(12) PATENT (19) NO (11) (13) B1 NORGE. (51) Int Cl. Patentstyret

Transkript

1 (12) PATENT (19) NO (11) 332 (13) B1 NORGE (1) Int Cl. A61K 39/09 (06.01) A61K 3/74 (06.01) A61K 39/02 (06.01) A61K 39/09 (06.01) A61K 39/116 (06.01) A61K 39/39 (06.01) C07K 14/31 (06.01) A61P 11/00 (06.01) A61P 31/04 (06.01) Patentstyret (21) Søknadsnr (86) Int.inng.dag og søknadsnr PCT/EP00/02467 (22) Inng.dag (8) Videreføringsdag (24) Løpedag () Prioritet , GB, , GB, , GB, , GB, (41) Alm.tilgj (4) Meddelt (73) Innehaver GlaxoSmithKline Biologicals SA, Rue de l'institut 89, BE-13 RIXENSART, Belgia (72) Oppfinner Jean-Paul Prieels, Rixensart, BE-, Belgia Pierre Michel Desmons, c/o GlaxoSmithKline Biologicals SA, Rue de l'institut 89, BE-13 RIXENSART, Belgia Craig Antony Joseph Laferriere, c/o GlaxoSmithKline Biologicals SA, Rue de l'institut 89, B-13 Rixensart, BE-, Belgia Carine Capiau, c/o GlaxoSmithKline Biologicals SA, Rue de l'institut 89, BE-13 RIXENSART, Belgia Marguerite Deschamps, c/o GlaxoSmithKline Biologicals SA, Rue de l'institut 89, B-13 Rixensart, BE-, Belgia Jan Poolman, c/o GlaxoSmithKline Biologicals SA, Rue de l'institut 89, BE-13 RIXENSART, Belgia (74) Fullmektig Zacco Norway AS, Postboks 03 Vika, 012 OSLO, Norge (4) Benevnelse Immunogent preparat, vaksine fremstilt av dette, anvendelse for fremstilling av et medikament og fremgangsmåte for fremstilling (6) Anførte publikasjoner (7) Sammendrag WO (PATON J.C. et al) Side 3, linje 1- og side 2 linje 18-, LEE C. et al., Immunologic epitope, gene and immunity involved in Pneumococcal glycoconjugate. Critical reviews in microbiology, Vol. 23, nr.2, s , BRILES D. et al., Pneumococcal diversity: considerations for new vaccine strategies with emphasis on Pneumococcal surface protein A (PspA) Vol 11, nr.4, s.64-67, WO (SMITHKLINE BEECHAM BIOLOGICALS S.A) Side 1, linje 19+. Side, linje 3+4., ALEXANDER J. et al. Immunization of mice with pneumolysin toxid confers a significant degree of protection against at least nine serotypes of Streprococcus pneumonidae. Infection and immunity, Vol.62, nr.12, s Foreliggende oppfinnelse gjelder området bakterielle polysakkaridantigenvaksiner. Nærmere bestemt gjelder foreliggende oppfinnelse vaksiner som omfatter et pneumokokkpolysakkaridantigen, typisk et pneumokokkpolysakkarid-konjugatantigen, utformet med et proteinantigen fra Streptococcus pneumoniae, og eventuelt en TH1-induserende adjuvans.

2 1 OPPFINNELSENS OMRÅDE Foreliggende oppfinnelse gjelder bakterielle polysakkaridantigenvaksiner, fremstilling av disse og anvendelse av slike polysakkarider i medisiner. Nærmere bestemt gjelder foreliggende oppfinnelse tre beslektede områder: A - vaksiner som omfatter et pneumokokk polysakkaridantigen, typisk et pneumokokk polysakkaridkonjugatantigen, utformet med et proteinantigen fra Streptococcus pneumoniae og om ønskelig en TH1-induserende adjuvans, B - spesifikke polysakkaridkonjugater, fortrinnsvis fra pneumokokker, blandet med en TH1-adjuvans, og C - bakterielle polysakkaridkonjugater generelt konjugert til protein D fra H. influenzae. OPPFINNELSENS BAKGRUNN 1 Streptococcus pneumoniae er en Gram-positiv bakterie som forårsaker betydelig sykelighet og dødelighet (særlig hos yngre og eldre), og som forårsaker invasive sykdommer som pneumoni, bakteriemi og meningitt, og sykdommer forbundet med kolonisering, f. eks. akutt otitis media. Hyppigheten av pneumokokk-pneumoni i USA blant personer over 60 år anslås til mellom 3 og 8 pr I % av tilfellene fører dette til bakteriemi og andre manifestasjoner, f. eks. meningitt, med en dødelighetsfrekvens på nær %, selv ved behandling med antibiotika. 2 Pneumococcus er innkapslet i et kjemisk sammenkoplet polysakkarid som gir serotypespesifisitet. Det finnes 90 kjente serotyper av pneumokokker, og kapselen er den viktigste virulensdeterminant for pneumokokker siden den ikke bare beskytter bakteriens indre overflate mot komplement, men også fordi den i seg selv er lite immunogen. Polysakkarider er T-uavhengige antigener, og de kan ikke prosesseres eller presenteres på MHC-molekyler for interaksjon med T-celler. De kan imidlertid stimulere immunsystemet via en alternativ mekanisme som omfatter kryssbinding av overflatereseptorer på B-celler. 3 Det har blitt vist i flere eksperimenter at beskyttelse mot invasiv pneumokokksykdom i størst grad korrelerer med antistoff spesifikt for kapselen, og beskyttelsen er serotypespesifikk. Polysakkaridantigenbaserte vaksiner er velkjente innen faget. Fire som er godkjente for anvendelse i mennesker omfatter Vi-polysakkaridet fra Salmonella typhi, PRPpolysakkaridet fra Haemophilus influenzae, den tetravalente meningokokkvaksine som er sammensatt av serotypene A, C, W13 og Y, og den 23-valente pneumokokkvaksine som er sammensatt av polysakkaridene som tilsvarer serotypene 1, 2, 3, 4,, 6B, 7F, 8, 9N, 9V,

3 2 A, 11A, 12F, 14, 1B, 17F, 18C, 19A, 19F,, 22F, 23F og 33 (som utgjør mist 90 % av pnemokokkisolater fra blod). 1 2 De siste tre vaksinene gir beskyttelse mot bakterier som forårsaker respiratoriske infeksjoner som fører til alvorlig sykdom og dødelighet hos spedbarn, likevel har disse vaksinene ikke blitt godkjent for anvendelse i barn som er yngre enn to år, siden de ikke er tilstrekkelig immunogene i denne aldersgruppen [Peltola et al., (1984), N. Engl. J. Med. 3: ]. Streptococcus pneumoniae er den vanligste årsak til invasiv bakteriesykdom og otitis media hos spedbarn og småbarn. Likeså har eldre personer dårlig respons på pneumokokkvaksiner [Roghmann et al., (1987), J. Gerontol. 42:26-270], dette er grunnen til den forhøyede forekomst av bakteriell pneumoni i denne populasjonen [Verghese og Berk, (1983) Medicine (Baltimore) 62:271-28]. Lee C. et al., Immunological epitope, gene and immunity involved in Pneumococcal glycoconjugate. Critical reviews in microbiology, 1997, Vol. 23, nr.2, s , beskriver immunologiske epitoper i et polysakkarid-antigen fra S. pneumonidae polysakkarider. Her blir det slått fast at en økt immunogenisitet av polysakkaridantigener kan oppnås ved konjugering av polysakkaridantigen til proteiner i en konjugert vaksine. Det gjøres også kjent vaksinesammensetninger som inneholder både polysakkaridantigen og proteinantigen fra S. pneumonidae, samt at det er sannsynlig at slike vaksinesammensetninger kan indusere gode immunsreponser i barn. Briles D., et al., Pneumococcal diversity: considerations for new vaccine strategies with emphasis on Pneumococcal surface protein A (PspA) Vol 11, nr 4, s.64-67, vurderer mulige vaksinestrategier med hovedvekt på Pneumococcal overflateprotein A (PspA). I likhet med Lee et al., pekes det på at konjugering av polysakkarider til proteiner kan bidra til at konjugatet blir mer immunogent sammenlignet polysakkaridenheten alene. Alexander J. et al., Immunization of mice with pneumolysin toxid confers a significant degree of protection against at least nine serotypes of Streptococcus pneumonidae. Infection and immunity, Vol. 62, nr.12, s , fokuserer på immunisering av mus med Pneumolysinderivater med redusert toksisitet. Lav immunogenisitet av multivalente Streptococcus pneumonidae polysakkarider i vaksiner er et velkjent problem i denne publikasjonen og løsningen som foreslås er vaksinesammensetninger som inneholder både polysakkaridantigen og proteinantigen fra Streptococcus pneumonidae. Derivater av pneumolysin anvendes som protein bærere eller i form av beskyttende immunogen. 3 Strategier som har blitt utformet for å overvinne denne manglende immunogenisitet i spedbarn omfatter kopling av polysakkaridet til store immunogene proteiner, som gir hjelper-t-cellehjelp og som induserer immunologisk hukommelse mot

4 3 polysakkaridantigenet som proteinet er konjugert til. Pneumokokkglykoproteinkonjugatvaksiner evalueres i dag for sikkerhet, immunogenisitet og virkning i forskjellige aldersgrupper. A) Pneumokokkpolysakkaridvaksiner 1 Den 23-valente, ikkekonjugerte pneumokokkvaksine har vist stor variasjon i klinisk virkning, fra 0 % til 81 % (Fedson et al. (1994) Arch Intern Med. 14: ). Virkningen ser ut til å variere med risikogruppen som immuniseres, f. eks. eldre personer, pasienter med Hodgkins sykdom, splenectomypasienter, pasienter med sigdcelleanemi og pasienter med agammaglobulinemi (Fine et al. (1994) Arch Intern Med. 14: ), og også med sykdomsmanifestasjonen. Den 23-valente vaksinen gir ikke beskyttelse mot pneumokokk-pneumoni (i visse høyrisikogrupper, f. eks. eldre) og otitis media. Det foreligger derfor et behov for forbedrede pneumokokkvaksinepreparater, fortrinnsvis preparater som vil være mer effektive når det gjelder beskyttelse eller lindring av pneumokokksykdom (særlig pneumoni) hos eldre og hos småbarn. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en slik forbedret vaksine. B) Utvalgte pneumokokkpolysakkaridkonjugat + 3D-MPL-preparater 2 Det er generelt akseptert at den beskyttende virkning av den kommersielle, ikkekonjugerte pneumokokkvaksine i større eller mindre grad er forbundet med konsentrasjonen av antistoff som induseres ved vaksinasjonen, faktisk ble de 23 polysakkaridene godkjent for anvendelse kun basert på immunogenisiteten av hvert polysakkarid i blandingen (Red. Williams et al. New York Academy of Sciences 199 s ). En videre forbedring av antistoffresponsen på pneumokokkpolysakkaridene kunne derfor øke prosentandelen av spedbarn og eldre som responderer med beskyttende nivå av antistoff på den første injeksjon av polysakkarid eller polysakkaridkonjugat, og kunne redusere dosen og antall injeksjoner som var nødvendige for å indusere beskyttende immunitet mot infeksjoner forårsaket av Streptococcus pneumoniae. 3 Siden tidlig i det. århundre har forskere eksperimentert med et svært stort antall forbindelser som kan tilsettes til antigener for å forbedre deres immunogenisitet i vaksinepreparater [se oversikt i M.F. Powell & M.J. Newman, Plenum Press, NY, Vaccine Design the Subunit and Adjuvants and Excipients ]. Mange er svært effektive, men gir signifikante lokale og systemiske uønskede reaksjoner som hindrer anvendelse av dem i humane vaksinepreparater. Aluminiumbaserte adjuvanser (f. eks. alun, aluminiumhydroksid

5 4 eller aluminiumfosfat), som først ble beskrevet i 1926, forblir de eneste immunologiske adjuvanser som anvendes i humane vaksiner som er godkjente i USA. 1 Aluminiumbaserte adjuvanser er eksempler på bærerklassen av adjuvanser, som virker via deponeringseffekten som induseres. Antigen absorberes på overflaten av adjuvansen, og når preparatet injiseres vil adjuvans og antigen ikke umiddelbart fordeles i blodstrømmen i stedet forblir preparatet i det lokale injeksjonsmiljøet, og resultatet er en mer uttalt immunrespons. Slike bæreradjuvanser har den kjente tilleggsfordel at de er egnet for stabilisering av antigener som lett nedbrytes, f. eks. noen polysakkaridantigener. 3D-MPL er et eksempel på en ikkebærer-adjuvans. Forbindelsens fulle navn er 3-Odeacylert monofosforyl-lipid A (eller 3 De-O-acylert monofosforyl-lipid A eller 3-Odesacyl-4 monofosforyl-lipid A), og forbindelsen betegnes 3D-MPL for å angi at posisjon 3 i glukosamin i den reduserende ende er de-o-acylert. For fremstilling av forbindelsen, se GB A. Kjemisk sett er det snakk om en blanding av 3-deacylert monofosforyl-lipid A med 4, eller 6 acylerte kjeder. Forbindelsen ble opprinnelig fremstilt tidlig på 1990-tallet, hvor fremgangsmåten for 3-O-deacylering av 4 -monofosforyl derivatet av lipid A (MPL) førte til et molekyl med ytterligere svekket toksisitet, uten endring i den immunstimulerende aktivitet. 2 3D-MPL har blitt anvendt som adjuvans, enten alene eller fortrinnsvis i kombinasjon med en adjuvans av deponeringstypebærer f. eks. aluminiumhydroksid, aluminiumfosfat eller olje i vann-emulsjoner. I slike preparater inngår antigen og 3D-MPL i den samme partikkelstruktur, noe som tillater mer effektiv tilførsel av antigenet og immunstimulerende signaler. Undersøkelser har vist at 3D-MPL kan ytterligere forsterke immunogenisiteten av et alunabsorbert antigen [Thoelen et al. Vaccine (1998) 16:708-14; EP B1]. Slike kombinasjoner foretrekkes også innen faget for antigener som lett absorberes (f. eks. bakterielle polysakkaridkonjugater), hvor absorpsjon til alun bidrar til å stabilisere antigenet. Utfelte aluminiumbaserte adjuvanser anvendes hyppigst, da disse er de eneste adjuvanser som i dag anvendes i godkjente, humane vaksiner. Følgelig foretrekkes vaksiner som inneholder 3D-MPL i kombinasjon med aluminiumbaserte adjuvanser innen faget, grunnet lett utvikling og hurtig introduksjon på markedet. 3 MPL (ikke-3-deacylert) har blitt evaluert som adjuvans med flere monovalente polysakkaridkonjugatvaksineantigener. Samtidiginjeksjon av MPL i saltvann forsterket antistoffresponsen i serum på fire monovalente polysakkaridkonjugater: Pneumokokk-PS 6B-tetanustoksoid, pneumokokk-ps 12-difteritoksoid og S. aureus type og S. aureus type 8 konjugert til Pseudomonas aeruginosa-exotoksin A [Schneerson et al. J. Immunology

6 (1991) 147: ]. Den forsterkede respons ble sagt å være antigenspesifikk. MPL i en olje i vann-emulsjon (en adjuvans av bærertype) forsterket gjennomgående virkningen av MPL i saltvann grunnet nærvær av MPL og antigen i samme partikkelstruktur, og ble ansett å være det foretrukne adjuvanssystem for optimal tilførsel av andre polysakkaridkonjugatvaksiner. 1 Devi et al. [Infect. Immun. (1991) 9:3700-7] evaluerte adjuvansvirkningen av MPL (ikke- 3-deacylert) i saltvann på antistoffresponsen i mus mot et TT-konjugat av kapsulært polysakkarid fra Cryptococcus neoformans. Dersom MPL ble anvendt samtidig med konjugatet var det kun en marginal økning i både den IgM- og IgG-spesifikke respons på polysakkaridet, MPL hadde imidlertid mye større virkning ved tilførsel to dager etter konjugatet. Den praktiske side ved anvendelse av et immuniseringsskjema som krever forsinket tilførsel av MPL relativt til antigenet er tvilsom, særlig når det gjelder spedbarn. Adjuvansvirkningen av MPL med polysakkarider og polysakkarid-proteinkonjugater ser ut til å være avhengig av preparatet. Igjen gir innføring av MPL i et egnet tilførselssystem for langsom frigivelse (f. eks. ved anvendelse av en bæreradjuvans) en kraftigere adjuvansvirkning og unngår problemet når det gjelder tilførselstidspunkter og forsinket tilførsel. Oppsummert er læren ifølge teknikkens stand at for gitte polysakkarid- eller polysakkaridkonjugatantigener hvor MPL eller 3D-MPL anvendes som adjuvans, anvendes disse fortrinnsvis sammen med en bæreradjuvans (f. eks. de aluminiumbaserte adjuvanser) for å maksimalisere den immunstimulerende virkning. 2 De foreliggende oppfinnere har overraskende nok funnet at for visse pneumokokk polysakkaridkonjugater er immunogenisiteten av vaksinepreparatet signifikant høyere dersom antigenet utformes med 3D-MPL alene, snarere enn med 3D-MPL sammen med en bæreradjuvans (f. eks. en aluminiumbasert adjuvans). Den observerte forbedring er videre uavhengig av den anvendte konsentrasjon av 3D-MPL og hvorvidt de gitte konjugater foreligger i et monovalent preparat eller er kombinert for dannelse av et polyvalent preparat. 3 C) Bakterielt polysakkarid - protein D-konjugater Som nevnt ovenfor er polysakkaridantigenbaserte vaksiner velkjente innen faget. De godkjente polysakkaridvaksinene som er nevnt ovenfor har vist forskjellig klinisk virkning. Vi-polysakkaridvaksinen har blitt anslått til å ha en effektivitet på mellom % og 77 % når det gjelder forebyggelse av tyfusfeber bekreftet ved dyrking (Plotkin og Cam, (199) Arch Intern Med 1: ). Meningokokk-C-polysakkaridvaksinen ble vist å ha en

7 6 effektivitet på 79 % under epidemiske betingelser (De Wals P, et al. (1996) Bull World Health Organ. 74: ). Den 23-valente pneumokokkvaksine har vist stor variabilitet i klinisk virkning fra 0 % til 81 % (Fedson et al. (1994) Arch Intern Med. 14: ). Som nevnt ovenfor er det akseptert at den beskyttende virkning av pneumokokkvaksinen i større eller mindre grad er forbundet med konsentrasjonen av antistoff som induseres ved vaksinasjonen. Blant problemene som er forbundet med polysakkaridtilnærmingen til vaksinasjon er det faktum at polysakkarider i seg selv er dårlige immunogener. Strategier som er utformet for å overvinne denne manglende immunogenisitet omfatter kobling av polysakkaridet til store, svært immunogene proteinbærere som gir hjelper-t-cellehjelp. 1 Eksempler på slike svært immunogene bærere som i dag hyppig anvendes for fremstilling av polysakkaridimmunogener omfatter difteritoksoid (DT eller CRM197-mutanten), tetanustoksoid (TT), Keyhole Limpet -Haemocyanin (KLH), og renset proteinderivat av tuberkulin (PPD). Problemer forbundet med hyppig anvendte bærere En rekke problemer er forbundet med alle disse hyppig anvendte bærere, både når det gjelder produksjon av GMP-konjugater og immunologiske egenskaper av konjugatene. 2 Trass i disse bæreres hyppige anvendelse og deres vellykkethet når det gjelder induksjon av anti-polysakkaridantistoffresponser, er de forbundet med flere ulemper. Det er for eksempel kjent at antigenspesifikke immunresponser kan undertrykkes (epitopsupresjon) ved nærvær av allerede eksisterende antistoffer rettet mot bæreren, i dette tilfelle Tetanus toksin (Di John et al; (1989) Lancet, 2:141 8). I populasjonen, sett under ett, vil en svært høy prosentandel allerede ha eksisterende immunitet både mot DT og TT, siden folk rutinemessig vaksineres med disse antigenene. I Storbritannia gis for eksempel 9 % av barna DTP-vaksinen, som omfatter både DT og TT. Andre forfattere har beskrevet problemet med epitopsupresjon forbundet med peptidvaksiner i dyremodeller (Sad et al, Immunology, 1991; 74: ; Schutze et al, J. Immunol. 13: 4, 198; ). 3 For vaksiner som krever regelmessig forsterkervaksinasjon vil anvendelse av svært immunogene bærere som TT og DT i tillegg sannsynligvis undertrykke polysakkaridantistoffresponsen etter flere injeksjoner. Disse gjentatte vaksinasjonene kan

8 7 også ledsages av uønskede reaksjoner for eksempel hyperresponsivitet av forsinket type (DTH). KLH er kjent som et kraftig immunogen, og har allerede blitt anvendt som bærer for IgEpeptider i kliniske forsøk på mennesker. Noen uønskede reaksjoner (DTH-liknende reaksjoner eller IgE-sensitivisering) har blitt observert, likeså antistoffresponser mot antistoff. Valg av bærerprotein for en polysakkaridbasert vaksine vil derfor kreve en balanse mellom behovet for å anvende en bærer som fungerer i alle pasienter (bred MHC-gjenkjenning), induksjon av høyt nivå av anti-polysakkaridantistoffresponser og lav antistoffrespons mot bæreren. 1 Bærerene som hittil har blitt anvendt for polysakkaridbaserte vaksiner har derfor mange ulemper. Dette gjelder spesielt for kombinasjonsvaksiner, hvor epitopsupresjon er spesielt problematisk dersom samme bærer anvendes for forskjellige polysakkaridantigener. I WO 98/1339 ble flere bærere i kombinasjonsvaksiner anvendt for å prøve å overvinne denne virkningen. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en ny bærer for anvendelse i fremstilling av polysakkarid/polypeptidbaserte immunogene konjugater som ikke lider av ulempene beskrevet ovenfor. 2 Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et protein D (EP B1) fra Haemophilus influenzae, eller fragmenter av dette som bærer for polysakkaridbaserte immunogene preparater, innbefattet vaksiner. Anvendelse av denne bærer er spesielt fordelaktig i kombinasjonsvaksiner. OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN 3 A) Pneumokokkpolysakkaridvaksiner Følgelig tilveiebringer foreliggende oppfinnelse et vaksinepreparat som omfatter minst et polysakkaridantigen fra Streptococcus pneumoniae (fortrinnsvis konjugert) og et proteinantigen fra Streptococcus pneumoniae eller en immunologisk funksjonell ekvivalent av dette, om ønskelig med en TH1-adjuvans (en adjuvans som induserer en immunrespons av TH1-type). Fortrinnsvis inngår både et pneumokokkprotein og en TH1-adjuvans. Preparatene ifølge oppfinnelsen er spesielt godt egnet for behandling av pneumoni hos eldre.

9 8 Pneumokokkvaksiner (konjugerte eller ikkekonjugerte) er ikke nødvendigvis i stand til å beskytte mot pneumoni i den eldre populasjon, hvor forekomsten av denne sykdom er svært høy. Den viktigste forsvarsmekanisme mot pneumococcus er opsonofagocytose (en begivenhet som formidles av humorale B-celler og neutrofile celler og som skyldes produksjon av antistoffer mot pneumokokkpolysakkaridet, hvor bakterien til sist fagocyteres), deler av de opsoniske mekanismer som inngår er imidlertid svekkede hos eldre personer, dvs. superoksiddannelse ved PMN (polymorfonukleære celler), produksjon av andre reaktive oksygenmolekyler, mobilisering av PMN, apoptose av PMN og deformerbarhet av PMN. Antistoffresponsen kan også være svekket hos eldre. I strid med det normalt aksepterte dogme er normalt nivå av anti-kapsulært polysakkaridantistoffer ikke nødvendigvis effektive når det gjelder fullstendig fjerning av bakterier, siden pneumokokker kan invadere vertsceller for å unngå denne gren av immunsystemet. 1 De foreliggende oppfinnere har overraskende nok funnet at ved samtidig stimulering av den celleformidlete gren av immunsystemet (f. eks. T-celleformidlet immunitet) i tillegg til den humorale gren av immunsystemet (B-celleformidlet) er resultatet en synergi (eller et samarbeide) som kan forbedre fjerningen av pneumokokker fra verten. Dette er en oppdagelse som vil bidra til forebyggelse (eller behandling) av pneumokokkinfeksjoner generelt, men som vil være spesielt viktig for forebyggelse (eller behandling) av pneumonier hos eldre, hvor polysakkaridbaserte vaksiner ikke viser virkning. 2 De foreliggende oppfinnere har funnet at de to grener av immunsystemet kan samarbeide på denne måte dersom et pneumokokkpolysakkarid (fortrinnsvis konjugert) tilføres sammen med et pneumokokkprotein (fortrinnsvis et protein som uttrykkes på overflaten av pneumokokker eller som utskilles eller frigjøres, som kan prosesseres og presenteres sammen med MHC klasse II og klasse I på overflaten av infiserte pattedyrceller). Selv om et pneumokokkprotein i seg selv kan utløse celleformidlet immunitet har oppfinnerne også funnet at nærvær av en TH1- induserende adjuvans i vaksinepreparatet hjelper denne gren av immunsystemet, og overraskende nok gir en ytterligere styrking av samarbeidet mellom immunsystemets to grener. 3 B) Utvalgte pneumokokkpolysakkaridkonjugat + 3D-MPL-preparater Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer følgelig også et antigent preparat som omfatter ett eller flere pneumokokkpolysakkaridkonjugater sammen med 3D-MPL som adjuvans og i det vesentlige frie for aluminiumbaserte adjuvanser, hvori minst ett av pneumokokkpolysakkaridkonjugatene er signifikant mer immunogent i preparater som

10 9 omfatter 3D-MPL, sammenliknet med preparater som omfatter 3D-MPL sammen med en aluminiumbasert adjuvans. De foretrukne utførelser som tilveiebringes er antigene preparater som omfatter konjugater av et eller flere av følgende kapsulære polysakkarider fra pneumokokker: Serotype 4, 6B, 18C, 19F og 23F. I slike preparater er hvert polysakkarid overraskende nok mer immunogent i preparater som omfatter 3D-MPL alene, sammenliknet med preparater som omfatter 3D-MPL og en aluminiumbasert adjuvans. I en utførelse av oppfinnelsen tilveiebringes således et antigent preparat som omfatter kapsulært polysakkarid fra Streptococcus pneumoniae av serotype 4, 6B, 18C, 19F og 23F konjugert til et immunogent protein og med en 3D-MPL-adjuvans, hvori preparatet er i det vesentlige fritt for aluminiumbaserte adjuvanser. 1 I en andre utførelse tilveiebringer foreliggende oppfinnelse et antigent kombinasjonspreparat som i det vesentlige er fritt for aluminiumbaserte adjuvanser og som omfatter 3D-MPLadjuvans og to eller flere pneumokokkpolysakkaridkonjugater utvalgt fra gruppen bestående av: serotype 4, 6B, 18C, 19F og 23F. 2 C) Bakterielt polysakkarid protein D-konjugater Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer således et polysakkaridkonjugatantigen omfattende et polysakkaridantigen avledet fra en patogen bakterie konjugert til protein D fra Haemophilus influenzae eller et fragment av dette. I tillegg tilveiebringer oppfinnelsen polyvalente vaksinepreparater hvor ett eller flere av polysakkaridantigenene er konjugert til protein D. Oppsummert omfatter foreliggende oppfinnelse følgende: Foreliggende oppfinnelse omfatter immunogent preparat, kjennetegnet ved at det omfatter minst ett polysakkaridantigen fra Streptococcus pneumoniae blandet med minst ett proteinantigen fra Streptococcus pneumoniae eller en immunologisk funksjonell ekvivalent av dette, og en adjuvans som er en preferensiell induser av en TH1-respons og omfatter minst en av de følgende: monofosforyl-lipid A eller et derivat derav, en saponinimmunstimulant eller et immunstimulerende CpG-oligonukleotid. 3 Videre omfatter oppfinnelsen vaksine, kjennetegnet ved at den omfatter det immunogene preparat ifølge kravene 1-11.

11 Omfattet av oppfinnelsen er også anvendelse av et pneumokokkpolysakkaridantigen i kombinasjon med et proteinantigen fra Streptococcus pneumoniae og en TH1-induserende adjuvans som omfatter minst en av de følgende: monofosforyl-lipid A eller et derivat derav, en saponinimmunstimulant eller et immunstimulerende CpG-oligonukleotid, for fremstilling av et medikament for forebyggelse av pneumoni hos pasienter over år. 1 Til slutt omfatter oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av et immunogent preparat ifølge de ovenstående krav, kjennetegnet ved at den omfatter trinnene: - utvelgelse av et eller flere pneumokokkpolysakkaridantigener; - utvelgelse av et eller flere pneumokokkproteinantigener; - utvelgelse av en adjuvans som er en preferensiell induser av en TH1-respons og omfatter minst en av de følgende: monofosforyl-lipid A eller et derivat derav, en saponinimmunstimulant eller et immunstimulerende CpG-oligonukleotid; og - sammenblanding av polysakkaridantigenet og proteinantigenet med en egnet eksipient. BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN A) Pneumokokkpolysakkaridvaksiner Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en forbedret vaksine, særlig for forebyggelse eller lindring av pneumokokkinfeksjon hos eldre (og/eller spedbarn og småbarn). I forbindelse med oppfinnelsen anses en pasient som eldre dersom vedkommende er år gammel eller mer, typisk over 60 år, og mer generelt over 6 år gammel. 2 I en utførelse av oppfinnelsen tilveiebringes således et vaksinepreparat som er egnet for anvendelse i eldre (og/eller spedbarn og småbarn) som omfatter minst ett polysakkaridantigen fra Streptococcus pneumoniae og minst ett proteinantigen fra Streptococcus pneumoniae. I en andre, foretrukket utførelse tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en vaksine (egnet for forebyggelse av pneumoni hos eldre) som omfatter minst ett polysakkaridantigen fra Streptococcus pneumoniae og minst ett proteinantigen fra Streptococcus pneumoniae samt en TH1-adjuvans. 3 Det forventes at en slik vaksine også vil være anvendbar for behandling av pneumokokkinfeksjoner (f. eks. otitis media) i andre høyrisikogrupper i befolkningen, f. eks. hos spedbarn eller småbarn.

12 11 I en tredje utførelse tilveiebringes et vaksinepreparat som omfatter et pneumokokkpolysakkaridantigen og en TH1-adjuvans. Streptococcus pneumoniae polysakkaridantigener ifølge oppfinnelsen 1 Streptococcus pneumoniae-vaksinen ifølge foreliggende oppfinnelse vil typisk omfatte polysakkaridantigener (fortrinnsvis konjugerte) hvori polysakkaridene er avledet fra minst fire serotyper av pneumococcus. De fire serotypene omfatter fortrinnsvis 6B, 14, 19F og 23F. Mer foretrukket inngår minst 7 serotyper i preparatet, for eksempel avledet fra serotypene 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F og 23F. Enda mer foretrukket inngår minst 11 serotyper i preparatet, for eksempel omfatter preparatet i en utførelse kapsulære polysakkarider avledet fra serotypene 1, 3, 4,, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F og 23F (fortrinnsvis konjugerte). I en foretrukket utførelse av oppfinnelsen inngår minst 13 polysakkaridantigener (fortrinnsvis konjugerte), selv om ytterligere polysakkaridantigener, for eksempel 23-valent (som serotypene 1, 2, 3, 4,, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, A, 11A, 12F, 14, 1B, 17F, 18C, 19A, 19F,, 22F, 23F og 33F), også omfattes av oppfinnelsen. For vaksinasjon av eldre (f. eks. for forebyggelse av pneumoni) inngår fortrinnsvis serotypene 8 og 12F (og mest foretrukket også 1 og 22) i det 11-valente antigene preparat beskrevet ovenfor slik at det dannes en 1-valent vaksine, mens for spedbarn eller småbarn (hvor otitis media er et større problem) inngår fortrinnsvis serotypene 6A og 19A slik at det dannes en 13- valent vaksine. 2 For forebyggelse/lindring av pneumoni hos den eldre populasjon (+ år) og otitis media hos spedbarn (opptil 18 måneder) og småbarn (typisk fra 18 måneder til år) er en foretrukket utførelse av oppfinnelsen å kombinere et multivalent Streptococcus pneumoniae-polysakkarid som beskrevet heri og et Streptococcus pneumoniae-protein eller en immunologisk funksjonell ekvivalent av dette. Pneumokokkproteiner ifølge oppfinnelsen 3 For foreliggende oppfinnelses formål defineres immunologisk funksjonell ekvivalent som et peptid av et protein som omfatter minst en beskyttende epitop fra proteinene ifølge oppfinnelsen. Slike epitoper er typisk overflateeksponerte og svært konserverte, og de kan utløse en baktericid antistoffrespons i en vert eller forhindre toksiske virkninger. Den funksjonelle ekvivalent har fortrinnsvis 1, og mer foretrukket eller flere, på hverandre følgende aminosyrer fra proteinet ifølge oppfinnelsen. Mest foretrukket kan fragmenter,

13 12 delesjoner av proteinet, for eksempel transmembrandelesjonsvarianter av det (dvs. anvendelse av proteinenes ekstracellulære domene), fusjoner, kjemisk eller genetisk detoksifiserte derivater og liknende anvendes, med det forbehold at de er i stand til å utløse idet vesentlige den samme immunrespons som det native protein. Foretrukne proteiner ifølge oppfinnelsen er pneumokokkproteiner som er eksponert på pneumokokkens ytre overflate (i stand til å gjenkjennes av vertens immunsystem under i det minste en del av pneumokokkens livssyklus), eller proteiner som utskilles eller frigjøres fra pneumokokken. Mest foretrukket er proteinet et toksin, et adhesin, en signaloverfører med to komponenter eller et liposom fra Streptococcus pneumoniae, eller en immunologisk funksjonell ekvivalent av disse Spesielt foretrukne proteiner for anvendelse i en slik kombinasjonsvaksine omfatter, men er ikke begrenset til: Pneumolysin (fortrinnsvis detoksifisert ved kjemisk behandling eller mutasjon) [Mitchell et al, Nucleic Acids Res Jul 11; 18(13): 40 Comparison of pneumolysin genes and proteins from Streptococcus pneumoniae types 1 and 2., Mitchell et al. Biochim Biophys Acta 1989 Jan 23; 07(1): Expression of the pneumolysin gene in Escherichia coli: rapid purification and biological properties., WO 96/089 (A. Cyanamid), WO 90/0691 (Paton et al), WO 99/03884 (NAVA)]; PspA og transmembrandelesjonsvarianter av dette (U.S. patentskriv nr Briles et al.); PspC og transmembrandelesjonsvarianter av dette (WO 97/ Briles et al); PsaA og transmembrandelesjonsvarianter av dette (Berry & Paton, Infect Immun 1996 Dec;64(12):2-62 Sequence heterogeneity of PsaA, a 37-kilodalton putative adhesin essential for virulence of Streptococcus pneumoniae ); cholinbindende pneumokokkproteiner og transmembrandelesjonsvarianter av disse, CbpA og transmembrandelesjonsvarianter av dette (WO 97/4111; WO 99/1266); Glyceraldehyd-3- fosfat - dehydrogenase (Infect. Immun :333); HSP70 (WO 96/40928); PcpA (Sanchez-Beato et al. FEMS Microbiol Lett 1998, 164:7-14); M-liknende protein, SB patentsøknad nr. EP08371, og adhesin 18627, SB patentsøknad nr. EP Proteinene som anvendes i foreliggende oppfinnelse er fortrinnsvis utvalgte fra gruppen pneumolysin, PsaA, PspA, PspC, CbpA eller en kombinasjon av to eller flere slike proteiner. Foreliggende oppfinnelse omfatter også immunologisk funksjonelle ekvivalenter av slike proteiner (som definert ovenfor). I preparatet kan proteinet bidra til induksjon av en T-celleformidlet respons mot pneumokokksydommer - noe som er spesielt nødvendig for beskyttelse mot pneumoni - som

14 13 koopererer med immunsystemets humorale gren for inhibering av pneumokokkinvasjon og for stimulering av opsonofagocytose. Videre fordeler med å la proteinantigenet inngå er presentasjonen av flere antigener for opsonofagocytose prosessen og inhibering av bakteriell adhesjon (dersom et adhesin anvendes) eller nøytralisering av toksin (dersom et toksin anvendes). 1 Følgelig tilveiebringes i en utførelse av oppfinnelsen en Streptococcus pneumoniae-vaksine som omfatter en pneumokokkpolysakkaridkonjugatvaksine som omfatter polysakkaridantigener avledet fra minst fire serotyper, fortrinnsvis minst syv serotyper, mer foretrukket minst elleve serotyper, og minst ett, men fortrinnsvis to Streptococcus pneumoniae-proteiner. Et av proteinene er fortrinnsvis pneumolysin, PsaA, PspA eller CbpA (mest foretrukket detoksifisert pneumolysin). En foretrukket kombinasjon inneholder minst pneumolysin eller et derivat av dette og PspA. Som nevnt overfor er et problem forbundet med polysakkaridtilnærmingen til vaksinasjon det faktum at polysakkarider i seg selv er dårlige immunogener. For å overvinne dette kan polysakkarider konjugeres til proteinbærere, som gir hjelper-t-cellehjelp. Det foretrekkes derfor at polysakkaridene som anvendes i oppfinnelsen er koblet til en slik proteinbærer. Eksempler på slike bærere som i dag hyppig anvendes for fremstilling av polysakkaridimmunogener omfatter difteritoksoid og tetanus-toksoid (DT, DT CRM197 og TT), Keyhole Limpet -Haemocyanin (KLH), OMPC fra N. meningitidis, og renset proteinderivat av tuberkulin (PPD). 2 En rekke problemer er imidlertid forbundet med alle disse hyppig anvendte bærere (se seksjonen Problemer forbundet med hyppig anvendte bærere ovenfor). 3 Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer i en foretrukket utførelse en ny bærer for anvendelse ved fremstilling av polysakkaridbaserte immunogene konstruksjoner som ikke lider av disse ulempene. Den foretrukne bærer for de pneumokokkpolysakkaridbaserte immunogene preparatene (eller vaksinene) er protein D fra Haemophilus influenzae (EP 946-B) eller fragmenter derav. Fragmenter som er egnet for anvendelse omfatter fragmenter som omfatter T-hjelperepitoper. Nærmere bestemt vil et protein D-fragment fortrinnsvis omfatte den N-terminale 1/3 av proteinet. En ytterligere foretrukket bærer for pneumokokkpolysakkaridet er pneumokokkproteinet selv (som definert ovenfor i seksjonen Pneumokokkproteiner ifølge oppfinnelsen ).

15 14 Vaksinene ifølge den foreliggende oppfinnelse inneholder fortrinnsvis adjuvanser. Egnede adjuvanser omfatter et aluminiumsalt, f. eks. aluminiumhydroksidgel (alun) eller aluminiumfosfat, men kan også være et salt av kalsium, jern eller sink, eller de kan være en uløselig suspensjon av acylert tyrosin eller acylerte sukkere, kationisk eller anionisk derivatiserte polysakkarider eller polyfosfazener. Det foretrekkes at adjuvansen som velges er en preferensiell induser av en respons av TH1- type, for å understøtte den celleformidlete gren av immunresponsen. TH1 adjuvanser ifølge oppfinnelsen 1 Høyt nivå av cytokiner av TH1-type bidrar til å fremme induksjonen av celleformidlete immunresponser mot et gitt antigen, mens høyt nivå av cytokiner av TH2-type bidrar til å favorisere induksjon av humorale immunresponser mot antigenet. 2 Det er viktig å huske at grensen mellom immunresponser av TH1-type og TH2-type ikke er absolutt. I virkeligheten vil et individ understøtte en immunrespons som beskrives som hovedsakelig av TH1-type eller hovedsakelig av TH2-type. Det er imidlertid ofte fordelaktig å betrakte cytokinfamiliene ut fra hva som beskrives for CD4 +ve T-cellekloner fra mus av Mosmann og Coffman (Mosmann, T.R. og Coffman, R.L. (1989) TH1 og TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology, 7, s ). Tradisjonelt er responser av TH1-type forbundet med cytokinene INF- og IL-2 av T-lymfocyter. Andre cytokiner som ofte er direkte forbundet med induksjon av immunresponser av TH1-type produseres ikke av T-celler, f. eks. IL-12. I motsetning til dette er responser av TH2-type forbundet med utskillelse av IL- 4, IL-, IL-6 og IL-. Egnede adjuvanssystemer som fremmer en respons av hovedsakelig TH1-type omfatter monofosforyl-lipid A eller et derivat av dette, fortrinnsvis 3-de-O-acylert monofosforyl-lipid A og en kombinasjon av monofosforyl-lipid A, fortrinnsvis 3-de-Oacylert monofosforyl-lipid A (3D-MPL) og et aluminiumsalt. 3 Et forsterket system omfatter kombinasjonen av monofosforyl-lipid A og et saponinderivat, fortrinnsvis kombinasjonen av QS21 og 3D-MPL, som beskrevet i WO 94/0013, eller et mindre reaktivt preparat hvor QS21 er dempet med kolesterol, som beskrevet i WO 96/33739.

16 1 Et spesielt kraftig adjuvanspreparat som omfatter QS21, 3D-MPL og tokoferol i en olje i vann-emulsjon beskrives i WO 9/172, og dette er et foretrukket preparat. Vaksinen inneholder fortrinnsvis i tillegg et saponin, mer foretrukket QS21. Preparatet kan også omfatte en olje i vann-emulsjon og tokoferol (WO 9/172). Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en fremgangsmåte for fremstilling av et vaksinepreparat som omfatter sammenblanding av et protein ifølge foreliggende oppfinnelse og en farmasøytisk akseptabel eksipient, for eksempel 3D-MPL. Ikke-metylerte, CpG-holdige oligonukleotider (WO 96/02) er også preferensielle indusere av en TH1-response og er egnede for anvendelse i foreliggende oppfinnelse. 1 Spesielt foretrukne preparater ifølge oppfinnelsen omfatter et eller flere konjugerte pneumokokkpolysakkarider, et eller flere pneumokokkproteiner og en TH1-adjuvans. Induksjon av en celleformidlet respons ved hjelp av et pneumokokkprotein (som beskrevet ovenfor) og samarbeidet mellom de to grener av immunsystemet kan fremmes ved anvendelse av en slik TH1-adjuvans, noe som fører til en spesielt effektiv vaksine mot pneumokokksykdommer generelt og, av størst betydning, mot pneumokokk-pneumoni hos eldre. I ytterligere en utførelse av foreliggende oppfinnelse tilveiebringes et immunogen eller en vaksine som beskrevet heri for anvendelse i en medisin. 2 I ytterligere en utførelse av oppfinnelsen tilveiebringes et preparat som omfatter et pneumokokkpolysakkaridkonjugat og en TH1-adjuvans (fortrinnsvis 3D-MPL) som kan serokonvertere og indusere en humoral antistoffrespons mot polysakkaridantigenet i en populasjon av ikkeresponderende individer. 3 - % av populasjonen vites ikke å respondere på polysakkaridimmunisering (responderer ikke på mer enn 0 % av serotypene i en vaksine) (Konradsen et al., Scand. J. Immun 40:21 (1994); Rodriguez et al., JID, 173:1347 (1996)). Dette kan også være tilfellet for konjugerte vaksiner (Musher et al., Clin. Inf. Dis. 27:1487 (1998)). Dette kan være spesielt alvorlig for høyrisikogrupper i befolkningen (spedbarn, småbarn og eldre). De foreliggende oppfinnere har funnet at en kombinasjon av et konjugert pneumokokkpolysakkarid (som gir lav respons i en gitt befolkning) og en TH1-adjuvans (se

17 16 TH1-adjuvanser ifølge oppfinnelsen ovenfor) overraskende nok kan overvinne denne ikke-responsivitet. Fortrinnsvis bør 3D-MPL anvendes, og mest foretrukket 3D-MPL uten aluminiumbasert adjuvans (som en gir en enda bedre respons). Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer således slike preparater. Foreliggende oppfinnelsen kan anvendes i en fremgangsmåte for behandling av ikke respondere på pneumokokkpolysakkarider ved tilførsel av slike preparater. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en anvendelse av en TH1-adjuvans ved fremstilling av et medikament som omfatter konjugerte pneumokokkpolysakkaridantigener for behandling av (eller beskyttelse mot) pneumokokksykdommer i individer som ikke responderer på polysakkaridantigenet. 1 Foreliggende oppfinnelse kan anvendes i en fremgangsmåte for forebyggelse eller lindring av pneumoni hos et eldre menneske som omfatter tilførsel av en sikker og effektiv mengde av en vaksine som beskrevet heri, som omfatter et Streptococcus pneumoniaepolysakkaridantigen og enten en TH1-adjuvans eller et pneumokokkprotein (og fortrinnsvis begge deler) til den eldre pasienten. Videre kan foreliggende oppfinnelse anvendes i en fremgangsmåte for å forebygge eller lindre otitis media hos spedbarn eller småbarn som omfatter tilførsel av en sikker og effektiv mengde av en vaksine som omfatter et Streptococcus pneumoniae-polysakkaridantigen og enten et Streptococcus pneumoniae-proteinantigen eller en TH1-adjuvans (og fortrinnsvis begge deler) til spedbarn eller småbarn. 2 I fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen som beskrevet ovenfor foreligger fortrinnsvis polysakkaridantigenet som et polysakkaridproteinkonjugat. Vaksinepreparater ifølge oppfinnelsen 3 Vaksinepreparatene ifølge oppfinnelsen kan anvendes for å beskytte eller behandle pattedyr som er utsatt for infeksjon ved hjelp av systemisk tilførsel eller tilførsel via slimhinner av vaksinen. Slik tilførsel kan omfatte intramuskulær, intraperitonial, intradermal eller subkutan injeksjon eller mukosal tilførsel til magetarmkanalen, respirasjonssystemet, genitalia eller urinsystemet. Intranasal tilførsel av vaksiner for behandling av pneumoni eller otitis media foretrekkes (siden infeksjon med pneumokokker i nese og hals lettere kan forebygges, noe som svekker infeksjonen på dens tidligste stadium).

18 17 Mengden av konjugatantigen i hver vaksinedose utvelges som den mengde som induserer en immunbeskyttende respons uten vesentlige, uønskede bivirkninger i typiske vaksiner. En slik mengde vil variere avhengig av hvilket spesifikt immunogen som anvendes og hvordan det presenteres. Generelt forventes det at hver dose vil omfatte 0,1-0 g polysakkarid, fortrinnsvis 0,1-0 g, mer foretrukket 0,1- g, og hvor 1 til g er det mest foretrukne område. Innholdet av proteinantigener i vaksinen vil typisk være i området fra 1-0 g, fortrinnsvis fra -0 g, og mest typisk i området fra -2 g. 1 Optimale mengder av bestanddeler for en gitt vaksine kan fastslås ved standardundersøkelser som omfatter observasjon av egnede immunresponser i individer. Etter en innledende vaksinasjon kan individene gis en eller flere forsterkerimmuniseringer med passende mellomrom. Vaksinefremstilling beskrives generelt i Vaccine Design ( The subunit and adjuvant approach (red. Powell M.F. eks. & Newman M.J.) (199) Plenum Press, New York). Innkapsling i liposomer beskrives av Fullerton, U.S. patentskrift nr B) Utvalgte pneumokokksakkaridkonjugat + 3D-MPL-preparater For foreliggende oppfinnelses formål beskriver begrepet pneumokokkpolysakkaridkonjugater ifølge oppfinnelsen konjugater av kapsulære polysakkarider fra Streptococcus pneumoniae som er mer immunogene i preparater som omfatter 3D-MPL enn i preparater som omfatter 3D-MPL sammen med en aluminiumbasert adjuvans (f. eks. konjugater av serotype 4, serotype 6B, serotype 18C, serotype 19F eller serotype 23F). 3 For foreliggende oppfinnelses formål beskriver begrepet i det vesentlige fritt for aluminiumbaserte adjuvanser et preparat som ikke inneholder tilstrekkelig aluminiumbasert adjuvans (f. eks. aluminiumhydroksid og særlig aluminiumfosfat) til at dette gir en reduksjon av immunogenisiteten va et pneumokokkpolysakkaridkonjugat ifølge oppfinnelsen, sammenliknet med et ekvivalent preparat som omfatter 3D-MPL uten tilsatt aluminiumbasert adjuvans. Det antigene preparat bør inneholde adjuvans som i det vesentlige består av 3D-MPL. Mengden av aluminiumbasert adjuvans som tilsettes pr. dose bør fortrinnsvis være mindre enn 0 g, mer foretrukket mindre enn g, enda mer foretrukket mindre enn g, og mest foretrukket er ingen aluminiumbasert adjuvans tilsatt til de antigene preparatene ifølge oppfinnelsen.

19 18 For foreliggende oppfinnelses formål bør bestemmelse av hvorvidt et pneumokokkpolysakkaridkonjugat er signifikant mer immunogent enn preparater som omfatter 3D-MPL enn i preparater som omfatter 3D-MPL sammen med en aluminiumbasert adjuvans utføres som beskrevet i eksempel 2. Som et mål på hvorvidt et preparat er signifikant mer immunogent når det omfatter 3D-MPL alene bør forholdet mellom GMC IgG-konsentrasjonen (som bestemt i eksempel 2) mellom preparater som omfatter 3D-MPL alene og et ekvivalent preparat som omfatter 3D-MPL sammen med aluminiumbasert adjuvans være høyere enn 2, mer foretrukket høyere enn, enda mer foretrukket høyere enn 7, ytterligere mer foretrukket høyere enn 9, og mest foretrukket høyere enn Blant problemene som er forbundet med polysakkaridtilnærmingen til vaksinasjon er det faktum at polysakkarider i seg selv er dårlige immungener. Strategier som har blitt utformet for å overvinne denne manglende immunogenisitet omfatter kopling (konjugering) av polysakkaridet til store proteinbærere, som gir hjelper-t-cellehjelp. Det foretrekkes at pneumokokkpolysakkaridene ifølge oppfinnelsen er koblet til en proteinbærer som gir hjelper- T-cellehjelp. Eksempler på bærere som kan anvendes omfatter difteritoksoid, mutant av difteritoksoid og tetanus toksoid (DT, CRM197 og TT), Keyhole Limpet -Haemocyanin (KLH), renset proteinderivat av tuberkulin (PPD), og OMPC fra Neisseria meningitidis. Mest foretrukket anvendes protein D fra Haemophilus influenzae (EP B), eller fragmenter av dette (se seksjon C) som den immunogene proteinbærer for pneumokokkpolysakkaridene ifølge oppfinnelsen. 2 I en utførelse omfatter det antigene preparat ifølge oppfinnelsen pneumokokkpolysakkarid av serotype 4 (PS4) konjugert til et immunogent protein og utformet med 3D-MPLadjuvans, hvor preparatet er i det vesentlige fritt for aluminiumbasert adjuvans. I ytterligere utførelser omfatter det antigene preparat PS 6B, 18C, 19F eller 23F, konjugert til et immunogent protein og utformet med 3D-MPL-adjuvans, hvor preparatet er i det vesentlige fritt for aluminiumbasert adjuvans. 3 I ytterligere en utførelse av oppfinnelsen tilveiebringes et antigent kombinasjonspreparat som omfatter to eller flere pneumokokkpolysakkaridkonjugater utvalgt fra gruppen PS 4, PS 6B, PS 18C, PS 19F og PS 23F, utformet med 3D-MPL-adjuvans, hvor preparatet er i det vesentlige fritt for aluminiumbasert adjuvans.

20 19 Immunogenisiteten av pneumokokkpolysakkarider ifølge oppfinnelsen påvirkes ikke i signifikant grad ved at de kombineres med andre pneumokokkpolysakkaridkonjugater (eksempel 3). Følgelig tilveiebringer en foretrukket utførelse av oppfinnelsen et antigent kombinasjonspreparat som omfatter ett eller flere pneumokokkpolysakkaridkonjugater ifølge oppfinnelsen i kombinasjon med ett eller flere andre pneumokokkpolysakkaridkonjugater, hvor preparatet er utformet med 3D-MPL-adjuvans, men er i det vesentlige fritt for aluminiumbasert adjuvans. I ytterligere foretrukne utførelser av oppfinnelsen tilveiebringes antigenkombinasjonspreparater som inneholder minst ett og fortrinnsvis to, tre, fire eller alle fem av pneumokokkpolysakkaridkonjugatene PS 4, 6B, 18C, 19F eller 23F, og i tillegg enhver kombinasjon av andre pneumokokkpolysakkaridkonjugater, utformet med 3D-MPL-adjuvans, hvor preparatet er i det vesentlige fritt for aluminiumbasert adjuvans. 1 Det antigene Streptococcus pneumoniae-kombinasjonspreparat ifølge oppfinnelsen vil typisk omfatte polysakkaridkonjugatantigener hvori polysakkaridene er avledet fra minst 4, 7, 11, 13, 1 eller 23 serotyper (se Streptococcus pneumoniaepolysakkaridkonjugatantigener ifølge oppfinnelsen ovenfor for foretrukne kombinasjoner av serotyper avhengig av sykdommen som skal behandles). De antigene preparatene ifølge oppfinnelsen anvendes fortrinnsvis som vaksinepreparater for å forebygge (eller behandle) pneumokokkinfeksjoner, særlig hos eldre, spedbarn og småbarn. 2 Videre utførelser av foreliggende oppfinnelse omfatter tilveiebringelse av de ovenfor beskrevne antigene preparater for anvendelse i medisiner, en fremgangsmåte for induksjon av en immunrespons mot et kapsulært polysakkaridkonjugat fra Streptococcus pneumoniae som omfatter trinnene tilførsel av en sikker og effektiv mengde av et av de ovenfor beskrevne antigene preparater til en pasient, og anvendelse av ett av de ovenfor beskrevne antigene preparater ved fremstilling av et medikament for forebyggelse av (eller behandling) av pneumokokksykdom. 3 Foreliggende oppfinnelse kan anvendes for forebyggelse /lindring av pneumoni hos den eldre (+ år) populasjon og otitis media hos spedbarn (opptil 18 måneder) og småbarn (typisk fra 18 måneder til år), ved kombinere et multivalent Streptococcus pneumoniaepolysakkaridkonjugat, utformet som beskrevet heri, med et Streptococcus pneumoniae-protein

21 eller en immunologisk funksjonell ekvivalent av dette. Se avsnittet pneumokokkproteiner ifølge oppfinnelsen ovenfor for foretrukne proteiner og proteinkombinasjoner. De antigene preparatene (og vaksinene) som beskrives heri ovenfor foreligger fortrinnsvis i frysetørket form inntil de skal anvendes, på hvilket tidspunkt de rekonstitueres etter behov med fortynningsmiddel. Mer foretrukket er de frysetørket i nærvær av 3D-MPL og rekonstitueres etter behov med saltløsning. 1 Frysetørking av preparatene fører til et mer stabilt preparat (frysetørking hindrer f. eks. nedbryting av polysakkaridantigenene). Prosessen gir også overraskende nok et enda høyere antistofftiter mot pneumokokkpolysakkaridene. Dette har blitt vist å være spesielt av betydning for PS6B-konjugater. En annen utførelse av oppfinnelsen er således et frysetørket antigent preparat som omfatter et PS 6B-konjugat og med 3D-MPL som adjuvans, og i det vesentlige fritt for aluminiumbaserte adjuvanser. For fremstilling av vaksinene, se seksjonen Vaksinepreparater ifølge oppfinnelsen ovenfor. 2 C) Bakteriepolysakkarid protein D-konjugater Tendensen mot kombinasjonsvaksiner har den fordel at den reduserer ubehag for mottakeren, forenkler planleggingen av vaksineringen og sikrer fullføring av vaksineringsskjemaet, men medfører også en fare for at vaksinens effektivitet reduseres (se ovenfor for en diskusjon vedrørende epitopsupresjon grunnet for hyppig anvendelse av bærerproteiner). Det vil derfor være fordelaktig å fremstille vaksinekombinasjoner som oppfyller populasjonens behov og som i tillegg ikke viser immunogen interferens mellom bestanddelene. Disse fordelene kan realiseres ved de immunogene preparatene (eller vaksinene) ifølge oppfinnelsen, som er spesielt gunstige for tilførsel av kombinasjonsvaksiner til høyrisikogrupper som spedbarn, småbarn eller eldre. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et protein D fra Haemophilus influenzae, eller fragmenter av dette som bærer for polysakkaridbaserte immunogene preparater, innbefattet vaksiner. Fragmenter som er egnede for anvendelse omfatter fragmenter som omfatter T- hjelperepitoper. Nærmere bestemt vil protein D-fragmentet fortrinnsvis omfatte den N- terminale 1/3 av proteinet. 3 Protein D er et IgD-bindende protein fra Haemophilus influenzae (EP B1) og er et kraftig immunogen.