Resultatrapport: A genomic solution to reduce clinical mastitis in Norwegian Red cattle (NRF-prosjekt )

Transkript

1 Resultatrapport: A genomic solution to reduce clinical mastitis in Norwegian Red cattle (NRF-prosjekt ) Norsk tittel: Reduksjon av mastitt i norske melkekyr ved hjelp av moderne genomanalyse Prosjektleder: Sigbjørn Lien, Institutt for husdyr- og akvakulturvitenskap (IHA), Norges miljø- og biovitenskapelige universitet (NMBU). Norsk sammendrag: Mastitt er den mest vanlige storfesykdommen i verden. Sykdommen fører til store økonomiske kostnader for melkeprodusenter og innebærer negative konsekvenser for velferden til dyrene. Et omfattende nasjonalt helsekortsystem har gjort det mulig å gjennomføre systematisk avl for redusert mastitt i Norge. Dette har resultert i bedret resistens og mindre bruk av antibiotika for å behandle sykdommen. Tradisjonell avl har derimot sine klare begrensinger og utvikling av nye og mer effektive metoder for å redusere frekvensen av mastitt er sterkt etterspurt nasjonalt og internasjonalt. I dette prosjektet ønsker vi å bruke nye og innovative metoder innen funksjonell genomanalyse (ny sekvenseringsteknologi i kombinasjon med storskala genotyping- og genekspresjonsanalyser) for å identifisere gener og synteseveier involvert i resistens og utvikling av klinisk mastitt hos storfe. Prosjekter vil i vesentlig grad bidra til en forbedring av den genetiske kunnskapsbasen knyttet til sykdommen, samt danne grunnlaget for implementering i praktisk avlsarbeid for å redusere frekvensen av klinisk mastitt i den norske kupopulasjonen. Hovedformål: Hovedformålet med prosjektet har vært å utnytte det unike biobankmaterialet i Norge, sammen med storskala funksjonell genomanalyse, for å identifisere kausal DNA variasjon, gener og synteseveier som påvirker forekomsten av klinisk mastitt hos storfe. Dette for å bedre dyrehelse og velferd til norske kyr samt redusere bruken av antibiotika i norsk husdyrhold. Delmål: a. Identifisere et stort antall polymorfier (Single Nucleotide Polymorphisms - SNPs) i kromosomregioner hvor man tidligere har påvist at det finnes genetisk variasjon (quantitative trait loci - QTLs) som påvirker frekvensen av klinisk mastitt i Norsk Rødt Fe (NRF) ved bruk av ny DNA-sekvenseringsteknologi b. Identifiser mulig kausale SNPer in silico samt konstruere et tett SNP-kart i utvalgte QTL regioner c. Bestemme haplotype strukturer i utvalgte QTL regioner, undersøke effekten av distinkte haplotyper på forekomsten av klinisk mastitt samt identifisere storfe med ulike QTL alleler d. Konstruere en Illumina ekspresjonsmatrise (DASL) som inneholder et sett av utvalgte gener (gener under QTL topper og andre immunrelaterte gener), og bruke denne mikrobrikken til å studere genekspresjon i dyr med ulike QTL alleler

2 e. Undersøke ekspresjon og funksjon av gener involvert i førstelinje forsvar mot mastittpatogener i immunceller fra okser med ekstreme avlsverdier for egenskapen f. Identifisere kausal DNA variasjon som påvirker klinisk mastitt ved å integrere informasjon om fenotyper, haplotyper og ekspresjonsprofiler Populærvitenskapelig framstilling av resultater: Bakgrunn: Norge var det første landet i verden som etablerte et nasjonalt helsekortsystem på storfe for mer enn 30 år siden. Siden da har man har samlet inn, systematisert og lagret unik informasjon på individnivå for helse, reproduksjon, kjøtt- og melkeproduksjon. Omfanget og kvaliteten på disse registreringene, kombinert med detaljert slektskapsoversikt i populasjonen, samt tilgang på biologisk materiale (sæd/blod), gjør at Norge i dag har en av verdens mest attraktive biobankene for funksjonell genomforskning på storfe. Vi har tidligere brukt data fra denne biobanken til å identifisere områder i genomet (Quantitative Trait Loci QTLs) som påvirker melkeproduksjon, fruktbarhet og forekomst av jurbetennelse (mastitt). Hovedformålet med dette prosjektet har vært å fokusere på de mest lovende QTL-områdene for mastitt på kromosom 6 (BTA6) og kromosom 20 (BTA20) for om mulig å identifisere kausal DNA variasjon, gener og synteseveier som er ansvarlig for forskjellene i forekomsten av klinisk mastitt. Resultater: Innledningsvis i prosjektet (delmålene a., b. og c.) gjennomførte vi et helgenomscan (genomewide association study - GWAS) for å finne områder i genomet som påvirker forekomsten av klinisk mastitt i norske kyr. Analysene ble gjort i flere etapper der siste analyse inkluderte mer enn 3300 NRF-okser som var avkomsgransket for egenskapen. Oksene ble genotypet og imputert til et samlet datasett med >500,000 genetiske markører (SNPer). En påfølgende statistisk analyse som koblet SNPene med mastittregistringer gjorde det mulig å snevre inn QTL-områdene på BTA6 og BTA20 i betydelig grad og gjorde det mulig å identifisere sannsynlige kandidatgener som påvirket egenskapen. For BTA6 ble den mest signifikante sammenhengen til mastitt funnet for en SNP på rundt 88,744 Mb, ca basepar oppstrøms for et gen med navn group-specific component (GC). GC produserer et protein som har en rekke funksjoner som kan knyttes opp mot immunforsvaret. Blant annet transporterer det vitamin D til steder som er infisert av bakterier, hvor vitamin D så inngår i immunresponsen. GC-proteinet er også antatt å virke som en makrofag-aktiverende faktor, samt en del andre immunrelaterte funksjoner. Genet er altså en svært relevant funksjonell kandidat, samtidig som det er veldig få andre kandidatgener i nærheten av den mest signifikante markøren. Ingen av de genene man på forhånd hadde sett på som naturlige kandidater gav tilnærmet like gode resultater, noe som fikk oss til å konsentrere videre innsats til mer inngående studier av GC. Parallelt med genomscannet gjorde vi også en helgenomsekvensering av 21 sentrale NRFeliteokser for å avdekke mulig kausal DNA-variasjon som ikke tidligere er blitt rapportert. De mest interessante SNPene (i hovedsak SNPer i kodende og regulatoriske områder, men også en del SNPer i introns) ble genotypet og analysert for forbindelser til mastitt. Denne gangen var det en SNP i intron 1 av GC som kom ut med best resultater. Teststatistikken vi bruker

3 (LRT) krever verdier på over for å si at resultatene er signifikante. For den aktuelle SNPen i intron 1 var LRT-verdien 86. Dette er en langt høyere verdi enn vi noen gang har fått med tilsvarende analyser, uavhengig av egenskap. Nesten like høye verdier ble funnet for noen SNPer rett oppstrøms for genet. Tross omfattende bioinformatiske analyser klarte vi ikke å knytte noen direkte funksjonell endring knyttet til noen av SNPene. Ingen av dem så ut til å påvirke genutrykk, proteinsekvens eller mengde produsert protein. Vi satte derfor i gang et systematisk søk etter større strukturelle variasjoner som kan forklare forskjellen i mastittforekomst. Dette ble gjort ved å sortere de resekvenserte oksene i tre grupper avhengig av genotype for den mest signifikante SNPen i intron 1 (AA, AG eller GG). A-allelet for denne markøren er assosiert med markant høyere mastittforekomst enn G-allelet. Analysene av strukturell variasjon avdekket at dyr med A-allelet har en større duplikasjon på ca basepar rett etter genet. Dyr homozygote for G-allelet har ikke denne ekstra kopien. Hvilken sammenheng denne duplikasjonen har med funksjonen til GC og mastitt har vært hovedfokus i siste fase av prosjektet. Det ble samlet inn mer enn 100 leverprøver fra slakteri og isolert RNA for genekspresjonsanalyser. Prøvene ble også genotypet, noe som gjør det mulig å studere genuttrykk i grupper av dyr med ulike genotyper for SNPen i intron 1 av GC (AA eller GG). Opprinnelig var planen å gjøre dette med DASL teknologi fra Illumina (delmål d.), men grunnet nyvinninger innen ny sekvenseringsteknologi har vi endret dette til RNAseq. Denne teknologien gir i tillegg til en nøyaktig kvantifisering av genuttrykk, en kartlegging av ulike mrna-varianter som utrykkes. Analysene så langt viser at det finnes ulike mrnavarianter av GC-genet og hovedhypotesen nå er at duplikasjonen vi har funnet i NRF kan være bestemmende for hvilke mrna som produseres. Det er velkjent at alternative mrnavarianter kan endre stabiliteten til mrnaet som i neste omgang kan påvirke mengden protein, dette er derfor en sannsynlig funksjonell forklaring. En annen mulighet er at man får forskjeller i proteinsekvens som endrer funksjonen til proteinet. Når det gjelder GC-genet har vi funnet ut at det er et alternativt siste exon som ligger inne i selve duplikasjonen. Vi har også funnet et sete for et såkalt micro-rna inne i det dupliserte området. Micro-RNA kan redusere mengden protein som dannes på ulike måter, og det kan tenkes at å ha dobbelt opp av dette setet reduserer mengden protein i for stor grad sammenlignet med de dyrene som bare har ett slikt sete. Videre analyser har vist at SNP-allelene i GC genet som er assosiert til mer mastitt er også koblet til økt melkemengde. Disse sammenhengene er ikke absolutte noen som tilsier at det kan være mulig å finne haplotyper som kan brukes seleksjon til å gi en ønsket framgang for begge egenskaper. Denne problemstillingen krever mer inngående analyser for vi kan trekke en endelig konklusjon. For BTA20 ble det påvist QTLer for både mastitt og melkeproduksjonsegenskaper i et område fra Mb. Sammenliknet med BTA6 er dette et mye bredere område hvor de mest signifikante SNPene for klinisk mastitt, melkemengde og mengde melkeprotein var lokalisert til posisjonene 33.8, 37.5 og 36.2 Mb. Ikke uventet viser resultatene at det finnes en koblet effekt av de tre QTLene og på ulike egenskaper. I likhet med resultatene på BTA6 er som oftest et SNP-allel koblet til mindre mastitt også er koblet til høyere melkemengde i melka. Sammenhengen (korrelasjonen) er derimot ikke fullstendig, noe som tilsier at SNPer kan brukes i seleksjon for å endre begge egenskapene i en ønsket retning. Det ble plukket ut en rekke kandidatgener i området (PRLR, GHR, ILR7, C7, C6, C9, OXCT1, CARD6, FYB, LIFR og CLC28) som ble karakterisert på tilsvarende måte som for QTL-området på BTA6. Dessverre avdekket ikke disse analysene åpenbare funksjonelle endringer i gener koblet opp mot endret mastittfrekvens eller melkeprodukjon. Parallelt med QTL arbeidene på BTA6 og BTA20 har vi arbeidet mer spesifikt med ekspresjon og funksjon av gener involvert i førstelinjeforsvar mot mastittpatogener (delmål

4 e.). Vi har identifisert en rekke gener som forandrer uttrykk (på mrna nivå) i jurvev og cellekulturer fra storfe som følge av eksponering med bakterier (Staph. aureus, E. coli, Strep. uberis). Disse genene ble plassert til kromosomområder (QTL) assosiert med mastitt i norske kyr og analysert videre for å se hvilke biologiske prosesser de representerer. Spesielt interessante prosesser som ble funnet er signalveier for mobilisering av inflammatoriske celler fra lymfe og blod inn i vev under inflammasjon og infeksjon. Vi har også analysert genuttrykk i makrofagceller fra NRF-okser etter eksponering med Staph. Aureus-bakterier som er den mest vanlige årsaken til mastitt i Norge. Makrofagceller representerer kroppens første forsvarslinje mot infeksjoner. Slike celler kan isoleres fra blodprøver, holdes i kultur og studeres i en begrenset tidsperiode før de dør. Makrofager fra blodprøver av NRF-okser med god og dårlig avlsverdi for klinisk mastitt ble isolert og satt opp i kultur. Hver kultur ble delt i to; en del ble utsatt for en S. aureus-stamme som tidligere er isolert fra en ku med mastitt, og den andre delen ble brukt som kontroll. GENO plukket ut totalt 23 okser, 11 med god og 12 med dårlig avlsverdi for mastitt, til analysene. Vi analyserte uttrykk av totalt 8 gener involvert i cellemigrering (cytokiner) i dette materialet. Resultatene viser at det er forskjell mellom makrofagceller fra okser med god og med dårlig avlsverdi. Bakteriene førte til at genene ble nedregulert, men mindre i cellene fra dyr med god avlsverdi (dvs. døtre med mindre mastitt) enn i cellene fra dyr med dårlig avlsverdi. Det vil si at bakterien førsøker å dempe immunforsvaret hos dyrene og dyr med god avlsverdi motstår denne effekten bedre enn dyr med lav avlsverdi. Dette tyder på at evne til å sende ut signalstoffer for cellemigrasjon er sentral i forbindelse med forsvar mot mastitt. De 23 oksene ble også genotypet for et genombasert SNP-sett for å studere sammenhenger mellom genomvariasjon og genutrykk. Disse analysene viser at mange områder av genomet har varianter som samvarierer med uttrykket av cytokingenene. Disse genomområdene inneholder blant annet gener involvert i ulike prosesser i immunforsvaret. I tillegg fant vi flere regulatoriske mikro RNA gener som også kan ha betydning. Oppsummering: Kort oppsummert kan vi si å ha oppfylt hovedmålsetningen i prosjektet som var å identifisere en rekke gener og synteseveier som påvirker forekomsten av klinisk mastitt i norsk husdyrproduksjon. Prosjektet har således produsert grunnleggende kunnskap av betydning for å øke den biologiske forståelsen av egenskapen. Samtidig har prosjektet framskaffet verdifull informasjonen som kan brukes i forebyggende helsearbeid og praktisk avlsarbeid for å bedre dyrevelferden og redusere bruken av antibakterielle midler i Norge. Formidling av resultater: Publikasjoner i tidsskrift med referee: 1. Sodeland, M., Kent, M.P., Olsen, H.G., Opsal, M. A., Svendsen, M., Sehested, E., Hayes, B. and Lien, S. (2011). Quantitative trait loci for clinical mastitis on chromosomes 2, 6, 14 and 20 in Norwegian Red cattle. Anim. Genet. 42: Sodeland M, Grove H, Kent M, Taylor S, Svendsen M, Hayes BJ, Lien S. (2011). Molecular characterization of a long range haplotype affecting protein yield and mastitis susceptibility in Norwegian Red cattle. BMC Genet. 12:70 3. Lewandowska-Sabat, A.M., J. Gunther, H.M. Seyfert & I. Olsaker (2012). Combining quantitative trait loci and heterogeneous microarray data analyses reveals putative candidate pathways affecting mastitis in cattle. Animal Genetics 43:

5 4. Lewandowska-Sabat A.M., G.M. Boman, A. Downing, R. Talbot, A.K. Storset & I. Olsaker (2013). The early phase transcriptome of bovine monocyte-derived macrophages infected with Staphylococcus aureus in vitro. BMC Genomics 14:891 doi: / Olsen, H.G., T.M. Knutsen, A.M. Lewandowska-Sabat, M. Sodeland, H. Grove, T. Nome, M. Arnyasi, K. Sundsaasen, S. Taylor, B. Heringstad, M. Kent, S. Lien. Fine mapping and molecular dissection of a QTL on bovine chromosome 6 suggests a key role of the group-specific component (GC) gene in clinical mastitis and milk production. In prep. 6. Olsen, H.G., T.M. Knutsen, S. Teimouri, H. Grove, K. Sundsaasen, M. Svendsen, S. Lien. Investigation of positional candidate genes affecting clinical mastitis and milk production on bovine chromosome 20. In prep. 7. Lewandowska-Sabat A.M., B. Heringstad, T.R. Solberg, H.G. Olsen, A.K. Storset & I. Olsaker. "Immune responses of bovine monocyte-derived macrophages infected with Staphylococcus aureus varies according to breeding values and SNP genotypes". In prep Mastergrad: Sepehr Teimouri (2013). Molecular dissection of quantitative trait loci affecting clinical mastitis in Norwegian Red cattle. Master Thesis in Applied Biotechnology, Hedmark University College. Presentasjoner på faglige møter / konferanser: 1. Lewandowska-Sabat, A.M., G.M. Boman, M. Sodeland, B. Heringstad, A. Storset, S. Lien & I. Olsaker (2011) "Bovine macrophages and mastitis: In vitro gene response to Staphylococcus aureus exposure" 62nd Annual meeting of the European Association for Animal Production, Stavanger, Norway, 29 Aug. - 2 Sept. 2011: Poster 23 In: Conference book of abstracts: 184 ( 2. Lewandowska-Sabat, A.M., G.M. Boman, M. Sodeland, B. Heringstad, A. Storset, S. Lien & I. Olsaker (2011) "Bovine macrophages and mastitis: In vitro gene response to Staphylococcus aureus exposure" Physiology and Genomics of Mastitis. Experimental dissection of host-pathogen interaction in the udder, Tutzing, Germany 31 Oct. - 2 Nov Oral presentation (by I. Olsaker). In: Conference abstract book: Lewandowska-Sabat, A.M., B. Heringstad, A. Storset & I. Olsaker (2013) Mastitt hos storfe: genrespons hos immunceller (makrofager) fra NRF okser når de blir utsatt for Staphylococcus aureus bakterier Husdyrforsøksmøtet, Lillestrøm, Norway, Jan Oral presentation. In: Husdyrforsøksmøteboken, Storfe - Avl og genetikk 2, side ( 4. Lewandowska-Sabat A.M., G.M. Boman, A. Downing, R. Talbot, A.K. Storset & I. Olsaker (2013) The early phase transcriptome of bovine monocyte-derived macrophages infected with Staphylococcus aureus in vitro Joint Conference of HGM and the 21th International Congress of Genetics, Singapore, 13-18th April 2013, Poster 1822 In: Abstract book p. 254 ( 5. Lewandowska-Sabat A.M., G.M. Boman, A. Downing, R. Talbot, A.K. Storset & I. Olsaker (2013) The early phase transcriptome of bovine monocyte-derived macrophages infected with Staphylococcus aureus in vitro The 28th NKVEt Symposium, Mastitis new knowledge on diagnostics and control on modern dairy farms, Reykjavik, Iceland, 13-14th May 2013: Poster In: Proceeding p. 39 ( 6. Lewandowska-Sabat, A.M., B. Heringstad, T.R. Solberg, H.G. Olsen, A. Storset, & I. Olsaker (2014) The immune responses of bovine monocyte-derived macrophages infected with Staphylococcus aureus in vitro The 34 th International Society for Animal Genetics Conference, Xi an, China 28 July - 1 Aug. 2014, Poster 3005 In: ISAG2014 Book of Abstracts p. 49 (