Nyhetsbrev for medlemmer av NSMS Nr 2, 2009, 6. årgang

Transkript

1 Nyhetsbrev for medlemmer av NSMS Nr 2, 2009, 6. årgang

2 Innholdsfortegnelse Organsisasjonen NSMS...2 Lederen har ordet...3 Studier av vann ved hjelp av massespektrometri...4 Rapport fra den 18. internasjonale MSkonferansen i Bremen...8 Bestemmelse av frie fettsyrer ved hjelp av væskekromatografi og massespektrometri (LC-MS)...10 Møter og konferanser...16 Forsidebilde eies av: Thermo Fisher Scientific Innleveringsfrister for bidrag til Massenytt: Organisasjonen NSMS Norsk Selskap for Massespektrometri (NSMS) er en nasjonal forening som ønsker å ivareta faget massespektrometri. Vi er en frittstående forening som ikke har underavdelinger. Norsk selskap for massespektrometri er tilknyttet det internasjonale MS-miljøet ved at vi er medlem av International Mass Spectrometry Foundation (IMSF) og vi har en valgt representant i styret til IMSF. Vi avholder nasjonale seminarer i massespektrometri hvert annet år. Disse blir avholdt på steder der vi har mulighet for både å gå og stå på ski, med andre ord vi kombinerer det faglige med det sosiale. Dette gjør at vi får en fin atmosfære rundt det hele og nye kontakter dannes mens gamle pleies. NSMS arrangerer også noe som vi kaller MSbrukermøter. Disse møtene skal arrangeres på tider som ikke kolliderer med våre ordinære vintermøter. Ideen med disse møtene er å få ms-intereserte til å diskutere faget på et mer praktisk grunnlag. Vi ønsker å ta opp praktiske problmer og utfordringer, for på den måten å kunne hjelpe hverandre med små og store problemer på MS-laboratoriet. Vårnummer: frist 1. mars Høstnummer: frist 15. september Medlemskap i NSMS Alle med interesse for massespektrometri kan bli medlem av Norsk Selskap for Massespektrometri. Kontingenten er for tiden kr. 100,- pr. år. og innmelding vil du kunne gjøre på våre internettsider. html eller ved å sende en mail til lederen av nsms, leder@nsms.no Ansvarlig redaktør Dag Ekeberg, tlf e-post: Dag.Ekeberg@umb.no Redaksjonsmedarbeider Hanne Devle, tlf e-post: Hanne.Devle@umb.no Trykkeri Zoom Grafisk AS, Drammen Tlf: ISSN

3 Lederen har ordet Dag Ekeberg, NSMS Vi er nå godt inne i et nytt år og to nye år skal de som innehar råd og verv i NSMS jobbe med nye ideer samtidig som vi skal ta vare på gode tradisjoner. Vi er alle mottakelige for nye forslag og tanker, så får vi se om vi klarer å realisere dem. Styrets viktigste oppgave er å sørge for at det neste MS-vintermøte blir holdt på en minst like god måte som de tidligere. Dette skal styret forsøke å få til siden det er styret selv som skal være arrangør denne gangen, men vi er så heldige å ha med oss Arnfinn Kvarsnes som dataguru. I den anledning er styret mottakelig for forslag mht vårt neste MS-vintermøte. Selv om vi nå i flere år har fått veldig bra tilbakemeldinger så er det alltid rom for forbedringer. Som leder av NSMS vedtok styret at jeg skulle delta på det 18. Internasjonale MS-møte som denne gang fant sted i Bremen. Referat fra dette møtet kan du lese i dette nr av Massenytt. Disse møtene finner sted hvert tredje år, men det prates om at man etter hvert skal la de gå hyppigere dvs hvert annet år slik våre nasjonale møter går. De nordiske MS-møtene går fortsatt hvert tredje år en stund til sikkert. Når det gjelder nordisk MS-møte så kan dere forsøke å huske på at det neste nordiske skal finne sted neste år det er våre svenske kolleger som har som oppgave å ta seg av dette. De nordiske ms-foreningene har ennå ikke blitt kontaktet men jeg regner med at vi hører noe om ikke så lenge. Vanligvis så finner disse møtene sted på høsten så det er mulig det gjør det denne gangen også. Massenytt er et tidsskrift hvor vi har som mål å øke interessen for og kunnskap omkring massespektrometri. Vårt fagfelt dekker et bredt spekter som for eksempel teori, organisk og uorganisk kjemi, biokjemi osv. Derfor er vi avhengige av alle for at vi skal kunne dekke våre områder og vi setter pris på om du kan bidra med for eksempel noen ord om hva det er du holder på med eller om du skriver ren teori så er det også hjertelig velkommen. Onsdag 18. november vil vi få besøk av gjesteforelser Iain Campuzano som holder følgende forelesninger: kl : Metals in Medicine: Locating a Platinum Binding Site and Ion Mobility Derived Gas Phase Atomic Interaction Radii kl : Ion Mobility Mass Spectrometry: A Rapid Method for Determining Shape and Cross Sections of Macromolecular Complexes Forelesningene finner sted i biblioteket i Bioteknologibygget ved UMB. 3

4 Studier av vann ved hjelp av massespektrometri Einar Uggerud, CTCC, Kjemisk institutt, UiO Det er strengt tatt unødvendig å argumentere for hvorfor kjemiske studier av vann er viktige og nødvendige, så jeg vil nøye meg med å minne leserne om noen enkle fakta. Vann er en forutsetning for alt liv på jorda. Alle biologiske prosesser er knyttet til vann som løsningsmiddel, katalysator eller substrat. Menneskekroppen består av to tredeler vann, og kan ikke fungere uten stadig tilførsel. Et tre kan betraktes som en termodynamisk maskin som drives av sollys med kontinuerlig gjennomstrømming av vann fra rot til blad. To tredeler av jordoverflaten er dekket av hav. Vann fordamper fra overflaten, transporteres av vinden, kondenserer til dråper, som når de vokser seg store nok faller ned igjen som regn eller snø. Denne dynamiske prosessen er en essensiell del av energibalansen i atmosfæren, og mengden og fordelingen av skyer er på sin side med på å regulere temperatur og klima. Undertegnede har alltid vært fascinert av vann. Til tross for den enkle kjemiske sammensetningen, selv små barn kjenner formelen, er vår forståelse for vannets egenskaper stadig vekk ufullstendig.[1] La meg ta et enkelt eksempel. I motsetning til de fleste kjente stoffer, utvider vann seg når det fryser til is, med hele ti prosent. Det vil si at vannmolekylene har betydelig større tilgjengelig volum når de er bundet fast i krystallgitteret enn når de er frie til å diffundere mellom hverandre i væskefase. Det fenomenet er vanskelig å forklare på en tilforlatelig måte, og det foreligger dels motstridende teorier om fenomenet. Ved Massespekrometrilaboratoriet [2] arbeider vi med vann, om enn på en uvanlig måte, ved å studere klynger av vannmolekyler. Vannklynger, (H 2 (n er et heltall, fra 2 og oppover) kan betraktes som en glidende overgangsfase mellom isolerte vannmolekyler i gassfase på den ene siden, og vannmolekyler i kondensert fase på den andre. Vannklynger kan dannes på flere vis, vi benytter elektrosprayionisering.[3] Ved hjelp av elektrospray danner vi klynger med positiv eller negativ elektrisk ladning, enten A + (H 2 eller B - (H 2. A + og B - er kationer eller anioner som vi sørger for er til stede i sprayløsningen i lave konsentrasjoner. Slike vannklynger representer dermed solvatisering av ioner på det mest grunnleggende plan. Videre i denne artikkelen vil jeg vise et par eksempler på enkle massespektrometriske eksperimenter som gir oss verdifull kunnskap om egenskapene til vannklynger spesielt, og vann og is generelt. I det første eksempelet skal vi se nærmere på hvordan ioner transporteres i vann. De to mest interessante ionene er naturlig nok H + og OH -, og vi vil derfor konsentrere oss om disse. Det andre eksempelet dreier seg om kondensasjon og fordamping av vann. Også disse elementære prosessene kan studeres ved hjelp av massespektrometeret. Transport av ioner Den første teorien for elektrisk strøm i vann er mer enn to hundre år gammel og stammer fra Theodor Grotthuss. Grotthuss var blitt kjent med Voltasøylen (det første batteriet) og Voltas vitenskapelige arbeider i Roma og Paris, der han studerte, og hadde merket seg at vann leder begge typer elektrisitet. Han satte seg fore å forklare elektrisk konduktivitet ved elektrolyse. Det gjorde han ved å postulere ionet. Han betegnet ioner som molécules, det var først Faraday som fant på navnet ioner tretti år seinere. Grotthuss gikk lenger enn til å postulere elektrisitetsbærerne. Han forsto at ionene måtte vandre for at det skulle gå elektrisk strøm gjennom en vandig løsning, og han foreslo en mekanisme for dette som medfører at vannets molekyler spaltes til ioner i løpet av prosessen, se figur 1.[4] Den samme Grotthuss er forøvrig en litt mystisk skikkelse. Han publiserte kun i en kort periode. For det mest holdt han til på familiegodset i Litauen sammen med sin mor, og han døde ung. Figur 1. Modernisert utgave av Grotthuss mekanisme for protonledning i vann. Pilene representerer en serie påfølgende heterolytiske bindingsbrudd, hvilket dermed fører til netto protonledning. I prinsippet kunne en tenke seg at alle bindingsbrudd og -dannelser foregikk samtidig, i takt (den såkalte relémekanismen). Det ville betydd nesten momentan ledning, og er svært usannsynlig da det ville kreve en sammenhengene kjede av hydrogenbindinger der alle OH-bindingene har samme vibrasjonsfase. 4

5 Det er forbløffende hvor godt utgangspunkt Grotthuss teori gir for å forstå ioneledning og mobilitet av ioner i vann, selv to hundre år etterpå. Imidlertid er det mange ubesvarte spørsmål, ikke minst om hvilke kjemiske elementærreaksjoner som inngår, hvilke hastigheter disse har, og alle energimessige forhold knyttet til reaksjonsmekanismen. Vår egen tilnærmelse til problemet går gjennom noen relativt enkle eksperimenter.[5] Vi benytter vårt QTOF-instrument til formålet. Dette instrumentet er utstyrt med to masseanalysatorer med en kollisjonscelle mellom. Kollisjonscella er modifisert slik at vi kan lede inn damper av flyktige væsker. Ioner, f.eks. H 3, dannes i elektrospraykilden og føres inn i massespektrometeret. Ved hjelp av kvadrupolfeltet i masseanalysator nummer 1 filtrerer vi bort alle ioner vi ikke ønsker, med unntak av en type, svarende til en bestemt m/z-verdi, og dermed en bestemt verdi av n. Disse ionene føres så inn i kollisjonscella, som inneholder litt tungtvann, og vi studerer utfallet av gassfasereaksjonen mellom H 3 og D 2 O ved å bestemme reaksjonsproduktene. Det gjør vi ved hjelp av masseanalysator nummer 2, TOF-delen. Vi observerer to produkter, nemlig H 3-1 (HDO) og H 3-1 (D 2 O). Det første tilsvarer utveksling av H og D mellom D 2 O og ett av H 2 O-molekylene i klyngeionet. Denne prosessen er protonkatalysert, og det er nødvendig at protonet vandrer til tungtvannmolekylet før H/Dutvekslingen finner sted, se figur 2. Det andre produktet er resultatet av en enkel ligandutveksling, nemlig at D 2 O-molekylet bytter plass med ett H 2 O-molekyl. Denne prosessen er selvfølgelig ikke avhengig av protonkatalyse. Begge reaksjonene skjer i løpet av den korte levetiden av kollisjonskomplekset [H 3 D 2 O] *. Komplekset blir dannet når reaktantene kolliderer, og vi har beregnet levetiden til omlag 1 μs for klynger med n = 20. Vi ser en sammenheng mellom størrelsen på klyngen og tendensen til H/D-utveksling. I de minste klyngene (n < 20) rekker ikke H- og D-atomene å bli slumpmessig fordelte før kollisjonskomplekset dissosierer til produkter. Ved analyse av våre data kan vi følgelig beregne protonmobiliteten. At H/Dutvekslingen skjer som følge av protonkatalyse er åpenbart når en sammenlikner reaksjonene mellom enten H 3 eller NH 4+ (H 2, og tungtvann. I det første tilfellet observerer vi høy tendens til H/Dutskifting, mens i det andre tilfellet er den svært lav og ligandutveksling dominerer. Som kjent er ammoniakk mer basisk enn vann, og trekker sterkere på protonet, slik at protonet i stor grad er forhindret fra å bevege seg. For tida studerer vi mer komplekse klynger, blant annet slike som inneholder flere basiske komponenter. Her har vi allerede gjort flere overraskende oppdagelser, og vi arbeider nå med å forstå disse blant annet ved å foreta kvantekjemiske bergninger. Figur 2. Mekanisme for protonvandring i protonerte vannklynger. Denne mekanismen svarer også for H/D-utveksling mellom D 2 O- og H 2 O-molekyler. Et proton vil kun vandre fra ett vannmolekyl til et annet når den faktiske protonaffiniteten til det andre er høyere enn det første. Den faktiske protonaffiniteten for vannmolekyler i klynge er alltid høyere enn for isolerte vannmolekyler, og protonaffiniteten er høyere, jo flere vannmolekyler som er bundet sammen i området rundt det aktuelle vannmolekylet. I illustrasjonen over er blir den faktiske protonaffiniteten til vannmolekylet lengst ned forhøyet ved at et annet molekyl flytter seg til det. Fluktuasjoner i nettverkstrukturen leder med andre ord til endringer i protonets plassering. Spontan fordamping av vannklynger og termodynamikk Fordampingsentalpien til vann er 44 kj/mol. Denne viktige termodynamiske størrelsen er en middelverdi, knyttet til makroskopiske mengder vann. For små vannklynger vet vi at fordampingsvarmen varierer med størrelsen. Allerede på 1970-tallet foretok Kebarle og andre likevektsmålinger av bindingsentalpier (samme, men med motsatt fortegn av fordampingsentalpien) og -entropier for vannklynger med n < 6 ved hjelp av høytrykk-massespektrometri (HPMS). Fra disse studiene viste det seg at reaksjonsentalpien for H H 2 O = H 3 5

6 er mest negativ for de minste verdiene (n = 1 3). Fra n = 3 til 4 er det et byks nedover i tallverdien til bindingsentalpien, noe som knyttes til strukturen til H 3 O) 3 som danner et fullt indre solvatiseringsskall av tre vannmolekyler rundt H 3 O +, med hvert solvatisert vannmolekyl bundet med en hydrogenbinding, noe som betyr at fra og med n = 4 begynner byggingen av det andre skallet. Elektrospray-massespektrometri byr på muligheter til å studere langt større klynger enn det som er mulig med HPMS. I vårt laboratorium har vi helt siden Georg Hvistendahls tid studert fragmentering av metastabile ioner, det vil si ioner som fragmenterer under flukt gjennom massespektrometeret. Trinnvis fordamping, det vil si H 3 H H 2 O er i prinsippet å betrakte som en hvilken som helst fragmenteringsreaksjon, og vi observerer spontan og suksessiv avspaltning av opp til fire vannmolekyler i løpet av de par millisekundene det tar for en protonert vannklynge å bevege seg gjennom vakuumkammeret i QTOF-instrumentet. Det er imidlertid vanskelig å trekke termodynamiske data ut av disse kinetiske måledataene, og vi var opprådde helt til vi kom i kontakt med en utmerket fysiker fra Göteborg, Klavs Hansen. Klavs har tidligere arbeidet med å utvikle en generell metode for å bestemme bindingsenergier fra data av den type vi kan få fra massespektrometriske eksperimenter. Metoden er utviklet fra kjernefysikken, og forutsetter at et par ganske enkle krav er oppfylt. Jeg skal nå forklare hovedtrekkene i analysemetoden.[6] Figur 3 viser et massespektrum som består av to typer klynger, nemlig H 3 og NH 4+ (H 2. I det følgende kan vi ignorere serien med ammoniumioner, og konsentrere oss om H 3 -serien. Vi ser at spekteret er ganske pent i den forstand det er mulig å tenke seg en jevnt glatt kurve gjennom alle toppunktene. Denne ideelle kurven blir i neste omgang avfoldet fra de sanne data. De toppene som da stikker over idealet vil utgjøre positive utslag og de som dukker under negative utslag i forhold til en ideell middelverdi. Med andre ord kunne vi utgangspunktet tenke oss at en klynge som stikker opp over gjennomsnittet er noe kraftigere bundet enn naboene. Slike klyngestørrelser betegnes gjerne som magiske tall, også et begrep lånt fra kjernefysikken. Vurderingen av sammenhengen mellom relativ topphøyde og stabilitet er for så vidt kvalitativt korrekt, men bare til en viss grad. En mer nøyaktig analyse fordrer mer omhyggelig bearbeidelse av måledataene. Etter å ha anvendt en ganske enkel kinetisk modell og pålagt oss et par rimelige føringer om de termodynamiske forhold, samt å anvende en såkalt dråpemodell for å bestemme bindingsenergien av den ideelle klynga, ble vi i stand til å bestemme fordampingsenergier for hele spennet 5 < n < 120. Det ligger forhåpentligvis ikke i vår natur å overdrive betydningen av egne vitenskapelige funn, men vi er ganske fornøyde med at dette datasettet gjør oss i stand til å komme fram til en løsning på et gammelt mysterium, nemlig hvorfor n = 20 er et magisk tall (se figur 3). Figur 3. Massespektrum av klynger dannet ved positiv elektrosprayionisering av en vandig løsning av ammoniumsulfat. Vi observerer to rekker av ioner, henholdsvis svarende til klynger av ammoniumioner og hydroksoniumioner. Analysen viser tydelig at dette, på samme måte som for n = 3, skyldes lukking av et skall. Vår fortolkning er imidlertid ikke knyttet til noen bestemt geometrisk struktur men til termodynamisk fase, nemlig at klynger med n > 20 er væske, mens de med n 20 er is. Det har tidligere vært spekulert på om den geometriske formen til H 3 O) 20 er spesielt gunstig, og man har foreslått at en perfekt geometrisk anordning med H 3 O + innesperret i et perfekt bur av tjue hydrogenbundne vannmolekyler der oksygenatomene utgjør hjørnene i et dodekaeder (figur 4). 6

7 Foruten våre funn, viser resultatene av ferske kvantekjemiske beregninger at en slik perfekt dodekaedrisk struktur ikke er spesielt stabil. Den mest stabile formen avviker sterkt fra denne, blant annet ved lav symmetri og ved at protonet gjerne vil være en del av hydrogenbindingsnettverket i periferien og ikke befinne seg i sentrum. Jeg vil til slutt takke Patrik Andersson, Mauritz Ryding, Klavs Hansen (alle Göteborg), Osamu Sekiguchi, Alexey Zatula, Anton Simakov og Vebjørn Bakken (alle Oslo) for mye moro med vannklynger. Referanser 1. Nettstedet Water Structure and Science av Martin Chaplin er en rik kilde til kunnskap om vann, se: 2. Massespektrometrilaboratoriet, Kjemisk institutt, Universitetet i Oslo, 3. Det går an å danne klynger av vannmolekyler ved hjelp av en ganske alminnelig elektrospray-ionekilde, bare en er lett nok på hånda. Prøv selv. Skru av varmeelement og gasstrøm, og arbeid med lav konus-spenning, så dukker de gjerne opp. Figur 4. Et dodekaeder, ett av de fem platonske legemer. Figuren er fra html. 4. C. J. T. de Grotthuss Sur la décomposition de l eau et des corps qu elle tient en dissolutionl aide de l électricité galvanique. Ann. Chim. (Paris) (1806). Forfatteren har en kopi av denne. Forøvig kan vi vise til en mer detaljert framstilling av ioneledningsmekanismer i N. Agmon, Chem. Phys. Lett., 244, 456 (1995), og en kort, men interessant, historisk/biografisk framstilling av J. A. Krikštopaitis In the Wake of Volta s Challenge: The Electrolysis Theory of Theodor Grotthuss, 1805, som lett kan finnes fram på Internettet. 5. P. U. Andersson, M. J. Ryding, O. Sekiguchi, E. Uggerud Isotope exchange and structural rearrangements in reactions between size-selected ionic water clusters, H 3 and NH 4+ (H 2, and D2O. Physical Chemistry Chemical Physics, (2008). 6. K. Hansen, P. U. Andersson and E. Uggerud, Activation energies for evaporation from protonated and deprotonated water clusters from mass spectra The Journal of Chemical Physics, antatt august 2009, doi: /

8 Rapport fra den 18. Internasjonale MS-konferansen i Bremen, september 2009 Dag Ekeberg, NSMS Som leder av Norsk selskap for massespektrometri fløy jeg til Bremen via Frankfurt søndag den 30. August for å delta på den 18. Internasjonale konferansen i massespektrometri. Det var professor Jürgen Grotemeyer som var leder for dette arrangementet. Møtet ble åpnet som seg hør og bør på en verdig og fin måte søndag kveld, med flere fine taler. Den offisielle avslutningen ble gjort fredag den 4. september av John Traeger som er president i den internasjonale stiftelsen for massespektrometri (IMSF). I løpet av denne uken opplevde ca 1500 deltagere en rekke interessante foredrag, diskusjoner, ekskursjoner og utstillinger. For å starte med deltagerantallet var det færre denne gangen jamført med det forrige som fant sted i Praha i Men det betyr ikke at årets begivenhet var dårlige av den grunn. Av nordmenn som møtte kan vi nevne John Vedde og Einar Uggerud fra Universitetet i Oslo, Henning Cederkvist fra Rikshospitalet, Helene Rønning fra Norges veterinærhøgskole, Hanne Devle fra Universitete for miljø og biovitenskap og undertegnede representert Norsk selskap for massespektrometri, med andre ord totalt seks personer fra Norge. Med så mange MS-instrumenter plassert omkring i vårt vidstrakte land hadde jeg regnet med at vi var bedre representert. Det spekuleres hos enkelte at dette tallet er så lavt bla pga at det er et proteomikk-seminar et annet sted dette semesteret, men folk som vet hva de prater om sier at det faglige utbyttet for de som jobber med proteiner og lignende er minst like god ved de internasjonale MS-konferansene. Her kommer vi inn på et området jeg personlig mener vil være en utfordring for IMSF og de lokale MS-foreninger, nemlig å opprettholde en mangfoldighet som gjør at våre møter blir attraktive for flere enn én gruppe MS-folk. Programmet på årets MS-konferanse startet tidlig om morgenen. Klokken 0800 startet plenarforedagene og det skal sies at her hadde arrangøren lagt sammen et variert innhold. Det kan nevnes at W.C. Lindberg fra USA sitt plenarforedrag hadde tittel Using lasers and mass spectrometry as a probe of anion reaction dynamics. R.G: Cooks, som også har vært på et av våre MS-vintermøter, hadde valgt tittelen Perspectives in Mass Spectrometry: A Personal View. Fra Frankrike kom R. Lobinski med sin tittel Elemental mass spectrometry in proteomics and metabolomics studies. Det er ikke noe poeng å ramse opp titlene til alle 7 inviterte plenarforedragsholdere og det er heller ikke plass til dette i Massenytt, men det var mye nyttig lærdom som ble presentert. Keith Jennings som foredragsholder. Jeg kan allikevel ikke la være å skrive om Fred W. McLafferty sitt bidrag. Som alltid var han levende engasjert og en utrolig god foredragsholder. Fred er en person som ikke gror fast faglig. Fred McLafferty, engasjert som alltid. 8

9 Med sitt fantastiske foredag som hadde tittelen Multistep Evolution of protein conformation on electrospray into gas phase trollbandt hele forsamlingen bortsett fra en amerikaner som på død og liv ville ta han skulle hatt med noen teoretiske momenter omkring noen av hans påstander. Det kan nevnes at komiteen for det neste MS-vintermøte vurderer å invitere Fred W. McLafferty nok en gang til vårt MS-vintermøte. Det er nemlig en del år siden sist han var hos oss. Det finnes mange fine steder å gå ut og spise god mat og drikke litt god vin eller øl (Beck og Hacke Bech). Det gamle ærverdige rådhuset er et meget godt egnet sted for slike aktiviteter og det fikk en del av oss oppleve i og med at noen firma inviterte deltakere med på en helaften. For min del så var jeg invitert av MSVision på en fantastisk middag med deilig rødvin som tilbehør. Bilde fra Gerard Meijer s åpningsforedrag. Taming beams of neutral molecules. Bremen er noe spesiell mht massespektrometri i og med at både Bruker og Thermo har sine lokaler i Bremen. Begge firmaene tilbød omvisning av sine lokaler under hele konferansen, og de pågikk hele dagen med en varighet på 1 time. Busser var satt opp mellom konferansesenteret og firmaene. Bremen Rathaus, kjent landemerke og med restaurant og vinhus i kjelleren. Jeg vil avslutte dette lille reisebrevet med å oppfordre dere alle til å vurdere å delta på det 19. IMSC som finner sted i Kyoto i Dere kan lese mer rom dette møtet i tiden som kommer på deres hjemmesider: Konferansemiddag. 9

10 Bestemmelse av frie fettsyrer ved hjelp av væskekromatografi og massespekterometri (LC-MS) Erlend Hvattum, GE-Healthcare, Oslo Introduksjon Fettsyrer i fri form, dvs. frie fettsyrer (FFA), forekommer i svært begrenset mengde i ulike typer vev. Som regel er fettsyrene en del av enkle eller komplekse lipider, for eksempel triglycerider og fosfolipider. Hydrolyse av disse lipidene vil da gi FFA og bestemmelse av FFA gir fettsyreprofilen som er en viktig parameter i ulike type prøver, for eksempel blodplasma og matvarer. Fettsyrestrukturen viser stor variasjon. Fellesnevneren er en karboksylsyregruppe med en karbonkjede. Antall karbonatomer i kjeden varier og det kan enten være partall eller oddetall karbonatomer i kjeden. Det mest vanlige er partall karbonatomer og i størrelsesorden karbonatomer. Karbonkjeden kan inneholde dobbeltbindinger og får da betegnelsen umettede fettsyrer. Både enumettede og flerumettede fettsyrer er vanlige. Dobbeltbindingene viser som regel cis-geometri, men trans dobbeltbindinger forekommer også. Andre variasjoner i karbonkjeden kan også forekomme, karbonkjeden kan være forgrenet eller inneholde funksjonelle grupper som hydroksy, epoksy eller keto-grupper. Forgrenete fettsyrer og hydroksy-, epoksy-, ketofettsyrer forekommer svært sjeldent i vev fra pattedyr, men er mer vanlig i ulike typer bakterier etc. I de siste årene har det har vært et sterkt fokus på såkalte omega-3 fettsyrer, fordi økt inntak av disse fettsyrene (særlig fra fisk) kan ha en positiv helsegevinst på ulike typer sykdommer som hjertekarsykdommer, kreft etc. Omega-3 (også n-3 og ω-3) fettsyrer er betegnelsen på en familie av flerumettede fettsyrer som alle har det felles at én av dobbeltbindingene sitter på karbonatom nummer 3 fra hydrokarbonenden. I tabell 1 er noen vanlig fettsyrer oppgitt med engelsk navn og forkortelser, omega-3 fettsyrer er bl.a. EPA og DHA (se tabell 1). I figur 1 vises strukturen av noen vanlige fettsyrer. Tabell 1. Noen vanlige forekommende fettsyrer i biologiske prøver og deres forkortelse. Navn (engelsk) Forkortelse Myristic acid C14:0 Myristoleic acid C14:1 Palmitic acid C16:0 Palmitoleic acid C16:1 Stearic acid C18:0 Oleic acid C18:1 (cis-9) Elaidic acid C18:1 (trans-9) Linoleic acid C18:2 (cis-9,12) α-linolenic acid C18:3 (cis-9,12,15) γ-linolenic acid C18:3 (cis-6,9,12) Arachidic acid C20:0 Eicosadienoic acid C20:2 (cis-11,14) Eicosatrienoic acid C20:3 (cis-11,14, 17) Arachidonic acid C20:4 (cis-5,8,11,14) Eicosapentaenoic acid (EPA) C20:5 (cis- 5,8,11,14,17) Docosahexaenoic acid (DHA) C22:6 (cis- 4,7,10,13,16,19) Figur 1. Strukturen av noen vanlige C18 fettsyrer. Analyse av fettsyrer Bestemmelse av fettsyrer i ulike typer prøver kan være problematisk siden det finnes både posisjons- (n-3/n-6) og cis/trans-isomeri av dobbeltbindingene i fettsyrene. Tradisjonelt har frie fettsyrer (FFA) blitt bestemt ved hjelp av gasskromatografi (GC) med kapillærkolonner og koblet til enten flammeionisasjons- eller massespektrometri-detektor, dvs såkalt GC-FID eller GC-MS [1]. Forutsetning for 10

11 å bestemme FFA med GC er at fettsyrene må derivatiseres og den mest brukte metoden er å danne såkalte fettsyre-metylestere (FAME) [1]. Dette er en innarbeidet metode og de fleste FFA kan bestemmes ved hjelp av GC-FID/GC-MS. Fordelen med å bruke GC som separasjonsmetode er selvsagt høy oppløsning og dermed muligheten for separasjon av de fleste FAMEs. Imidlertid, til tross for den potensielt høye oppløsningen med GC, er det fortsatt vanskelig å oppnå fullstendig separasjon av viktige cis- og trans-isomerer. I tillegg kan det være problemer med termisk degradering og strukturmodifisering av flerumettede FA ved omdanning til metylestere. Dessuten kan derivatiseringstrinnet være arbeidskrevende. Når det gjelder bestemmelse av FFA ved hjelp av væskekromatografi (HPLC), ble det rapportert metoder for separasjon av FFA allerede tidlig i utviklingen av HPLC. Metodene var isokratisk reversfase C18 HPLC av FAMEs med refraktiv indeks (RI) eller UV deteksjon (se oversikt [2,3]. Fortsatt er C18 den mest vanlige stasjonærfasen i HPLC av fettsyrer. Imidlertid, med utviklingen av binære og tertiære HPLC pumper, baserer de fleste metoder seg i dag på gradientseparasjon. Når det gjelder derivatisering, som er viktig i GC for å gjøre fettsyrene tilstrekkelig flyktige, er det i HPLC i første rekke benyttet for å kunne detektere fettsyrene. Den relativt universelle FID detektoren har ikke sitt motstykke i HPLC og deteksjon med UV er avhengig av kromofore grupper. Derfor derivatiseres fettsyrene i HPLC for å øke metodenes følsomhet. Når det er sagt blir også derivatisering benyttet for å påvirke separasjon mellom de ulike fettsyrene. Det er imidlertid ikke noe i veien for å analysere frie fettsyrer, dvs ikke-derivatiserete fettsyrer, med HPLC. Forutsetningen i så fall er å benytte sure mobilfaser slik at karboksylsyregruppen protoniseres. I tillegg til reversfase C18 separasjon, er det også et par andre viktige HPLC separasjonsmetoder som er verdt å nevne i forbindelse med bestemmelse av fettsyrer, nemlig ionepar-kromatografi og sølvionkromatografi. Det siste er en veldig spesiell form for kromatografi som er til dels mye benyttet i HPLC av fettsyrer (og andre lipider) [4,5]. Sølvion-kromatografi (Ag-HPLC) benytter seg av egenskapene som sølvioner har til å danne reversible polare komplekser med umettede bindinger i organiske molekyler. Det muliggjør separasjon i henhold til antall, geometrisk konfigurasjon og posisjon av dobbeltbindingene i for eksempel fettsyrer. Ag-HPLC benyttes særlig til separasjon av cis- og trans-isomere fettsyrer og sølvionene er enten impregnert på kolonnens stasjonærfase eller tilsatt til mobilfasen. Ag-HPLC er ikke umiddelbart kompatibelt med massespektrometri. Massespektrometri av fettsyrer Massespektrometri (MS) er blitt mye brukt i forbindelse med bestemmelse av de ulike lipidklassene og også inkludert de frie fettsyrene. Når det gjelder fettsyrer har ulike ioniseringsmetoder og ulike masseanalysatorer vært benyttet. I dag er det mest vanlig å bruke elektrosprayionisering (ESI) med quadrupol, ionefelle eller time-of-flight (TOF) masseanalysatorer [2,3]. I tillegg har også atmosfærisk-trykk kjemisk ionisering (APCI) vært brukt. Som for de fleste andre molekyler, er ionisering av fettsyrer med elektrospray både enkelt og praktisk. Normalt trenger man ikke å derivatisere fettsyrene. Både positiv og negativ ionisering kan benyttes for fettsyrer. Negativ ionisering gir som regel det deprotonerte molekylet ([M H] - ) som hovedion. ESI og APCI er myke ioniseringsteknikker og gir derfor lite fragmentering av molekylene. Dette kan være et problem med hensyn til spesifisiteten av LC-MS metoder siden separasjonen av posisjonelle så vel som cis- og trans-isomerer vanligvis ikke er tilstrekkelig i HPLC til kun å følge massen av molekylet. For å øke spesifisiteten av LC-MS metoden er det oftest nødvendig å bruke MS/MS for å generere spesifikke diagnostiske produktioner. Fragmentering av fettsyreanioner har vært detaljert beskrevet i litteraturen og inkluderer bl.a. såkalt field desorption ionisering og høy-energi kollisjons indusert dissosiering (CID) [6,7]. Høy-energi CID av fettsyreanioner gir fragmenter som kan være strukturoppklarende, bl.a. med hensyn til posisjon av dobbeltbindinger etc. [6]. Fragmentering av fettsyreanioner med lav-energi CID, dvs. det som er vanlig å bruke i dag med ESI/APCI og standard masseanalysatorer (quadrupol, ionefelle og TOF), gir imidlertid lite strukturinformasjon. Hovedfragmentet er tap av vann fra den anioniske karboksylgruppen [8]. Dette gjør det vanskelig å lage spesifikke LC-MS/MS metoder, dvs selected/multiple reaction monitoring (SRM/ MRM) med fettsyreanionet som moderion [9]. For 11

12 å oppnå økt strukturinformasjon av fettsyrene har derivatisering vært benyttet. Derivatisering med ladete (positivt) molekyler har gitt metoder med deteksjonsgrenser i det lave femtomol (10-15 ) området [10]. Det som imidlertid har vist seg å være svært lovende når det gjelder fettsyrekarakterisering med lavenergi CID er å tilføre metallkationer til mobilfasen. Det har vist seg at fettsyremetallkation addukter lett fragmenterer ved lav-energi CID, særlig når alkali, jord-alkali eller kobberioner er blitt brukt sammen med ESI [11,12]. Tilsetning av disse metallionene til prøveløsningen gir enkeltladete adduktioner av typen [M H + C 2 ] + og [M H + C] + (C = monoeller divalent kation). Metallkation addukter har vist seg å gi spesifikke fragmenter som gjør det mulig å bestemme posisjonen av dobbeltbindingene i umettede fettsyrer. Bruk av ulike kationer har vært studert og lithium (Li) kationet har vist seg å være svært egnet for ESI-MS av lipider. Hsu og Turk har benyttet Li-addukter til å studere fragmentering av flere ulike lipidklasser (frie fettsyrer, fosfolipider og triglycerider) [12-15]. Når det gjelder FFA postulerer de (og andre) at fragmenteringen foregår ved en såkalt charged remote fragmenteringsmekanisme, dvs fragmenteringen av et ion hvor båndet som kløyves ikke er nabo (eller i umiddelbar nærhet) til ladningen [12]. Ved infusjon av fettsyrer i nærvær av Li-acetat ble det dannet [M H + Li 2 ] + ioner som så fragmenterte (lav-energi CID) ved suksessiv kløyving av karbonkjeden slik at det ble dannet en serie med fragmentioner med masseforskjell på 14u (CH 2 -) (se figur 2). Når det gjaldt enumettede fettsyrer, terminerte denne serien med fragmentioner ved dobbeltbindingen. I flerumettede fettsyrer, hvor dobbeltbindingene var separert med en methylgruppe, ble det observert intense fragmentioner etter kløyving av karbonatomene mellom dobbeltbindingene. Konklusjonen på arbeidet var at man dermed kunne benytte tradisjonelle MS instrumenter, for eksempel trippelquadrupoler, ionefelle eller Q-TOFs, dvs instrumenter med lav-energi CID, til å bestemme posisjon av dobbeltbindiner i FFA uten å måtte benytte seg av derivatisering. Cheng og Gross [16] har skrevet en utmerket oversiktsartikkel om charge-remote fragmentering. Der blir det hevdet at for å være sikker på at charge-remote fragmentering er den dominerende reaksjonen, er det viktig at ladningen på molekylet sitter fast, fortrinnsvis på den ene enden av molekylkjeden, og at ladningen ikke migrerer. Hvis ladning ikke sitter fast, vil charge-driven fragmentering (ladningsdrevet fragmentering) konkurrere med charge-remote fragmentering og man vil få en blanding av produktioner som kan være vanskelig å tolke. For eksempel vil protonerte fettsyrer ([M + H] + ioner) fragmentere med et innledende tap av H 2 O og dermed føre til ladningsmigrering som igjen vil favorisere en ladningsdrevet fragmenteringsmekanisme. Dette er i motsetning til metallkation addukter av fettsyrer, hvor ladning sitter fast og ikke migrerer. Afonso et al. [11] undersøkte lav-energi CID av fettsyrer i nærvær av kobberioner og fettsyrene dannet kobberion komplekser, dvs. [M H + Cu II ] + ioner. Nedbrytning av fettsyre kobberion-komplekset med ionefelleinstrument ga diagnostiske ioner som bl.a. gjorde det mulig å lokalisere dobbeltbindingene og skille cis- og trans-isomere fettsyrer. Et nøytralt tap av CO 2 var spesifikt for cis-isomere fettsyrer under de gjeldende betingelser. Dette er en viktig observasjon med tanke på spesifisiteten av LC-MS metoder siden cis-/trans-isomere fettsyrer ikke nødvendigvis er lette å separere med tradisjonell HPLC. Til slutt er det verdt å nevne at Zehethofer et al. [17] har benyttet seg av fettsyre metallkationer for å utvikle en spesifikk fettsyre LC-MS/MS metode. Spesifisiteten ligger i både separasjonstrinnet og i detektoren, dvs MS/MS-delen. For å oppnå spesifisitet i separasjonstrinnet benyttes UPLC, dvs. to UPLC-kolonner i serie (begge med partikler på 1.7 μm). Post-kolonne ble barium ioner (bariumacetat) tilført til mobilfasen ved hjelp av en separat pumpe. Fettsyrene dannet [M H + Ba] + ioner som ga mer eller mindre tilsvarende fragmentioner som Li-adduktene beskrevet over. Ved hjelp av de to C18 UPLC-kolonnene var det mulig å oppnå baselinje separasjon av ulike cis- og trans-isomerer, for eksempel for C18:1 og C18:2 fettsyrer. Der det ikke var mulig å oppnå baselinje separasjon, for eksempel for posisjonsisomerer som C18:3n-3/C18:3n-6 og C20:3n-3/C20:3n-6, ble det brukt isomerspesifikke ioner i MRM overgangene. I følge artikkelen var det dermed mulig å bestemme kvantitativt 29 ulike frie fettsyrer i plasma. 12

13 Figur 2 viser hvor på alkylkjeden fragmenteringen skjer for Li-addukter av en- og flerumettede fettsyrer (fra referanse [12]). Referanser (1) Gutnikov, G. Journal of Chromatography B: Biomedical Applications 1995, 671, (2) Chen, S. H.; Chuang, Y. J. Analytica Chimica Acta 2002, 465, (3) Lima, E. S.; Abdalla, D. S. P. Analytica Chimica Acta 2002, 465, (4) Dobson, G.; Christie, W. W.; Nikolova-Damyanova, B. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications 1995, 671, (5) Nikolova-Damyanova, B. Journal of Chromatography A 2009, 1216, (6) Jensen, N. J.; Tomer, K. B.; Gross, M. L. Analytical Chemistry 1985, 57, (7) Griffiths, W. J. Mass Spectrometry Reviews 2003, 22, (8) Gagné, S.; Crane, S.; Huang, Z.; Chun, S. L.; Bateman, K. P.; Lévesque, J. F. Journal of Lipid Research 2007, 48, (11) Afonso, C.; Riu, A.; Xu, Y.; Fournier, F.; Tabet, J. C. Journal of Mass Spectrometry 2005, 40, (12) Hsu, F. F.; Turk, J. Journal of the American Society for Mass Spectrometry 1999, 10, (13) Hsu, F. F.; Bohrer, A.; Turk, J. Journal of the American Society for Mass Spectrometry 1998, 9, (14) Hsu, F. F.; Turk, J. Journal of the American Society for Mass Spectrometry 1999, 10, (15) Hsu, F. F.; Turk, J. Journal of the American Society for Mass Spectrometry 2001, 12, (16) Cheng, C.; Gross, M. L. Mass Spectrometry Reviews 2000, 19, (17) Zehethofer, N.; Pinto, D. M.; Volmer, D. A. Rapid Communications in Mass Spectrometry 2008, 22, (9) Nagy, K.; Jakab, A.; Fekete, J.; Vékey, K. Analytical Chemistry 2004, 76, (10) Pettinella, C.; Lee, S. H.; Cipollone, F.; Blair, I. A. Journal of Chromatography B 2007, 850,

14 Workshop onsdag 11. November kl 1415 til 1600 i Biblioteket i Bioteknologibygningen ved UMB på Ås Ming Gu fra CernoBioSciemce og Jan Nordin står for en demostrasjon av Massworks med sine data og kanskje ved dine resultater. Ta med deg noen resultater fra din egen lab slik at vi kan få testet programmet på reelle prøver fra forskjellige laboratorier. Vi kommer tilbake med instruksjoner på type datafiler. MassWorks is an easy-to-use post acquisition software package that utilizes Cerno s patented MSIntegrity technology to achieve high mass accuracy and high spectral accuracy on conventional mass spectrometers of unit mass resolution. MassWorks sclips now also provides high spectral accuracy through exact lineshape calibration without the need for standards. MassWorks integrates the powerful MSIntegrity calibration technology to obtain up to 100X improvement in mass accuracy on unit resolution systems and up to 99.9% spectral accuracy on both high and unit resolution systems in a fast and versatile MS software application package. By combining novel calibration techniques with sound mathematical principles, Cerno methodologies can provide significant improvements to all types of MS data, both high and low resolution. High mass accuracy on quadrupole GC or LC/MS (up to 5ppm) Improved Spectral Accuracy on all systems (up to 99.9%) Effective noise filtering (up to 3X) 14

15 The annual meeting in the Danish Society for Mass Spectrometry January 21-22, 2010 in Svendborg This years meeting will be held in Svendborg as a two-day session covering a broad spectrum of MS topics including keynote lectures. Keynote speakers: Roman Zubarev, Karolinska Institute, Stockholm. John Fletcher, University of Manchester. Topics covered: 3D Imaging using TOF-SIMS, Proteomics, MetID on peptides and proteins, FAIMS, LCMS Analytical work, Bioanalysis, PTR-MS Language: The official languages of the meeting are Danish and English. The organizing committee encourage all speakers to deliver slides in English. Participation fees: The participation fee is DKK 2000 (students: DKK 1500). The fee includes participation in the meeting, accommodation at Hotel Svendborg, bus-transportation from Odense to Svendborg, 2x lunch and a 3 course dinner including wine ad libitum. Registration and payment: To register, go to dsms.dk. Registration and payment is not accepted later that November 4 th The fee will be refunded in full if written cancellation is received before November 20 th Cancellation received after this date is not refundable. Maximum number of participants is 130. Contact information: - about exhibition, please contact Lene Hoffmeyer (lene.hoffmeyer@leo-pharma.com) - about programme, please contact Steen Pontoppidan (sp@msvision.eu) - about registration and payment, please contact Malene Mohr (mmhr@novonordisk.com) Transportation: Bus-transportation from Odense to Svendborg and back is arranged. Networking while running Remember to bring your running shoes so you can participate in the running trip guided by a local trainer on Friday morning. Organizing Committee Helge Egsgaard, Risø DTU Carsten Heegaard, Lundbeck A/S Steen Pontoppidan, MSVision ApS Lene Hoffmeyer, LEO Pharma A/S Malene Mohr, Novo Nordisk A/S 15

16 Møter, konferanser, messer & seminarer 2009 Mass Spec Europe Conference and Exhibition , Barcelona, Spania Norske Symposium i Kromatografi , Sandefjord Confrence on Ion Chemistry and Mass Spectrometry , Lake Arrowhead, California rodgers.chem.wayne.edu/ionchem/ The annual meeting in the Danish Society for Mass Spectrometry , Svendborg, Danmark Det 14. Norske seminar i massespektrometri , Quality Hotel & Resort Hafjell e-post: Dag.Ekeberg@umb.no 59th ASMS Conference on Mass Spectrometry , Denver, Colorado th ASMS Conference on Mass Spectrometry , Vancouver, Canada The 19th International Mass Spectrometry Conference Kyoto, Japan Pitcon Conference & Expo , Orlando, Florida 58th ASMS Conference on Mass Spectrometry , Salt Lake City, Utah Hjernetrim Kan du tolke dette EIspekteret? Svar kommer i neste utgave av Massenytt. Løsning av hjernetrim fra forrige Massenytt var: Eddiksyre mercapto metylester Ingen riktige svar er kommet til redaksjonen. 16