Sammendrag BI2015. Innhold

Transkript

1 Sammendrag BI2015 Innhold 1 Forklaringer av konsepter Arabinoseoperonet Bariumsulfatassay Blue/White color screening Dialyse DNA fingerprinting Flytskjema for å genmodifisere bakterier Fusjonsprotein Gelelektroforese GFP Hardy-Weinberg Principle Isoelektrisk fokusering Kolonnekromatografi Ligering av DNA Miniprep Myrosinase-glukosinolatsystemet PCR Primer DNA polymerase Steder PCR er benyttet Plasmider Receptor-like kinases Reporter gene construct Restriksjonsenzymer SDS-PAGE Transformasjon Ulike typer DNA fragmenter Vektor Forklaring av enkeltbegreper 11

2 1 Forklaringer av konsepter 1.1 Arabinoseoperonet Arabinoseoperonet er et induserbart operon som stammer fra E. coli celler. Operonet består av enzymer som bryter ned arabinose og er under kontroll av promotoren pbad. arac koder for AraC som binder seg til P BAD og inhiberer transkripsjon. Hvis det er arabinose tilstede vil denne binde seg til AraC slik at konformasjonen til AraC endres. Dette gjør at RNA polymerase da kan binde seg og transkribere arabad. Dette er et eksempel på negativ genregulering. pglo plasmidet inneholder GFP under kontroll av arabinoseoperonet, dette gjør at GFP kun vil bli uttrykt når arabinose er tilstede. 1.2 Bariumsulfatassay Et av produktene i degrading av glukosinolater er sulfat. Ved å tilsett barium acetate til en prøve, som er lettløselig, kan man detektere tilstedeværelsen av sulfater. Barium vil reagere med SO 4 2 som er tungtløselig og vil felle ut som et hvit stoff. Tilstedeværelsen av sulfater vil indikere tilstedeværelse av myrosinase enzymer og glukosinolater. Sinigrin + Myrosinase glucose + SO 4 2 (aq) (1) Bariumacetate (aq) + SO 4 2 (aq) BaSO 4(s) (2) 1.3 Blue/White color screening Blå/hvit seleksjon blir brukt for å separere bakteriekolonier med insatt ikkerekombinante plasmider fra bakteriekolonier med insatt rekombinerte plasmider. lacz som koder for β-galactosidase er inkludert i kloneplasmidet. På begynnelsen av lacz genet er det inkludert en multiple cloning site (MCS) som koder for en rekke restriksjonenzymer. Det er her det klonede genet eventuelt blir insatt under ligering. Hvis det klonede genet blir insatt her vil dette ødelegge lacz genet, og du får ikke et funksjonelt β-galactosidase. Fungerende β-galactosidase vil splitte X-gal til et stoff som reagerer med oksygen og danner et indigo-farget stoff. En vellykket kloning av plasmidet kan derfor detekteres ved å tilsette X-gal. Alle bakteriekolonier som har fått insatt det ønskede genet vil ikke splitte X-gal og vil derfor være hvite. Blå kolonier vil ikke ha det ønskede genet innsatt. lacz genet er ekstraordinært stort, over 3000 bp, derfor vil en del av det blir plassert på genomet til bakterien. Kalles α-komplimentering fordi den lille biten som er på plasmidet kalles α-fragmentet. 1.4 Dialyse Dialyse er en separasjonsteknikk som separerer molekyler basert på størrelse. Vanligvis må størrelsesforskjellen være på 10- til >50-ganger. En løsning blir plassert i en dialyseslange og dialyseslangen blir lagt ned i en bufferløsning. Dialyseslangen er semipermeabel med porer på en viss størrelse. Kun molekyler som er mindre porene kan passere membranen. Hvis dialyseslangen blir plassert i en bufferløsning som er mye størren en volumet i dialyseslangen vil nesten alle de små molekylene diffundere ut. 1.5 DNA fingerprinting DNA fingerprinting er en metode for å skille ulike individer ved bruk av DNA. Restriksjonsenzymer eller PCR brukes til å amplifisere enkelte DNA-sekvenser som er svært variable i lengde fra person til person. Disse prøvene settes på en gel electroforese og det resulterende mønseret 2

3 HTL BI2015 November 19, 2014 vil være forskjellig fra individ til individ. De DNA-loci som testes er ofte svært variable segmenter, det vanligste er a benytte VNTRs. VNTRs er svært variable da de pga. overkrysning ofte kan variere fra generasjon til generasjon, og de transkriberes ikke sa de er ikke utsatt for konservering ved seleksjon. Ved bruk av flere DNA-segmenter vil sikkerheten pa analysen øke. 1.6 Flytskjema for a genmodifisere bakterier 1.7 Fusjonsprotein Et fusjonsprotein er et protein laget av en rekombinant DNA-sekvens som koder for minst to deler fra ulike proteiner. Et fusjonsprotein kan bli laget ved a legere DNA sekvensen for to proteiner som skal bli fusjonert og uttrykke denne sekvensen. Det resulterende mrnaet vil inneholde begge genene og proteinet som resulterer fra translasjonen vil besta av de to originale proteinene fusjonert sammen. Det er viktig a ta hensyn til at de to fusjonerte proteinene ma ivareta sin originale funksjon. F.eks. har mange proteiner en signalsekvens pa N-terminus eller C-terminus som er viktige i modifisering og lokalisering av proteinet etter translasjon. For a ivareta proteinets funksjon blir det ofte fusjonert rett etter promotor eller pa enden av genet. Men for a overkomme problemer med signalsekvens og lignende kan det ogsa fusjoneres i midten. 3

4 1.8 Gelelektroforese Gelelektroforese er en metode for å skille DNA molekyler basert på størrelse. Fosfatryggraden i DNA gir en negativ ladning til DNA molekyler. Fordi denne ladningen er jevnt fordelt i DNA molekylet vil DNA fragmentet bli mer negativt jo lengre det er. I en fri løsning vil alle DNA fragmenter bevege seg mot en positiv elektrode med lik hastighet. Hvis friksjon blir introdusert vil de små fragmentene bevege seg raskere enn de store. I gel elektroforese blir friksjon introdusert ved hjelp av en gel. Denne består vanligvis av agarose eller polyacrylamid. Størrelsen på porene i gelen bestemmer hvilken størrelse på fragmentene som gelen best kan skille fra hverandre. For å separere DNA fragmenter korrekt må de være lineære og under 30 kbp. Fragmenter over 30 kbp vil bli fanget på mange ulike måter og hindret fra å bevege seg. Sirkulære fragmenter med kun et brudd i fosfatryggraden vil være sirkulære, svært hindret fra å bevege seg i gelen og de vil derfor vandre kort. Sirkulære fragmenter uten brudd i fosfatryggraden vil ha en supercoilet struktur som gjør at de vandrer lengre enn lineære fragmenter på samme størrelse. Agarose er et lineært polysakkarid med alternerende enheter av galactose og 3,6-anhydrogalactose som er ekstrahert fra rødalger. Tørr agarose vil løse seg i vann som er nesten kokende. Hvis vann og agarose blir blandet med vann i en konsentrasjon på 1%-3%, kokt og satt til kjøling, vil polysakkaridet lage en blanding av porer med ulik størrelse. Høyere konsentrasjon vil gi smalere porestørrelse. Polyacrylamide gelelectrophorese (PAGE) bruker en gel av polyacrylamide. Prosenten av polyacrylamide kan variere fra 3 til 30 %. PAGE kan brukes til å separere DNA fragmenter ned til enkeltbaseparoppløsning. DNA fragmenter på over 1000 bp kan ikke gå inn i porene i gelen. 1.9 GFP Green fluorescent protein (GFP) er protein orginalt isolert fra maneten Aequorea victoria. Når GFP blir utsatt for UV-lys lyser den opp med en grønn farge, og denne fluorisensen kan bli studert i et mikroskp. Til forskjell fra andre reporter gener er GFP ikke et enzym og det trenger ikke et annet stoff som kofaktor for å fluorisere. Det at GFP i tillegg ikke er giftig gjør at det er et svært nyttig verktøy i molekylærbiologien. Det originale GFP fra A. victoria har 238 aminosyrer og en vekt på 27 kda. Proteinet er hydrofobt og har en struktur som består av elleve β-sheets som utgjør en β-barrel struktur. Beskyttet av denne β-barrelen er en α-helix og en chromophore laget av post-translational modifisering av -Ser65-Tyr66-Gly67- aminosyreresiduene til en imidazole ring. Den kromoforiske strukturen blir eksitert med UV-lys på 395 nm og gir ut grønt lys på 508 nm. Det finnes også modifiserte versjoner av GFP. EGFP (enhanced GFP) har sterkere fluorisens, EYFP og ECFP gir ut henholdsvis gult og cyan lys. Det har også blitt laget rødt og blått GFP. Humanisert GFP som har fått tilpasset en kodonsekvens til mennesker finnes også. Da GFP er ikke-enzymatisk er det ofte brukt som en del av et fusion protein. Her blir det f.eks. satt på enden av et av proteinene i cytoskjellettet, som tubulin eller actin, slik at cytoskjelettet i cellen lyser opp. Et problem med GFP som fusjonsprotein er at det ofte virker i dimers eller tetramers. Bruk av GFP i fusjonsprotein på proteiner som vanligvis ikke aggregerer i cellen kan derfor få dem til å begynne å aggregerere. Et annet problem er at GFP proteinet kan bli satt inn i viktige signalsekvenser på enden av molekylet, men dette er et problem som gjelder for alle fusjonsproteiner Hardy-Weinberg Principle Frekvensen til et allel som ikke utvikler seg kan bli beskrevet med Hardy-Weinberg prinsippet. Prinsippet sier at om det kun er mendeliansk genetikk og det ikke skjer noen evolusjon vil 4

5 frekvensen av alleler og genotyper i en populasjon være konstant fra generasjon til generasjon. For en fenotyp som blir bestemt av kun to ulike alleler (R og r), og følger Hardy-Weinberg equilibrium, er frekvensen til genotypene i populasjonen beskrevet med følgende likning: p 2 + 2pg + q 2 = 1 p 2 = frekvensen av homozygoter for R (RR), 2pg=frekvensen for heterozygoter (Rr) og q 2 = frekvensen av homozygoter for r (rr). Da det kun er to mulige typer alleler i denne modellen, og frekvensen av alleler må være 1, kan frekvens av det ene allele uttrykkes med den andre: p = 1 q og q = 1 p Isoelektrisk fokusering Isoelekrisk fokusering er gel elektroforese hvor proteiner blir separert på ladning i stedet for størrelse (som er det vanligste). En polyacrylamide gel blir satt opp med en ph-gradient. Ettersom proteinene beveger seg mot den negative polen øker phen. Den økende phen gjør at proteinene gradvis mister sin positive ladning fordi de gir fra seg protoner. Når netto ladning på proteinet er null vil de ikke lenger bevege seg i det elektriske feltet, og de stopper opp. Proteinet har netto ladning på sitt isoelekriske punkt (pi). Fordi ulike protiener har ulik pi vil ulike bånd på gelen representere ulike proteiner. I isoelektrisk fokusering beholder proteiner sin 3D-struktur. Tilstedeværelsen av protein kan derfor bli testet ved å teste aktiviteten til proteinet. Hvis f.eks. et enzym blir isolert kan det detekteres ved å tilsette et enzymspesifikt substrat og sjekke for tilstedeværelsen av produkt. Isoelektrisk fokusering kan også brukes for å ekstrahere funksjonelle proteiner til seinere bruk Kolonnekromatografi Den kraftigste metoden for å isolere proteiner er kolonnekromatografi. Kolonnekromatografi bruker en mobil fase og en stasjonær fase. Den stasjonære fasen består av et porøst materiale med passende kjemiske egenskaper for å forsinke et spesifikt protein, eller en gruppe proteiner, i forhold til alle de andre proteinene. Den mobile fasen er en bufferløsning som vandrer gjennom kolonnen. I affinitetskromatografi har kollonnemateriale en høyere affinitet for target proteinet enn andre proteiner. Spesifikke proteiner kan derfor binde seg til kolonnen, men alle de andre materialene flyter igjennom. De bundete proteinene blir eluert fra kolonnen ved å endre egenskapene til bufferen. Bindingen til kolonnen kan f.eks. skyldes at kolonnemateriale har antistoffer for proteinet som skal isoleres, at kolonnemateriale har substrater proteinet binder seg til eller andre liknende egenskaper. Hydrofobic interaction chromatography (HIC) er en type affinitetskromatografi. Her binder de hydrofobe stoffene seg bedre til kolonnen enn hydrofile stoffer. De hydrofile proteinene blir eluert med en saltløsning. Genmodifisering av proteinet kan bli kombinert med affinitetskromatografi for å isolere spesifikke protiener. Her blir en en spesifikk aminosyre sekvens, kalt en tag, lagt til enden av proteinet. Tagen bør ha høy affinitet for enkelte molekyler som andre stoffer ikke har. Et eksempel er His-tagen som består av seks histidine residues. Tagen blir lagt til en del av protienet som ikke påvirker proteinfunksjonen, vanligvis nær C- eller N-terminus. Histidine binder nonkovalent og med høy affinitet til visse metallioner som f.eks. Ni 2+ og proteinene kan elueres med imidazole eller histidine. Andre tags består f.eks. av en spesifikk aminosyresekvens som blir gjenkjent av et antistoff. Det finnes også kolonnekromatografi som isolerer proteiner på størrelse. Her består den stasjonære fasen av kuler med små hull i. Små proteiner vil vandre igjennom hullene, mens de store vil vandre rett forbi. Fordi de små kulene dermed vil vandre lengre enn de store vil større proteiner komme ut først. 5

6 Det finnes også kolonnekromatografi på ph. Men kan da ikke skrive om alle. Oppløsningen på kromatografien kan økes ved å øke trykket. Dette motvirker diffusjonen og gjør at man kan bruke en lengre kolonne og dermed får bedre oppløsning. Under hele kolonnekromatografiprosessen kan mengden protein detekteres ved å måle absorbasjonen av UV-lys da proteiner absorberer UV-lys ved 280 nm. (DNA absorberer ved 260) Ligering av DNA DNA ligase kan lage en binding mellom en fri hydroxylgruppe på 3 enden på en DNA-tråd og en fosfatgruppe på 5 enden av en annen DNA-tråd. Denne reaksjonen krever energi, og kommer fra NAD + i bakterier og ATP i dyr. DNA ligase kan bare sette sammen DNA som er en del av en dobbelhelix, ikke mellom ssdna. Rollen til DNA ligase i organismene er først og fremst å sette sammen brudd i DNA tråden i dsdna etter replikering. Temperaturoptimum for å ligere brutt DNA er 37 C, men ved denne temperaturen er stickyends mellom restriksjonskuttet DNA ustabilt. Optimumstemperaturen er derfor et kompromiss mellom optimumstemperaturen for enzymet og optimumstemperaturen for assosiering mellom DNA fragmentene. Temperaturen for dette er vanligvis mellom 4 og 20 C. Blunt end ligering kan kun skje ved svært høye konsentrasjoner av DNA og DNA ligase fra bakteriofagen T4 vil legere slikt DNA Miniprep En alkalisk ph mellom 12,0 og 12,5 denaturerer linært DNA men ikke lukket sirkulært DNA. Det bakterielle kromosomet er også sirkulært, men i prosessen blir dette store sirkulære molekylet omgjørt til lineære fragmenter. Plasmider blir ikke denaturert og kan derfor ekstraheres. Standarprosedyren for slik plasmid-isolering kalles mini-prep og er som følger: 1. Lysatet fra bakteriecellene blir lysert og tilsatt i en alkalisk løsning av natriumhydroksid og sodium dodecyl sulfate (SDS). SDS denaturerer proteinenene og ødelegger cellemembranen. Kromosomalt DNA blir denaturert og plasmid DNA blir i løsningen. 2. Syrlig potassium acetate blir brukt for å nøytralisere løsningen. Kromosomalt DNA renaturerer, men danner et uløselig nettverk som kan bli ekstrahert. Proteiner og store RNA molekyler utfeller pga. høye konsentrasjoner av potassium acetate. 3. Sentrifugering fjerner de uløselige stoffene. 4. Plasmid DNA i løsningen blir bundet til en silica eller positivt ladet ioneutvekslings matrix. Andre forurensinger vil ikke binde seg til matriksen og blir vasket vekk. 5. Plasmid DNA blir eluert fra matrixen med en buffer med lav salkonsentrasjon eller vann Myrosinase-glukosinolatsystemet Alle planter i Brassicaceae familien inneholder en spesiell type sekundærmetabolitt kalt glukosinolater. Når glukosinolater kommer i kontakt med enzymet myrosinase splittes glukosinolatene til et reaktivt stoff som isothiocyanate, D-glukose og sulfat, se figur 1. Ulike typer glukosinolater og ulike forhold for reaksjonen gir ulike reaktive stoffer. De ulike reaktive stoffene beskytter planten mot mikroorganismer og insekter. Når de reaktive stoffene blir spist av dyr eller mennesker kan de gi leverskade og problemer med jodoptak i thyroid. De gir også den skarpe smaken av planter i Brassicaceae familien. For å sikre at myrosinase-glukosinolatsystemet kun blir aktivert når det trengs, uttrykker ulike celler myrosinase og glukosinolater. Når disse cellene blir ødelagt vil substratet og enzymet komme i kontakt med hverandre og isothiocyanater og andre reaktive stoffer blir produsert. 6

7 Figur 1: Strukturformler for den generelle reaksjonen katalysert av myrosinaseenzymet PCR Polymerase Chain Reaction (PCR) er en metode for å amplifisere en målsekvens in vitro fra et templat DNA fra noen få molekyler til mange millioner kopier. Metoden krever kun følgende komponenter: DNA template med målesekvens, to primere, DNA polymerase (og kofaktorer som Mg 2+ ), nucleotide triphosphates og en PCR-maskin kalt en thermocycler. PCR er en syklisk reaksjon med 3 trinn med ulike temperaturer som blir repetert til du har en stor nok mengde target DNA. Temperaturen blir kontrollert av thermocycleren. Første trinn er å varme opp DNA til 90 C i et minutt eller to slik at dsdna separerer. Andre trinn er å senke temperaturen til C (annhealing temperatur) slik at primeren kan binde seg til målsekvensen. Tredje trinn er å øke temperaturen igjen til rundt 70 grader som er temperaturoptimum for DNA polymerase slik at DNA kan blir amplifisert så effektivt som mulig. Denne prosessen bli repetert til du har en stor nok mengde målsekvens DNA Primer DNA polymerase kan kun legge til nukleotider til 3 enden av en allerede eksisterende nukleotidtråd. Det trengs derfor en primer for en fungerende PCR reaksjon. En PCR primer er en oligonucleotide typisk bp lang som har en komplimentærsekvens til begynnelsen av målsekvensen. Under det andre trinnet i PCR blir temperaturen senket til annealing temperatur. Dette er optimaltemperaturen for at primeren skal binde seg til målsekvensen. For en PCR reaksjons å trengs det to primere. En av primerne bestemmer begynnelsen av target sekvensen, den andre bestemmer enden. En av konsekvensene av dette er at målsekvensen kun finnes som en egen enhet i den tredje syklusen av PCR-reaksjonen. En lengre primer vil gi en mindre fraksjon av annealed primers i annealing trinnet. PCR reaksjonen er en eksponentiell amplifisering så selv en liten ineffektivitet vil amplifisere til en signifikant minkning i amplifisert produkt. Annealing temperatur til PCR må være nær smeltetemperauren (T m ) til primer-dnahybridet for god primer spesifisitet. Den beste annealing temperaturen er et par grader under T m. Annealing temperatur blir blant annet bestemt av lengden på primeren og innholdet av baser. Ulike baser i DNA binder seg med ulike mengder hydrogenbindinger, A:T binder med to og G:C binder med tre. G:C er derfor en sterkere binding enn A:T. T m kan regnes ut med formelen 2(AC) + 4(GC). Det beste forholdet er 50 % GC. Den siste nukleotiden på primeren er også viktig i PCR reaksjonen fordi DNA polymerase legger til nye nukleotider på 3 enden. Det er derfor viktig at minst de 5-6 siste nukleotidene matcher perfekt med målsekvensen. Primeren må også ikke være palindromic og de to primerne må ikke være komplementære. For å designe en primer må starten og slutten av DNA sekvensen være kjent. For å finne denne sekvensen kan DNAet først sekvenseres, man kan bruke informasjon om genet fra liknende arter eller man kan dedusere en mulig aminosyresekvens fra aminosyresekvensen i proteinet. DNAet kan også bli gjort om til en sirkulær form, slik at du kun trenger å vite startsekvensen. 7

8 DNA polymerase Et krav for DNA polymerasen som benyttes i PCR er at den må tåle de røffe forholdene. En særlig stor utfordring er å overleve den høye temperaturen som kreves for å denaturere DNA. Løsningen på dette var å ekstrahere en DNA polymerase fra en termofil bakterie. DNA polymerase fra Thermus aquaticus, kalt Taq polymerase, tåler temperaturer helt opp til 95 C, og har en optimumstemperatur på 74 C. Enzymet har en 5-3 polymerase aktivitet og 5-3 exonuclease aktivitet, men den mangler 3-5 exonuclease aktivitet. Taq polymerase gir altså en del feil. Taq polymerase legger ofte også til en nukleotid, som oftest adenosine, på 3 enden av den nye DNA-tråden. Selv om Taq polymerase er mest brukt finnes det også mange andre termostabile polymeraser. F.eks. Pfu polymerase fra pyrococcus furiosis har også 3-5 proffreading activity. Dessverre er denne mye treigere enn Taq polymerase Steder PCR er benyttet Eksempler på steder hvor PCR er til nytte: molekylær kloning, DNA sekvensering, arkeologi, kriminalsaker, amplifisering av ukjente sekvenser, klinisk patologi, genetisk diagnose, karrakterisering av ukjente mutasjoner, DNA fingerprinting og genomanalyse Plasmider Plasmider er ekstra-kromosomale DNA fragmenter som er stabile fra en generasjon til en annen i sin ekstra-kromosomale tilstand. Finnes i størrelse fra 1500 bp til 300 kbp. De fleste plasmider finnes i lukkede sirkulære dsdna. Plasmidene vil også som oftest gi bakterien en fenotype, f.eks. resistanse mot et tungmetall eller antibiotika. Plasmider kan ikke replikere utenfor en organisme. 50 % av alle bakterier inneholder minst et plasmid. Størrelsen og antallet plasmider i en celler varierer. Antallet kopier av et plasmid i en celle blir kalt copy number. Størrelsen av plasmider i Escherichia coli varierer fra 1 % til 10 % av kromosomet. Hvis plasmidet ikke gir cellen noen fordeler vil cellen raskt degradere eller miste plasmidet. Noen store plasmider har derfor funksjoner som dreper bakterien hvis plasmidet blir tapt. En annen taktikk er å ha et gen som gir bakterien en fordel, f.eks. resistanse mot antibiotika Receptor-like kinases Plante reseptor-like kinases (RLKs) er transmembrale proteiner med et ekstracellulær aminoterminal domene og et karboksylterminal intracellulært kinase domene. RLKs likner svært mye på dyrs receptor tyrosine kinases. RLKs er involvert i en rekke prosesser i planter inkludert sykdomsresistens, self-versus-nonself recognition, hormongjenkjenning og utvikling Reporter gene construct Et reporter gene construct kan bli brukt for å undersøke hvor i en multicellulær organisme et spesifikt gen er uttrykt. Et eksempel er β-glukuronidase (GUS) reporter system, se figur 2. I GUS reporter system vil promotoren for det studerte genet bli plassert foran DNA sekvensen for β- glukuronidase, og den resulterende gensekvensen blir klonet inn i planten. Der hvor promotoren blir uttrykt i organismen vil også GUS enzymet bli produsert. GUS bryter ned X-glucose til et blått uløselig stoff. Tilstedeværelsen av dette blå stoffet kan dermed bli undersøkt og den blå fargen vil representere uttrykk av promotoren som blir studert. En av de mange fordelene med GUS-reporter construct er at det ikke påvirker veksten til planten som studeres. Hvis man f.eks. i stedet hadde brukt en gene-knocout metode for å studere genet ville organismen ha dødd hvis genet man studerer haddde vært nødvendig for organismen. 8

9 Figur 2: The GUS reporter system. P X = testet promotor. GUS = DNA sekvensen for enzymet β-glukuronidase Restriksjonsenzymer Restriksjonsenzymer er bakterielle enzymer som kutter fosfatryggraden til begge DNA trådene ved en spesifikk DNA sekvens. Disse spesifikke DNA sekvensene er 4-8 nukleotider lange og blir kalt restriksjonsseter. Restriksjonsenzymer utviklet seg antakeligvis som et forsvarssystem mot fremmed DNA. Alle restriksjonssetene som er native i bakterielt DNA blir merket med en metylgruppe av et modifiseringsenzym. På denne måten blir ikke bakterielt DNA degradert av restriksjonsenzymet. Hvis virus DNA, eller annet fremmed DNA, med et restriksjonssete, går inn i cellen, vil et restriksjonsenzym kutte DNAet og det vil bli ødelagt. De fleste restrikssjonssetene er inverterte repitisjoner, det betyr at top strand sekvensen er lik som bottom strand sekvensen. Fordi restriksjonsenzymene kutter DNA på spesifikke steder er de svært nyttige verktøy i molekylærbiologi. Kutting på spesifikke steder kan brukes til å sette inn gener i plasmider, gjenkjenne ulike fenotyper (RFLP) eller andre ting. Restriksjonsenzymer kan enten kutte DNA tråden på det samme stedet på begge trådene (blunt end), eller med et lite overheng (sticky end). Hvis to DNA fragmenter skal ligeres sammen vil det være mye lettere å bruke sticky ends som har overlapp. De to fragmentene vil da binde seg til hverandre i en hvis grad og gjøre jobben lettere for DNA ligase SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) er en versjon av gel elektroforese som brukes for å separere proteiner på størrelsen. Sodium dodecyl sulfate er basisk stoff med en negativ ladning og et protein vil binde omtrent 1,4 gagner sin molekylære vekt av SDS. Bundet SDS denaturerer proteinets 3D struktur, men for å sørge for komplett denaturering av proteinet vil også små sulfhydryl reagenter, som fjerner disulfidbroene i proteiner, bli tilsatt. Bundet SDS gir en stor negativt ladning som skjuler den originale ladningen til proteinet. Mengden SDS bundet til proteinet er også proporsjonal med lengden til proteinet. Vanlig gel electrophorese med en polyacrylamid gel blir deretter utført. Fordi alt proteinet har en omtrent lik ladning og form vil SDS-PAGE separere proteinene nesten eksklusivt på størrelse Transformasjon Transformation er overføring av DNA uten andre biologiske makromolekyler fra ekstern medium til inn i en bakterie. DNAet kan bli inkorporert i bakterien. Ingen celle til celle kontakt eller virus trengs til forskjell fra henholdsvis konjugering eller transduksjon. I praksis er transformasjon først og fremst en laboratorieteknikk, det skjer sjeldent i naturen. Noen bakterier, kalt kompetente bakterier, tar opp DNA uten forhåndsbehandlign. Andre krever kjemisk behandling for å ta opp DNA via transformasjon. 9

10 En metode er heat-shock treatment, vanligvis brukt på E.coli. Bakterien blir avkjøl sammen med metallioner, spesielt med høy konsentrasjon av Ca 2+. Bakterien blir deretter varmet opp i en kort periode. Denne prosessen skader celleveggen og DNAet kan gå inn i cellen. En annen metode er electroshock treatment, vanligvis brukt på gjærceller. Her blir organismen eksponert for en høy-volts spenning over kort tid i en electroporator. Dette åpner celleveggen og gjør at DNA kan gå inn i cellen Ulike typer DNA fragmenter SINEs Short interspersed elements er korte sekvenser funnet i flere kopier som utgjør en stor del av høyt eller middels repetert DNA i pattedyr. De fleste av disse sekvensene har ingen funksjon så vidt vi vet. Den best kjente SINE er Alu element. Alu element Alu element er en SINE og et transposon i primaters DNA som ikke blir transkribert og er repetert i høy grad på tilfeldige steder i genomet. Alu elementet er på ca. 300 bp og utgjør 6-8 % av genomet. Disse binder seg til RNA polymerase II og undertrykker genuttrykk. LINEs Long interspersed elements er lange sekvenser funnet i mange kopier som utgjør mesteparten av moderat repetert (hundrevis til tusenvis av kopier) DNA i pattedyr. Kommer antakeligvis fra retrovirusliknende forfedre. Den vanligste i det mammalske genom er L1 som består av 7000 bp og to kodende sekvenser. Satellitt DNA Satellitt DNA er svært repetert DNA i eukaryoter som blir funnet som clustere av tandem repeats og er permanent coilet i heterochromatin. Mengden varierer svært fra organisme til organisme, mus har 8 %, Drosophilia har nesten 50%. En stor del av satellite DNA er å finne rundt centromere i mennesker (kalt alpha DNA) og har derfor antakeligvis en strukturell funksjon. VNTRS Variable number of tandem repeats består av korte DNA sekvenser som er repetert i et ulikt antall, men antall kopier er mye mindre enn for satellitt DNA. Repetisjoner på rundt 25 bp blir kalt minisattelitter, og på mindre enn 13 blir kalt microsattelitter. En av de vanligste minisattelittene blir funnet i telomerer. VNTRs blir ikke uttrykt. De er fordelt rundt om kring i det menneskelige genom. Fordi VNTRs er repeterte sekvenser vil overkrysning ofte føre til ulik distribusjon i lengde av VNTRene Vektor En vektor er en DNA sekvens som replikerer som en egen enhet og kan bli brukt for å frakte DNA fragmenter. De fleste vektorer er enten basert på plasmider eller bakteriofag lambda (λ). En vektor som ofte blir brukt for å klone gener blir kalt for en cloning vector, mens en vektor som blir i hovedsak brukt for å uttrykke gener kalles en expression vector. For å være nyttige vektorer må en vektor kunne selvreplikere og ha en karrakteristikk som gjør at vi kan kjenne igjen transformerte celler fra utransformerte celler. I tillegg har de fleste vektorer minst et restriksjonssete slik at DNA fragmenter relativt lett kan bli klonet inn i vektoren. Fem egenskaper en ekspresjonsvektor bør inneholde: 1. orit. Vektoren må ha et startsted for replikering slik at den kan replikere. 10

11 2. Antibiotikaresistensgen, slik som bla som koder for β-lactamase som gir ampicillinresistanse. Dette er nødvendig for å skille transformerte celler fra ikke transformerte celler. 3. Promotor. Plasmidet må ha en ledig promotor som kan brukes for å uttrykke genet du skal uttrykke. Det er ekstra nyttig om denne er inducible slik at du kan kontrollere når genet blir uttrykt. 4. Multiple cloning site (MCP). Ved siden av promotoren må cellen ha et restriksjonskuttesete som kan brukes for å sette inn ditt gen etter promotoren. Det er ekstra nyttig om det er mulighet for å bruke flere ulike restriksjonsenzymer, insetting av en MCP tillater dette. 5. I tillegg må ekspresjonsvektoren ha genet du ønsker å replikere, slik at du faktisk får et produkt. (Jeg er litt usikker på dette punktet, men dette er det beste jeg kom fram til.) 2 Forklaring av enkeltbegreper Agrobacterium tumefaciens er en jordbakterie som gir crown gall disease ved å sette inn deler av sitt DNA (fra et plasmid kalt T-DNA) inn i en plante. Mye brukt til genetisk modifisering av planter. Divalente kofaktorer trengs for de fleste DNA-enzymer, dette inkluderer f.eks. Mg 2+. Etidium bromide (EtBr) er et mye brukt fluoriserende stoff for å detektere DNA molekyler, når det blir utsatt for UV-lys fluoriserer det med en oransje farge. Fluorisensen øker med det 20-dobbelte når det binder seg til DNA. Legger seg i gropene i DNA-heliksen. Svært kreftfremkallende. Electroporation er en metode for å indusere transformasjon i celler, vanligvis gjærceller. Cellene blir utsatt for et høy-volts elektrisk støt i kort tid og dette skader celleveggen nok til at DNA kan bli tatt opp av cellen. Heat-shock er en metode for å indusere transformasjon i celler. Bakterier blir først behandlet med divalente ioner og kjølt ned. Deretter blir bakterien i kort tid varmet opp. Denne prosessen fremmer transformasjon. Hot-start -PCR. Taq polymerase har 5-3 eksonucleaseaktivitet. Da PCR-reagentene ofte blir satt sammen på is vil oppvarming av løsningen til denatureringstemperatur av DNA på et punkt nå optimumstemperaturen til Taq polymerase. Ved denne temperaturen vil Taq polymerase begynne å degradere primere før PCR-reaksjonen har satt i gang med sin 5-3 eksonucleaseaktivitet. For å forhindre dette kan man tilsette Taq-polymerase først når blandingen er varmet opp eller man kan tilsette et antistoffer eller andre proteiner som gjør at Taq-polymerase sin aktivitet blir inhibert ved lavere temperaturer. Isoenzym er enzymer som har ulik aminosyresekvens men som katalyserer den samme reaksjonen. Disse enzymene har ofte ulike kinetiske parametre og/eller ulik regulering. Kompetente celler er celler som kan ta opp DNA via transformasjon uten å bli behandlet først. Mismatching primers er en primer som kun er delvis komplimentær til målsekvensen. 11

12 Negativ kontroll er regulering av gener når tilstedeværelsen av et spesifikt stoff hindrer genuttrykk av et eller flere gener. Periplasma er mellomrommet mellom den cytoplasmiske membranen og den ytre membranen i gram-negative bakterier. Positiv kontroll er regulering av gener når tilstedeværelsen av et spesifikt stoff fremmer genuttrykk av et eller flere gener. PV92 er en locus på kromosom 16 hvor det i mange individer har skjedd en insersjon av Alu elementet i det menneskelige genom. Rekombinant protein er et protein translert av recombinant DNA. Recombinant DNA er DNA som stammer fra flere ulike kilder satt sammen i en DNA-tråd. Sekundærmetabolitt er organiske stoffer produsert av en organisme som vanligvis ikke er inkludert i normal vekst, utvikling eller reproduksjon. Et eksempel er glukosinolater. Seleksjonsmarkør er en egenskap, ofte bestemt av et enkelt gen, som gjør det mulig å skille en organisme med denne egenskapen fra en organisme som ikke har den egenskapen. Et eksempel på en seleksjonsmarkør er antibiotikaresistens. T4 DNA ligase er en DNA ligase fra bacteriophag T4, og er den mest brukte DNA ligasen i laboratorier. Denne kan ligere dsdna, DNA-RNA-hybrider og ligerer blunt ends DNA mye mer effektivt enn DNA ligase fra E. coli. Virulensgener er gener som gjør at en organisme er patogen. Et eksempel er at de fleste stammene av E. coli er ufarlige, men enkelte stammer har virulensgener som gjør dem patogene, f.eks. gjelder dette EPEC (enteropatogenic E. coli). 12