkører (DBY3Ggu, DBY7Ggu; Hedmark et al. 2004). To uavhengige replikater per markør ble kjørt for alle prøver ved kjønnsbestemmelsen. Tabell 1 Oversikt over innsamlede prøver Prøvemateriale Län år spillning/sekret urin hår Sum Jämtland/Dalarna Västerbotten Norrbotten Jämtland/Dalarna Västerbotten Norrbotten Sum

3 Etter endt mikrosatelittanalyse og kjønnsbestemmelse ble de genetiske profilene til alle individuelle prøver sammenlignet. Prøver som var identiske på tvers av 10 loci samt representerte det samme kjønn, ble klassifisert som representanter for ett og samme individ. Slektskap mellom individer ble bestemt ved hjelp av metoden beskrevet av Marshall et al. (1998). Kun individer som var samplet i eller ved et ynglehi ble undersøkt. Kandidatforeldre ble plukket ut blant individer som var samplet i rimelig nærhet til det aktuelle ynglehiet. RESULTATER OG DISKUSJON Suksessrate og genotypningskvalitet Av de innsamlede prøvene (Fig 1), har vi bare lyktes å få fram resultater fra spillnings- og sekretprøver. De to vevsprøvene var i meget dårlig forfatning og fungerte ikke bra. Vi har også forsøkt å kjøre noen av hårprøvene, foreløpig uten suksess. Her behøver vi noe mer tid til metodeutviklingsarbeide. Derimot fungerte spillnings- og sekretprøvene meget bra. Vellykket genetisk analyse ble gjennomført på 140 av de totalt 207 innsamlede prøvene (67 %). En suksessrate på 67 % er tilsvarende suksessraten som vi oppnådde i et eksperimentelt studium (Hedmark et al. 2004). Det kan være verdt å merke seg at prøvene syntes å fungere bedre jo lenger nord de var samplet. I Norrbotten og Västerbotten hadde vi en suksessrate på 77%, sammenlignet med 62 % i Jämtland/Dalarna. Suksessraten for begge disse områdene er betydelig høyere enn det vi har oppnådd i Sør-Norge de to siste årene (ca 50 %). FIG 1 FIG 1 Geografisk fordeling av alle innsamlede prøver (spillning, sekret, hår- og vevsprøver). 3

4 Stabilt vintervær kan være en mulig forklaring på at suksessraten synes å ligge høyere jo lenger nord man kommer. Andre studier samt egne erfaringer tyder på at resultatene blir langt bedre for ekskrementer samlet på snø enn resultater fra ekskrementer samlet på barmark (Lucchini et al 2003, Flagstad et al. 2004). Kvaliteten på genotypingen av de fungerende prøvene var også god. Allelic dropout (dvs. genotypningsfeil der kun det ene av to alleler (genetiske varianter) detekteres i analysen) ble funnet i mindre enn 10% av alle replikater for heterozygote individer detektert i Vi har tidligere påvist eksperimentelt at en slik genotypningsfeilrate gir korrekte resultater med tre replikater per locus for alle prøver (Hedmark et al. 2004). Individbestemmelse, hitilhørighet og foreløpige slektskapsanalyser De 54 fungerende prøvene fra Västerbotten og Norrbotten representerte totalt 35 ulike individer (Fig 2, 3; Appendix 1). Västerbotten var representert med 17 individer (8 hunner, 8 hanner) i 2002 (inklusive individ 1036 som ble funnet på den norske siden av grensen). I 2003 fant vi 6 ulike individer (5 hunner, 1 hann), hvorav to var representert også i 2002-materialet. I Norrbotten fant vi 11 ulike individer i 2002 (9 hunner, 2 hanner). Bare tre individer var representert i 2003-materialet (2 hunner, 1 hann). De 86 fungerende prøvene fra Jämtland og Dalarna representerte 45 ulike individer Fig 4, 5; Appendix 1). 23 av disse dyra (13 hunner, 10 hanner) var representert bare i 2002, mens 15 dyr (7 hunner, 8 hanner) var representert bare i individer (4 hunner, 3 hanner) var representert i begge innsamlingssesonger. Svært mange av prøvene var samlet på eller i nærheten av et ynglehi. I Fig 2 og 3 har vi gitt hver av disse ynglehiene en bokstav (a-q). Disse observasjonene med mulige slektskapsrelasjoner er oppsummert i Tabell 2. Vi ser at i de aller fleste tilfellene er det en enslig hunn som er samlet ved ynglehiet, som oftest antagelig den ynglende tispa. I tre tilfeller finner vi en enslig hann [ynglehi c, k og n]. Hannene ved ynglehi c og n er samplet i mai-juni 2002, og kan dermed representere unger født dette året. Ynglehi k ble av innsamler karakterisert som et gammelt hi, og hannen ved dette hiet (ind1015) kan enten være en ungjerv født i 2001 eller en eldre hann. I tre tifeller finner vi både hanner og hunner på ynglehiet (ynglehi i, l og m). Vi har et eneste tilfelle der et individ (1005) er samplet ved to ulike hi (ynglehi g og i). Ett av disse to hiene ble av innsamler ansett som et sannsynlig sekundærhi (ynglehi g). Foreløpige slektskapsanalyser (Tabell 2) indikerer nært slektskap mellom alle individene på ynglehiene e, f, g, h og i. Et mor/datter-forhold er f.eks. relativt sannsynlig mellom ind 1021 og Individene 1004 og 1020 er også sannsynligvis nært beslektet med disse (søster/mor/datter). Ingen av disse fire hunnene kan utelukkes som mor til individ Derimot er det bare individ 1021 og 1004 som kan være en mulig mor til individ 1034, som er samplet året etter. Her er individ 1021 den mest sannsynlige, både utifra den formelle analysen, og utifra lokaliteten til de to prøvene. For ynglehi x kan vi utelukke et mor/avkoms-forhold mellom individ 1022 (hunn) og 1012 (hann). Individ 1012 kan således være en voksen hann. For ynglehi x er det ganske klart at individ 1011 er avkom til individ 1010 eller Individ 1016 er den mest sannsynlige moren av disse to. Således blir den mest sannsynlige slektskapsrelasjonen på dette ynglehiet at individ 1016 er mor til både 1010 og

5 b a c e g f d h l i k j m n FIG 2 5

6 o p q FIG 3 6

7 u s y r t w v x FIG 4 7

8 v w x FIG5 8

9 I Jämtland og Dalarna hadde vi større suksess i å plukke ut sannsynlige familiegrupper. I tillegg til et sannsynlig far/datter-fohold (ynglehi u; Fig 4; Tabell 2), fant vi tre svært sannsynlige familiegrupper (Ynglehi v, w, x; Tabell 2, Fig 4, 5, 6). Vi ser at den reproduserende hannen i alle tre tilfeller er representert ved prøver som dekker et relativt stort område, mens hunnen i alltid er representert med prøver samplet tett på ynglehiet. Som det fremgår fra figuren, har alle disse slektskapsrelasjonene et høyt sannsynlighetsnivå. Vi understreker at en god del av betraktningene rundt mulig slektskap mellom individer i Tabell 2 er høyst foreløpige, ettersom mange av relasjonene er basert på kun 10 loci. Større sikkerhet vil kunne oppnås ved å kjøre ytterligere en del markører, men et enda sikrere resultat ville kunne oppnås dersom vi hadde prøver av flere potensielle fedre i nærheten av de ulike ynglehiene. Slike prøver er i stor grad mangelvare i det foreliggende materialet, spesielt for Norrbotten og Västerbotten. Tabell 2 Oppsummering av observasjonene på ynglehi registrert av innsamler Ynglehi Individer observert Kjønn Mulige slektskapsrelasjoner a 1001 F - b 1002 F - c 1018 M - d 1017 F - e 1036 F - f 1020 F - g 1005 M potensielle mødre: 1004, 1020, 1021, 1036 h 1021 F potensielle mødre: 1004, 1020, 1036 i 1004, 1005 F, M potensielle mødre for 1004: 1020, 1021, 1036 j 1006 F - k 1015 M - l 1012, 1022 M, F mor/avkoms-forhold kan utelukkes m 1010, 1011, 1016 F, M, F n 1014 M - o 1033 F - p 1032 F - q 1035 F - r 708, 710, 711, 732 F, F, M, M familiegruppe (se Fig 6) s 737 F - t 719 F mest sannsynlige mor; 1010 og 1011 avkom; 1010 kan ikke utelukkes som mor for de to andre u 96, 738 M, F 96 er en svært sannsynlig far til 738; mor ikke samplet v 721, 716 trolig voksen hann og hunn; ingen avkom samplet w 715, 716, 723, 734, 736, 739 M, M, F, M, M, M familiegruppe (se Fig 6) x 14, 83, 701, 702, 704, 705, 706, 726 M,M,F,M F,F,F,M familiegruppe (se Fig 6); også ubeslektede dyr nær hiet, muligens på grunn av kjøttgjømma y 707 M - 9

10 FIG 6 Sannsynlige slektskapsforhold i Jämtland og Dalarna. De reproduserende parene finnes innenfor de angitte sirklene. Tegnene for hann og hunn angir de reproduserende individene angir sannsynlighetsnivået til de tre familiegruppene. 10

11 KONKLUSJON En av de sentrale problemstillingene bak disse analysene, har vært å belyse hibruken hos reproduserende hunner, og hvorvidt bruk av flere ynglehi er vanlig. Utifra de foreliggende data, synes det ikke som om reproduserende hunner bruker flere ynglehi i særlig stor utstrekning. Så vidt vi kan se, har vi bare et påvist tilfelle av en sekundærlye (ynglehi g) indirekte påvisning gjennom individ 1005 (en hann som sannsynligvis ble født i 2002). Man må likevel ta i betraktning at datamengden er relativt begrenset, og at man kan ha gått glipp av enten primær- eller sekundærlyer i flere tilfeller. En mer detaljert kartlegging av ynglehibruken i Västerbotten og Norrbotten, krever nok derfor at samplingen legges opp noe mer strukturert. Det bør i alle tilfeller samples så tett som mulig på ynglehiene i mars/april før eventuelle unger har kommet opp på snøen. Dette for å sample den reproduserende hunnen med størst mulig sikkerhet. Videre bør man vende tilbake til hiet i mai/juni for også å sample eventuelle unger. Man bør også sample i relativ nærhet av ynglehiene under hele samplingsperioden, for å plukke opp mulige fedre, og derigjennom maksimere graden av sikkerhet på slektskapsanalysene. En slik samplingsstrategi vil nok gi en god del bonus i form av både kvantitet (mer data) og kvalitet (sikrere resultater). Vi ser fruktene av en mer omfattende samplingstrategi for ynglehiene i Jämtland og Dalarna. Her kunne vi, utifra de foreliggende data, slutte oss til tre svært sannsynlige familiegrupper. I tillegg har vi en del mulige mor/avkoms-relasjoner, som utgjør et verdifullt grunnlag for de data som vil bli generert fra prøver som kommer inn under de neste innsamlingssesongene. REFERANSER Davis, C. S., and C. Strobeck Isolation, variability, and cross-species amplification of polymorphic microsatellite loci in the family Mustelidae. Molecular Ecology 7: Duffy, A. J., A. Landa, M. O Connell, C. Stratton, and J. M. Wright Four polymorphic microsatellites in wolverine, Gulo gulo. Animal Genetics 29: Flagstad, Ø., Hedmark, E., Landa, A. Brøseth, H., Persson, J., Andersen, R., Segerström, P., and H. Ellegren Colonization history and noninvasive monitoring of a re-established wolverine population. Conservation Biology (in press). Hedmark, E., Flagstad, Ø., Segerström, P., Persson, J., Landa, A., and H. Ellegren DNAbased individual and sex identification from wolverine (Gulo gulo) faeces and urine. Conservation Genetics (in press). Lucchini, V., Fabbri, E., Marucco, F., Ricci, S., Boitani, L., Randi, E Noninvasive molecular tracking of colonizing wolf (Canis lupus) packs in the western Italian Alps. Molecular Ecology 11: Marshall, T. C., J. Slate, L. Kruuk, and J. M. Pemberton Statistical confidence for likelihood-based paternity inference in natural populations. Molecular Ecology 7: O Connell, M., J. M. Wright, and A. Farid Development of PCR primers for nine polymorphic American mink Mustela vison microsatellite loci. Molecular Ecology 5: Walker, C. W., C. Vilà, A. Landa, M. Lindén, and H. Ellegren Genetic variation and population structure in Scandinavian wolverine (Gulo gulo) populations. Molecular Ecology 10:

12 Appendix 1 Oversikt over fungerende prøver. Individ på kart Prøve Kjønn 1 innsamlernummer Dato År Län JS02-35B M 31-mar W JS M 18-feb Z JS F Z :1A 05-feb Z W02M JS02-29A M 15-mar W Z02M JS02-99 M 08-apr Z Z02M JS M 03-apr Z Z02M JS M 07-maj Z Z02M JS M Z :1A 18-apr Z Z02M JS02-92 M 13-apr Z W02F JS02-29C F 15-mar W W02M JS02-29D M 16-mar W W02F JS02-31A F 16-apr W W02F JS02-31C F 16-apr W W02F JS02-31D F 16-apr W W02F JS02-34A F 14-apr W W02F JS F W :4A 25-jun W W02F JS F W :5A 25-jun W W02F JS F W :6A 25-jun W W02F JS F W :7A 25-jun W W02F JS F W :8A 25-jun W Z02M JS02-71 M 03-maj Z Z02F JS02-74 F 08-apr Z Z02F JS02-76 F 21-feb Z Z02F JS02-75 F 21-maj Z Z02F JS02-79 F 08-maj Z Z02F JS02-80 F 08-maj Z Z02F JS02-83 F 08-apr Z 12

13 Z02M JS02-87 M 12-apr Z Z02M JS M 04-apr Z Z02M JS M Z :1A 20-mar Z Z02F JS02-89 F 21-feb Z Z02F JS02-93 F 12-mar Z Z02F JS F 24-mar Z Z02F JS F 20-feb Z Z02F JS F 20-feb Z Z02F JS F Z :1A 15-apr Z Z02F JS F Z :1B 15-apr Z Z02M JS M 12-apr Z Z02M JS M 2002? Z02M JS M 08-apr Z Z02M JS M 04-apr Z Z02M JS M 13-mar Z Z02M JS M 14-mar Z Z02M JS M 24-feb Z Z02M JS M 27-mar Z Z02M JS M 15-mar Z Z02M JS02-138A M 21-feb Z Z02M JS M 15-mar Z Z02M JS M Z :1A 28-feb Z Z02M JS M Z :1A 29-jan Z Z02M JS M Z :1A 02-feb Z Z02M JS M 07-mar Z Z02M JS M 25-mar Z Z02M JS M 26-feb Z Z02M JS M? 2002? Z02F JS F 06-maj Z 13

14 Z02F JS F 25-feb Z Z02F JS F 27-mar Z Z02F JS02-135A F 09-maj Z Z02F JS02-142A F 09-maj Z Z02F JS F Z :1A 18-feb Z Z02M JS M 07-mar Z Z02F JS F 15-mar Z Z02F JS F Z :1A 13-mar Z Z02F JS F Z :1A 11-mar Z Z02M JS M 07-maj Z Z03M JS M W :1A 13-feb W Z03F JS F W :1A 30-jan W Z03F JS F Z :1A 19-feb Z Z03M JS M Z :1A 31-jan Z Z03M JS M Z :2B 31-jan Z Z03M JS M Z :1A 31-jan Z Z03F JS F Z :1A 31-jan Z Z03M JS M Z :1A 07-apr Z Z03M JS M Z :1A 15-apr Z Z03M JS M Z :2C 31-jan Z Z03F JS F Z :1A 07-apr Z Z03M JS M Z :1A 04-jan Z Z03M JS M Z :1A 07-apr Z Z03M JS M Z :1A 02-mar Z Z02F JS F Z :1C 04-jul Z Z02F JS F Z :2C 27-jun Z Z03M JS M Z :1A 01-feb Z Z03F JS F 24-feb Z Z03F JS F 26-mar Z 14

15 BD02F JS02-01 F BD :1A 29-apr BD BD02F JS02-21 F 26-apr BD BD02F JS02-24 F 20-maj BD AC02F JS02-36:1A F 25-apr AC AC02F JS02-36:3A F 25-apr AC AC02M JS02-36:2A M 25-apr AC AC02M JS M 15-maj AC AC02M JS M 15-maj AC AC02M JS M 15-maj AC AC02M JS M AC :1A 10-maj AC AC02F JS02-37 F 16-maj AC AC02F JS F AC :2B 06-jun AC AC02F JS02-38A F 29-apr AC AC02M JS02-38B M 29-apr AC AC02M JS02-39 M 12-apr AC AC02F JS02-41:B1 F 18-maj AC AC02M JS02-41:D M 18-maj AC AC02M JS M 02-apr AC AC02M JS02-43A M 26-mar AC AC02M JS M AC :1B 17-jun AC AC02M JS M AC :2C 17-jun AC AC02M JS02-44A M 09-maj AC AC02M JS02-46 M 13-mar AC AC02F JS02-47:2B F 18-maj AC BD02F JS02-48 F 03-jun BD BD02F JS02-49 F 03-jun BD BD02M JS02-50 M 03-jun BD AC02F JS F 06-mar AC AC02F JS F 18-jun AC 15

16 AC02F JS F AC :1B 17-jun AC AC02F JS F AC :2C 17-jun AC BD02F JS F BD:020615:3C 15-jun BD BD02F JS F BD :1A 20-jun BD BD02F JS F BD.02XXXX:1A 2002 BD BD02F JS F BD :1A 20-jun BD BD02M JS M BD.02XXXX:1A 15-jun BD BD02F JS F BD.02XXXX:1A 15-jun BD BD02F JS F BD.02XXXX:2A 15-jun BD BD02F JS F BD.02XXXX:3A 15-jun BD BD02F JS F BD.02XXXX:4A 15-jun BD BD02F JS F BD.02XXXX:1A 15-jun BD BD02F JS F BD.02XXXX:2A 15-jun BD BD03F JS F BD.03XXXX:1A 01-jul BD BD03F JS F BD.03XXXX:1A 01-jul BD BD03M JS M BD :1A 15-maj BD AC03F JS F AC :1A 13-jun AC AC03F JS F AC :1A 25-apr AC AC03F JS F AC :1A 18-jun AC AC03F JS F AC :2C 18-jun AC AC03M JS M AC :1A 11-maj AC AC03F JS F AC :1A 23-apr AC AC03F JS F AC :1A 12-jun AC NO02F JS F 1A 11-jun NO NO02F JS F 2A 11-jun NO 1 F = hunn; M = hann 2 AC = Västerbotten; BD = Norrbotten; NO = Norge; W = Dalarna; Z = Jämtland 16