Strukturkjemiske metoder 1

Transkript

1 Biologiske makromolekylers struktur KJM5310 F4, F5, F6 STRUKTURKJEMISKE METODER X-Ray, NMR, EM, AFM, CD, MS, EXAFS, Raman, UV/synlig, MCD, DFT, modellering, samt symmetri. Høsten Hans-Petter Hersleth Strukturkjemiske metoder 1 Hele 3D-strukturen Røntgendiffraksjon (Proteinkrystallografi) NMR (Nukleær magnetisk resonans spektroskopi) Homolog modellering Overflaten Elektronmikroskopi (Kryo-EM) Atomic force microscopy Primær eller sekundærstruktur MS (massespektrometri) CD (circulær dikroisme) Algoritmer for studie av makromolekylers struktur 1

2 Strukturkjemiske metoder 2 for studie av makromolekylers struktur Delstrukturer / Aktivt sete UV/synlig-spekroskopi Resonance Raman/IR-spektroskopi EXAFS (Extended X-ray Absorption Fine Structure) EPR (Elektron paramagnetisk resonans spektroskopi) MCD (magnetisk circulær dikroisme) Mössbauer spektroskopi DFT-beregninger (density functional therory) / Kvantekjemi Modellering Strukturkjemiske metoder 3 For å få hele strukturen er røntgendiffraksjon og NMR hovemetodene. De andre metodene er et utvalg av de mest utbredte. Det gis her kun en overfladisk beskrivelse av metodene med særlig henblikk på å få innsikt i hvilke metoder som finnes og hvilken informasjon en kan få fra de. Røntgendiffraksjon vektlegges sterkest i gjennomgangen. (ellers anbefales kurset KJM5300 Proteinkrystallografi og MBV4020 Arbeidsmetoder i molekylærbiologi og biokjemi II). 2

3 HELE 3D- STRUKTUREN Røntgendiffraksjon 1 Proteinkrystallografi Ved å plassere krystaller av makromolekyler i en røntgenstråle får man et sprednigsmønster (diffraksjon) av strålen som man registerer. I dette mønsteret ligger det informasjon om krystallenes oppbygging og i dette også strukturen til molekylet(ene) som danner krystallen. 3

4 Røntgendiffraksjon 2 Proteinkrystallografi Man bruker røntgenstråler fordi bølgelengden til disse strålene er av samme størrelsesorden som de atomer man ønsker å se. I et vanlig lysmikroskop kan man se objekter med størrelse ned til bølgelengden av vanlig lys noe mer forstørrelse kan man ikke sette inn, slike linser finnes ikke. Begreper og bakgrunn: Røntgendiffraksjon 3 Krystaller: periodisk gitter med molekyler organisert sytematisk i såkalte enhetsceller Proteinkrystallografi Diffraksjon: fenomen som skyldes spredning av stråling fra et gitter Røntgenstråling: Diffraksjon er bare mulig hvis bølgelengden er at samme størrelsesorden som objektet man skal se 4

5 Røntgendiffraksjon 4 Proteinkrystallografi Faseproblemet: etter at strålen treffer krystallen og spres må de spredte strålene samles igjen slik at man kan lage et bilde av molekylene i krystallen. Ingen linse kan fokusere røntgenstråling dette må gjøres i en datamaskin (flere ulike metoder ikke viktig i KJM5310). Det er kun amplituden (intensiteten) som kan måles, ikke fasen. Elektrontetthet: Det er elektroner som sprer strålen og dermed får vi et bilde av elektrontettheten (et konturkart) ut fra fokuseringsprosessen. Inn i denne tettheten plasseres aminosyrene slik at vi får en 3Dmodell av molekylet. I og med at det er elektroner som sprer strålen er intensiteten avhenging av atomets antall elektroner. Røntgendiffraksjon 5 Proteinkrystallografi Krystallisering og krystaller: Krystaller dannes ved at en løsning av molekylet bringes langsomt over løselighetspunktet slik at fast stoff felles ut. Mange ulike forsøksbetingelser (ph, salt, buffere, additiver m.m.) må ofte prøves ut. Molekylene (protein, DNA-fragment, trna, viruspartikler) danner regelmessige mønster gjerne med symmetri når de krystalliserer. Symmetrien kan være av to typer: ren rotasjon og rotasjon + translasjon [For krystaller generelt har vi også speiling og inversjon, men det går ikke med våre kirale makromolekyler] Salt concentration 5

6 Symmetri i krystaller og makromolekyler Det finnes tre ulike symmetri-typer for isolerte objekter: Rotasjoner (2,3,4,5,6-tallig er de vanligste) Speilplan Inversjon Det er bare symmetri av den første typen som kan forekommer for biologiske makromolekyler pga deres kiralitet som ikke blir bevart ved speiling og inversjon. For krystaller kommer i tillegg translasjon/forskyvning langs akser. Dette kalles skruakser. Symbolet for dette er N r hvor N er rotasjonens orden mens r forteller hvor mange r/n-deler forflytningen er fra et objekt til neste. Eksempel: 4 1 betyr 4-tallig symmetri med translasjon ¼. Dette kommer vi tilbake til når vi ser på α-helikser og DNA-typer Symmetri i krystaller og makromolekyler Mange makromolekyler danner såkalte oligomerer, dvs at det aktive molekylet finnes i flere symmetri-relaterte kopier i en enkelt partikkel. Dette har flere fordeler: Flere aktive seter pr. partikkel Lavere osmotisk trykk Mulighet for kommunikasjon mellom enhetene Mer stabil struktur Eksempler: Hemoglobin består av 2x(a+b) enhet. Kommunikasjon mellom de to kopiene forbedrer oksygenopptak og frigjøring Transkripsjonsfaktorer har ofte 2-tallig symmetri for å binde bedre til DNA som da har tilsvarende symmetri på bindingsstedet. Mange ionekanaler, membranproteiner og andre sirkulære molekyler har symmetri (mindre genom, symmetrisk omgivelser) 6

7 Instrument og datainnsamling Røntgendiffraksjon 6 Proteinkrystallografi Diffraksjosmønsteret samles inn ved hjelp av enten et hjemmeinstrument med røntgengenerator eller på et synkrotronanlegg. Resultater er en liste med intensiteter for til spredte stråler. Disse inneholder informasjon om elektrontettheten. Diffraksjon og spredning av stråling: Krystallen vil fungere som et gitter med mange krystallplan som reflekterer strålen i ulike retninger. Jo tettere disse planene ligger, jo større blir spredningsvinkelen. Samtidig øker oppløsningen og detaljnivået i strukturdataene. Røntgendiffraksjon 7 Faseproblemet og løsning av fokuseringsproblemet 1 ρ( xyz) = F( hkl) cos2π ( hx + ky + lz α hkl ) V h k l Proteinkrystallografi Ved å bruke denne ligningen kan man regne ut et kart som man bruker til modellbygging. Desto tettere bølger man legger sammen jo mer detaljert blir modellen. Dette måles ofte i Ångstrøm. At en struktur har en oppløsning på 2.2 Å betyr at de tetteste bølgene som ble lagt sammen for å regne ut kartet kom fra krystallplan med 2.2 Å avstand og har tilsvarende detaljrikdom. 7

8 Røntgendiffraksjon 8 Fordeler og ulemper + Gir ofte svært gode og nøyaktige bilder av makromolekyler + Modellene er korrekte i den forstand at data ikke skal tolkes, slik som i NMR + Kan lage modell av hele molekylet både overflaten og de indre deler, molekylene er gjennomsiktige Må ha krystaller av molekylet Relativt dyrt instrument Destruktiv teknikk, proteinprøven ødelegges av stråleskade Ser et stivt gjennomsnittsmolekyl ikke et dynamisk pulserende og fleksibelt molekyl Ser ikke molekylet i sitt rette element i vannløsning men det er mye vann i krystallene og det har vist seg å være god overensstemmelse mellom krystallstruktur og strukturer av protein i løsning NMR 1 Nuclear Magnetic Resonance Kjernemagnetisk resonans observasjon av overganger mellom energinivåer for atomkjernespinn i et sterkt magnetisk felt. Kan observere omgivelsene til utvalgte atomkjerner (vanligvis 1 H og 13 C, men også 15 N, 17 O og 31 P er av biologisk interesse) Fra mønsteret på spekteret (et 2-dimensjonalt spekter) kan man lese av såkalte koplingskonstanter som viser vekselvirkning mellom ulike magnetiske kjerner som er i nærheten av hverandre. 8

9 NMR 2 Når molekylet plasseres i et magnetisk felt så ordner kjernenes spinn seg med feltet. Ved å sende inn radiofrekvens så kan man eksitere. Når kjernen faller ned igjen til likevektstilstanden sendes det så ut en stråling som kan observeres. Frekvensen til strålingen fra hver kjerne er forskjellig for hvert atom og er avhengig av miljøet rundt kjernen. Frekvensverdien relativt til en referanse kalles kjemisk skift. Kobling med n andre like kjerner gir en splitting i n+1 antall topper Nuclear Magnetic Resonance 1D 1 H-NMR spektrum NMR 3 Nuclear Magnetic Resonance Det er to typer av slike koplingskonstanter: Direkte gjennom kovalente bindinger (2 eller 3 bindinger i avstand, eks. H-C-C-H) (COSY, correalation spectroscopy) Indirekte gjennom rommet (NOE-kopling, Nuclear Overhauser Effekt) 9

10 NMR 4 Nuclear Magnetic Resonance Siden avstanden mellom hydrogenatomene i to påfølgende aminosyrer i proteiner er 4 bindinger vil COSY eksperiment kun gi koblinger mellom atomer i samme aminosyreresidue. Dette gir fingerprint signaler for hver aminosyre. NMR 5 Nuclear Magnetic Resonance NOE koblingene kan være mellom naboaminosyrer eller mellom aminosyreresiduer som er sekvensmessig langt fra hverandre, men som er nærme hverandre i rommet: 10

11 2D 1 H NMR NOE spektrum viser kobling mellom H- atomer som er nærmere hverandre enn 5 Å i rommet. NMR 6 Nuclear Magnetic Resonance NMR 7 Nuclear Magnetic Resonance Koplingskonstantenes størrelse forteller om avstanden mellom atomkjernene Man setter opp en avstandstabell for molekylet Fra denne tabellen konstruerer man en 3-dimensjonal modell av molekylet hvor alle avstandene stemmer med observasjonene. Flere modeller kan være aktuelle. I tillegg kan modellene gi indikasjoner på fleksibilitet i bestemte områder av proteinet (for eksempel i looper). 11

12 NMR 7 Nuclear Magnetic Resonance Flere modeller kan være aktuelle. I tillegg kan modellene gi indikasjoner på fleksibilitet i bestemte områder av proteinet (for eksempel i looper). Fordeler og ulemper NMR 8 + Utføres på molekyler i løsning relativt enkelt eksperiment rent praktisk, ikke-destruktiv teknikk + Kan gi detaljert strukturinformasjon om hele makromolekylet, både overflate og indre deler. Viser informasjon om dynamiske prosesser. Komplisert spekter som er vanskelig å tolke Relativt dyrt instrument Modellen behøver ikke være korrekt, man kan få flere alternative modeller som alle passer til observerte data Dyrt instrument Nuclear Magnetic Resonance 12

13 OVERFLATEN Kryo-EM 1 Elektronmikroskopi Spredning av elektroner fra 2-dimensjonal flate. Fotografering ved hjelp av elektroner istedenfor vanlig lysbølger. En-partikkel elektronmikroskopi (midler mange like kopier) Elektrontomografi (f.eks bilde av en hel celle, enkeltbilder) Bestråling av prøver med elektroner fører til stråleskader, de reagerer med prøven. Derfor kryo-em. For å bygge 3D-modeller av molekylære komplekser trengs mange objekter (forsterkning av signal + flere synsvinkler). Gjennom en matematisk prosess dannes en 3D-modell som viser hvordan molekylet ser ut. 13

14 Kryo-EM 2 Elektronmikroskopi Kryo-EM av ribosomet til 11 Å oppløsning De senere år har utviklingen vært stor på EM-området, og mange kombinerer nå EM med NMR/krystallografi for å bygge modeller av molekylære komplekser hvor hver del bestemmes i detalj fra krystallografi/nmr mens komplekset rekonstrueres vha disse byggesteinene og EMeksperimenter Strukturen av cell-puncturing device til bakteriofag T4 Krystallstruktur til 2.9 Å er kombinert inn i 17 Å kart fra kryo-em: Kryo-EM 3 Elektronmikroskopi 14

15 Kryo-EM 4 Elektronmikroskopi Fordeler og ulemper + Har ikke behov for krystaller, kan ta bilde direkte av molekyler i en vannløsning/membran. Spennende teknikk for membranproteiner, proteinkomplekser og viruspartikler. Molekylet i sitt rette element. Relativt lav oppløsning, kan ikke se fine detaljer i makromolekylene, får et omriss av overflaten av objektet. Oppløsningen forberedes med nye instrumenter. Matematisk krevende, skal konstruere 3-dimensjonal figur fra mange flate bilder av partikkelen i ulike orienteringer Dyrt instrument AFM 1 Atomic Force Microscopy Atomic force microscopy er en visualiseringsmetode som tilhører gruppen scanning probe microscopy (SPM). Prøvens skannes med en prøvetip som interagerer med strukturelle trekk med overflaten gjennom aggregatatomære krefter slik at prøvetippen forskyves vertikalt. Undersøkelse av krystallgroing, og defekter ved viruskrystaller 15

16 AFM 2 Atomic Force Microscopy Fordeler og ulemper + Unike real-time in situ visualiserings muligheter. Store muligheter for real-time studier av biomolekylære fenomener. Relativt lav oppløsning, kan ikke se fine detaljer i makromolekylene, får et omriss av overflaten av objektet. Primær- og sekundærstruktur 16

17 MS MS-instrumentet produserer ioner fra en prøve som injiseres ofte ved at molekylet splittes i fragmenter. De ulike fragmentene separeres etter deres masse/ladnings-forhold (m/zverdi) og intensitet til hvert signal forteller hvor store mengder det dannes av hvert fragment. Ut fra fragmenteringsmønsteret spekteret kan man utlede molekylets struktur. Denne utledningen fungerer best for relativt små molekyler. Metoden kan brukes til å sekvensbestemme proteiner (primærstruktur) Fordeler og ulemper + Kan finne svært nøyaktige molekylvekter (Elektronspray for proteiner). + Svært følsom teknikk, krever minimalt med prøvemengde Destruerer prøven Massespektrometri Kan ikke utlede 3-dimensjonal struktur, kun hvilke fragmenter molekylet er bygget opp av. CD-spektroskopi Måler forskjell mellom absorpsjon av venstre- og høyredreiende polarisert lys om funksjon av bølgelengde på lyset. Siden proteiner er kirale molekyler med kirale elementer (α-heliks, β- strands) vil ikke absorpsjon av de to typene lys være like stor. Benyttes for å bestemme hvor stor del av et protein som danner slike helikser. Benyttes også mye for å studere denaturering (nedbrytning) av proteiner siden helikser da brytes ned stabilitetsstudier. Fordeler og ulemper + Enkel metode + Bevarer prøven Circular Dichroism Gir lite detaljert informasjon kun %-vis fordeling av heliksstruktur 17

18 Algoritmer Sekundærstruktur prediksjon Bruker algoritmer for å predikere sekundærstruktur. Hver aminosyre tildeles en sannsynlighet for å være i α-heliks og β- plate. DELSTRUKTUR AKTIVT SETE 18

19 UV/synlig-spektroskopi Observerer elektroniske overganger i aromatiske/kongjungerte systemer og kofaktorer som haemgruppen. Kan brukes til å gi lokal informasjon om tilstander. Kan brukes på enkrystaller for å angi tilstanden til det aktive setet i proteinkrystallen som benyttes i røntgendiffraksjon. EXAFS 1 Extended X-Ray Absoption Fine Structure Det er vanligvis aktive seter med metallatomer som undersøkes. Når det sendes inn røntgenstråling med økende energi vil det ved et punkt absorberes kraftig. Dette tilsvarer utsparking av et elektron (fotoelektrisk effekt). Plasseringen av denne toppen forteller noe om oksidasjonstilstanden (XANES). EXAFS området er det på oversiden av absorpsjonskanten. 19

20 EXAFS 2 Extended X-Ray Absoption Fine Structure EXAFS området gir informasjon om ligandområdet 4-5Å fra atomet som absorberer. Fenomenet skyldes tilbakespredning fra ligandene rundt det absorberende atomet. EXAFS besvarer: Hvor mange atomer av hvilket slag i hvilken avstand fra det absorberende atomet? En modell prøves å tilpasses de observerte dataene. Resonans Raman spektroskopi IR-spektroskopi: vibrasjonen til enkeltbindinger Raman-spektroskopi: Benyttes til å studere blant annet bindingstyper, vibrasjonskarakteristikken til metallsentre i proteiner. 20

21 EPR-spektroskopi Electron Paramagnetic Resonance Elektron paramagnetisk resonas (EPR), også kalt elektron spin resonans (ESR), brukes til å observere forbindelser som inneholder ett eller flere uparede elektroner. Et elektron har spinn S=½ med to muligheter for magnetisk moment ms=±½. I et ytre påtrykt magnetisk felt B vil dette gi mulighet for to orienteringer av det magnetiske momentet: parallelt (β-spinn) eller antiparallelt (α-spinn) med det ytre feltet. Dette gir en splitting av energinivåene til elektronet som vist i figuren, kalt Zeeman-effekten. For å få elektronovergang fra parallel til antiparallel tilstand ved absorpsjon må en sende inn elektromagnetisk stråling med en energi lik differansen i energinivå (= mikrobølgefrekvens) EPR-spektroskopi Electron Paramagnetic Resonance g-verdien reflekterer det elektroniske miljøet rundt et uparret elektron eller eventuelt flere magnetisk koblede elektroner. EPR spektroskopi er et viktig redskap i studier av biologiske systemer som inneholder paramagetiske forbindelser som radikaler, elektron-overføringssentre og metallioner. 21

22 MCD Magnetic Circular Dichroism Bruker et magnetisk felt i forbindelse med CDspektroskopi. Dette kan gi informasjon om koordinasjonstallet for ligerte metallsentre i proteiner Mössbauer spektroskopi Teknikk som studerer overganger i atomenes kjerne og forutsetter derfor kjerner med lavtligende eksiterte tilstander. Denne effekten er observert for 43 grunnstoffer hvor 57 Fe er av størst relevans for proteiner. Kan gi informasjon om spinntilstand og oksidasjonstilstand. 22

23 Kvantekjemi DFT - Density Functional Theory For proteiner kan man gjøre kvantemekaniske beregninger av området rundt aktive seter (altså på et system med begrenset antall atomer, hele proteiner er umulige) Modellering Energien til et molekyl regnes ut ved å sammenligne alle bindinger og kontakter i molekylet med en rekke referanseverdier hentet fra ulike eksperimenter. Den totale energien er lik summen av alle energibidrag fra Kovalente bindinger Bindingsvinkler Torsjonsvinkler Van der Waals kontakter Elektrostatiske (ioniske) kontakter Eventuelt andre bidrag (finjustering) Molekylmekanikk Formelen som brukes til å regne ut energien kalles kraftfelt. Det finnes mange ulike kraftfelt laget for ulike formål. 23

24 Eksempel Ofte kombinerer man flere av disse forskjellige metodene for å få en best mulig beskrivelse. Myoglobin compound II som eksempel: Krystallografi Resonance Raman EPR Lysaborbsjon Mössbauer DFT Myoglobin compound II 24