Momenter ved undervisningen i. ved. Sigurd H. From

Størrelse: px
Begynne med side:

Download "Momenter ved undervisningen i. ved. Sigurd H. From"

Transkript

1 Momenter ved undervisningen i Molekylær r utviklingsbiologi og embryo- / stamcelle- relaterte teknologier ved Sigurd H. From

2 INNHOLDSFORTEGNELSE 1 Innledning 2 Generelle molekylære mekanismer / fenomener under ontogenesen. Basis for funksjonell genomikk 3 Molekylære mekanismer for styring - og opprettholdelse - av ekspresjonsmønstre som basis for stabil celledifferensiering 4 Endogene og eksogene signalsystemer som påvirker gen-ekspresjon. Morfogenetiske gradienter 5 Molekylære mekanismer ved bestemte faser i embryogenesen 6 Embryo - relaterte teknologier. Medisinske implikasjoner 7 Kloning og stamceller. Ex vivo embryogenese Appendix 1: Appendix 2: Appendix 3: Appendix 4: Ordliste - Definisjoner Tidsinndelinger av fosterperioden hos mennesket Litteratur - referanser Web - referanser

3 1 INNLEDNING 1 Betegnelsen UTVIKLINGSBIOLOGI har tradisjonelt omhandlet det enkelte individs utvikling fra éncelletrinnet gjennom fosterperioden, - og for mange arters vedkommende, også frem til voksen organisme og død (ontogenesen). EVOLUSJONSLÆREN på den annen side dreier seg om artenes utvikling på jorden (fylogenesen). Bruk av molekylærbiologiske og molekylærgenetiske analysemetoder i utviklingsbiologien i de siste 20 år har vist oss den nære sammenheng det er mellom disse disipliner. Det er utallige eksempler på at gener og proteiner som først er blitt identifisert i enklere arter, særlig bananflue, men også gjærceller og bakterier, er konservert opp gjennom dyrerekken. Til dels utfører de tilsvarende eller lignende funksjoner hos mus og menneske som i de enklere arter. De pågående genom- og proteom-prosjekter bekrefter i høy grad dette, og de vil ha en enorm innflytelse på fagområdet MOLEKYLÆR UTVIKLINGSBIOLOGI i tiden fremover. Molekylær utviklingsbiologi vil i stadig større grad omfatte både de fylogenetiske og ontogenetiske aspekter ved de forskjellige former for liv her på jorden. Man regner med at det idag finnes et sted mellom 10 og 100 millioner levende arter på jorden; de aller fleste er éncellede. Fundamentale fellestrekk for alle celler er: - De lagrer sin arveinformasjon i DNA - De replikerer sin arveinformasjon ved templat polymerisering - De transkriberer deler av sin arveinformasjon til samme type (intermediært) produkt: RNA - De translaterer RNA til proteiner på samme måte Alle arter plasseres nå i tre hovedgrupper som vist i følgende figur hentet fra Molecular Biology of The CELL, 4. utgave, 2002: (=The CELL ) Figur 1-1

4 Følgende figur gir en oversikt over størrelsene til genomer for store grupper: 2 Figur 1-2 Det er antatt at det trengs minimum forskjellige gener for å gi en proteinbefolkning som er nødvendig for de enkleste celleformer ( minimumsgenom ). Forsøk er i gang for in vitro å lage en celle med et slikt antall gener. Ut i fra hva vi idag vet om arveinformasjon for alt levende, så har alle arter ca 200 gen-familier felles. Neste illustrasjon fra The CELL-2002 gir en oversikt over disse: Table 1-1 Gjennom evolusjonen har nye gener (og dermed arter) oppstått fra allerede eksisterende former. Vi kjenner i dag ingen måter som fører til at det i naturen kan dannes helt nye gener fra scratch.

5 Neste figur viser fire vanlige veier for genetisk innovasjon og som utgjør hovedmekanismer for molekylære evolusjon i de siste 2 4 milliarder år: 3 Figur 1-3 Med ontogenesen forstår man det enkelte individs utvikling fra fertilisasjonen til individets død. Tradisjonelt har utviklingsbiologi i denne sammenheng omfattet en omtale av individets utvikling fra fertilisasjon til fødsel, ofte brukt synonymt med embryologi. I dag blir det mer og mer vanlig å anvende betegnelsen molekylær utviklingsbiologi om endringsprosessene under hele ontogenesen. I vår sammenheng vil omtalen av molekylær utviklingsbiologi stort sett være begrenset til menneskets utvikling i de to første månemånedene etter fertilisasjonen, også kalt den egentlige embryonalperioden, samt tilsvarende periode hos enkelte modelorganismer som mus. Utviklingen av kjønnscellene, gametogenesen, vil også inngå da dette representerer en essentiell forutsetning for etablering av et nytt individ For mange kan det kanskje også være uklart hvorfor slike kunnskaper er nødvendige for fremtidig yrkesutøvelse. MOLEKYLÆR UTVIKLINGSBIOLOGI er ikke en samling teoretisk tankegods, men dreier seg om basale problemer som burde oppta oss alle. Og som i høy grad også har praktiskt relevans. Tidsskriftet Cell er av de fleste regnet som det fremste av alle tidsskrift innen moderne biomedisin med en meget stor redaksjonsstab av de ypperste forskere fra hele verden på dette fagfeltet. Over halvparten av disse definerer seg selv som utviklingsbiologer, og de har i høy grad vært blant de fremste til å skape grunnlaget for molekylær biologi, molekylær genetikk og molekylær medisin og molekylær cellemedisin. Teknologier for gen-diagnostikk, preimplantasjonsdiagnostikk, gen-terapi, in vitro fertilisasjon, transgene dyr som modeller for human-sykdommer, komparativ genomikk, knock-down teknologier (som RNAi), kloning og stamceller osv. er i høy grad utviklet av forskere som arbeider innen utviklingsbiologi. Dette er alle eksempler på områder som i tiden fremover vil få stadig større betydning for klinisk yrkesutøvelse. Dette heftet inneholder derfor et avsnitt om Embryo- og stamcellerelaterte teknologier. De mest dramatiske begivenheter i biomedisinen i de siste årene er knyttet til kloningen av sauen Dolly og dens etterfølgere, - sammen med etableringen av embryonale stamceller (ES-celler) fra mennesket. Det er ikke lengre utenkelig at man kan ta en differensiert celle fra en pasient og omgjøre denne til en ES-celle gjennom det som kalles terapeutisk kloning eller på annen måte. Slike ES-celler vil man så

6 differensiere og eventuelt gen-modifisere in vitro til den type behandlingscelle som pasienten trenger, enten som vehikler for gen-terapi eller som erstatningsceller ved degenerative tilstander eller for andre formål. Ved transplantasjon av slike celler vil man ikke vente forkastelsesreaksjoner siden cellene opprinnelig kom fra pasienten selv. Det er heller ikke urealistisk, - ut fra forsøk på mus - å anta at det i tiden fremover vil bli utviklet stadig mere avansert teknologi for in vitro organogenese basert på slike ES-celler og kanskje stamceller fra fødte individer (adulte stamceller). For mange av oss er det nesten utrolig ut fra vanlig tenkemåte i molekylær cellebiologi - at f. eks. en fibroblast som har vært dyrket i kultur i månedsvis og som stammer fra en 17 år gammel okse eller lignende (se følgende figur) kan omprogrammeres og resultere i dannelsen av en komplett organisme. 4 Figur 1-4 Ved kloning, altså overføring til en kjernefri eggcelle, må fibroblastens kjerne lære seg på noen timer det som spermier og oocytter bruker måneder og år på! - innbefattet rekonfigurere sine telomerer og sitt epigenetiske mønster - pregningsbilde / methyleringsbilde histon kode. Det er vanskelig å tenke seg en mer fantastisk demonstrasjon av miljøets betydning for funksjonell genomikk. MOLEKYLÆR UTVIKLINGSBIOLOGI er også et fag som stimulerer til undring over hva liv er og over livets mangfoldighet. I 1965 fikk Francois Jacob Nobelprisen i fysiologi eller medisin sammen med Jacques Monod for sitt grunnleggende pionerarbeid om gen-reguleringsmekanismer hos prokaryote. Disse to, sammen med Louis Pasteur og Madame Curie er vel Frankrikes mest kjente vitenskapspersoner gjennom tidene. Francois Jacob var i over 50 år knyttet til Pasteur-instituttet i Paris. Etter Nobelpristildelingen skiftet han fra å studere prokaryote organismer til utviklingsbiologi med hovedvekt på studier av transkripsjonsmekanismer og med transgene mus som modellsystem. I sin siste bok (fra 1997 La souris, la mouche et l homme ) skriver han bl.a.: Det helt utrolige er at når befruktningen har funnet sted, begynner den første celle, den befruktede eggcelle, å dele seg. Det gir to celler, så fire. Så åtte. Deretter en liten klump av celler. At denne klump setter seg fast i livmorveggen, at den blir lengere, vokser og noen måneder senere er blitt til et barn som i 95 % av tilfellene er utstyrt med alt som skal til for reisen gjennom verden og til og med kan tenke, det er mirakelet. Det er det mest forbløffende fenomen som forekommer her i verden. Så forbløffende at det burde være gjenstand for forundring over hele jorden. At menneskene burde bruke sin tid på å spørre seg selv om hvilke mekanismer som ligger til grunn for et sådant under.

7 I essential cell biology, 2. utgave 2004, er lignende tanker formulert på denne måten: 5 Fertlization marks the beginning of one of the most remarkable phenomena in all of biology - the process of embryogenesis, in which the zygote divides to produce large numbers of diploid cells that develop into a new individual. Sigurd H. From April 2004 (s.h.fromm@basalmed.uio.no)

8 2 Generelle molekylære mekanismer / fenomener under ontogenesen. Basis for funksjonell genomikk 2.1 Det nye individs genetiske konstitusjon bestemmes ved fertilisasjonen. Dette bestemmes av DNA-innholdet i kjernene til den sædcelle og eggcelle som fusjoner ved fertilisasjonen og derved danner startcellen, zygoten. I tillegg vil også DNA-innholdet i eggcellens mitochondrier være av betydning. Man antar at sædcellen ikke bidrar med mitochondrier ved zygotedannelse. 2.2 Økning i celletallet ved mitotiske delinger (proliferasjon). Den første celledelingen finner sted ca 24 timer etter fertilisasjonen. Gjennom hele fosterperioden er det høy mitotisk aktivitet. Et nyfødt menneske består av ca 5000 milliarder celler og som voksen av opp mot milliarder celler. Totalantallet celledelinger i løpet av et menneskeliv har vært angitt til 10 16, noe som i gjennomsnitt svarer til 350 milliarder mitoser hvert døgn eller 3 millioner mitoser hvert sekund. Mus, som er det mest benyttede forsøksdyr, består av ca 2 milliarder celler ved fødselen (etter en 19 døgns fosterperiode) og av ca 40 milliarder celler som voksen. Parallelt med nydannelsen foregår en programmert celledød. 2.3 Essentielle prosseser under fosterutviklingen I tillegg til den uttalte celleproliferasjon er det tallrike andre kompliserte prosesser som finner sted under fosterutviklingen. Et svært viktig punkt er den fenotypiske forskjelliggjøring av cellene (spesialisering eller differensiering) som foregår, videre utstrakte cellevandringer (-migrasjoner) til bestemte destinasjoner i organismen, utvelgende samhold (adhesjon) mellom visse celletyper og avvisninger (repulsjoner) mellom andre. Videre evne til signaloppfangelse og -utsendelse, signalformidling og selektiv respons på myriader av påvirkninger og med et mønster som er et resultat av cellenes erfaringsbakgrunn og tidsriktige (homokrone) kompetanse i påvirkningsøyeblikket slik at ugunstige / letale cellereaksjoner ikke oppstår. Cellene må hele tiden ha erkjennelse av sin posisjon i organismen og en forståelse av organismens arkitektur og de relative størrelsesforhold. Etterhvert utvikles også det molekylære grunnlag for kognitive reaksjoner. Tilsammen representerer fosterutviklingen (og hele ontogenesen) et uhyre komplekst system og med en logistikk som vi er langt fra å ha overblikk over. Allikevel er det så at i løpet av de siste 100 år og særlig de 20 siste årene har vi fått en ganske bra oversikt over mange fundamentale forhold i molekylær utviklingsbiologi.

9 2 Noen av de mest sentrale ledd vil bli omtalt i denne fremstillingen. 2.4 Genetisk ekvivalens Gjennom embryogenesen dannes det stadig flere forskjellige celler hva angår struktur og funksjon. Dette skyldes ikke endringer av DNA-sekvenser. Alle somatiske celler er DNA-messig lik zygoten (med unntak av visse immunkompetente celler og de kjønnsceller som individet lager). Man sier at alle individets celler er genetiske ekvivalente med zygoten hva angår DNAsammensetning. Denne fundamentale erkjennelse fremkom gjennom kloningseksperimenter utført av britiske forskere på 1950-og 1960-tallet, særlig av John Gurdon. Figur 2.1 viser slike forsøk. Fig. 2-1 Senere kloningsforsøk har bekreftet at tesen om genetisk ekvivalens også er korrekt for pattedyr.

10 3 2.5 Differensiell gen-ekspresjon er basis for dannelse de ulike celle-fenotyper. Man mener i dag (2004) at det er gener i det humane genom. Det antas at hver enkelt celle i organismen uttrykkes omkring gener som resulterer i dannelse av mange former for genprodukter Med uttrykket genprodukter har man tradisjonelt tenkt på proteiner, men i dag opererer man med en langt videre inndeling som her angitt: Primære gen-produkter er alltid RNA-molekyler.Disse kan igjen inndeles i translaterbare RNAenheter (exoner) som resulterer i proteinsyntese og ikke-translaterbare RNA-enheter (også kalt RNA fra non-protein-coding DNA). Eksempler på ikke-translaterbare RNAer er terminale (infrastrukturelle) RNA-molekyler som rrna, trna, katalytiske RNA-varianter (ulike ribozymtyper) og riboregulatorer som mirna, sirna og (potensielt) prosesserte introner. Det er grunn til å tro at ca av disse genene uttrykkes i alle celler og i hovedsak resulterer i dannelse av proteiner som cellene benytter i sitt intermediære stoffskifte og til andre generelle cellefunksjoner (såkalte husholdningsproteiner ) I tillegg uttrykkes flere tusen gener som gir de forskjellige grupper av celler sine spesielle fenotyper, morfologiske manifestert som epitelceller, bindevevsceller, blodceller, muskelceller, nerveceller osv. Slike differensieringsgener befinner seg primært i den del av genomets gen-pool ( gener?) som kommer i tillegg til nevnte husholdningsgener. Med betegnelsen transkriptom forstås det komplette sett av gener som uttrykkes i en celle under gitte betingelser (alternativt i et organ eller en hel organisme). Det betyr samtlige RNA-molekyler som er tilstede,også inkludert mrna-typer som er et resultat av alternativ spleising og multiple mrnaer dannet fra samme gen. Molekylær utviklingsbiologi dreier seg i betydelig grad om å forstå de mekanismer som bevirker utvelgelse og transkripsjon av de gener som er nødvendig for å etablere de ulike cellefenotyper som oppstår under embryogenesen og som muliggjør ko-operasjon mellom cellepopulasjonene. Dette kan kalles for funksjonell genomikk og omfatter nå viktige sektorer som: - konvensjonell transkripsjonsregulering (se del 3.2) - epigenetiske modifikasjoner (se del 3.3) av kromatinmaterialet som methylering-, acetylerings- og fosforyleringsforhold, inkludert histon-koder. Dette er essentielle komponenter i de prosesser som gjør at en gitt differensiert celle opprettholder sitt transkripsjonsmønster gjennom tallrike cellesykluser. (Normalt vil f. eks alle etterkommere av en fibroblast være fibroblaster.) - riboregulatorer (microrna = mirna, RNAi, se del 3.4) Når det blir mulig å gjøre transkriptom- og proteom-analyser på enkeltcellenivå, vil man ha et langt bedre grunnlag for å presisere hva som ligger i uttrykk som differensierte celler og differensieringsnivåer. Inndelingen på morfologisk grunnlag i celletyper er inadekvat. Med utgangspunkt i et totalt celletall på milliarder celler i en voksen menneskeorganisme er det mer sannsynlig at det foreligger 1000 milliarder ulike fenotyper (hvis

11 4 man legger til grunn at 99% av cellene er klonale ekspansjoner av en gitt celletype i en gitt lokalisasjon og under gitte bestingelser (ref.: John S. Mattick. Nature Review of Genetics. April 2004). 2.6 Komparativ genomikk. Organiseringen av det humane genom Her nevnes bare noen få punkter: Hver somatisk celle har 1 meter DNA ( np) fra sædcellen og 1 meter DNA ( np) fra eggcellen, fordelt på de 46 paternale og maternale kromosomene.hvis vi setter den haploide lengde (1 meter) lik 3000 km (Oslo - Napoli), svarer 1 np til 1 mm. De 2 meter med DNA sammen med de kromosomale proteiner og annet skal ha organisert plass en cellekjerne som gjennomsnittlig har en diameter på 6 µm. Dette tilsvarer å plassere en sytråd på 40 km i et bestemt mønster inne i en tennisball. Et gjennomsnitts gen i det humane genom er på np. Nesten alle gener i det humane genom er delt i exoner og introner. Exonene utgjør i snitt ca 5% av hvert gen, intronene 95%. Et gjennomsnittsexon består av 145 np og det finnes ca 9 exoner i et snitt-gen (max. antall exoner i et gen er 178). I et snitt-gen er det 8 introner med en middelverdi på ca 3200 np, ialt pr. gen ca np. Genene (exoner og introner) utgjør kun 25% av genomet. Bare ca 1% av det humane genom består av proteinkodende områder. Alle intronene utgjør 24% av genomet. Samtlige exoner i genomet utgjør ca 32 millioner np og ca 40 km av genomets 3000 km! Tilsvarende tall for alle introner er 800 millioner np og 720 km. Gener som koder for proteiner (gener som inneholder exoner) transkriberes til pre-mrna. Pre-mRNA må som kjent prosseseres i kjernen på ulike måter (capping, polya-hale m.m.) I tillegg må intronene kuttes ut og exonene ligeres, enten i samme sekvens som informasjonen finnes i genet, eller ved alternativ spleising. Man mener nå at transkriptene fra over 60% av humane gener blir gjenstand for alternativ spleising. Over 80% av slik spleising resulterer i proteiner med en endret aminosyresekvens. Dette er basis for at det humane genom antas å gi grunnlag for et proteom som omfatter mellom og proteiner til tross for et gen-tall på Såvel sekvensielle som alternative kutte- og spleiseprosesseringer av pre-mrna til mrna forestås av meget store riboprotein- maskiner, kalt spliceosomer. Nyere data viser at slike maskiner består av fem snrna - molekyler (sn = small nuclear) og opp til 300 forskjellige proteiner. Det har vært en utbredt oppfatning at utkuttede introner ikke har noen funksjoner og at de blir degradert i kjernen. Dette syn er i ferd med å endre seg i retning av at de kan ha viktige regulatoriske funksjoner (bl.a. som mirna, se senere), og at de kan plasseres i den store gruppen som nå kalles ncdna (non-codingdna) eller bedre npcdna (non-protein-coding-dna). npcdna omfatter betydelige deler av genomet i tillegg til intron-kodendedna.

12 5 Figur 2-2 Komparative genom-analyser viser at mengde npcdna pr. genom har økt betydelig gjennom evolusjonen, illustrert i følgende figur (hentet fra John S. Mattick. Nature Review Genetics. April 2004)

13 6 Figur 2-3 Disse genom-endringene i npcdna viser et visst sammenfall med evolusjonsmessig kompleksitet til arter på jorden, særlig til overgangen mellom prokaryote og eukaryote som illustrert i neste figur hentet fra samme kilde:

14 7 Figur Kvalitative og kvantitative vurderinger av translaterbare RNA - populasjoner (mrna-populasjoner) pr. celle Det antas at en gjennomsnittlig somatisk celle totalt inneholder forskjellige mrna-molekyler. Mange av dem (10.000?) er like for alle somatiske celler i kroppen. Det er antatt at cellene inneholder færre enn 10 eksemplarer av hver av disse mrna former ( få-eksemplar gruppen - gruppe 1). I en mellomgruppe (gruppe 2) finnes omkring 10 mrna typer som hver foreligger i ca eksemplarer. Den tallrikeste gruppen omfatter bare noen ganske få mrna-typer (1-5?), men disse kan finnes i opptil eksemplarer pr. celle. 2.8 Kvalitative og kvantitative vurderinger av ikke-translaterbare RNA - populasjoner (non-protein-coding) npcrna - populasjoner pr. celle Dette omfatter typer av RNA nevnt under punkt 2.5. Dette er nå et forskningsfelt i rivende utvikling. Kvantitative data kan ennå ikke angies.

15 8 2.9 Kvalitative og kvantitative vurderinger av total protein-populasjon pr. celle (proteomet) Det er flere enn forskjellige proteinmolekyler i en somatisk celle (som et resultat særlig av differensiert transkripsjon og alternativ spleising). I gjennomsnitt er det ca 1 million av hvert proteinmolekyl (men med stor spredning). Følgelig inneholder en somatisk celle omkring 10 milliarder proteinmolekyler totalt (og antagelig ca 4 millioner ribosomer). Ved symmetriske celledelinger antar man at hver av de to nye celler får ca 5 milliarder proteinmolekyler og 2 millioner ribosomer. I løpet av G 1 øker proteintallet på nytt til 10 milliarder. Transkripsjonshastighet ved dannelse av mrna er ca 40 nt pr. sekund og ved proteinsyntese koples 15 aa sammen pr. sekund. Totalantall proteiner i en musezygote kan være opp til 1300 milliarder og i en human zygote opp til 4400 milliarder. Et gjennomsnittsprotein består av 300 aa. Teoretisk kan det lages forskjellige proteiner som alle er på 300 aa ut i fra de 20 forskjellige aminosyrer som er til disposisjon. Dette tallet er så stort at det å lage et slikt antall proteiner vil kreve flere atomer enn hva hele universet er anslått til å inneholde. De proteinene som skal til for å lage et menneske er derfor et lite og meget selektivt utvalg i forhold til de teoretiske muligheter. Dette er en proteinskatt som vi i stor grad har fått fra de andre artene på jorden, og som vi i betydelig utstrekning deler med dem. Et resultat av evolusjonsprosesser over 4 milliarder år.

16 3 Molekylære mekanismer for styring - og opprettholdelse - av gen-ekspresjonsmønstre som grunnlag for stabil celledifferensiering 3.1 Nivåer for kontroll av gen-ekspresjon på veien til funksjonelle sluttprodukter. Figur Konvensjonell transkripsjonsregulering. Transkripsjonsfaktorer. Gen-regulatoriske proteiner inkl. DNA-bindende proteiner og deres kognate nukleotidsekvenser Med konvensjonell transkripsjonsregulering tenker man først og fremst på mekanismer som styrer ekspresjon fra proteinkodende gener. Den tradisjonelle modellen for dette er vist i figur 3-2, bestående av et promotorområde og enhancer regioner, begge plassert oppstrøms for det strukturelle gen. En rekke gen-regulatoriske proteiner inngår i de komplekser som avgjør om påvirkningen leder til uttrykking av genet eller represjon av samme. Sentralt i styringskompleksene er DNA-bindende proteiner (hyppig kalt transkripsjonsfaktorer) som spesifikt kan interagere med utvalgte, kognatenukleotidsekvenser, ofte bestående av 6-10 nukleotider og lokalisert i enhancer-område

17 2 Figur 3-2 Figur 3-3 Ernhancer-områdene er ofte lokalisert flere tusen nucleotider fra promotorregionene. Det er en vanlig antagelse at de regulatoriske proteiner i begge regioner interagerer ved løkkedannelse av DNA til et stor funksjonelt styringskompleks.

18 Transkripsjonsfaktorers spesifisitet til kognate nucleotidsekvenser beror på utformningen av funksjonelle domener ( motifs ) i de DNA-bindende proteiner. En vanlig hovedinndeling av slike domener er som følger: Helix - Turn - Helix utformning. Dette er en stor samling av DNA-bindende proteiner som bl.a. omfatter en meget viktig gruppe av transkripsjonsfaktorer av den største betydning under fosterutviklingen. Sistnevnte gruppe kalles homeotiske gener. En rekke av dem koder kun for ett DNA-bindende proteindomene. Slik informasjon finnes i gen-sekvenser på 180 nt (homeoboksen) som koder for helix-turn-helix domener i proteinuttrykkene. Disse er på 60 aa og kalles homeodomener. Slike homeotiske poteiner fungerer gjerne som homo-dimerer ved transkripsjonsregulering. Homeotiske gener som koder for proteiner som kun inneholder denne type DNA-bindende domene, kalles hox-gener. En rekke homeotiske proteiner inneholder også andre typer DNA-bindende domener i tillegg til homeodomenet. Gruppen homeotiske gener omfatter derfor mange flere utviklingsgener enn hox-genene Neste figur viser strukturell organisasjon av et homeodomene protein Figur 3-4 Figur 3-5

19 Bananfluer har 8 homeotiske gener, samlet i to klynger eller clustre. Det er ca. 500 millioner år siden vi (mus og mennesker) var bananfluer. I løpet av denne utviklingsperioden har de homeotiske gen-samlingene amplifisert seg og fordelt seg på fire av våre kromosomer (humankromosomer nr. 2, 7, 12 og 17). Neste figur viser et standardkart over de homeotiske gener hos bananflue og pattedyr inkludert mennesket. Hos vertebrater kalles disse genene Hox-gener. 4 Figur 3-6 Legg merke til 3-5 orienteringen. 3 gener uttrykkes tidligere enn 5 gener og mere anteriort i organismen. Man sier at det er en form for ko-linearitet mellom gen-organiseringen i kromosomene og ekspresjonsmønsteret i kroppen. Hox-gener er avgjørende for identiteten til kroppsavsnitt spesielt langs den anterior posteriore lengdeakse (hode-hale). Dette kommer til uttrykk bl.a. i utformningen av neuralrør og neurallister, somitter, ekstremiter m.m. (Derimot er det utviklingsgener som koder for proteinligander som særlig preger spesifiseringen av dorso-ventral akser (eks. DVakse i neuralrør) og medial-lateralakser (ML-akser, høyre-venstre akser og organ asymmetrier.) NON-HOX HOMEOBOKS GENER (NB: Husk alle er TFer!): Spesifisiteten til homeoboksgener hva angår krav til målgener, øker hvis homeoboksgenet også inneholder nucleotidsekvenser som koder for andre DNA-bindingsdomener i transkripsjonsfaktorene enn homeodomenene.. Neste figur er en illustrasjon på grupper av slike gener:

20 5 Figur 3-7 Av stor betydning under hele ontogenesen har den undergruppen som kalles Pax-gener Transkripsjonsfaktorer med zink-finger - domener I slike proteiner utgjøres DNA-bindingsdomenene ikke bare av en gitt aminosyresekvens, men også av zink-atomer som strukturelle komponeneter. Et eksempel på strukturell organisasjon figur 3-8 Figur 3-8 Zink-finger konfigurasjonen benyttes i en rekke transkripsjonsfaktorer som er uttrykt fra utviklingsgener.

21 3.2.3 Transkripsjonsfaktorer med leusin-glidelås- (Leucine Zipper-) domener. Heterodimerer 6 Denne type proteiner danner ofte dimerer med proteiner med andre former for DNA-bindende domener, noe som i betydelig grad øker mulighetene for bindingsspesifisitet til kognate DNA-sekvenser. Mange transkripsjonsfaktorer, kodet for av utviklingsgener, benytter slike mekanismer. Figur 3-9 illustrerer heterodimerers interaksjon med DNA. Figur Epigenetikk. Kjerne - territorier Dette fagområdet er for tiden gjenstand for intens forskning, ikke minst som følge av kloning basert på overføring av differensierte, somatiske celler til enucleerte oocytter. Dette innebærer en grad av reprogrammering av celledifferensiering som meget få trodde var mulig for få år siden. Her omtales kort visse gen-bruks mekanismer ved normal ontogenese. Reprogrammering og transdifferensiering omtales i kap. 7. Regulering av gen-ekspresjon gjennom de konvensjonelle transkripsjonsmekanismer nevnt foran, forutsetter at de involverte transkripsjonsfaktorer og andre komponenter kan komme i direkte fysisk kontakt med aktuelle cis-regulatoriske områder for et gitt gen. Dette krever at lokal topografi i kromatinmaterialet er slik at tilgang muliggjøres - aktivt kromatin eller eukromatin, noe som igjen innebærer at det kromosomale målområdet er dekondensert i forhold til heterokromatin. Kromatinets kondenseringsgrad er også avgjørende for prosesser som DNA-replikasjon, rekombinasjon og DNA-reparasjon i tillegg til gentranskripsjon. Det er fortsatt mange uklarheter med hensyn til hva om styrer kromsomers kondenseringsgrad i interfase og dermd eukromatin- / heterokromatin-bildet. Det samme gjelder de enkelte kromosomers plassering i interfasekjerner, f.eks. hvorvidt et gitt kromosom primært er lokalisert til et bestemt delområde eller territorium innen kjernen. Vedvarende tilgjengelighet for transkripjonskomplekser til geners regulatoriske sekvenser forutsetter styring av kromosomkonfigurasjoner på en slik måte at etablerte transkripsjonmønstre kan opprettholdes og dermed være med på å danne basis for stabile celledifferensieringer og proliferasjonsforhold. Eksempelvis vil fibroblaster, selv etter tallrike mitoser, gi opphav til celler som fenotypisk er fibroblaster, det vil si transkriberer fibroblast-spesifikke gener. Embryogenesen er hovedfasen i livet for etablering av differensierte celleformer korrelert med celleproliferasjon. Samtidig legges grunnlaget for å bevare, - stabilisere - de etablerte transkripsjonsmønstre som er basis for celledifferensieringen. Hva er de molekylære mekanismer for slike former for celle-hukommelse? Som presisert foran skyldes det ikke endringer av DNA-sekvenser. Kloningseksperimentene har jo vist at så godt som alle differensierte celler i en organisme er genetisk ekvivalente.

22 I dag bruker man betegnelsen epigenetikk for å beskrive slike stabile endringer av genekspresjonspotensialet som særlig etableres i fosterperioden, men som også kan oppstå / videreutvikles senere i livet og som ikke innebærer DNA-sekvens forandringer. Til tross for dette er de epigenetiske endringene arvelige, hereditære. De molekylære mekanismer for epigenetikk er spesielt knyttet til kovalente modifikasjoner som methylering av DNA (inkludert såkalt imprinting eller pregning), videre til det som nå kalles histon-koden (se senere), til non-histon proteiner i kromatin samt ATP-avhengige remodellerings-komplekser DNA-methylering Methylgrupper finnes på bestemte steder i DNA og knyttet til cytosin i CpG dubletter og i begge polynucleotidkjeder. Fra 2-7% av cytosin i DNA hos animalske celler er methylert. Prosessen katalyseres av bestemte methyltransferaser. Slike methylering kan direkte blokkere mulighetene for transkripsjon av et nærliggende gen (bl.a. ved å hindre enhancer - promotor interaksjon) eller ved at bestemte methyl-cpg-bindende proteiner bidrar til blokkeringen. I visse tilfeller kan også methylering fremme transkripsjon. Like etter fertilisasjonen, under furingsdelingene, foregår det en utstrakt demethylering av genomet (unntatt pregede områder, se under). Etter implantasjonen starter en global methyleringsbølge (basert på methyltransferase-aktivitet) som er særlig aktiv under gastrulasjonen hvoretter den avtar. Det er vel etablert at slik DNA-methylering er essentiell for embryogenesen hos vertebrater. Globalt er over 80% av CpG-sekvenser methylerte i ikke embryonale celler. Men det finnes umethylerte CpG øyer i dette methylerte havet. Slike CpG-øyer kan være nukleotidpar lange. Det er antatt at genom hos pattedyr inneholder ca slike øyer, ofte lokalisert til promotor-områder knyttet til husholdningsgener IMPRINTING (pregning) En viktig form for methylering av DNA inngår i fenomenet IMPRINTING. Med dette forstår geners hvis ekspresjon er beroende på om genet kommer fra far eller mor (paternalt eller maternalt allele). Imprinting ble oppdaget ved eksperimenter utført på mus tidlig på 1980-tallet. Man forsøkte da å få uniparentale, diploide musefostre til å utvikle seg. (Haploide eggceller kan eksperimentelt diploidiseres og gir da gynogene fostre. Alternativt kan i en zygote eggcellers kjerne fjernes og sædcellens kjerne eksperimentelt diploidiseres. Dette gir androgene fostre). Ingen av disse to varianter utviklet seg ut over de tidligste stadier, noe som indikerte epigenetiske forskjeller mellom de paternale og maternale gameter og at begge er nødvendige for normal fosterutvikling og placentadannelse. De epigenetiske forskjellene knyttet til imprinting beror særlig på det DNA-methyleringsmønster som etableres i cis-områder til visse gener under gametogenesen. Tallet på slike gener hos mus og menneske angis ofte til stykker. Dette mønster av pregede gener forblir stabilt etter fertilisasjonen og gjennom den videre utvikling. Det er visse likheter mellom imprinting som omtalt her og X-kromosom inaktivering hos hunnkjønn Histon-koden Denne er basert på oppfatninger om at histoner, særlig i nucleosomene, kan kovalent modifiseres ved forskjellige former for enzymaktivitet som fører til methylering, acetylering og deacetylering, fosforylering og ubiquitinering. Videre at non-histon proteiner kan lese og interagere med slike konjungasjonsmønstre og derved modifisere kromatinstrukturen så f.eks. gener i aktuelt kromosomområde kan transkriberes. Sidekjeder til nucleosomale histoner er preferensielle modifikasjonsseter som vist i figur

23 Figur

24 9 Figur 3-11 Det er også gode indikasjoner på at det er et samspill mellom de mekanismer som inngår i histon-kode komplekset og styringsregimer for DNA-methylering. Figur 3-12

25 Riboregulatorer. RNAi, mirna og sirna. Translasjonskontroll RNAi står for RNA interferens. Dette er et forskningsfelt som har fått enorm oppmerksomhet i de siste årene. RNAi er i ferd med å revolusjonere molekylær biomedisin, både hva angår vår forståelse av mekanismer som fungerer under normal celledifferensiering, embryogenese / ontogenese og som årsaker til utviklingsdefekter og en rekke sykdommer iberegnet cancer. Sammenfattet kan man si at RNAi særlig hemmer translasjon av mrna molekyler og dermed blokkerer dannelsen av kognate proteinmolekyler. Visse former for RNAi synes også å kunne delta i transkripsjonskontroll og i prosesser som fører til strukturelle endringer av kromatin. I tillegg er RNAi også i ferd med å bli et av våre viktigste verktøy for eksperimentelle påvirkninger og analyser innen genomikk, genetikk og for fenotype-manifestasjoner. Eksperimentell bruk av RNAi vil bli omtalt i kap 6 og 7. Her vil vi ta for oss noen av de biologiske funksjoner. Fenomener knyttet til det vi i dag kaller RNAi fikk sitt gjennombrudd i 1998 da Andrew Fire og medarbeidere publiserte en artikkel i Nature om at tilføring av dobbelt trådet RNA (dsrna) til modellorganismen C. elegans (en rundorm) førte til sekvensspesifikk ned-regulering av gen-ekspresjon. (Dette var på en del måter en videreføring og presisering av eksperimenter gjort tidlig på 1990-tallet på petuniaer, hvor spesielle transgene modifikasjoner hadde gitt slike planter med endret pigmentasjon.) Fires forsøk hadde også nær relasjon til noe andre C.elegans forskere hadde registrert allerede i 1993 og som var knyttet til ekspresjon av visse endogene rundorm-gener). Det er en stor overraskelse for de fleste at observasjoner som disse - og særlig Fires arbeid - på få år skulle få en slik innflytelse på molekylær biologi for planter og dyr og molekylær medisin som vi ser i dag. Man kjenner i dag en rekke gener knyttet til RNAi hos mange vertebrater, inkludert mus og mennesker. Det er nå enighet om at RNA-interferens fenomener skyldes effekter av dsrna, enten dsrna foreligger inne i celler som følge av transkripsjon av gener for spesielle ( non-coding ) ncrna eller fra andre endogene kilder som former for heterokromatisk DNA, transposoner, visse virustyper eller er tilført fra eksogene kilder. Slikt dsrna vil bli prosessert inne i cellene i hovedtrekk på samme måte enten dsrna har en celleintern eller -ekstern opprindelse. Prosesseringen fører til dannelse av dsrnaer på (ca.) 22 np. Slike RNA-molekyler kalle microrna (mirna) hvis opprindelsen er fra ncrna-gener (nå også kalkt mirna-gener). Det primære transkripsjonsprodukt fra disse gener er på opp til 1000 np og benevnes nå ofte pri-mirna. Slike molekyler prosesseres inne i kjernen av et proteinkompleks (kalt Drosha) til pre-mirna. Selektive eksportmediatorer (som eksportin5) bevirker transport av pre-mirna fra kjernen til cytoplasma via kjerneporer. Her bindes pre-mirna til et nytt proteinkompleks (kalt Dicer) som videredegraderer pre-mirna til mirna. Dette mirna vil så koples til nok et proteinkompleks, kalt RISC (RNA-induced silencing complex). Gjennom denne bindingen blir mirna gjort enkelttrådet (ss = single stranded) og brakt i kontakt med målmrna (= mrna for proteinsyntese) ut i fra nucleotid-komplementaritet mellom ss-mirna og mål-mrna. Dette leder til inaktivering / degradering av mål-mrna og manglende syntese av det (kognate) protein som det inaktiverete mrna inneholdt informasjon for. Man har nå identifisert ca 250 mirna gener hos mus og menneske. Biogenesen av mirna i planteceller følger de samme hovedlinjer som her angitt for animalsk mirna, men med en del ulikheter i de enkelte ledd Også prosessering av eksogen RNA fører til dannels av molekyler på 22 np. Disse kalles hyppig small iinterfering RNA (sirna) og koples til RISC-komplekser med samme effekter som for mirna. Både mirna og sirna er derfor en viktige mekanismer for translasjonskontroll. Figur 3-13 (fra D.P.Bartel i tidsskriftet Cell for 23. jan. 2004) gir en sammenfattet fremstilling av disse prosesseringsveier:

26 11 Figur 3-13 RNAi systemet er mest kjent i relasjon til translasjonskontroll med hemming av manglende proteinsyntese som resultant. Det bør understrekes at slike dsrna-molekyler også kan ha andre effekter, så som aktivering av transkripsjon av proteinkodende gener.: Et meget sentralt punkt i utviklingsbiologi er spørsmålet om hvordan de ulike vevstyper og cellelinjer innen disse, etableres. Slike spørsmål blir nærmere behandlet i kap.7. Her skal bare nevnes som et eksempel visse forhold hva angår multipotente, adulte, neurale stamceller i hippocampus. Slike celler kan proliferere, men transkripsjon av de gener som skal til for å gjøre dem til aktive neuroner er normalt hemmet. Hvordan kan denne hemmingen oppheves ved behov? Fred Gage og medarbeidere ved Salk instituttet har nylig (mars 2004) vist at en bestemt type dsrna på ca 20 np er nødvendig og tilstrekkelig for å oppheve differensieringshemningen av slike stamceller og dirigere dem inn på en utviklingsvei til å bli aktive neuroner. RNAi-systemet kan også bevirke forandringer av kromatin-konfigurasjoner, muligens ved å påvirke DNA-methyleringsforhold. Nylig (februar 2004) er det fremstilt transgene mus hvor et gen for et essensielt protein i Dicer-komplekset er satt ut av funksjon. Derved umuliggjøres også Dicer-funksjonen. Dette er letalt allerede i gastrulasjonsfasen for homozygote knockout-mus av denne typen, en klar indikasjon på betyningen av RNAi-prosesser i tidlige trinn av fosterutviklingen. Det er grunn til å tro at videre forskning i de nærmeste årene vil klarlegge mange sider ved RNAi-systemets betydning for fosterutvikling / ontogenese hos mus og mennesker

27 Andre translasjonskontrollpunkter Disse fremgår av figur Figur 3-14

28 4 Endogene og eksogene signalsystemer som påvirker gen-funksjoner. Morfogenetiske gradienter. Funksjonell genomikk er først og fremt et spørmål om informasjon som ligger lagret i et gitt gen eller grupper av gener blir uttrykt (blir aktivert) i form av gen-produkter som RNA og proteiner eller om informasjonsuttrykking hindres, blokkeres. Slike aktiverings- / represjonsvalg er svært avhengig av hvilke signaler som når frem til aktuelle gener og deres regulatoriske områder noe som også i betydelig grad avhenger av kromatin-topografien (inkluderte de epigenetiske forhold) i aktuelle genregioner, se kap. 3. I denne del skal vi særlig befatte oss med visse sider av signalsystemene. Noen hovedfaktorer er vist i neste figur: Figur Endogene (interne) signaler er signaler fra cellen selv. De kan f.eks. ha sin opprinnelse i intracellulære forskjeller i molekylfordelinger i celler som har gjennomgått asymmetriske mitoser. Dattercellene etter asymmetriske mitoser vil nødvendigvis innbyrdes ha ulike molekylfordelingsmønstre. Man vet relativt lite om hvordan topografiske forskjeller av denne art kan lede til signaldannelse og hvilke signalveier som er operative for å formidle signalene til gen-regulatoriske områder. Forholdene kompliseres også ved at slike celler hele tiden påvirkes av eksogene signaler.

29 2 4.2 Eksogene (eksterne) signaler Grunnlaget for ekstern kommunikasjon er celle-celle- og celle-ecm-interaksjoner. Fra gammelt av ( klassisk embryologi ) ble slik kommunikasjon eller signalformidling - kalt embryonal induksjon. I dag vet vi at disse signalene (induksjonssubstansene) er definerte, kjemiske forbindelser, hyppigst protein-vekstfaktorer, produsert og utskilles av nettopp naboceller. Videre vet vi nå at potensielle målceller for en gitt ligand er de celler i området som er utstyrt med kognate receptorer for det aktuelle signalstoff. Celler uten slike receptorer er ikke målceller. Hvis signalstoffene er proteiner, vil kognate reseptorer befinne seg i målcellenes ytre cellemembran, og interaksjonen vil starte opp former for intracellulær signal- formidling. (Er signalstoffene derimot lipofile forbindelser, som retinsyre (et vitamin A derivat), steroider, thyroxin e.l., vil substansene kunne passere målcellenes cellemembran for deretter å binde seg til intracellulære receptorer. Best kjent er de såkalte kjernereceptorer som har vært omtalt i andre sammenhenger i molekylær cellebiologi. Dette vil ikke bli gjentatt her, men det er viktig å understreke at bl.a. retinsyre har en helt sentral plass i reguleringen av embryogenesen) Neste figur viser viktige ledd i slik intracellulær signalformidling: Figur 4-2

30 3 Proteinligander vekstfaktorer som fungerer under embryogenesen - er til dels slike som allerede er omtalt under andre emner i molekylær cellebiologi med reseptorer som er G-protein koplet (7TM Seven pass transmembrane receptor) og reseptorer som er enzym-koplede (særlig RTK: Receptor Tyrosine Kinases og Receptor Serine/Threonine Kinases). I tillegg kommer signalveier hvor regulert proteolyse er et essensielt element. Signalveiene leder frem til gener som har kognate sekvenser i sine regulatoriske områder. Slike MÅLGENER kan være gener som koder for nye proteinligander som utskilles fra målcellene. Eller målgenene kan kode for transkripsjonsfaktorer som initierer eller hemmer transkripsjon fra et annet sett av målgener i de samme målcellene. Derved utløses kaskadeeffekter som ofte forsterker (amplifiserer) responsen fra de primære målceller i tillegg til hva som skyldes transduksjons-fenomener under signalledningen Eksempler på tyrosin-kinase koplede reseptorer som er viktige under embryogenesen Figur 4-3 Mest kjent i fosterutviklingssammenheng er Fibroblast Growth Factor (FGF) gruppen. Den omfatter (ca.) 12 ligandmedlemmer Eksempel på Serin / Threonin Kinase koplede reseptorer: Transforming Growth Factor β (TGFβ-) superfamilien omfatter flere enn 25 proteinligander som Bone Morphogenetic Proteins (BMPer) og activiner som er svært sentrale for embryogenese. Hovedpunkter i signalveiene er vist i neste figur:

31 4 Figur Signalveier som avhenger av regulert proteolyse Notch - Delta systemet Signalisering via Notch reseptor og signalproteinet Delta er kanskje den hyppigst benyttede signalvei under fosterutviklingen hos dyr og mennesker. Hovedleddene er vist i neste figur: Figur 4-5

32 Wnt og β-catenin systemet (Wingless) (Wnt uttales vint ) Det er identifisert vel 10 Wnt-ligand medlemmer. Figur Hedgehog systemet Hedgehog-proteinene kodes av minst 3 gener hos vertebrater. Mest kjent er genet som koder for protein-liganden Sonic Hedgehog og som har et utall sentrale funksjoner under fosterutviklingen og ellers. Dessuten finnes gener for protein-ligandene Desert Hedgehog og Indian Hedgehog. Den aktive formen av hedgehog-proteinene er alle kovalent koplet til cholesterol i plasmamembraner hvilket er medbestemmende for deres ekstracellulære diffusjonsmuligheter. Disse poteinligandene må også binde til seg en bestemt fettsyrekjede for å bli funksjonelle. Hovedleddene i signalveiene er nå klarlagt og vises i neste figur:

33 6 Figur MORFOGENETISKE GRADIENTER I alle disse situasjoner (og en rekke andre) er sentrale spørsmål: 1) hva som bestemmer rekkevidden til de utskilte ligander og 2) hvordan fordeles ligandmolekylene i forhold til produsentcellenes posisjoner. Settes det f. eks.opp gradienter slik at ligandkonsentrasjonen avtar med avstand fra produksjonssted ( morfogenetiske gradienter )? I så fall hva er grunnlaget for gradientetableringen? Hva betyr binding til ECM? Videre, vil ulike ligandkonsentrasjoner kunne utløse forskjellige differensieringsprogrammer i målceller osv. Et sammendrag av forskjellige syn på dette presenteres i figur 4-8 og 4-9.

34 Figur 4-8 7

35 8 Figur 4-9 (Fra: John Gurdon. Annual review of Cell and Developmental Biology. 2002) 4.4 Interaksjoner mellom proteinligander Hvorvidt en celle i en multicellulær organisme kan respondere på en gitt ligand avhenger primært av om den har egnede reseptorer for liganden. Men i tillegg må cellen som helhet være i en kompetent status hva angår den videre intracellulære signalformidling. Videre er det viktig å være klar over at celler hele tiden blir utsatt for hundrevis av signalmolekyler fra omgivelsene. Ofte er det slik at bestemte kombinasjoner av signalpåvirkninger må foreligge for å gi en adekvat respons. En slik responsiv fase kan også være meget kortvarig. Påvirkningen må derfor finne sted innenfor bestemte tidsvinduer. Utenfor disse vil en gitt ligand eller ligandkombinasjon ikke ha noen effekt eller en helt annen påvirkningskarakter. Ligandenes halveringstid er også av stor betydning.

36 9 Ut i fra slike vurderinger er det overraskende at det er mange eksempler på at eksperimentell eksponering for en del ligand-typer på en dramatisk måte kan påvirke embryogenesen. En forklaring er at noen ekstracellulære proteinligander kan ha inhibitoriske effekter på hverandre (chordin noggin BMPer) hva angår konsentrasjon eller distribusjon av funksjonelle signalkomplekser. Det har lenge vært kjent at dannelse av sekundær embryo kan utløses ved transplantasjon av den dorsale blastopor-leppe hos amfibier. Den primitive knute (Hensens knute) er en tilsvarende struktur. Lignende resultater kan idag oppnås ved bruk av definerte signalproteiner som appliseres på egnede steder i fosteret. Alternativt kan mrna molekyler for denne type proteiner injiseres i celler. Translasjon av slike mrnaer kan føre til dannelse av sekundær embryoner. (Det er vanskelig å gjøre amfibier transgene, derfor benyttes teknikker som her angitt). Figur 4-10 Figur 4-11

37 5 Molekylære mekanismer ved bestemte trinn i embryogenesen 5.1 Gametogenese Kjønnscelleutviklingen finner jo sted før fertilisasjonen og dermed før starten av embryogenesen. Men gametogenesen omfatter en rekke celluære og molekylære prosesser av avgjørende betydning for etableringen av et nytt individ. Det er derfor vanlig å medta dette emneområdet i en omtale av molekylær utviklingsbiologi. I vår sammenheng blir dog bare utvalgte hovedpunkter omtalt. Dannelsen av kjønnsceller er en langvarig og krevende opplæringsprosess. Oocytter og spermier må sees på som høyt spesialiserte celler. Når en eggcelle og sædcelle fusjonerer ved fertilisasjonen, dannes en zygote som har informasjon for å utvikle seg til et komplett nytt individ. På et meget tidlig fostertrinn, kanskje allerede på blastocysttrinnet, segregeres visse celler i forhold til de øvrige cellene i den indre cellemasse (ICM). Slike celler har dermed slått inn på en differensieringsvei som noe senere gjør dem til forstadieceller for kjønnsceller. Slike forstadieceller kalles primordiale kimceller,( primordialer germ cells, PGC). Hos mennesket kan primordiale kimceller med sikkerhet først påvises i slutten av 3. fosteruke i veggen av plommesekken (se Langman, fig. 1.7). Her deler de seg mitotisk og migrerer så mot slutten av 4. fosteruke og i første del av 5. fosteruke inn i selve fosteret og videre til gonadeanleggene. PCG i ovarieanlegg fortsetter med mitotiske celledelinger og differensieres etterhvert til oogonier. Også oogoniene deler seg mitotisk. Tallet på dem øker hos mennesket til antatt ca 7 millioner i 5. fostermåned. I tidsperioden frem til 7. fostermåned vil en rekke oogonier differensieres til primære oocytter. Etter gjennomgått S-fase vil primære oocytter gå inn i 1. meiotiske profase Oogonier som ikke differensieres, vil bli borte som følge av programmert celledød. Nær fødselen er alle primære oocytter i meiotisk profase 1. Antallet på dette tidspunkt er anslått til 1-2 millioner. Den meiotiske celledeling stopper opp i profase 1 inntil individet når puberteten. På dette tidspunkt er tallet på primære oocytter redusert til ca Fra puberteten av vil 5-15 primære oocytter med tilhørende hjelpeceller fortsette meiose-og modningsprosessene pr. menstruasjonscyclus. Vanligvis ovuleres kun én eggcelle pr. syklus. Meiosen fullføres kun hvis den ovulerte eggcellen blir fertilisert.. Totalt vil ikke over 500 eggceller bli ovulert i en kvinnes reproduktive periode. Hos menn begynner differensieringen av de primordiale kimceller til spermatogonier først ved puberteten. Disse cellene fungerer som stamceller som deler seg mitotisk resten av livet til nye stamceller og til primære spermatocytter som så gjennomgår meiose og den prosess som kalles spermiogenese., noe som tilsammen er angitt til å ta 64 døgn. Meiosen ved spermieutvikling tar 24 døgn Antall spermier i et ejakulat er ca millioner, men bare omlag 200 av disse når frem til fertiliseringområdet som er den del av en eggleder som ligger nærmest et ovarium. Meiose er et avgjørende ledd i gametogenesen. Gjennom meiose I og II vil diploide celler med 46 to-kromatid kromosomer gi opphav til fire celler som hver har 23 én-kromatid kromosomer. Essensiell er den tilfeldige fordelingen av maternale og paternale to-kromatid kromosomer under meiose I (2 23 =8.6 x 10 6 varianter kan teoretisk dannes). I tillegg kommer overkrysningen mellom maternale og paternale kromatidene i homologe kromosompar under profase I. Begge disse forhold gjør meiosen til en genetisk forskjelliggjøringsprosess. Det er dessuten viktig å være klar over den epigenetiske reprogrammering som foregår under gametogenesen. Best kjent er endringene hva angår methylering av DNA. I tidlige stadier av gametogenesen skjer det en utstrakt demethylering av DNA. Denne etterfølges senere i kjønnscelleutviklingen i dannelse av et nytt og omfattende mønster av methylert DNA., inkludert selektiv methylering av paternale og maternale alleler (imprinting, se kap. 3).

38 2 Figur Fertilisasjon og preimplantasjonsutviklingen (furingsdelinger - cleveage - og blastocystdannelse) Fertilisasjon Fertilisasjonen finner normalt sted i ampulledelen av ovidukten. Hit må eggcellen transporteres etter ovulasjon til peritonealhulen, fortsatt omgitt av zona pellucida og corona radiata. Det er antatt at cilievirksomhet og kontraksjoner av glatte muskelceller i egglederveggen er viktig for transporten inn i ovidukten. Likeledes må spermier nå frem til ampulledelen fra deponeringssted i vagina. Normalt varierer ejakulatvolumet mellom 2 6 ml og spermietallet fra millioner. Av disse antar man at bare ca 200 stykker når frem til ampulleområdet. Kontraksjon av glatte muskelceller i oviduktveggen samt spermienes flagellebaserte bevegelser utgjør transportmekanismen. Selve fertilisasjonen omfatter følgende hovedpunkter: Spermiens penetrasjon av corona radiata Feste til og penetrasjon av zona pellucida Adhesjon til eggcellen og fusjon mellom spermien og eggcellen (zygotedannelse) Umiddelbare reaksjoner i zygoten Spermiene baner seg vei mellom corona radiata celler ved svømmebevegelser og muligens ved frigjøring av hyaluronidase fra acrosomkappen. Hos mennesket er zona pellucida 13 µm tykk. Hos mus består zona pellucida særlig av 3 typer av glykoproteiner, kalt ZP1, ZP2 og ZP3. som kan interagere med hverandre og danne nettverksstrukturer. Zona pellucida hos mus inneholder over 1 milliard ZP3 molekyler som kan fungere som reseptorer for molekyler som galaktosyl transferase i spermienes cellemembran. Dette leder til influx av Ca ++ i spermiehodet, noe som utløser acrosomal

39 3 reaksjonen hvilket frigjør et stort antall enzymer som kan nedbryte zona pellucida lokalt. Av særlig stor betydning er en serin protease. Spermien kan deretter penetrere zona pellucida og komme inn i mellomrommet mellom denne og eggcellens cellemembran. Dette rommet kalles perivitellinrommet. Binding av en spermie til eggcellens cellemembran synes å være basert på molekylkomplekser som etableres i spermiens cellemembran svarende til ekvatorialområdet av spermiehodet som et resultat av acrosomal reaksjonen. Disse molekylkompleksene muliggjør binding av spermien til utvalgte integriner i eggcellens cellemembran. På kontaktstedet vil det så skje en fusjon mellom eggcellens cellemembran og spermiens cellemembran og en zygote etableres. Denne kontinuiteten av de to cellers membraner fører til at spermiens hode, kropp og hale inkorporeres i eggcellens cytoplasma. Derved vil også spermiens mitochondrier bli opptatt, men disse synes ikke å bidra under dannelsen av det nye individ. I så fall er det nye individs mitochondrier alle av maternal opprinnelse. Man antar at disse fertilisasjonsmekanismene hos mus i hovedtrekk er tilsvarende hos mennesket. Figur 5-2 Det nye individs genetiske kjønn bestemmes av om det er en spermie med X- eller Y-kromosom som fertiliserer eggcellen. Polyspermi-forebyggende reaksjoner Straks én spermie har fusjonert med eggcellen, sperres adgangen for andre spermier til eggcellen. To hovedmekanismer opererer hos mus. Den første består av en hurtig elektrisk depolarisering av zygotens plasmamembran. Hos flere arter endres hvilepotensialet fra 70 mv til + 10 mv på 2-3 sekunder etter fusjonen. Endringer varer noen ganske få minutter. Man antar nok en gang at lignende forhold gjør seg gjeldende også hos mennesket. Deretter trer neste mekanisme i funksjon. Denne starter med en influx-bølge av Ca ++ på fusjonsstedet. Ca ++ -økningen fordeles over hele zygoten og aktiverer sekvensielt cortical granula slik at disse sekretblærene fusjonerer med zygotens plasmalem og blæreinnholdet (polysakkarider og hydrolytiske enzymer) tømmes ut i perivitellinområdet. Dette bevirker hydrolyse av spermiereseptorene (ZP3) i zona pellucida og hindrer flere spermier i å binde seg til denne.

40 4 Metabolsk aktivering av zygoten Dette skjer meget snart etter fertilisasjonen, sannsynligvis som et resultat av Ca ++ -influxen Dekondensering av spermiekjernen. Pronuclei Kort tid etter spermiens inntrengning i eggcellen erstattes protaminene i sædcellens kromosomer med histoner, noe som fører til et normalt kjernebilde, som også ligner på eggcellens kjerne. De to haploide kjerner i zygoten med slikt utseende, kalles pronuclei.. Hver av disse pronuclei går så inn i en S-fase. De to pronuclei møtes og deres kjernemembraner oppløses. Snart vil zygoten gå inn i sin første mitose. Kromosomtallet er 46 to-kromatidkromosomer og 12 pg (picogram) DNA, dvs. det samme som forut for mitose for alle somatiske celler hos mennesket. Slik sett representerer fertilisasjonsprosessen en reversering av meiosen med nyetablering av en diploid celle, zygoten. Figur 5-3 Det finnes tallmateriale fra Vest-Europa og USA som indikerer at bare ca 30% av etablerte kontaktforhold mellom en spermie og en eggcelle resulterer i fødte mennesker. Det betyr i så fall at omlag 70% av slike kontaktforhold resulterer i en eller annen form for spontan abort. I tillegg kommer tallet på provoserte aborter Furingsdelinger. Cleavage. Blastulasjon. Den første delingen av zygoten finner sted ca 24 timer etter fertilisasjonen Denne plus alle etterfølgende celledelinger er mitoser, altså konserverende hva angår genetisk informasjon. Følgelig kan det nye individ sees på som en celleklon med zygoten som

41 5 utgangscelle. På 2-celletrinnet vil hver av cellene ha en masse som er svært lik halvparten av zygotens, på 4-celletrinnet har hver celle en masse som er lik en fjerdepart av zygotens masse osv. De enkelte cellene kalles blastomerer og prosessen benevnes blastulasjon. Den pågår i ca 5 døgn inntil celletallet er noe over hundre. Da vil fosteret være transportert til uterus og snart klar for innvekst i endometriet. Figur 5-4 Blastomerene er alle plassert innenfor zona pellucida Denne hinnen har tilnærmet konstant diameter under hele blastulasjonen og av samme størrelse som før fertilisasjonen. Cellesyklus under blastulasjonen består nesten bare av S-fasen og mitose-fasen idet blastomerene deler mellom seg eggcellens cytoplasma. Celledelingene er asynkrone slik at man finner fostre med ulike tall celler. I hvilken grad disse celledelingene også er asymmetriske på molekyl fordelingsnivå er ikke klarlagt. Transkripsjon av det nye individs genom, zygote-genomet starter hos pattedyr på 2-celletrinnet, men med moderat intensitet under mesteparten av preimplantasjonsutviklingen. Når tallet på celler er blitt 8-16 vil ikke alle blastomerene kunne ha den samme topologiske posisjon i fosteret. Noen blastomerer plasseres sentralt, bort fra zona pellucida, de resterende befinner seg perifert. Dette sees på som en av de første avgjørende celledifferensieringene noe som kan skyldes at de to grupper av celler får forskjellige mikromiljøer. De perifert beliggende celler vil på dette trinn danne mange gap- og tight-junctions, noe som gir en markert celleadhesjon og gjør det vanskelig å observere de enkelte celler i lysmikroskopet. Prosessen kalles compaction. Fra gammelt av sammenlignes nå fosteret med et morbær. Dette særtrinn under blastulasjonen benevnes morula-stadiet.

42 6 Figur 5-5 I denne perioden vil et Na + -, K + - ATPase basert Na + transportsystem føre til at Na + og H 2 O forflyttes fra det perifere blastomerskiktet og samler seg i mellomrom mellom de sentralt beliggende blastomerer. På døgn 4-5 vil disse små væskefylte hulrom ha konfluert i ett større, kalt blastocoelen ( blastocølen ). De perifere blastomerer benevnes nå trofoblaster og de sentralt plasserte blastomerer den indre cellemasse (ICM). Fosteret som en helhet kalles en blastocyst. Alle cellene har fått en størrelse på linje med vanlige kroppsceller, somatiske celler. Det nye individ vil i sin helhet utvikles fra noen få (3-5?) av cellene i ICM. De resterende ICM-celler og alle trofoblastene vil kun danne fosterhinner, se figur 5-6 her:

43 7 I løpet av døgn 5-6 vil fosteret klekkes, det vil si komme ut av zona pellucida. Enkelte trofoblaster blir i stand til å skille ut et trypsinlignende enzym som bevirker dannelsen av et lokalt hull i zona. Fosteret smyger seg ut av dette hullet for så (i de fleste tilfelller) å feste seg midt på bakre uterusvegg. Dette skjer hos mennesket 6-7 døgn etter fertilisasjonen. Neste trinn er selve implantasjon av fosteret i uterus. Under hele preimplantasjonsperioden skjer det en global demethylering av DNA med unntak for de pregede (imprinted) gener. Disse beholder det methyleringsmønster som ble etablert i de siste deler av gametogenesen. Ny global DNA-methylering finner sted særlig under gastrulasjonsfasen. For omtale av implantasjonen og utviklingen i uke 2 henvises til kapittel 3 i Langmans bok. 5.3 Gastrulasjonsprosessen. Etablering av de tre kimlag Gastrulasjonen De tre kimlag (ektoderm, mesoderm og endoderm) dannes alle fra epiblastskiktet gjennom den prosess som kalles gastrulasjon. Starten av gastrulasjonsprosessen kan observeres fra begynnelsen av 3. fosteruke (døgn 15-17) som en strekformet fortykning i midtlinjen i apex-området av det pæreformede epiblast-laget, sett fra taket av amnionhulen, ned på epiblastlaget, dorsalt fra. Fortykningen er et resultat av at epiblastceller deler seg og migrerer mot dette området. Den strekformede fortykningen, som kalles den primitive strek ( primitive streak ) er et resultat av kødannelse, volddannelse, på hver sin side av midtlinjen av slike migrerende epiblaster som konvergerer mot dette området. Epiblaster i det primitive strek-området vil så form-endre seg og migrere inn under (ventralt for) epiblastlaget, mellom dette og hypoblastlaget.prosessen kalles ingresjon. Dette nye skikt benevnes nå midtlaget (mesoderm), samtidig omdøpes epiblastlaget til ektoderm. Det er noe uklart hvordan det indre kimblad (den definitive endodermen) dannes hos mennesket, men det vanligste syn nå er at omdannede epiblaster fra den primitive strek vandrer inn og fortrenger hypoblastcellene for så å etablere endodermskiktet, parallelt med mesoderm-dannelsen. Etableringen av den primitive strek er også en markering av at fosterets lengdeakse i anterior posterior, AP- (senere kalt craniocaudal-) retning nå er bestemt og dermed også venstre høyre- aksen (left right, LR). Den dorso-ventrale akse (DVaksen) er forlengst etablert som angitt foran. Dermed er alle de tre primære kroppsakser fastlagt. De volder av epiblaster som er nevnt over, er kontinuerlig med hverandre i anterior retning og begrenser her en grop som også er en avslutning av den renne som man finner mellom de to voldene. Gropen kalles det primitive innsøkk og sammen med volden akkurat i dette området benevnes hele strukturen den primitive knute ( node ) eller Hensens knute. Den primitive knute er et overordnet organisasjonssenter under fosterutviklingen, og en struktur som tilsvarer det som kalles den dorsale blastoporleppe ned gjennom chordatrekken.

44 8 Figur 5-7 Den generelle mesoderm kommer til å separere ektoderm og endoderm nesten alle steder, unntatt i det området som kalles oropharyngealmembranen og cloacalmembranen, se fig Dette betyr at vi også finner mesoderm mellom ektoderm og endoderm i den mest anteriore del av fosteret, foran oro-pharyngelamembranen. Her anlegges hjertet i slutten av tredje fosteruke. De epiblastceller (senere ektodermceller) som proliferer i lengdeakseområdet anteriort for den primitive strek, migrerer mot Hensens knute hvor de ingrerer for så samlet å migrere som en cellulær streng i midtlinjen fra Hensens knute og i anterior retning mellom ektoderm og endoderm. Den særformen av mesoderm kalles chordamesoderm, men hyppigst brukes betegnelsene chorda dorsalis eller notochord. Alle dyr som under embryogenesen har en slik ryggstreng, benevnes chordater. Denne gruppen inkluderer alle vertebrater. Ryggstrengen strekker seg i anterior retning nesten til oro-pharyngealmembranen, bare skilt fra denne av en spesialstruktur som kalles prochordalplaten. Denne består av alle tre kimlag. Mesodermen her har spesielle egenskaper (se senere). Figur 5-8 Den generelle mesodermen, som ligger på hver sin side av ryggstrengen, navnsettes i medial lateral retning ut i fra lokalisasjon i forhold til denne aksestrukturen. Den del av mesodermen som ligger nærmest ryggstrengen, på hver sin side av denne, benevnes den paraksimale mesoderm (para-aksiale), den del av den generelle mesoderm som ligger lengst ut til siden i fosteret, kalles lateralplate mesodermen og mesodermen mellom disse to områder benevnes den mellomliggende mesoderm eller intermediær mesodermen.

45 9 5.4 Dannelse av neuralrør og neurallister (neurulasjon) Figur 5-9

46 10 Figur 5-10 Figur 5-11

47 11 Dorso-ventral differensiering av neuralrøret, se figur 5-12: Figur 5-12

48 12 Dannelse av neurallister, se figur 5-13 Figur 5-13

49 Regionalisering av mesodermen. Somittdannelse Figur 5-14 Figur 5-15

50 Figur

51 6 Embryo-relaterte teknologier. Medisinske implikasjoner Den meget store økningen i vår forståelse av mange basale mekanismer innn molekylær embryologi i de senere år skyldes i høy grad at utviklingsbiologer har utviklet en rekke avanserte, embryo-relaterte teknologier. Mange av disse har store medisinske implikasjoner og har etterhvert fått en rekke praktiske applikasjoner. Embryo-relaterte teknologier omfatter bl.a.: (Kloning av dyr (reproduktiv og terapeutisk kloning, samt isolasjon og karakterisering av embryonale og andre former for stamceller vil bli omtalt i kapittel 7. Det samme gjelder eksempler på retningsdirigert differensiering av stamceller, celletransplantasjoner og celleterapi.) 6.1 In vitro fertilisasjon Figur 6-1

52 2 6.2 Spermie-injeksjon i eggcelle Figur Pre-implantajonsdiagnostikk (fig s. 694 Figur 6-3

53 3 6.4 Fremstilling av chimere mus Dette er en meget viktig teknikk i molekylær utviklingsbiologi. Den er en forutsetning for å kunne fremstille såkalte knockout / knockin - mus etter målrettede gen-modifikasjoner av embryonale stamceller (ES-celler, se kap. 7) Kimlinje -transgene, chimere dyr kan tilbakekrysses til homozygositet. Figur 6-4

54 4 6.5 Transgene mus inkludert knockout- / knockin- transgene dyr. CreLox-teknologi For en nærmere omtale av teknologier for fremstilling av transgene dyr, inkludert mus hvis egne gener er blitt modifisert, se essential cell biology, fig og tilhørende tekstsider. Det er verdt å påpeke at ved bruk av transgener designet for homolog rekombinasjon til endogene gener, vil interaskjon med spesifikt målgen kunne foregå i løpet av minutter og slik at det endogene målgen blir satt ut av funksjon eller endret på annen måte umiddelbart. Til og med enkeltnucleotid-modifikasjoner kan skje (svarende til å finne én bestemt millimeter innenfor en strekning på 3000 km). Her skal kun omtales den såkalte CreLox-teknologi. Kort fortalt gå den ut på å endre - som regel fjerne - DNA-sekvenser i genomet som er flankert av to nukleotidstrekninger på ca 30 nt. Disse strekningen tjener som sete-spesifikke bindingsomåder for en bestemt gruppe av rekombinaser, i denne sammenheng den som kalles for Cre (=causes recombination). CreLox-teknologi bernyttes særlig til to formål: Til tid- og sted-kontrollert utkutting av endogene gener /-genfragmenter Når Cre foreligger i kjernen på celler med Lox-flankerte DNA-sekvenser (f.eks. et endogent gen), så vil enzymet kutte ut DNAsekvensen. I slike tilfeller må aktuell DNA-sekvens på forhånd være blitt flankert med Lox-strekninger, noe som utøres ved homolog rekombinajons -prosedyrer. Det avgjørende for tid- og sted-kontroll blir styringen av Cre s tilstedeværelse. Tradisjonelt har man derfor fremstilt transgene muselinjer med ønskede Lox-flankerte gen-områder. Slike mus krysses med mus gjort transgene for Cre-genet, styrt av en vevsspesifikk og / eller induserbar promotor. Der hvor Cre uttrykkes vil Lox-flankert gen-område deleteres. Cre-enzymet kan også appliseres lokalt ved in vivo elektroporasjon. Ved konvensjonell knockout-teknologi vil fremgangsmåten føre til at det endogene gen fjernes / inaktiveres i alle celler fra begynnelsen av fosterutviklingen. Dreier det seg om et gen hvis ekspresjon er essensielt på tidlig embryotrinn av, så vil delesjonen være letal allerede ved starten av fosterutviklingen. Dette umuliggjør studier av slike geners betydning på langt senere trinn i utviklingen som under organdannelse Til tid- og sted-kontroll av transgeners ekspresjon Et vanlig transgen består av en promotor (styringsområdet for ekspresjon) og selve transgenet. Mellom disse to kan man ved konstruksjonen innsette et Lox-flankert DNA-fragment på ca 1000 nt. Dette DNA-fragment hindrer ekspresjon av transgenet og kalles STOPP. Nærvær av Cre-enzymet vil kutte ut STOPP og dermed føre til ekspresjon av transgenet i samsvar med styringsområdets konstruksjon. 6.6 Autofluorescerende proteiner (AFP) som celle- og gen-markører I eksperimentell molekylær utviklingsbiologi inngår ofte ulike former for transplantasjoner av celler, vev og organer til ektopiske lokalisasjoner eller mellom organismer. I tillegg er kombinasjoner mellom vevstyper vanlige, f. eks. epitel- / mesenchymrekombinanter ved organogenese studier. Det er av uvurderlig betydning å ha genetiske markører som gjør det lett å holde orden på opprinnelsen til transplantatene. Spesielt viktig er det å ha markører som enkelt muliggjør identifikasjon i levende materiale. I de senere år har man fra forskjellige marine arter isolert gener som koder for proteiner som fluorescerer hvis de blir utsatt for lys med egnet bølgelengde. Slike proteiner sies å være autofluorescerende (AF). Det er mulig å transfektere celler og å fremstille transgene dyr med DNA-konstrukter for slik AF-proteiner. Transkripsjonen av AF-genenene kan reguleres av styringsområder som gir ekspresjon i alle celler i transgene dyr (global ekspresjon) eller styringsområdene kan være satt opp for vevsspesifikk, regional ekspresjon. AF-proteinene interferer ikke med normal aktivitet til celler hvor de forekommer. I dag finnes det en rekke muselinjer som er transgene for slike AF-proteiner, bl.a. AF-proteiner som gir grønn-, gul- og blå fluorescens ved eksitasjon. Figur 6-5 (fra Andras Nagys arbeider) viser to typer av museblastocyster fra muselinjer transgene for henholdsvis grønt-af-protein (GFP) og blått- (cyan-) AF-protein (CFP). Figur 6-6 viser tilsvarende musefostre i senere utviklingstrinn:

55 5 Figur 6-5 Figur 6-6 Gener for autofluorescerende proteiner kan i DNA-konstrukter koples til aktuelt transgen slik at begge gentyper uttrykkes. Alternativt kan de to gener koples sammen ved hjelp av IRES-sekvenser (IRES = internal ribosome entry site) slik at det dannes proteiner fra markør-gen og transgen. Dette gjør det enklere å analysere transgenets ekspresjon og produktlokalisasjon. I mange tilfeller vil markørproteinets tilstedeværelse ikke interferere med transgen-proteinets aktivitet. 6.7 Tetraploide teknologi (TEC-teknologi) Hvis de to blastomerer bringes til å fusjonere når et musefoster er på to-celle stadiet, dannes det et foster bestående av én celle som er tetraploid. Denne vil dele seg i kultur og etter noen dager gi et foster på blastocysttrinnet. Alle blastocystens celler er

56 6 tetraploide. Det har vist seg at hvis tetraploide blastocyster innføres i vertshunner, så vil implantasjon kun lede til dannelse av fosterhinner og intet foster. Hvis tetraploide preimplantasjonsfostre aggregeres med diploide blastomerer fra et annet foster eller med diploide ES-celler, så vil et slikt foster - etter overføring til en vertsmor - utvikle både fosterhinner og selve museembryoet. Embryoet vil kun bestå av etterkommere av de diploide ES-cellene. Denne prosedyren kalles Tetraploid Embryo Complementation (TEC) Fremgangsmåten er vist i neste figur hvor det tetraploide foster kommer fra en muselinje med global ekspresjon av grønt fluorescerende protein (GFP) og de diploide ES-celler er derivert fra en muselinje med global ekspresjon av cyan fluorescerende protein (CFP). Figur 6-7 ES-celler som benyttes til slike formål kan gen-endres på alle kjente måter, inkludert målrettede knockout / knockin -strategier av endogene gener. Det er også mulig å sette begge alleler for et aktuelt gen ut av funksjon på ES-celle nivå. Samlet betyr dette at man ved TEC-teknologien kan få etablert musefostre / mus som er homozygote for en designet delesjon av begge alleler av et gitt endogent gen i løpet av noen få uker, eventuelt også med integrasjon av ønsket knockin-konstrukt på allelenes delesjonssteder. Konvensjonell teknologi basert på dannelse av vanlige chimerer og påfølgende tilbakekryssing tar over ett år. Prinsippene for TEC-teknologien ble utviklet for mange år siden, men forskjellige vanskeligheter gjorde at få mus som ble fremstilt på denne måte, ble født. I de siste 2-3 år har man lykkes i å forbedre fremgangsmåten betraktelig, bl.a. hva angår valg av innavlede musestammer. Nå foreligger det derfor et stort antall viktige muselinjer hvor musene i sin helhet er utviklet ut fra genendrede, in vitro dyrkede, embryonale stamceller.

57 7 Figur RNA interferens - teknologier. Global og regional knockdown av gen-ekspresjonsprodukter I avsnitt 3.3 omtalte vi enkelte biologiske effekter av dsrna-molekyler, dannet ved transkripsjon av en særgruppe gener innen storgruppen av non-coding RNA-gener eller fra eksterne kilder som visse vira. Slike dsrna-molekyler blir prosessert intracellulært på måter angitt i figur 3-13 til såkalte mikrornaer (mirnaer). Hvis dsrna-molekyler på flere hundre np eksperimentelt tilføres celler vil også disse dsrnaer kunne bli prosessert til små interferende RNA - molekyler på np (sirna). Disse sirnaene vil likesom mirna-molekyler kunne interagere med RICS og binde seg sekvensspesifikt til endogene mrna-molekyler hvis translasjon derved hindres. Følgelig uteblir eller reduseres dannelsen av kognate proteinmolekyler (se fig 3-13). Hvis celler eller forsøksdyr tilføres syntetisk fremstilt sirna med en nukleotidsekvens komplementær til et gitt mål-mrna, vil også dette føre til redusert dannelse av kognat protein. Valgt sekvens for tilført sirna er viktig for å oppnå maksimal effekt. I forsøk er det derfor vanlig å tilføre sirna med tre forskjellige sekvensstrekninger for å treffe særlig sårbare områder i målmrna. Effekten vil kun vare den tid som eksperimentelt sirna er tilstede i cellene. Endringer i fenotype vil derfor som regel være transiente. Hvis man ønsker å benytte denne RNAi-teknologien for å frembringe en varig knockdown i proteintype fra et gitt proteinkodende gen, så kan det gjøres ved å konstruere ekspresjonsvektorer for ønsket sirna (eller forstadier). Slike vektorer må deretter transfekteres til celler i forsøket eller benyttes som transgener ved fremstilling av gen-modifiserte dyr (særlig transgene mus). Nylig (februar 2004) er det beskrevet vektorer som muliggjør både induserbar, reversibel og stabil RNA interferens i pattedyrceller. På litt sikt vil denne teknologien sikkert også bli koplet til CreLoxP-teknologien ( se punkt 6.5) og med bruk av vevsspesifikke promotorer for å styre knockdown i transgene mus.

58 8 De typer av sirna-forsøk som vi her kort har skissert, berører i hovedsak knockdown at ett eller noen få genprodukter pr. eksperiment. I så måte har teknologien flere fellestrekk med konvensjonelle antisens RNA - teknikker og på knockout - teknologier hvor man benytter homolog rekombinasjon i ES-celler med påfølgende fremstilling av chimere mus. I før-genom tiden var forward genetics hovedmetoden for å analysre gen-funksjoner i stor skala, særlig ved hjelp av kjemisk fremkalte mutasjoner som ga tap av funksjon i et stort antall gener. Et stort arbeid er nedlagt i denne type analyser av Drosophila og senere zebrafisk, ikke minst hva angår klarleggingen av forskjellige utviklingsgeners betydning for frembringelsen av embryonale fenotyper. Nobelprisvinneren C.Nüsslein Volhard store innsats på dette felt er et godt eksempel. Men denne type forskning er meget tid- og ressurskrevende. I løpet av de senere år er det komplette genom for en rekke av de mest sentral modellorganismer i molekylær utviklingsbiologi blitt sekvensert. Det gjelder bl.a. C. elegans, Drosophila og mus.i tillegg er jo det humane genom sekvensert. De komplette sekvenser er selvsagt av stor betydning for forståelse av mange utviklingsbiologiske forhold, men gir ikke noen direkte informasjon hva angår funksjonell genomikk. Eksperimentell anvendelse av RNAi-teknologien har i løpet av de aller siste årene revolusjonert dette forholdet. I det siste året har sentrale forskningsgrupper publisert artikler om stor-skala, systematiske, funksjonsanalyser av store deler av genomet hos C.elegans (i 2003), Drosophila (i 2003) og mus og menneske (2 artikler i mars 2004). Alle arbeidene er gjort på celler i kultur fra de forskjellige arter. Fremgangsmåten til den ene gruppen som har arbeidet med funksjonsanalysene hos mus og menneske, var basert på å produsere ekspresjonsbibliotek av sirna og såkalt shrna (sh = short hairpin) mot ialt 9610 ekspresjonsprodukter fra humane proteinkodende gener (og 5563 ortologe musegener) For hvert målgen ble det konstruert minst tre typer shrna, slik at totalen ble ca ekspresjonskasetter - som alle ble kontrollsekvensert. og innebygget i multi-funksjonelle vektorer slik at kassettene relativt enkelt kan overføres til retrovirus former og videre til andre vektorer etter behov. I tillegg ble hver av kassettene utstyrt med egen spesifikk gjenkjennings-markører ( bar codes ). De relative mengder av hver type shrna-kassett koplet til RISCprodukter kan derved vurderes ved hjelp av micro-array teknologier. Slike RNAi-bibliotek vil muliggjøre utallige funksjonsanalyser for forskningsgrupper verden rundt både hva angår stor-skala ( global ) genomikk og for utvalgte cellulære prosesser som signalsystemer, transkripsjonsregulering, cellesyklus / proliferasjon, migrasjon, impulsledning osv., osv. I slike sammenhenger kan man nedregulere en rekke kandidatproteiner i antatte reaksjonskjeder parallelt med fenotypeanlyser. (eks ved automatisert fluorescensmikroskopi). Hva mere er: Funksjonelle genomikk-analyser basert på RNAi-strategier tar uker, ikke måneder tradisjonelle gen-endringer basert på indusert mutagenese av DNA. og mange år slik tilfellet er ved Et felt hvor man kan vente seg særlig stor fremgang ved bruk av RNAi-basert knockdown-strategier er i embryonale stamceller som ledd i proliferasjonsanalyser og etablering av avanserte regimer for in vitro retningsdirigert celledifferensiering og organogenese, - ex vivo embryogenese (se også kap. 7).

59 7 Kloning og stamceller. Ex vivo embryogenese 7.1 Reproduktiv kloning og terapeutisk kloning Det er viktig å skille mellom disse to begrepene: Med reproduktiv kloning forstår vi forsøk på å fremstille fødte organismer ved at en somatisk cellekjerne overføres ( nuclear transfer = nt) til en kjernefri (enucleert) eggcelle som deretter plasseres i livmoren hos en vertsorganisme for videreutvikling inntil fødsel. Figur 7-1 Ved terapeutisk kloning overføres også en somatisk cellekjerne (nuclear transfer) til en enucleert eggcelle. Denne form for zygote (rekonstituert celle) dyrkes så i kultur inntil blastocysttrinnet. Hos mus og menneske tar dette 4-6 døgn. Deretter isoleres embryonale stamceller (ntes-celler) fra den indre cellemasse i blastocysten. De resterende deler av blastocysten destrueres Reproduktiv kloning Kloningen av sauen Dolly i 1997 og av musen Cumulina i 1998 fikk en enorm innflytelse på moderne biomedisin. For første gang ble det demonstrert at differensierte somatiske celler, også fra pattedyr, kan reprogrammeres til å oppføre seg som genomet i en zygote bare miljøet endres radikalt nok slik som det er i cytoplasmaet i en kjernefri eggcelle. Siden 1997 er nå en rekke arter blitt klonet slik som kyr, griser og aper. Hovedstrategien er stort sett den samme: Enucleeringen (fjerning av eggcellens kjerne) gjøres ved mikrokirurgi ved at en tynn pipette føres inn i eggcellen. Kjernen suges inn i pipetten og fjernes. Oocytter i forskjellige trinn av meiose II har vært benyttet som recipienter.

60 2 Donorcellens genom overføres deretter til den enucleerte eggcelle enten ved mikroinjeksjon av donorcellens kjerne eller ved indusert fusjon mellom donorcelle og eggcellen. Hvis overføringen teknisk sett er vellykket, kan det være aktuelt å aktivere den kjernetransplanterte eggcellen, bl.a. ved kortvarige endringer i konsentrasjonen av divalente ioner. Deretter holdes cellen i kultur til furingsdelingene har startet før overføring til eggleder eller uterus i vertsmor. Hvis kloningen gjennomføres ved fusjon mellom donorcelle og enucleert oocytt, vil det nye individ få en blandet populasjon av mitochondrier. Tallet på mitochondrier i en eggcelle er imidlertid vesentlig høyere enn i somatiske celler. Det er foreløpig uklart om mitochondriell heterogeniteter av betydning for de klonede dyr, f. eks. hva angår mitochondrielle sykdommer. (Hvis kloning skjer mellom to arter, eks. kjerne fra menneske og enucleert eggcelle fra en ku eller kanin (xenocybrider), vil mitochondrielle arveforhold sannsynligvis bli av betydning. Slike forsøk er nylig utført i USA og Kina- som en kompensasjon for bruk av humane oocytter- og for å klarlegg basal reprogrammeringsmekanismer.) I de tidlige kloningsforsøk basert på bruk av donorceller fra voksne organismer, la man stor vekt på det trinn i cellesyklus som donorcellen befant seg i. Men etterhvert har det vist seg at donorceller i forskjellige syklusstadier kan resultere i vellykket kloning. I tillegg vet man nå at det er mulig å anvende en rekke forskjellige, differensierte celletyper som kjernedonorer. Donorcellene fra såvel hannkjønnsindivider som hunner kan benyttes. Donororganismens alder synes også å spille en mindre rolle. Donorfibroblaster fra øret til en 17 år gammel okse viste seg å resultere i klonede kalver etter fusjon med enuclerte eggceller (okser blir sjelden mere enn 20 år). Også differensierte celler som har vært dyrket i kultur, ja endog blitt gen-modifiserte ved transfeksjon, har vist seg egnet som donorceller. Celler fra gamle individer og celler som har vært holdt lenge i primærkultur, vil ofte ha en redusert telomerlengde. Dette oppfattes som et tegn på aldring og at cellene nærmer seg slutten av sin livslengde. Det er oppsiktsvekkende at slike celler i det hele tatt kan gi grunnlag for vellykkede kloningsforsøk, og det har vært stor spenning knyttet til levealder for individer klonet med et slikt utgangspunkt. Figur 7-2. er en bemerkelsesverdig illustrasjon Det spesielle ved dette bildet er at kalvene ble klonet ut fra celler som hadde vært i kultur så lenge at de normalt snart ville ha gått til grunne, og cellene viste tydelig langtkomne aldersendringer. Slike celler har korte telomerer, noe som ofte blir tatt som en indikasjon på deres alder. Allikevel kan de brukes til kloning. Innført i kjernefrie eggceller modifiseres kromosomene slik at telomerene blir vesentlig lengre enn i celler fra unge dyr. Hva mer er: Celler fra klonede dyr, laget på denne måten, kan i kultur gjennomgå over 90 celledelinger, mens celler fra ikke-klonede kalver bare gjennomfører ca 60 celledelinger. Man vet foreløpig ikke hva som forårsaker telomerforlengelsen og om de klonede dyrenes levealder forlenges tilsvarende. (Fra: Robert P. Lanza og medarbeidere. Science 28. april 2000 (288: ). Extention of Cell Life- Span and Telomere Length in Animals Cloned from Senescent Somatic Cells. ) Figur 7-2 At det er mulig gjennom kloning å fremstille celler med sterkt forlenget levealder kan få den største betydning i arbeidet med å utvikle embryonale og adulte stamceller til behandling av mange sykdommer hos mennesket..

61 3 Det er dog utvilsomt slik at suksessraten ved reproduktiv kloning av dyr hittil har vært lav, og at mange fostre og fødte dyr har oppvist en rekke defekter. Dette er ikke overraskende når man tenker på at en somatisk kjerne må radikalt omprogrammeres på få timer til å kunne utgjøre et startgenom for et nytt inivid. Som tidligere nevnt bruker gameter meget lang tid på sin utdannelse før fertilisasjon, inkludert etablering av en rekke epigenetisk forhold. Det utrolige er jo at reproduktiv kloning av pattedyr virkelig er mulig i visse tilfeller. Men den enstemmige oppfatning blant alle seriøse forskere i feltet er at reproduktiv kloning av mennesker er forkastelig både av faglige og andre grunner. 7.2 Generelt om stamceller Standard kriterier for å kalle en celle for en stamcelle (The CELL,2002) er at den: 1 ikke selv er terminalt differensiert 2 kan dele seg så lenge organismen lever 3 Når en stamcelle deler seg, så kan en dattercelle fortsette som stamcelle eller slå inn på en differensieringsbane Man opererer med forskjellige nivåer av stamceller ut fra klassiske syn på differensieringspotensialet: - totipotente eller omnipotente stamceller Dette er stamceller som kan gi opphav til alle typer celler som en organisme består av inkludert fosteravledede fosterhinneceller. Denne gruppen omfatter kun zygoter og tidlige blastomerer. - pluripotente stamceller / multipotent stamceller Språkbruken er lite konsistent hva angår disse betegnelser. Tradisjonelt har uttrykket pluripotent vært anvendt om embryonale stamceller (ES-celler) avledet fra den indre cellemasse på blastocysttrinnet. Enkelte forskere inkluderer også primordiale kimceller i denne gruppen. ES-celler kan differensieres til alle typer celler som inngår i organismen, men ikke til typer av fosterhinneceller alle Betgnelsen multipotente stamceller benyttes hyppigst om stamceller som har et snevere differensieringspotensiale enn ES-celler Vi har former for stamceller i kroppens ulike organer, sannsynligvis hele livet igjennom (samlenavn ADULTE stamceller). Tallet på adulte stamceller i de enkelte organer er lavt. I beinmarg antar man at bare ca 1 av celler kvalifiserer til betegnelsen stamcelle (The CELL. 2002). Det er en vanlig oppfatning at stamceller er lokalisert til nisjer hvor de er omgitt av naboceller som forsyner dem med signalmolekyler og andre former for kooperasjon. Man legger i dag stor vekt på slike nisjers innflytelse for de asymmetriske miljøforhold som stamceller eksponeres for og som også antas å ha stor innflytelse på asymmetriforhold under stamcelle-mitoser. Den dominerende oppfatning er at stamceller eller deres etterfølgere (progenitorer) ikke vil endre sin løpebane (transdifferensieres) sålenge de befinner seg i sin tradisjonelle nisjer. Men nå vet man at hvis miljøet endres radikalt nok, som ved kloning, kan en omfattende reprogrammering finne sted på alle trinn fra stamcelle til terminalt differensiert celle.

62 4 Rekrutteringen til terminalt differensierte celler i mange organer synes å gå gjennom en fase med celler som på engelsk omtales som committed transit amplifying cells som vist i figur 7-4. Figur 7-3 Figur 7-4

63 5 7.3 Embryonale stamceller (ES-celler) fra mus og menneske. Ex vivo embryogenese. Molekylær cellemedisin Embryonale stamceller (ES-celler) isoleres fra den indre cellemasse (ICM) når et foster er i blastocysttrinnet. Hvis embryonale stamceller isoleres fra et klonet foster på blastocysttrinnet, kalles cellene ntes-celler (nt = nuclear transfr). Embryonale kimceller (embryonic germ cells, EG-celler) isoleres fra gonadeanlegg i tidlig embryotrinn. Adulte stamceller (AS-celler) kan isoleres fra en rekke organer hos fødte individer (som beinmarg, hjerne, muskelvev, epidermis, dermis, tarmslimhinne m.fl.) Figur ES-celler isolert fra ikke-klonede ( ordinære ) blastocyster Embryonale stamceller ble for første gang isolert fra museblastocyster i De kan holdes i kultur i udifferensiert form i tallrike cellegenerasjoner ved spesielle dyrkningsbetingelser. Tidlig på 1980-tallet ble det vist at slike ES-celler kunne danne chimere mus etter ES-celle injeksjon i museblastocyster eller ved aggregasjon med musefostre i morula-trinnet, - for deretter å bli overført til vertsmor. ES-cellenes store betydning i biomedisinsk forskning ble klart dokumentert da man i ble i stand til å inaktivere utvalgte endogene gener i slike celler ved innføring av DNA-konstrukter som muliggjorde

64 6 målrettet integrasjon i musegenomet ut fra prinsipper for homolog rekombinasjon. Deretter ble de genendrede ES-cellene benyttet til å danne chimere mus som angitt foran. Tilbakekryssingsregimer gjorde det mulig å produsere homozygote knockout -mus for aktuelt gen. Det er siden det tidspunkt produsert flere tusen muselinjer hvor ett (eller flere) endogene gener er satt ut av funksjon som basis for fenotypeanalyser av de fremkalte mutasjoner. I mange år har dette vært en av våre aller fremste strategier for forskning vedrørende funksjonell genomikk. Et viktig ledd i denne teknologien var å legge forholdene til rette for at ES-cellene kunne proliferere i kultur uten å slå inn på differensieringsbaner. Dette klarte man ved å dyrke ES-cellene på cellesyklusinaktiverte feeder-celler som skilte ut stoffer som hindret ES-celle differensiering. Nylig er det utviklet flere andre regimer for å hindre differensiering av ES-celler og samtidig stimulere deres proliferasjon. Hvis slike proliferasjonsstimulerende regimer ikke fungerer optimalt, vil ES-celler i kultur spontant utvikle seg til visse differensierte celleformer, hvorav neuron-lignende celler synes å være en vanlig default -vei.. I mange år klarte man kun å utvikle ES-celler fra mus (mes-celler = murine ES-celler) og ikke fra andre pattedyr. Det var et stort gjennombrudd da amerikanske forskere i 1998 lykkes i å isolere humane ESceller (hes-celler) fra blastocyster. Injeksjon av hes-celler i museblastocyster viste at disse cellene i denne type in vivo system, kunne differensiere seg til tallrike, spesialiserte former for human-celler. Disse resultatene førte til et enormt oppsving i interessen for in vitro differensiering av ES-celler, både fra mus og menneske. I løpet av få år er det blitt etablert dyrkningsregimer som gjør det mulig å bevirke planlagt, retningsdirigert differensiering av begge typer ES-celler til tallrike former for spesialiserte celler slik man finner dem hos mus og menneske. Differensieringskriteriene er basert på såvel morfologi som funksjon og med ekpresjonsmønstre, analysert ved in situ hybridisering, immuncytokjemi og micro-array teknologier, som klart identifiserer de in vitro - frembrakte, spesialiserte celleformer. Det er meget bemerkelsesverdig at slik in vitro retningsbestemt differensiering av ES-celler i de fleste tilfeller kan foregå i dyrkningskar med tilsetting av helt definerte medier, det vil si at man kjenner alle komponentene. Den retningsbestemte differensieringsvei avgjøres først og fremt av hvilke vekstfaktorer og andre ligander som mediet tilføres. Ofte dreier det seg om bare 3-4 forskjellige stoffer for å oppnå et bestemt resultat. I en del tilfeller skjer differensieringen via et såkalt embryoid body -stadium (aggregater av ESceller i suspensjon). Tidsrammen fra differensieringsstart av ES-celler til et ønsket resultat er oppnådd, kan være ned til 2-3 uker. Hva mere er: visse slike celletypr kan også starte på organdannelse i kulturskålen (som utvikling av hjerteanlegg fra ES-celle deriverte cardiomyocytter). De vekstfaktorer man velger for å fremskaffe en gitt celletype, er som regel plukket ut fra lister over hvilke signalstoffer som styrer in vivo differensieringen. Her må man huske på at i normal embryogenese inngår det mange kompliserte trinn fra blastocystfasen til høyt differensierte celleformer foreligger, trinn som implantasjon, gastrulasjon, etablering av de tre kimblad og regionalisering av disse, dannelse av åresystem og nerver m.m. At såvel murine som humane ES-celler i kultur kan gå utenom mange av disse opplæringstrinn er svært forbausende og har lagt grunnlaget for det som man nå kaller ex vivo embryogenese Transplantasjon av ES-celler og ES-celle-deriverte celler til mottaksorganismer Resultater som nevnt foran brakte naturlig nok straks frem tanken på å transplantere ES-celler og EScelle deriverte celleformer til forsøksdyr som mus med fremkalte behov for regenerativ celleterapi - og med tanke på å utvikle modellsystemer som basis for molekylær celleterapi hos mennesker. Forutsetningen for tankegangen er selvfølgelig at de transplanterte cellene vil finne frem til skadesteder og der interagere med den lokale cellebefolkning for å oppnå funksjonell rekonstitusjon. I modellsystemer finnes det nå en rekke eksempler på vellykkede resultater av slike forsøk.

65 7 Hva angår transplantasjon av udifferensierte, murine ES-celler til mus, så innebærer dette en risiko for at de overførte ES-cellene kan etablere teratocarsinomer i mottaksorganismen. Dette er selvsagt også et forhold som gjør at udifferensiert hes-celler ikke bør overføres til mennesker ut fra kunnskapsnivået i dag. Humane ES-celler fra ordinære blastocyster vil naturlig nok ha en annen genetisk konstitusjon og dermed et annet antigen-bilde enn en gitt pasient med behov for celleterapi. Man må derfor vente at slike transplanterte celler vil bli forkastet av recipientens immunsystem. En løsning på dette problem kunne være å gen-modulere antigen-bildet på celletransplantatet til bedre å samsvare med mottagerens immunforhold. Dette er antagelig en komplisert vei å gå. En annen viktig løsning er blitt åpenbar som følge av resultater av kunnskaper basert på terapeutisk kloning Terapeutisk kloning. ES-celler fra klonede blastocyster (= ntes-celler) Som vist i figur 7-5, så innebærer terpeutisk kloning at en cellekjerne fra en somatisk celle hos et født individ bli overført til en eggcelle hvis egen kjerne på forhånd er fjernet. Den rekonstituerte cellen dyrkes i kultur frem til blastocysttrinnet og ES-celler isoleres fra blastocystens indre cellemasse. De resterende deler av blastocysten destrueres. Slike ES-celler benevnes ntes-celler (nt= nuclear transfer). Det foreligger nå en rekke forskningsrsultater som viser at murine ntes-celler har de samme differensieringspotensialer i kultur som konvensjonelle ES-celler, og at de kan gen-modifiseres på samme måter. Et eksempel på dette er illustrert i figur 7-6 hvor mus som er defisiente for Rag2 (recombination activating gene 2) - og følgelig ikke kan produsere funksjonelle B- eller T-celler -blir behandlet med genmodifiserte ntes-celler Figur 7-6

66 8 Et slående eksempel på avansert differensiering av murine ES-celler og murine ntes-celler i kultur er vist i figur 7-8 som er et utdrag av en artikkel i Nature Biotechnology for oktober 2003: Figur 7-7 Nylig ble humane ntes-celler for første gang isolert fra klonede humane blastocyster, frembrakt etter prinsippene for terapeutisk kloning. Resultatene ble publisert i Science i mars Slike h-ntes-celler kunne gjennomgå over 70 passasjer i kultur, hele tiden med bibehold av en normal human karyotype. Somatiske donor-kjerner kom fra cumulus-celler fra de samme kvinner som donerte eggceller til forsøkene. (Hos mus er det vist at fibroblaster er egnede som kjernedonorer og er en lett tilgjengelig celletype). Transplantasjonsforsøk er ennå ikke utført. Man vil ikke vente at differensierte celler derivert fra slike h-ntes-celler vil gi avstøtningsreaksjoner ved eventuell transplantasjon til eieren av donorcellene. I de her omtalte forsøk kom også eggcellene fra kjernedonor, slik at det også forelå mitochondriell DNA-identitet (noe som kanskje ikke er en nødvendighet).

67 9 Mangel på humane eggceller vil være et stort problem ved bruk av terapeutisk kloning hos mennesker RETNINGSDIRIGERT in vitro DIFFERENSIERING AV ES-CELLER TIL GAMETER!: En mulig løsning på mangelen på humane oocytter kan være at det nå også lar seg gjøre å få ihvertfall murine ES-celler i kultur til å gjennomgå retningsdirigert differensiering til oogonier via et mellomtrinn som primordiale kimceller. Disse oogoniene går inn i meiose og rekrutterer naboceller til å danne follikkellignende strukturer. Disse gjennomgår senere ovulasjonslignende prosesser og frigjør celler som minner om oocytter omgitt av zona pellucida. Disse cellene synes å kunne bli partenogenetisk aktivert slik at embryogenese til blastocysttrinnet finner sted, noe den amerikanske forskningsgruppen ogsp demonstrerte. Det er uklart i hvilken grad normale epigenetiske prosesser, inkludert DNA-methylering, finner sted under dannelse av denne type blastocyster May 23, 2003 (300: ) Figur 7-8 I januar 2004 publiserte en annen amerikansk gruppe i Nature resultater som viser at murine ES-celler i kultur, via et embroid body - trinn kan differensiere seg til primordiale kimceller og at disse i kultur kan gjennomgå spermatogenese til haploide spermatocytter. Hvis slike spermatocytter injiseres i normale oocytter, vil det resultere i fertilisasjon med etablering av en celle med normalt, diploid kromosomtall og som utvikler seg i kultur til blastocyster. Lignende funn er også gjort av en annen gruppe.

68 10 Alle disse tre rapportene er på mange måter sensasjonelle. Flere uklarheter gjenstår og bekreftelser fra flere andre grupper. Men de åpner for en rekke muligheter til grunnleggende forskning av svært sentrale problemstillinger, bl.a. de molekylære mekanismer ved gametogenese, ikke minst koplet sammen med RNAi - teknologi og micro-array-analysr. Hvis det lar seg gjøre å fremstille et ubegrenset antall humane, oocytt-lignende celler (kanskje også mitochondrie-optimaliserte) som kan fungere som adekvat mikromiljø for reprogrammering av somatiske celler fra pasienter for deretter å utvikle seg til blastocyster med påfølgende etablering av h-ntes-celler som kan gen-modifiseres, vil dette kunne bidra til å revolusjonere behandlingsmulighetene ved bruk av designet celleterapi for en lang rekke sykdommer. De to følgende figurer er hentet fra kommentarartikkelen i Nature 8. januar 2004 til de funn som er omtalt her: Figur 7-9 Figur 7-10

69 Adulte stamceller Hvis adulte stamceller kan repogrammeres eller transdifferensieres til en egnet form for behandlingsceller for pasienter med slike behov, vil stamvellen kanskje kunne hentes fra den aktuelle pasienten. I så fall vil man ikke forvente forkastelsreaksjoner etter tyransplantasjon av behandlingsceller med en slik bakgrunn. I hvertfall foreløpig har det vist seg at adulte stamceller har et langt mindre differensieringpotensiale enn embryonal stamceller. Det har også vist seg at en rekke av de arbeider som først kom om adulte stamcellers plastisitet, var feilaktige. I mange tilfeller er det senere dokumentert at antatte redifferensieringsegenskaper hos adulte stamceller skyldtes fusjon med andre celler, primært på skadesteder hos forsøksdyret. Dessuten kommer at det ofte er teknisk vanskelig å isolere adulte stamceller og å dyrke dem i kultur. Men det finnes lovende kandidater, særlig spesialgrupper av beinmargsceller og kanskje også neurale stamceller. Etterhvert som vår viten om differensieringsmekanismer øker ut fra forskning basert på embryonale stamceller, så vil det kanskje i fremtiden bli mulig å utvikle regimer for retningsdirigert spesialisering i kultur også av adulte stamceller til ønskede former for behandlingsceller.

70 Sigurd H. From ORDLISTE DEFINISJONER UTVIKLINGSBIOLOGI Ablasjon Acros Allos, allantos Amelus Aner, andros Antisense RNA Blastocoele Blastocyst Blastomerer Blastulasjon Branchialbue -cele Caudal Cellehukommelse Cellehybrider Cephal Fjerning. Utryddelse Spiss, ende, topp Pølse Misfoster uten lemmer (melos = lem) Mann Nucleotider med en sekvens motsatt et gitt mrna molekyl. Hybridiserer med dette og hindrer translasjon. Alternativt utstyres antisensrna molekylet med et flagg. Derved kan hybriddannelse sees i celler i et mikroskop (in situ hybridisering). Det væskefylte rom i blastocyster Foster i sent preimplantasjonsstadium. Cellene er delt i to hovedgrupper, ICM = den indre cellemasse og trofoblastene. Se også blastocele. Navn på de enkelte cellene under blastulasjons-prosessen, fra 2-celletrinnet til og med blastocyststadiet Betegnelse for fosterutviklingen fra 2-celletrinnet til og med blastocyststadiet. Betyr knoppskyting av blastos =knopp, kim. Gjellebue (branchia = gjelle) oppsvulmning som inneholder væske, sml. cystis =blære. Eks.: blastocyst med blastocele. i retning mot halen (cauda=hale) Ofte kalt somatiske cellehybrider. Eksperimentelt fremkalles de ved indusert fusjon mellom to celler. Cellene kan komme fra ett og samme individ, fra forskjellige individer, fra forskjellige arter (som mus og menneske), eller man kan fusjonere plante- og dyreceller (også pro- og eukaryote celler). Hybridene kan få to kjerner eller kjernene kan gå sammen i ett synkaryon. Transkripsjon kan skje fra begge genomer. Ofte elimineres kromosomene sekvensielt fra den ene part. I konstellasjonen musmennesket reduseres tallet på humane kromosomer. I retning mot hodet (gr.:cephalon, L. = caput) Chimer Chyme Chorda dorsalis Fra gresk mytologi: Et individ med en løves hode, en geits kropp og en slanges hale.alternativt: Fler-foreldre dyr. Saft. Eks.: Mesenchyme. Midt i saften Ryggstreng

71 Appendix 1. Ordliste. Definisjoner. Utviklingsbiologi. Januar 2004 II Co-aktivatorer, corepressorer Congenital Cre CreLoxP-teknologi Cyclopi Cyst Decidua Dermatom Determinering DNA-bindings motifs Domene Dominant negative reseptor mutasjoner Dorsal Dys- Ect- (gr.), Ekt- Ektoderm Eksplantasjon Ektopisk Em- (=en-) Embryo Proteiner som påvirker transkripsjonen fra målgener ved protein-protein interaksjon med transkripsjonsfaktorer og mellom TFs og det primære transkripsjonskompleks Medfødt Navn på en sete-spesifikk rekombinase (Cre = Cause recombination). Teknikk for å styre tidspunkt / sted for ekspresjon av transgener eller for å besteme tid og sted for eksisjon av endogene DNA-sekvenser (kondisjonelle knockouts) Misfoster med et enkelt eller to sammenfallende øyne. av cystis = blære Den ytterste fosterhinnen, dannet fra livmorslimhinnen. Hud-delen av en somitt Fra gammelt av benyttet om celler som ikke endrer sin differensieringsbane selv om de utsettes for et nytt lokalmiljø eller transplanteres til andre lokalisasjoner. (Men kfr. DOLLY.) Spesielt stabile foldingsmønstre innen (del av) domener i proteiner som kan interagere med DNA. Viktige eksempler er: - helix-turn-helix (HTF) - zink fingers - leucine zipper - helix-loop-helix (HLH) Individuelt område innenfor en større struktur Mange proteiner fungerer først når de danner dimerer (eventuelt multimerer) med like eller forskjellige partnere (homo- eller heterodimerer). Dette gjelder bl.a. en rekke plasmamembranreseptorer og kjernereseptorer. Hvis det dukker opp et partnerprotein med en ikke-nativ konfigurasjon (som er resultat av gen-mutasjon), så vil avvikeren kanskje kunne danne dimer med den normale partner, men komplekset blir da ikke-funksjonelt. Dette kalles en dominant negativ mutasjon. Eksperimentelt kan man overføre gener som koder for slike avvikere og dermed sette endogene proteiner ut av funksjon. I retning mot ryggen (dorsum), bakover Vanskelig å gjennomføre, eks dysgenesi, dysgenese Ytre. Alternativt: Ex- (l.) ytre kimblad. Av ect (gresk = ytre). Tilsvarende latinske betegnelse er ex. Derm av derma = hud. Uttak av et organ eller en region for videreføring i et kultursystem på galt sted, ikke normal lokalisasjon I, inne i Indre (frukt). Bryo = Jeg bærer (frukt) inne i meg

72 Appendix 1. Ordliste. Definisjoner. Utviklingsbiologi. Januar 2004 III Embryonal induksjon Klassisk: Celler som på en eller annen måte påvirker naboceller til å endre differensieringsveier. Molekylært: Cellers påvirkning av naboceller, først og fremst ved sekresjon av protein-ligander (særlig kodet for av gen-superfamilier som TGFβ, FGF, Wnt og Shh). Slike proteiner kan også ha antagonistiske effekter overfor andre ekstracellulære signalmolekyler. I, inne i Hjerne. Inne i hodet. En = inne i, indre. Cephalon = hode. Indre kimlag kommer fra innsiden Livmorslimhinne Fjerne nucleus Utenpå God, riktig, En- (= em-) Encephalon Endoderm Endogen Endometrium Enucleere Epi- Eu- Fertilisasjon Befruktning FGF Fibroblast Growth Factor superfamilie medlemmer. Genene koder alle for sekreterte (secernerte!) proteinligander som påvirker et utall av forhold under embryogenesen. Føtus (foetus) Furingsdelinger (eng. cleavage ) Gastrulasjon Gen regulatoriske sekvenser (GRSs) Generelle transkripsjonsfaktorer (TFs) Latin for avkom Cellesyklus består nesten bare av S-fase og mitose. Blastomerene deler mellom seg zygotens cytoplasma (se også asymmetriske celledelinger). Fosterets diameter er relativt konstant gjennom pre-implantasjons fasen. Betegnelse for den del av fosterutviklingen som særlig omfatter etablering av den primitive fure og primitive knute (innsøkk) og som leder til dannelsen av det midtre kimblad, mesodermen, inkludert ryggstrengen. Av gaster som angir både hulrom (som magesekk) og utbuktning (eks. muskelbuk) Nucleotid-(nt)-sekvenser som fungerer som bindingssteder for gen regulatoriske proteiner (GRPs). Slike bindingssteder kalles også nucleotid- bindings motifs Flere enn 220 ulike nt-motifs er hittil identifisert. Såkalte respons elementer (RE) inngår i denne gruppen, eks. hormon respons elementer (HRE) og retinoic acid respons elementer (RARE) Med relasjon til promotor-områder. Kfr. Spesielle TFs med relasjon til enhancer -regioner Gjellebue Parvise utposninger av ektoderm i den senere ansikt-/hals regionen. Utposningene fusjonerer med tilsvarende på motsatt side (kontralateralt). Fylles kontinuerlig med bl.a migrerende neurallistceller og somitt- (somitomer-) deriverte celler. Fem definitive gjellebuer anlegges hos mennesket.

73 Appendix 1. Ordliste. Definisjoner. Utviklingsbiologi. Januar 2004 IV GRPs Gyneaecos Gyne Heterokron Heterotopisk Homeoboks gener Homeodomene Homeodomene proteiner Homeotiske gener Homeose Gene Regulatory Proteins (inkluderer bl.a. transkripsjonsfaktorer, co-aktivatorer og co-repressorer) Kvinne. Alt. gyne (gr.) Kvinne. Alt. gynaecos. (gr.) Forskjellig tid Forskjellig lokalisasjon Defineres som gener som inneholder en homeobokssekvens (på ca 180 nt). I tillegg inneholder de fleste homeoboks genene andre domener som er nødvendige for funksjonene til homeo-domene-proteinene. Homeoboksgenene er alle utviklingsregulatoriske gener, men er viktige også i mange andre sammenhenger. Alle koder for transkripsjonsfaktorer. Flere enn 350 homeoboksgener er identifisert.. Homeotiske gener (hox-gener) er en undergruppe av homeoboks gener DNA-bindings domene i homeodomene-proteiner, kodet for av homeoboks nucleotid-sekvenser. Det er Helix-turnhelix -delene av homeodomenet som interagerer med spesifikke DNA-bindingsmotifs. Homeodomener omfatter aminosyrer. Alle er kodet for av homeo-boks gener. Alle er transkripsjonsfaktorer. Dette er en undergruppe av homeoboksgenene som opprindelig ble karakterisert som gener som styrer identiteten til individuelle kroppsavsnitt (segmenter) hos Drosophila. Slike gener finnes hos bananflue i to gen- clustere (-klynger), kalt Antennapedia og Bithorax.Hos vertebrater kalles disse gener for Hox-gener. Et kroppsavsnitts identitet omgjøres til identiteten til et annet kroppsavsnitt Homologe kromosomer Hox gener Hox kode (kombinatorisk kode for posisjonserkjennelse) Tilsvarende maternale og paternale kromosomer. Dette er homeotiske gener hos vertebrater. De relateres til Antennapedia- og Bithorax-komplekset hos bananflue. Hos for eksempel mus og mennesker finnes 38 Hox-gener, fordelt i clustere - klynger på 4 ulike kromosomer. Hoxgener inneholder informasjon som i høy grad medvirker til etablering av kroppsmønstre og celler posisjonserkjennelse, særlig langs fosterets lengdeakse (paraksialmesodermen, samt neuralrør (bakhjerne og ryggmarg ) og neurallister. Hvilke kombinasjoner av Hox-gener som er uttrykt i forskjellige kroppsavsnitt og som langt på vei spesifiserer disse.

74 Appendix 1. Ordliste. Definisjoner. Utviklingsbiologi. Januar 2004 V Hyper- Hypo- Hystera (gr.) ICM Implantasjon Intermediær mesoderm Isokron Kimblads-derivater Kjernereseptorer (en tradisjonell betegnelse. Inngår i gruppen intracellulære reseptorer) Over Under Livmor (alternativt: uterus, metra) Indre Celle Masse Innvekst (i livmor-slimhinnen) Den del av mesodermen som ligger mellom paraksial mesodermen og lateral plate mesodermen. Samme tid som Hvilke vev/organer som utvikles fra de forskjellige kimblad. Stor heterogen gruppe. De fleste tilhører Steroid-, thyroid-, retinoid-superfamilien. Ligandene er relativt små, lipofile, hydrofobe molekyler. Ligandbinding kan indusere translokasjon fra cytoplasma til kjernen og ofte dannelse av homodimerer eller heterodimerer (som RAR/RXR) med påfølgende binding til genregulatoriske nucleotidsekvenser (også kalt respons elementer) Knockouts Knockdown Kognat Ko-linearitet (av Hox-gener) Kombinatorisk transkripsjonskontroll Kondisjonell styring av transgener Kroppskrumninger Ved help av transgen teknologi kan man sette endogene gener ut av funksjon. Ved tradisjonell teknikk skjer dette i alle dyrets celler. DNA-konstruktet lages slik at det integreres på ønsket sted i genomet. Spesifisiteten er basert på homolog rekombinasjon med endogene målsekvenser. Gjennom dette utskiftes også sekvenser i DNAmålområdet slik at det endogene gen ikke kan gi noe normalt ekspresjonsprodukt.. Alternativt brukes i tillegg teknologi for Kondisjonell styring av transgener, hyppigst CreLoxP-strategien. Nedregulering av mengde gen-produkt. Hyppigst benyttet i forbindelse med fremkalt spaltning av mrna molekyler av en gitt type (se RNA interferens, RNAi og sirna samt mirna) Tilsvarende, passende, som regel om reseptorer som er spesifikke for en gitt ligand Det er samfall mellom genenes rekkefølge på kromosomene og deres ekspresjonsgrenser langs fosterets lengdeakse (anterior-posterior akse) Ny teknikk (basert på bruk av sete-spesifikke rekombinaser som CRE) muliggjør tid- og stedkontroll av ekspresjon fra transgener. En variant av teknologien gir kondisjonell (betinget) kontroll av endogene genners struktur og funksjon. I anterior posterior retning og i medial lateral orientering. Foregår hos mennesket særlig i siste del av

75 Appendix 1. Ordliste. Definisjoner. Utviklingsbiologi. Januar 2004 VI 3.fosteruke og utover i 4. fosteruke. Lateral plate mesoderm Ligand Den del av mesodermen som ligger lengst ut til siden i fosteret. Definert substans som kan binde seg (ligere seg) til spesifikk reseptor LoxP Kort DNA-sekvens som er bindingssekvens for den setespesifikke rekombinasen Cre. Normalt trenger Cre to LoxP-seter (som flankerer en mellomliggende DNAstrekning) for syntén aktivitet (eksisjon /inversjon). Cre kan også fungere selv om LoxP-setene er plassert i forskjellige kromosomer. I så fall kan resultatet bli designede translokasjoner. Mamma (l.) Bryst. Alt. mastos (gr.) Mastos (gr.) Bryst (alt.mamma) Melos lem, ekstremitet Mensis, men Måned Mes- Midtre. Alt. med- (l.) Mesencephalon Midthjerne Mesenchym midt i saften. Embryonalt bindevev Mesoderm Mes- = midtre (kimlag) Meta- Etter, endre. Eks.: metaplasi = omgjøre (fra en celletype til en annen.) Sml. transdifferensiering. Metra Livmor (alt. uterus, hystera) Migrasjon Vandring (celle-) Morfogen Kjemiske substanser, særlig protein ligander, som lokalt kan påvirke differensieringen av celler (en form for parakrin sekresjon). Morfogenetisk Et gitt morfogen distribueres i avtagende konsentrasjon fra gradient produsentcellen. Morfogenet bindes til målceller og vil kunne utløse forskjellig differensiering av disse. Differensieringsforskjellene skyldes bl.a. at målcellene utsettes for ulike mengder av morfogenet (samt at morfogenet ekstracellulært kan interagere med andre proteinformer og derved endre ligandegenskaper). Morfologi Formlære, strukturobservasjoner med eller uten bruk av mikroskop Morula Morbær. Navn på fosteret slik det ser ut i 8-32 cellestadiet. Motifs Samme betydning som motiv, men ulik anvendelse. Motifs brukes særlig om spesielle sekvenser av aminoyrer eller av nucleotider innen henholdsvis proteiner og nucleinsyrer. Myotom Omfatter de celler i somittene som differensieres til myoblaster Målceller Brukes som regel om celler som responderer på ekstracellulære ligander basert på at de har kognate receptorer i ytre cellemembran eller intracellulære receptorer (ofte upresist kalt kjernereceptorer ).

76 Appendix 1. Ordliste. Definisjoner. Utviklingsbiologi. Januar 2004 VII Målcellene må følgelig være i en påvirkbar modus (ha en egnet differensieringsstatus). Målgener Neo- Neoplasi Neurallist Neuralrør Neuropor Non-Hox homeoboks gener Notochord Oropharyngealmembran Orthotopisk Oviduct Ovulasjon Para- Paraksial (mesoderm) Paraloge gruppe Peritoneum Pharyngealbue PIFs Plasma Placenta Plasmalem PLs Pre- Primordium Gener hvis transkripsjonsforhold reguleres av bestemte begivenheter, f.eks. som følge av at et gitt sett av proteinligander binder seg til sine spesifikke plasmamembranreceptorer med påfølgende intracellulær signalformidling. Videre eksempler er at når Hox-gener uttrykkes, så vil Hox-proteinene (som er transkripsjonsfaktorer) påvirke reguleringen av gener som har kognate bindingsmotifs (GRSs) for Hox-proteinene. Ny (se Plasma) Cellesamlinger som avsnøres fra grensesonen mellom vanlig ektoderm og neuroektoderm. Neurallistceller vandrer og inngår så i en rekke fosterstrukturer. Omtales ofte som et fjerde kimblad Dannes av neuroektodermceller ved en avsnøringsprosess fra vanlig ektoderm. Blir til store deler av nerve-systemet Signaler fra ryggstrengen er nødvendig for å indusere neuralrørsdannelse. Neuralrørsåpning Flere enn 300. Alle er transkripsjonsfaktorer. Mange av stor betydning for kroppsutformingen. Ryggstreng (også Chorda dorsalis., Chordamesoderm) Munnhule-svelg membran På samme sted som Eggleder Eggløsning ved siden av. Eks.: para-aksial = ved siden av aksen Para-aksial = den del av mesodermen som ligger nærmest fosterets lengde akse (anterior-posterior akse) Brukes om tilsvarende Hox gener i de 4 ulike gen- clustrene, slik som Hoxa-1, Hoxb-1 og Hoxd-1. Hox-genene kan samles i 13 paralog-grupper. Serøs bukhinne ( noe som er strukket ut ) Alternativt navn for gjellebue (pharynx = svelg) Protein Induserende Faktorer, proteiner som binder seg til plasmamembranreceptorer Egentlig form. Av gr. plassein = å forme. Eks: neoplasi = ny-forming (svulst) Morkake (egentlig flat kake ) =Ytre cellemembran Protein Ligander Før Anlegg, fosterutgave av en anatomisk enhet, f.eks. et organ

77 Appendix 1. Ordliste. Definisjoner. Utviklingsbiologi. Januar 2004 VIII Pro- Foran eller før. Eks.: prochordal plate. Preproproteiner Prochordalplate Plate foran strengen (chorda dorsalis, notochord), mellom denne og oropharyngealmemmbranen. Proliferasjon Økning i antall celler Pronucleus Betegnelse på de haploide kjønnscellers kjerner etter fertilisasjonen frem til zygoten går i mitose. Prosencephalon Forhjerne. Blir til Telencephalon og Diencephalon Proteom Den samlede proteinpopulasjon i en celle, kvalitativt og kvantitativt RA (9-cis) Variant av Retinoic Acid RA (all trans-) Retinoic Acid (derivat av retinol = vitamin A). Ligand for RA-Receptorer RA-indusert Retinsyre indusert homeose homeosis RAR (α,β,γ) RA- (kjerne)receptorer. Tre hovedtyper. RARE Responselementer relatert til RA-systemet RA-responsiv (Hypotetisk) sammensatt genregulatorisk enhet som kan enhancer initiere transkripsjon av ett eller flere Hox-gener ved RApåvirkning. Represjon Undertrykke, stenge, nedregulere Reproduktiv kloning Kloning hvor formålet er å utvikle voksne organismer Rhombencephalon Bakhjerne. Blir til Metencephalon og Myelencephalon Rostralt i retning mot snute, nebb, nese (rostrum) RXR α,β,γ Kjernereceptorer for 9-cis RA Sclerotom Hard del, Den del av en somitt som bl. a. omfatter celler som blir til brusk- og beinvevsdannende celler i akseskjelettet. Sekretere Fornorkset variant av secernere, skille ut sekret! Shh Sonic hedgehog. Tilhører hedgehog-familien av sekreterte protein-ligander. Viktig ved embryonal induksjon, bl. a. ved ryggstrengens rolle ved neurulasjonen, differensiering i dorso-ventral retning innen neuralrøret, somittdifferensierng, dannelse av lemmer m.m. Signal-kaskader Skjebnekart Somatiske celler Somitt Splanchnion Terapeutisk kloning Basert på merking av celler på tidlig embryotrinn. Deretter følge cellene og deres etterkommere gjennom forskjellige embryotrinn for å se hva som blir deres skjebne i hvilke regioner/organer de ender opp. Nå benyttes mer og mer genetisk merking (som gener for autofluorescerende proteiner) Vanlige kroppsceller, ikke kjønnsceller. Ursegment. Parvis symmetriske (metamere)oppdelinger av paraksial mesodermen. Innvoll Kloning hvor formålet er fosterutvikling kun frem til blastocysttrinnet for så å bruke blastocyster til å etablere en

78 Appendix 1. Ordliste. Definisjoner. Utviklingsbiologi. Januar 2004 IX Teratogen Teratologi Teratos (teras) ES-celle linje. Samlenavn for faktorer (fysiske, kjemiske, biologiske) som kan fremkalle misdannelser Læren om misdannelser fremkalt av teratogener Monster TGFβ Topos Transdifferensiering Transgen Transgene dyr Trophe Uterus Ventral Wnt-s Zona pellucida Zygon og avledninger Zygote TGF = Transforming Growth Factor). Superfamilie av gener for mange typer av sekreterte proteinligander med et vidt spekter av effekter på fosterutviklingen. Over 25 medlemmer. Plass, sted Brukes vanligvis om situasjoner hvor man mener at en differensiert celle direkte går over til en annen differensieret form Et DNA-konstrukt som skal overføres til celler eller til organismer (f.eks. ved injeksjon i en pronucleus i en zygote). Består ofte av en styringsdel og et strukturelt gen. Styringsdelen kan være laget for å gi sted - (celle-/vev-) spesifikk ekspresjon av genet, alternativt være konstruert for å gi induserbar ekspresjon, f.eks. ved tilføring av egnet ligand (til kognat ligandbindende faktor). Transgener av denne type vil integreres på tilfeldig sted i recipientcellens genom, i ett eller flere kopier i tandemarrangement. Integrasjonsstedets topologi kan i betydelig grad påvirke ekspresjonsmulighetene for det strukturelle gen fra ingen uttrykking til høyt nivå. Dyr som har et fremmed DNA-konstrukt integrert i alle sine celler, inkludert gameter. Transgene dyr fremstilles som regel ved injeksjon i en pronucleus på zygotetrinnet eller ved transfeksjon av ES-celler som så injiseres i blastocyster. De chimere dyr som derved dannes kan tilbakekrysses til homozygositet for transgenet (se også knockout -dyr). Ernæring Livmor (altwenativt: metra, hystera) I retning mot buken (venter), forover Wnt-gener. Flere enn 10 stk, relatert til wingless genet hos bananflue. Sekreterte proteinligander av stor betydning ved embryonal induksjon. Hinne som omgir eggcellers ytre cellemembran, senere zygoten og fosteret frem til blastocysttrinnet. Zona pellucida nedbrytes enzymatisk i uterus før implantasjonen ( klekking ) forene, trekke sammen. Se zygote. Sammensmeltning

79 Appendix 1. Ordliste. Definisjoner. Utviklingsbiologi. Januar 2004 X

80 Appendix 2 Inndeling av fosterperioden hos mennesket Hos mennesket er svangerskapsperioden 266 døgn, 38 uker eller 9 kalendermåneder, regnet fra fertilisasjonstidspunktet. Regnet fra 1. dag i siste menstruasjonssyklus øker verdiene med i snitt 14 døgn. Den egentlige embryonalperioden går fra 0 56 døgn. Deretter følger føtalperioden fra det 57. døgn til døgn 266, altså 210 døgn. Fosterperioden deles også opp i preimplantasjonsperioden (de første 6-7 døgn) og postimplantasjonsperioden (de resterende ca 260 døgn). En zygote hos mennesket har en diameter på vel 100 µm. Ved slutten av somittperioden, døgn 32, har et human foster en hode-hale utstrekning på ca 5 mm. Deretter øker denne lengden med omkring 1 mm pr. døgn frem til slutten av embryonalperioden. På døgn 56 er følgelig fosteret ca. 28 mm. I føtalperioden tiltar denne lengden med i gjennomsnitt 1.5 mm pr døgn i 210 døgn. Ved fødselen vil lengden målt på denne måten være i størrelsesorden cm.

Kapittel 14: Det eukaryote genom og dets uttrykksregulering

Kapittel 14: Det eukaryote genom og dets uttrykksregulering Kapittel 14: Det eukaryote genom og dets uttrykksregulering Innhold: 1. Det humane genom 2. Struktur av protein-kodende gener 3. RNA processering 4. Transkripsjonell kontroll 5. Posttranskripsjonell kontroll

Detaljer

Kapittel 16 Utvikling: differensielt genuttrykk

Kapittel 16 Utvikling: differensielt genuttrykk Kapittel 16 Utvikling: differensielt genuttrykk 1. Utvikling 2. Differensielt genuttrykks rolle i celledifferensiering 3. Polaritets rolle i cellebestemmelse 4. Embryonisk induksjon i cellebestemmelse

Detaljer

Sammenligningen mellom Arabidopsis thaliana genomet og de kjente genomene fra cyanobakterier, gjær, bananflue og nematode, viser bl. a.

Sammenligningen mellom Arabidopsis thaliana genomet og de kjente genomene fra cyanobakterier, gjær, bananflue og nematode, viser bl. a. Sammenligningen mellom Arabidopsis thaliana genomet og de kjente genomene fra cyanobakterier, gjær, bananflue og nematode, viser bl. a. Antall gener som er involvert i cellulær kommunikasjon og signaloverføring

Detaljer

LEKSJON 4: BIOTEKNOLOGI HVORDAN VI BRUKER NATURENS EGNE MEKANISMER TIL VÅR FORDEL, OG UTFORDRINGENE SOM FØLGER MED

LEKSJON 4: BIOTEKNOLOGI HVORDAN VI BRUKER NATURENS EGNE MEKANISMER TIL VÅR FORDEL, OG UTFORDRINGENE SOM FØLGER MED LEKSJON 4: BIOTEKNOLOGI HVORDAN VI BRUKER NATURENS EGNE MEKANISMER TIL VÅR FORDEL, OG UTFORDRINGENE SOM FØLGER MED KOMPETANSEMÅL Forklarebegrepene krysning og genmodifisering, og hvordan bioteknologi brukes

Detaljer

Bioteknologi i dag muligheter for fremtiden

Bioteknologi i dag muligheter for fremtiden Bioteknologi i dag muligheter for fremtiden Arvestoff Genetisk materiale, DNA. Baser En del av et nukleotid som betegnes med bokstavene A, C, G og T. Med disse fire bokstavene skriver DNAtrådene sine beskjeder

Detaljer

GENER, genregulering, og genfamilier

GENER, genregulering, og genfamilier GENER, genregulering, og genfamilier 1-A, H-11 Forelesning 21.11.11 Frank Skorpen, Institutt for Laboratoriemedisin, Barne- og Kvinnesykdommer, DMF, NTNU Gener Kromosom, kromatin og DNA Hva er et gen?

Detaljer

Kloning og genforskning ingen vei tilbake.

Kloning og genforskning ingen vei tilbake. Kloning og genforskning ingen vei tilbake. Sammendrag. Innen genforskning og kloning er det mange utfordringer, både tekniske og etiske. Hvordan kloning gjennomføres, hva slags teknikker som blir brukt

Detaljer

Hvor er responsen når vi ikke bruker den? Tore Vignes og Stein Evensen

Hvor er responsen når vi ikke bruker den? Tore Vignes og Stein Evensen Hvor er responsen når vi ikke bruker den? Tore Vignes og Stein Evensen Responser Noen bruker vi hele tiden Noen bruker vi sjelden Noen har vi nesten ikke brukt! Where is the f.. response!? Klasser Funksjonelle

Detaljer

Cellesignalisering II: Reseptor tyrosin kinaser, cytosoliske kinaser

Cellesignalisering II: Reseptor tyrosin kinaser, cytosoliske kinaser Cellesignalisering II: Reseptor tyrosin kinaser, cytosoliske kinaser! Introduksjon! Definisjon og klassifisering! Kinasefamilier: Receptor/cytosol! Receptor Tyrosin kinase-mediert signalisering! MAP kinase

Detaljer

Flervalgsoppgaver: proteinsyntese

Flervalgsoppgaver: proteinsyntese Flervalgsoppgaver - proteinsyntese Hver oppgave har ett riktig svaralternativ. Proteinsyntese 1 Hva blir transkribert fra denne DNA sekvensen: 3'-C-C-G-A-A-T-G-T-C-5'? A) 3'-G-G-C-U-U-A-C-A-G-5' B) 3'-G-G-C-T-T-A-C-A-G-5'

Detaljer

Regulering av DNA Transkripsjon i Eukaryote Organismer. ID, Kull 99, Vår 2001 Frank Skorpen IKM, DMF

Regulering av DNA Transkripsjon i Eukaryote Organismer. ID, Kull 99, Vår 2001 Frank Skorpen IKM, DMF Regulering av DNA Transkripsjon i Eukaryote Organismer ID, Kull 99, Vår 2001 Frank Skorpen IKM, DMF 1 Regulering av gen-uttrykk på mange nivåer Klargjøring av DNA Transkripsjon Initiering Stopp hnrna prosessering

Detaljer

Embryologi og normal fosterutvikling for patologer

Embryologi og normal fosterutvikling for patologer Embryologi og normal fosterutvikling for patologer Utvalgte mekanismer med en del teratogenese Joel C. Glover Division of Physiology Department of Molecular Medicine Institute of Basic Medical Sciences

Detaljer

Så, hvordan lager man nye nerveceller?

Så, hvordan lager man nye nerveceller? Forskningsnyheter om Huntingtons sykdom. I et lettfattelig språk. Skrevet av forskere. Til det globale HS-fellesskapet. Å omdanne hudceller til hjerneceller: et gjennombrudd innen forskning på Huntingtons

Detaljer

NORGES TEKNISK-NATURVITENSKAPELIGE UNIVERSITET INSTITUTT FOR FYSIKK EKSAMEN I EMNE TFY4260 CELLEBIOLOGI OG CELLULÆR BIOFYSIKK

NORGES TEKNISK-NATURVITENSKAPELIGE UNIVERSITET INSTITUTT FOR FYSIKK EKSAMEN I EMNE TFY4260 CELLEBIOLOGI OG CELLULÆR BIOFYSIKK Side av 1 av5 NORGES TEKNISK-NATURVITENSKAPELIGE UNIVERSITET INSTITUTT FOR FYSIKK EKSAMEN I EMNE TFY4260 CELLEBIOLOGI OG CELLULÆR BIOFYSIKK Faglig kontakt under eksamen: Catharina Davies Tel 73593688 eller

Detaljer

Den komplette DNA sekvens fra en organisme.

Den komplette DNA sekvens fra en organisme. Definisjoner: Hva er et genom? Den komplette DNA sekvens fra en organisme. Den komplette samlingen av gener som koder for alle proteiner, pluss ribosomalt RNA, trna, snrna (involvert i mrna spleising)

Detaljer

Oncogenic Mutations Affecting Cell Proliferation

Oncogenic Mutations Affecting Cell Proliferation Oncogenic Mutations Affecting Cell Proliferation Fra RTK til Nucleus (Boka s.1070-74) Normalt kreves et vekst stimulerende signal ( growth factor eks. PDGF, EGF, NGF) for at celler skal gå inn i celledeling,

Detaljer

Kapittel 20, introduksjon

Kapittel 20, introduksjon Kapittel 20, introduksjon Ekstracellulær signalisering Syntese Frigjøring Transport Forandring av cellulær metabolisme, funksjon, utvikling (trigga av reseptor-signal komplekset) Fjerning av signalet Signalisering

Detaljer

Kokeboka, oppskriften og kirsebærpaien

Kokeboka, oppskriften og kirsebærpaien Forskningsnyheter om Huntingtons sykdom. I et lettfattelig språk. Skrevet av forskere. Til det globale HS-fellesskapet. Farefull spleising - en ny måte å tenke om det skadelige huntingtinproteinet Forskere

Detaljer

Oppgave 2b V1979 Hvor i cellen foregår proteinsyntesen, og hvordan virker DNA og RNA i cellen under proteinsyntesen?

Oppgave 2b V1979 Hvor i cellen foregår proteinsyntesen, og hvordan virker DNA og RNA i cellen under proteinsyntesen? Bi2 «Genetikk» [3B] Målet for opplæringa er at elevane skal kunne gjere greie for transkripsjon og translasjon av gen og forklare korleis regulering av gen kan styre biologiske prosessar. Oppgave 2b V1979

Detaljer

Kreftforskning.no/myklebost. Eva Wessel Pedersen. Cancer Stem Cell Innovation Centre

Kreftforskning.no/myklebost. Eva Wessel Pedersen. Cancer Stem Cell Innovation Centre Stam Celler og Kreft Eva Wessel Pedersen Avdeling for Tumorbiologi,, Radium Hospitalet Cancer Stem Cell Innovation Centre Oversikt Stamceller generelt Hvorfor vi forsker på stamceller Kreft-stamceller

Detaljer

Kap 12. Det eukaryote kromosom. En organelle for pakking og styring av DNA

Kap 12. Det eukaryote kromosom. En organelle for pakking og styring av DNA Kap 12. Det eukaryote kromosom En organelle for pakking og styring av DNA Oversikt over kapittel 12 Komponentene i et kromosom: DNA, histoner, og nonhiston proteiner Ett langt DNA molekyl og mange typer

Detaljer

... Proteiner og enzymer. kofaktor. polypeptid

... Proteiner og enzymer. kofaktor. polypeptid 30 Proteiner og enzymer Proteiner er bygd opp av rekker av aminosyrer som er kveilet sammen ved hjelp av bindinger på kryss og tvers, såkalte peptidbindinger. Slike oppkveilete rekker av aminosyrer kaller

Detaljer

Forelesninger i BI Cellebiologi. Enzymer : senker aktiveringsenergien. Figure 6.13

Forelesninger i BI Cellebiologi. Enzymer : senker aktiveringsenergien. Figure 6.13 Enzymer : senker aktiveringsenergien Figure 6.13 Aktive seter : camp-avhengig protein kinase *For å illustrere hvordan det aktive setet binder et spesifikt substrat er valgt som eksempel camp-avhengig

Detaljer

Genfeil i kreftsvulster nøkkelen til en mer persontilpasset behandling?

Genfeil i kreftsvulster nøkkelen til en mer persontilpasset behandling? Genfeil i kreftsvulster nøkkelen til en mer persontilpasset behandling? Hege G. Russnes Forsker ved Avd. For Genetikk, Institutt for Kreftforskning og overlege ved Avd. For Patologi Oslo Universitetssykehus

Detaljer

Kapittel 12: FRA DNA TIL PROTEIN:

Kapittel 12: FRA DNA TIL PROTEIN: Kapittel 12: FRA DNA TIL PROTEIN: fra genotype til fenotype 1. Gener og polypeptider 2. DNA, RNA og informasjonsflow 3. Transkripsjon: DNA-dirigert RNA-syntese 4. Den genetiske kode 5. Aktører i Translasjon

Detaljer

Cellesyklus. Medisin stadium IA, 17. september 2012

Cellesyklus. Medisin stadium IA, 17. september 2012 Cellesyklus Medisin stadium IA, 17. september 2012 Trude Helen Flo Cellesyklus: En oversikt Definisjoner De ulike fasene av cellesyklus Regulering av cellesyklus Kort om apoptose Kort om stamceller Cellesyklus:

Detaljer

DNA - kroppens byggestener

DNA - kroppens byggestener DNA - kroppens byggestener Nina Baltzersen 22. september 2011 Enten man har slått seg, er forkjølet, støl etter trening eller rett og slett bare har en vanlig dag, så arbeider kroppen for fullt med å reparere

Detaljer

Faglig kontaktperson under eksamen: Jens Rohloff (mob 97608994)

Faglig kontaktperson under eksamen: Jens Rohloff (mob 97608994) Side 1 av 6 Norges teknisknaturvitenskapelige universitet Fakultet for naturvitenskap og teknologi Institutt for biologi Faglig kontaktperson under eksamen: Jens Rohloff (mob 97608994) EKSAMEN I: BI1001

Detaljer

Grunnleggende cellebiologi

Grunnleggende cellebiologi Grunnleggende cellebiologi Ann Kristin Sjaastad Sert. yrkeshygieniker, Dr. Philos HMS-seksjonen, NTNU Tema Cellens oppbygning Transportmekanismer Arvestoff og proteinsyntese Mutasjoner og genotoksisitet

Detaljer

REGULERING AV TRANSKRIPSJON I EUKARYOTE ORGANISMER

REGULERING AV TRANSKRIPSJON I EUKARYOTE ORGANISMER REGULERING AV TRANSKRIPSJON I EUKARYOTE ORGANISMER av Frank Skorpen, IKM, DMF, NTNU FORELESNING April 2001 Cellebiologi - Hovedfag 1 REGULERING AV TRANSKRIPSJON I EUKARYOTE ORGANISMER Det er flere nøkkel-mekanismer

Detaljer

1. Medfødt og ervervet immunitet. Karl Schenck, V2015

1. Medfødt og ervervet immunitet. Karl Schenck, V2015 1. Medfødt og ervervet immunitet Karl Schenck, V2015 Medfødt og ervervet immunforsvar Antimicrobial peptides «Alltid beredt!» Relativt uspesifikt Må aktiveres Spesifikt Komponenter av medfødt immunitet

Detaljer

Institutt for biologi Faglig kontaktperson under eksamen: Berit Johansen, 98691. EKSAMEN I: BI1001 Celle- og molekylærbiologi BOKMÅL

Institutt for biologi Faglig kontaktperson under eksamen: Berit Johansen, 98691. EKSAMEN I: BI1001 Celle- og molekylærbiologi BOKMÅL Side 1 av 5 Norges teknisknaturvitenskapelige universitet Fakultet for naturvitenskap og teknologi Institutt for biologi Faglig kontaktperson under eksamen: Berit Johansen, 98691 EKSAMEN I: BI1001 Celle-

Detaljer

MOLEKYLÆRBIOLOGISK DAG

MOLEKYLÆRBIOLOGISK DAG MOLEKYLÆRBIOLOGISK DAG Velkommen til Molekylærbiologisk institutt, Universitetet i Bergen 5. mars 2015 Forsidebilde (fotograf: Marc Niere) Dyrkede celler som vokser og deler seg i det uendelige er et nyttig

Detaljer

Institutt for biologi Faglig kontaktperson under eksamen: Berit Johansen (91897000) EKSAMEN I: BI1001 Celle- og molekylærbiologi BOKMÅL

Institutt for biologi Faglig kontaktperson under eksamen: Berit Johansen (91897000) EKSAMEN I: BI1001 Celle- og molekylærbiologi BOKMÅL 1 av 7 Norges teknisknaturvitenskapelige universitet Fakultet for naturvitenskap og teknologi Institutt for biologi Faglig kontaktperson under eksamen: Berit Johansen (91897000) EKSAMEN I: BI1001 Celle-

Detaljer

Reproduksjon av dyrevirus. Adsorpsjon Penetrasjon og avkledning Replikasjon og transkripsjon Syntese og samling (assembly) av viruskapsid Frigjøring

Reproduksjon av dyrevirus. Adsorpsjon Penetrasjon og avkledning Replikasjon og transkripsjon Syntese og samling (assembly) av viruskapsid Frigjøring Reproduksjon av dyrevirus Adsorpsjon Penetrasjon og avkledning Replikasjon og transkripsjon Syntese og samling (assembly) av viruskapsid Frigjøring ATTACHMENT Click after each step to view process PENETRATION

Detaljer

1. En ikke-naturlig forekommende eller konstruert sammensetning omfattende:

1. En ikke-naturlig forekommende eller konstruert sammensetning omfattende: 1 Patentkrav EP2931898 1. En ikke-naturlig forekommende eller konstruert sammensetning omfattende: et leveringssystem som er operativt konfigurert for å levere CRISPR-Caskomplekskomponenter eller polynukleotidsekvenser

Detaljer

Hovedområde: Bioteknologi Eksamensoppgaver fra skriftlig eksamen Naturfag (NAT1002).

Hovedområde: Bioteknologi Eksamensoppgaver fra skriftlig eksamen Naturfag (NAT1002). Hovedområde: Bioteknologi Eksamensoppgaver fra skriftlig eksamen Naturfag (NAT1002). Oppgave 26 V2008 Et eksempel på godkjent bruk av bioteknologi i Norge er A) gentesting for arvelige sykdommer B) genterapi

Detaljer

Foreleser: Eivind Coward, kontor 5. etg. Datablokken. coward@ii.uib.no Gruppeleder: Harald Barsnes

Foreleser: Eivind Coward, kontor 5. etg. Datablokken. coward@ii.uib.no Gruppeleder: Harald Barsnes Foreleser: Eivind Coward, kontor 5. etg. Datablokken. coward@ii.uib.no Gruppeleder: Harald Barsnes Forelesninger: tirsdag og fredag 12 14 rom 2104 Øvinger: fredag 10 12 rom 2143 Gi en innføring i noen

Detaljer

Klinisk molekylærmedisin (5): Eksempler på funksjonelle analyser

Klinisk molekylærmedisin (5): Eksempler på funksjonelle analyser Pediatrisk Endokrinologi 2003;17: 64-69 Klinisk molekylærmedisin (5): Eksempler på funksjonelle analyser Pål Rasmus Njølstad 1,2,3, Lise Bjørkhaug 1 1 Seksjon for pediatri, Institutt for klinisk medisin

Detaljer

FLERVALGSOPPGAVER - CELLEBIOLOGI

FLERVALGSOPPGAVER - CELLEBIOLOGI FLERVALGSOPPGAVER - CELLEBIOLOGI Hvert spørsmål har ett riktig svaralternativ. Cellebiologi 1 Hvilken celleorganell er vanlig i både plante- og dyreceller? A) kloroplast B) cellevegg av cellulose C) mitokondrium

Detaljer

Viktige opplysninger: Oppgavesettet utgjør totalt 100 vekttall. Antall vekttall er vist i parentes ved hver spørsmålsgruppe.

Viktige opplysninger: Oppgavesettet utgjør totalt 100 vekttall. Antall vekttall er vist i parentes ved hver spørsmålsgruppe. Ordinær eksamen, MEDSEM/ODSEM/ERNSEM2 Vår 2012 Onsdag 20. juni 2012 kl. 09:00-15:00 Oppgavesettet består av 6 sider, inkludert vedlegg Viktige opplysninger: Oppgavesettet utgjør totalt 100 vekttall. Antall

Detaljer

EKSAMENSOPPGAVE I BI1001 CELLE- OG MOLEKYLÆRBIOLOGI

EKSAMENSOPPGAVE I BI1001 CELLE- OG MOLEKYLÆRBIOLOGI Norges teknisk-naturvitenskapelige universitet Institutt for biologi KSAMNSOPPGAV I BI1001 CLL- OG MOLKYLÆRBIOLOGI Faglig kontakt under eksamen: Jens Rohloff Tlf.: 97608994 ksamensdato: 4. juni 2010 ksamenstid:

Detaljer

PBM 233 Mikrobiologi for farmasøyter

PBM 233 Mikrobiologi for farmasøyter PBM 233 Mikrobiologi for farmasøyter Faglærer 2004: Per Arne Risøen Biologisk seksjon, ZEB Kap. 11 Mikrobiell evolusjon og systematikk Dateringer av fossiler viser at bakterier oppstod for ca. 3,6 milliarder

Detaljer

MOLEKYLÆRBIOLOGISK FAGDAG

MOLEKYLÆRBIOLOGISK FAGDAG MOLEKYLÆRBIOLOGISK FAGDAG Velkommen til Molekylærbiologisk institutt, Universitetet i Bergen 8. mars 2017 Forsidebilde (fotograf: Marc Niere) Dyrkede celler som vokser og deler seg i det uendelige er et

Detaljer

NORGES TEKNISK-NATURVITENSKAPELIG UNIVERSITET Side 1 av 5 INSTITUTT FOR FYSIKK. EKSAMEN I FAG CELLEBIOLOGI 1 august 1997 Tid: kl

NORGES TEKNISK-NATURVITENSKAPELIG UNIVERSITET Side 1 av 5 INSTITUTT FOR FYSIKK. EKSAMEN I FAG CELLEBIOLOGI 1 august 1997 Tid: kl NORGES TEKNISK-NATURVITENSKAPELIG UNIVERSITET Side 1 av 5 INSTITUTT FOR FYSIKK Faglig kontakt under eksamen: Navn: Professor Tore Lindmo Tlf.:93432 EKSAMEN I FAG 74618 CELLEBIOLOGI 1 august 1997 Tid: kl

Detaljer

Holder cytoplasmaet på plass. Regulerer transporten inn i og ut av cellen og har kontakt med naboceller.

Holder cytoplasmaet på plass. Regulerer transporten inn i og ut av cellen og har kontakt med naboceller. Figurer kapittel 7 Fra gen til egenskap Figur s. 189 elledel ellemembran ytoplasma Lysosom Ribosom Mitokondrie Kanalnettverk (endoplasmatisk nettverk) Kjernemembran ellekjerne rvestoff (= DN) Molekyl Protein

Detaljer

Læringsutbyttebeskrivelser

Læringsutbyttebeskrivelser Delemne 1.5: Gener, celleproliferasjon og kreft Inngår i emne: MED-1501 Medisin og odontologi 1. studieår Oppdatert dato: 10. november 2018 Godkjent av Studieplanutvalget medisin Omfang: 5 uker Faglig

Detaljer

Reproduksjon av dyrevirus. Adsorpsjon Penetrasjon og avkledning Replikasjon og transkripsjon Syntese og samling (assembly) av viruskapsid Frigjøring

Reproduksjon av dyrevirus. Adsorpsjon Penetrasjon og avkledning Replikasjon og transkripsjon Syntese og samling (assembly) av viruskapsid Frigjøring Reproduksjon av dyrevirus Adsorpsjon Penetrasjon og avkledning Replikasjon og transkripsjon Syntese og samling (assembly) av viruskapsid Frigjøring ATTACHMENT Click after each step to view process PENETRATION

Detaljer

Bare et fåtall av genene uttrykkes i hver celle

Bare et fåtall av genene uttrykkes i hver celle 1 Medisin stadium 1c Geir Slupphaug, IKM Regulering av genuttrykk Grunnlaget for regulering av cellens funksjoner ligger lagret i arvematerialet - i DNA- molekylet For at genene skal utøve sin funksjon,

Detaljer

Generelle prinsipper ved stamceller, samt muligheter ved ryggmargsskader og hjerneskader

Generelle prinsipper ved stamceller, samt muligheter ved ryggmargsskader og hjerneskader Generelle prinsipper ved stamceller, samt muligheter ved ryggmargsskader og hjerneskader Joel C. Glover Avdeling for fysiologi Ins>tu? for medisinske basalfag Universitetet i Oslo Nasjonalt senter for

Detaljer

NORGES TEKNISK-NATURVITENSKAPELIGE UNIVERSITET INSTITUTT FOR FYSIKK EKSAMEN I EMNE SIF4070 CELLEBIOLOGI

NORGES TEKNISK-NATURVITENSKAPELIGE UNIVERSITET INSTITUTT FOR FYSIKK EKSAMEN I EMNE SIF4070 CELLEBIOLOGI Side 1 av 6 NORGES TEKNISK-NATURVITENSKAPELIGE UNIVERSITET INSTITUTT FOR FYSIKK EKSAMEN I EMNE SIF4070 CELLEBIOLOGI Faglig kontakt under eksamen: professor Catharina Davies Tel.73593688 Eksamensdato: 9.

Detaljer

Medisin stadium 1c Geir Slupphaug, IKM Regulering av genuttrykk

Medisin stadium 1c Geir Slupphaug, IKM Regulering av genuttrykk Medisin stadium 1c Geir Slupphaug, IKM Regulering av genuttrykk Grunnlaget for regulering av cellens funksjoner ligger lagret i arvematerialet - i DNA- molekylet For at genene skal utøve sin funksjon,

Detaljer

ML-208, generell informasjon

ML-208, generell informasjon ML-208, generell informasjon Emnekode: ML-208 Emnenavn: Molekylærbiologi Dato:20.12.2017 Varighet:4 timer Tillatte hjelpemidler: Ingen Merknader:Lag gjerne tegninger og figurer for å illustrere og forklare

Detaljer

Introduksjon til Biokjemi. Ingar Leiros, Institutt for Kjemi, UiT

Introduksjon til Biokjemi. Ingar Leiros, Institutt for Kjemi, UiT Introduksjon til Biokjemi Ingar Leiros, Institutt for Kjemi, UiT Biokjemi Biokjemi (Wikipedia): -Studien av de kjemiske prosesser i levende organismer, eller sagt på en annen måte; det molekylære grunnlaget

Detaljer

Kontinuasjonseksamen, MEDSEM2/ODSEM2/ERNSEM2 høst 2007 Onsdag 20. februar 2008 kl. 09:00-15:00

Kontinuasjonseksamen, MEDSEM2/ODSEM2/ERNSEM2 høst 2007 Onsdag 20. februar 2008 kl. 09:00-15:00 EKSAMENSOPPGAVER FRA UKE 18 (Noen av oppgavene overlapper med andre uker, særlig med uke 16. Ettersom vi ikke har hatt om dette enda, er jeg noen ganger usikker på hva som hører til uken, så dere får tilgi

Detaljer

Figurer kapittel 8: Bioteknologi Figur s

Figurer kapittel 8: Bioteknologi Figur s 2 Figurer kapittel 8: Bioteknologi Figur s. 236 237 5' 3' 5' 3' DNA-primer 5' 3' DNA bit som skal kopieres Oppvarming 3' 5' 5' DNAprimer tilsettes 3' 3' 5' DNApolymerase Nytt DNA dannes Kopieringen gjentas

Detaljer

Kosmos SF. Figurer kapittel 8 Den biologiske tidsalderen Figur s. 214 BIOTEKNOLOGI. Næringsmiddelindustri. Landbruk. Akvakultur

Kosmos SF. Figurer kapittel 8 Den biologiske tidsalderen Figur s. 214 BIOTEKNOLOGI. Næringsmiddelindustri. Landbruk. Akvakultur Figurer kapittel 8 Den biologiske tidsalderen Figur s. 214 Proteiner fra olje og gass Bryggerier Meierivirksomhet Næringsmiddelindustri Fiskeavl Akvakultur Genmodifiserte organismer Planteavl Landbruk

Detaljer

Fra laboratorium til pasient - stamcelleforskningens muligheter, utfordringer og perspektiver

Fra laboratorium til pasient - stamcelleforskningens muligheter, utfordringer og perspektiver Fra laboratorium til pasient - stamcelleforskningens muligheter, utfordringer og perspektiver Joel C. Glover Leder, Nasjonalt senter for stamcelleforskning Professor, Institutt for medisinsk basalforskning

Detaljer

Repetisjonsoppgaver samling 1 Cellen

Repetisjonsoppgaver samling 1 Cellen Repetisjonsoppgaver samling 1 Cellen 1) Tegn og forklar hvordan cellemembranen er oppbygd? 2) Hvordan er mitokondrier oppbygd og hvilke funksjoner har de? 3) Hva kan vesikler/blærer i cytoplasma inneholde?

Detaljer

Kapittel 10, del 2: Klassisk genetikk: Mendels arvelover. -forhold som influerer fenotypen slik at den avviker fra det Mendel observerte:

Kapittel 10, del 2: Klassisk genetikk: Mendels arvelover. -forhold som influerer fenotypen slik at den avviker fra det Mendel observerte: Kapittel 10, del 2: Klassisk genetikk: Mendels arvelover -forhold som influerer fenotypen slik at den avviker fra det Mendel observerte: 1. Dominansforhold 2. Multiple allel 3. Geninteraksjon 4. Genuttrykk

Detaljer

Medisin stadium 1A Geir Slupphaug, IKM. Den eukaryote cellen I

Medisin stadium 1A Geir Slupphaug, IKM. Den eukaryote cellen I Medisin stadium 1A Geir Slupphaug, IKM Den eukaryote cellen I Celler finnes i utallige varianter Prokaryote celler Prokaryote celler deles inn i archaebakterier og eubakterier. De er relativt små (1-5

Detaljer

Den eukaryote cellen I. Prokaryote celler

Den eukaryote cellen I. Prokaryote celler Medisin stadium 1A Geir Slupphaug, IKM Celler finnes i utallige varianter Den eukaryote cellen I Prokaryote celler deles inn i archaebakterier og eubakterier. De er relativt små (1-5 μm) og har en enkel

Detaljer

GRUNNLEGGENDE GENETISKE BEGREPER Del I - en serie om kattegenetikk

GRUNNLEGGENDE GENETISKE BEGREPER Del I - en serie om kattegenetikk GRUNNLEGGENDE GENETISKE BEGREPER Del I - en serie om kattegenetikk Dette er første del i en serie om kattegenetikk. I denne første delen vil jeg ta for meg de ulike genetiske begrepene som blir brukt i

Detaljer

Proteiner og aminosyrer

Proteiner og aminosyrer Proteiner og aminosyrer Presentasjonsplan 1/2 Cellen Grunnleggende komponenter DNA til mrna til proteiner Den genetiske koden: Hva er et codon? Presentasjonsplan 2/2 Aminosyrer del 1 Hvilke molekyler er

Detaljer

EKSAMENSOPPGAVE I BI1001 CELLE- OG MOLEKYLÆRBIOLOGI

EKSAMENSOPPGAVE I BI1001 CELLE- OG MOLEKYLÆRBIOLOGI Norges teknisk-naturvitenskapelige universitet Institutt for biologi EKSAMENSOPPGAVE I BI1001 CELLE- OG MOLEKYLÆRBIOLOGI Faglig kontakt under eksamen: Jens Rohloff Tlf.: 976 08 994 - Eksamensdato: 29.5.2008

Detaljer

DNA-replikasjon. DNA-replikasjon. Viktige punkt (repetisjon) Replikasjon foregår i replikasjonsfabrikker. Vil bli gjennomgått: I løpet av cellens

DNA-replikasjon. DNA-replikasjon. Viktige punkt (repetisjon) Replikasjon foregår i replikasjonsfabrikker. Vil bli gjennomgått: I løpet av cellens , 1C/D Geir Slupphaug, IKM Vil bli gjennomgått: Hovedvekt på prosesser i eukaryote celler Initiering av replikasjonen I løpet av cellens livssyklus, må DNAinnholdet i cellekjernen fordobles G0 G1 Dannelse

Detaljer

Protein Sorting- Kap. 17

Protein Sorting- Kap. 17 Forelesninger i BI 212 - Cellebiologi - Våren 2002 Protein Sorting- Kap. 17 Tor-Henning Iversen, Plantebiosenteret (PBS),Botanisk institutt,ntnu e-mail : Tor- Henning.Iversen@chembio chembio.ntnu.no Tlf.

Detaljer

Mikroalger til medisin; krefthemmere

Mikroalger til medisin; krefthemmere Mikroalger til medisin; krefthemmere Kari Skjånes og Hanne Skomedal Bioforsk Jord og Miljø og Plantehelse Agenda Hvorfor mikroalger som krefthemmere Kreftutvikling Potensiale Hva kan utvikles Hvordan utvikle

Detaljer

Brystkreft; Hva har molekylærbiologi lært oss?

Brystkreft; Hva har molekylærbiologi lært oss? Brystkreft; Hva har molekylærbiologi lært oss? Anne-Lise Børresen-Dale Seksjon for Genetikk Institutt for Kreftforskning Oslo Unversitets sykehus, Radiumhospitalet NFR Brystkreft er en meget kompleks sykdom

Detaljer

Født Født sånn sånn eller blitt sånn? Monica Cheng Munthe-Kaas, OUS 11.09.2013

Født Født sånn sånn eller blitt sånn? Monica Cheng Munthe-Kaas, OUS 11.09.2013 Født Født sånn sånn eller blitt blitt sånn? sånn? Monica Cheng Munthe-Kaas, OUS 11.09.2013 Innlandskongressen for Helseforskning 11 September 2013 Monica Cheng Munthe-Kaas Gener versus Miljø HJERNEVASK

Detaljer

EKSAMENSOPPGAVE I BI1001 CELLE- OG MOLEKYLÆRBIOLOGI

EKSAMENSOPPGAVE I BI1001 CELLE- OG MOLEKYLÆRBIOLOGI Norges teknisk-naturvitenskapelige universitet Institutt for biologi EKSAMENSOPPGAVE I BI1001 CELLE- OG MOLEKYLÆRBIOLOGI Faglig kontakt under eksamen: Berit Johansen Tlf.: 91897000 Eksamensdato: 25. mai

Detaljer

UNIVERSITETET I OSLO

UNIVERSITETET I OSLO UNIVERSITETET I OSLO Det matematisk-naturvitenskapelige fakultet Eksamen i : INF2300 Grunnkurs i bioinformatikk Eksamensdag : Tirsdag 15. juni 2004 Tid for eksamen : 09.00 12.00 Oppgavesettet er på : 13

Detaljer

Klinisk molekylærmedisin (4): Indirekte diagnostikk ved koblingsanalyser

Klinisk molekylærmedisin (4): Indirekte diagnostikk ved koblingsanalyser PEDENDO_SISTE_slutt.qxd 18.12.2003 21:34 Side 32 Pediatrisk Endokrinologi 2003;17: 34-38 Klinisk molekylærmedisin (4): Indirekte diagnostikk ved koblingsanalyser Pål Rasmus Njølstad 1,2,3,Jørn V. Sagen

Detaljer

Trening øker gjenvinning i celler Natur og miljø

Trening øker gjenvinning i celler Natur og miljø Forskningsnyheter om Huntingtons sykdom. I et lettfattelig språk. Skrevet av forskere. Til det globale HS-fellesskapet. Trening øker gjenvinning i celler Trening øker cellulær gjenvinning hos mus. Er det

Detaljer

2. Fremgangsmåten ifølge krav 1, hvori dsrna-duplekset har en lengde fra 8 basepar (bp) ti 30 bp.

2. Fremgangsmåten ifølge krav 1, hvori dsrna-duplekset har en lengde fra 8 basepar (bp) ti 30 bp. 1 Patentkrav 1. Fremgangsmåte for å endre et mål-dna, der fremgangsmåten omfatter å bringe mål-dna-et i kontakt med et kompleks omfattende: (a) et Cas9-polypeptid og (b) et enkeltmolekyl-rna som er målrettet

Detaljer

4260 Mikrobiologi. Midtprøveoppgaver. 02. oktober 2013

4260 Mikrobiologi. Midtprøveoppgaver. 02. oktober 2013 1 Høgskolen i Telemark Fakultet for allmennvitenskapelige fag 4260 Mikrobiologi Midtprøveoppgaver 02. oktober 2013 Tid: 2 timer Sidetall: 7 (40 spørsmål) Hjelpemidler: Ingen Velg kun ett svaralternativ

Detaljer

Naturfag for ungdomstrinnet

Naturfag for ungdomstrinnet Naturfag for ungdomstrinnet Arv Illustrasjoner: Ingrid Brennhagen 1 Vi skal lære om arvestoffet, DNA celledeling genetisk variasjon arv 2 DNA Arvestoffet kalles DNA. DNA er kjempestore molekyler som inneholder

Detaljer

Eksamensoppgave i PSY3111 Individuell utvikling, gener, nervesystem og atferd

Eksamensoppgave i PSY3111 Individuell utvikling, gener, nervesystem og atferd Psykologisk institutt Eksamensoppgave i PSY3111 Individuell utvikling, gener, nervesystem og atferd Faglig kontakt under eksamen: Dawn Behne Tlf.: Psykologisk institutt 73 59 19 60 Eksamensdato: 18.12.2014

Detaljer

FLERVALGSOPPGAVER GENETIKK

FLERVALGSOPPGAVER GENETIKK FLERVALGSOPPGAVER GENETIKK FLERVALGSOPPGAVER FRA EKSAMEN I BIOLOGI 2 Disse flervalgsoppgavene er hentet fra eksamen i Biologi 2 del 1. Det er fire (eller fem) svaralternativer i hver oppgave, og bare ett

Detaljer

FLERVALGSOPPGAVER EVOLUSJON

FLERVALGSOPPGAVER EVOLUSJON FLERVALGSOPPGAVER EVOLUSJON FLERVALGSOPPGAVER FRA EKSAMEN I BIOLOGI 2 V2008 - V2011 Disse flervalgsoppgavene er hentet fra eksamen i Biologi 2 del 1. Det er fire (eller fem) svaralternativer i hver oppgave,

Detaljer

Cellebiologiske prosesser som respons på virusinfeksjon

Cellebiologiske prosesser som respons på virusinfeksjon Cellebiologiske prosesser som respons på virusinfeksjon PBM 336 2005 Siri Mjaaland Infeksjoner - immunresponser 1 Figure 2-49 Interferoner Uspesifikk immunitet viral infeksjon stimulerer direkte produksjon

Detaljer

ML-208, generell informasjon

ML-208, generell informasjon ML-208, generell informasjon Emnekode: ML-208 Emnenavn: Molekylærbiologi Dato:20.12.2017 Varighet:4 timer Tillatte hjelpemidler: Ingen Merknader:Lag gjerne tegninger og figurer for å illustrere og forklare

Detaljer

Regulering av genuttrykk

Regulering av genuttrykk 1, stadium IC, 2012, Tonje S. Steigedal 2 Grunnlaget for regulering av cellens funksjoner ligger lagret i arvematerialet - i DNA- molekylet. For at genene skal utøve sin funksjon, må de imidlertid uttrykkes

Detaljer

Epigenetikk; arvesynden i ny innpakning? Dag O. Hessen University of Oslo, Dept. Biology Center of Ecological and Evolutionary Synthesis (CEES)

Epigenetikk; arvesynden i ny innpakning? Dag O. Hessen University of Oslo, Dept. Biology Center of Ecological and Evolutionary Synthesis (CEES) Epigenetikk; arvesynden i ny innpakning? Dag O. Hessen University of Oslo, Dept. Biology Center of Ecological and Evolutionary Synthesis (CEES) Den genetiske kode Oppnøstingen av den genetiske kode foregikk

Detaljer

Tilfeldig eller til akkurat rett tid og sted?

Tilfeldig eller til akkurat rett tid og sted? FORMSPØRSMÅLET "Ett av de vedvarende mysterier i utviklings- og celle -biologi, er kroppsdannelse (morfogenese), prosessen av hvordan den arvede kroppsformen blir dannet på hvert stadium, fra det befruktede

Detaljer

Uke 16 (nb, spm. fra uke 16 og uke 17 overlapper ofte)

Uke 16 (nb, spm. fra uke 16 og uke 17 overlapper ofte) Uke 16 (nb, spm. fra uke 16 og uke 17 overlapper ofte) Høst 07 konte 28. Forklar begrepene celledeling og cellevekst, og sett begrepene i sammenheng med hyperplasi og hypertrofi. Celledeling vil si økning

Detaljer

BI 212- Protein Sorting - Kap. 17 Syntese og mål for mitokondrie- og kloroplast-proteiner (forts.)

BI 212- Protein Sorting - Kap. 17 Syntese og mål for mitokondrie- og kloroplast-proteiner (forts.) Syntese og mål for mitokondrie- og kloroplast-proteiner (forts.) Veiene for opptak fra cytosol av kloroplast-proteiner Opptak av proteiner fra cytosol til kloroplaster ligner mye på mitokondrie-importen

Detaljer

Strålebiologisk grunnlag for strålevern. Del 1: Akutte, deterministiske effekter på vev og foster

Strålebiologisk grunnlag for strålevern. Del 1: Akutte, deterministiske effekter på vev og foster Strålebiologisk grunnlag for strålevern. Del 1: Akutte, deterministiske effekter på vev og foster Forelesning i FYSKJM4710 Eirik Malinen Deterministiske effekter Celler kan miste sin reproduktive kapasitet

Detaljer

Oppgave: MED1100-3_OPPGAVE2_H16_KONT

Oppgave: MED1100-3_OPPGAVE2_H16_KONT Side 10 av 35 Oppgave: MED1100-3_OPPGAVE2_H16_KONT Del 1: Ola har en arvelig betinget kombinert immundefekt med mangel på både T-celler og B-celler. Ola får derfor gjentatte Hvorfor er Ola beskyttet mot

Detaljer

HIV / AIDS - infeksjon - behandling. PBM 233 Mikrobiologi Siri Mjaaland

HIV / AIDS - infeksjon - behandling. PBM 233 Mikrobiologi Siri Mjaaland HIV / AIDS - infeksjon - behandling PBM 233 Mikrobiologi 10.02.2005 Siri Mjaaland HIV / AIDS 1981 første gang anerkjent som distinkt sykdom Opprinnelig overført fra sjimpanse Viruset kan ha sirkulert fra

Detaljer

Forelesninger i BI Cellebiologi. Denaturering og renaturering. Figure 3-13

Forelesninger i BI Cellebiologi. Denaturering og renaturering. Figure 3-13 Figure 3.9 Denaturering og renaturering Figure 3-13 Denaturering og renaturering Figure 3-14 Viser tre trinn i refolding av et protein som har vært denaturert. Molten globule -formen er en intermediær

Detaljer

Oversikt over kap. 11. Kap. 11 Den direkte påvisning av genotype skiller individuelle genomer. Fire klasser av DNA polymorfismer.

Oversikt over kap. 11. Kap. 11 Den direkte påvisning av genotype skiller individuelle genomer. Fire klasser av DNA polymorfismer. Kap. 11 Den direkte påvisning av genotype skiller individuelle genomer Oversikt over kap. 11 Fire klasser av DNA variasjon til direkte påvisning av genotype. Metoder som bruker hybridisering, elektroforese,

Detaljer

DNA replikasjon. Hovedvekt på prosesser i eukaryote celler. Dannelse av primere og Okazaki-fragment

DNA replikasjon. Hovedvekt på prosesser i eukaryote celler. Dannelse av primere og Okazaki-fragment 1 DNA replikasjon, Stadium IC, 2012, Tonje Strømmen Steigedal 2 Vil bli gjennomgått: Hovedvekt på prosesser i eukaryote celler Initiering av replikasjonen Dannelse av primere og Okazaki-fragment Koordinering

Detaljer

EKSAMEN I EMNE SIF4070 CELLEBIOLOGI Mandag 7. mai 2001 Tid: kl Ingen trykte eller håndskrevne hjelpemidler tillatt.

EKSAMEN I EMNE SIF4070 CELLEBIOLOGI Mandag 7. mai 2001 Tid: kl Ingen trykte eller håndskrevne hjelpemidler tillatt. Side av 5 NORGES TEKNISK-NATURVITENSKAPELIGE UNIVERSITET INSTITUTT FOR FYSIKK Faglig kontakt under eksamen: Navn: Bjørn Torger Stokke Tlf: 93434 BOKMÅL EKSAMEN I EMNE SIF4070 CELLEBIOLOGI Mandag 7. mai

Detaljer

TEKNOMAT ER DET SÅ ENKELT?

TEKNOMAT ER DET SÅ ENKELT? TEKNOMAT ER DET SÅ ENKELT? Tor Lea Gruppe for molekylær cellebiologi Institutt for kjemi, bioteknologi og matvitenskap 2111 2005 Innhold Dagens situasjon Alternativ kjøttproduksjon In vitro- kjøtt/laboratoriekjøtt

Detaljer

Fasit til oppgavene. K-skallet L-skallet M-skallet

Fasit til oppgavene. K-skallet L-skallet M-skallet Kapittel 1 1. Tegn atomet til grunnstoffet svovel (S), og få med antall protoner, nøytroner, elektroner, elektronskall og antall valenselektroner. K-skallet L-skallet M-skallet Svovel har, som vi kan se

Detaljer

Metode for å kartlegge DNA-et og båndmønsteret det har. Brukes for å kartlegge slektskap eller identifisere individer innenfor rettsmedisin.

Metode for å kartlegge DNA-et og båndmønsteret det har. Brukes for å kartlegge slektskap eller identifisere individer innenfor rettsmedisin. 8: Den bioteknologiske tidsalderen Figur side 238 Proteiner fra olje og gass Bryggerier Meierivirksomhet Næringsmiddelindustri Fiskeavl Akvakultur Genmodifiserte organismer Planteavl Landbruk Husdyravl

Detaljer

Forelesninger i BI Cellebiologi. Protein struktur og funksjon - Kap. 3

Forelesninger i BI Cellebiologi. Protein struktur og funksjon - Kap. 3 Forelesninger i BI 212 - Cellebiologi Protein struktur og funksjon - Kap. 3 Tor-Henning Iversen, Plantebiosenteret (PBS),Botanisk institutt,ntnu e-mail : Tor-Henning.Iversen@chembio.ntnu.no Tlf. 73 59

Detaljer

HIV / AIDS -infeksjon - behandling

HIV / AIDS -infeksjon - behandling HIV / AIDS -infeksjon - behandling HIV / AIDS 1981 første gang anerkjent som distinkt sykdom Opprinnelig overført fra sjimpanse Viruset kan ha sirkulert fra 1915-1941 Trolig sirkulert blant populasjoner

Detaljer