«En god start er avgjørende for å få en robust fisk» Ny, viktig kunnskap om torskens tidligste faser. I samarbeid med kunnskapsplattformen

Transkript

1 NFE N / årgang 40 Biologi - CODE En spesialutgave av Norsk Fiskeoppdrett Foto: Terje van der Meeren Ny, viktig kunnskap om torskens tidligste faser I samarbeid med kunnskapsplattformen «En god start er avgjørende for å få en robust fisk»

2 HAVBRUK - FREMTIDENS OLJENÆRING Bærekraftig havbruk Besøk oss på cermaq.no cermaq.com Lingavegen Strandebarm Tlf: C hr. Mic hels ens gt. 6B, 5012 B ergen Telefon: eafood. no Telefon: Fax:

3 TOPPTEKST LiftUP Sentralpumping - Dødfisk direkte fra merden til kvern - Økt biologisk sikkerhet - Båt eller kran er unødvendig - Forbedret HMS. - Gjør dødfiskhåndtering mer behagelig - Røktes fra flåten. - Fungerer like godt i dårlig vær Se video på 3

4 241 MIL J ØME R K E T Trykks ak TOPPTEKST Innhold Besøks - og postadresse Skoltegrunnskaien 1 Postboks 4084 Sandviken 5835 Bergen Telefon Web Telefaks Adm./Red redaksjon@kyst.no ABONNEMENT /05 ANSVARLIG REDAKTØR Gustav-Erik Blaalid gustav@kyst.no / REDAKTØR Pål Mugaas Jensen palmj@kyst.no / JOURNALIST Øyvind Sjøthun Røen oyvind@kyst.no JOURNALIST Linn Therese Skår Hosteland linn@kyst.no SALG CHILE Erich Guerrero erich@kyst.no SALGSSJEF Laila Indrebø laila@kyst.no KEY ACCOUNT MANAGER Jorge Piazza Cangas jorge@kyst.no KEY ACCOUNT MANAGER IngerJo Tellefsen ingerjo@kyst.no / Ny, viktig kunnskap om torskens tidligste faser Gjennom å ta i bruk nye molekylære analysemetoder, har en fullstendig revolusjonert mulighetene til å beskrive torskens utvikling, finne grunnleggende biologiske mekanismer og å få en dypere forståelse av cellulare og molekylære prosesser. Man kan dermed nå identifisere de underliggende faktorene som bestemmer yngelkvalitet og hva som skal til for å produsere en robust fisk. I dette særnummeret av Norsk Fiskeoppdrett presenteres nye og spennende resultater fra det store Forskningsrådsfinansierte prosjektet Cod Development (CODE). REGNSKAP Accountor UTGITT AV Norsk Fiskeoppdrett AS GRAFISK PRODUSKJON Rodrigo Orrego TRYKK Borge Grafisk AS BANKGIRO ORG. NR ABONNEMENT 2015 kr.3850,00 ISSN Norsk Fiskeoppdrett. Koplering av artikler og annonser er Ikke tillat uten samtykke fra Norsk Fiskeoppdrett. Ved oppsigelse av abonnement kun skriftlige henvendelser. Norsk Fiskeoppdrett gjør oppmerksom på at Innsendt Stoff også gjøres tilgjengelig elektronisk. Norsk Fiskeoppdrett tar ikke ansvar for innsendte bilder uten at det er gjort avtale om bruk disse. Norskfiskeoppdrett er et fritt og polistik uavhengig fagtidsskrift. Vi følger «Vær-varsom-plakaten» og «Redaktørplakaten» og er medlem av Mediebedriftenes Landsforening. Kontrollert godkjent årlig opplag. Kommentar Leder: En god start er av avgjørende betydning...7 Temperatur Høyere temperatur i tidlige livsstadier kan forbedre torskens vekst og kvalitet... 8 Byttedyrtype Effekter av byttedyrtype på vekst hos torskelarver: Stadier Utviklingsstadier i torsk basert på beindannelse Ernæring Næringsstoffer som begrenser vekst hos torskelarver fôret med hjuldyr Metabolisme Effekt av temperatur og ernæring på utvikling av torskelarver i tidlige stadier: RNA-sekvensering Hvilke faktorer gir en rasktvoksende fiskelarve av god kvalitet?...22 Redox Oksidativt stress forårsaket av taurinmangel - årsak til redusert vekst?...25 Appetitt Hvordan kan appetitt og fôrinntak stimuleres hos torskelarver? Forfatteroversikt Liste over alle bidragsyterne med adresser.. 31 Fettfordøyelse Fettfordøyelse i torskelarver Beinutvikling Skjelettutvikling og beinmetabolisme i tidlige livsstadier hos torsk...34 Osmoregulering Utvikling av osmoregulering hos torskelarver - rotatorier vs naturlig zooplankton...36 Synsutvikling Fra planktonfangst til fiskepredator; endring av syn gjennom utvikling...39 Langtidseffekt Langtidseffekter av ulike startfôr

5 NetKem notimpregnering reduserer begroing 27 Netwax produktene er godt dokumenterte og bidrar også til å lette rengjøring, hindre uttørring og beskytte mot UV-stråling. Naturlig dyreplankton versus hjuldyr og saltkreps Det har lenge vært kjent at naturlig dyreplankton gir god vekst hos torskelarver. I tidligere forsøk har larver som spiser plankton økt vekten med mellom 14 og 22% daglig fra dag 4 etter klekking til de er ca 5 uker gamle. Forsøket i CODE viser at dette mest sannsynlig skyldes god ernæring Underliggende faktorer som gir en rasktvoksende fiskelarve av god kvalitet Selv om fordelen med å startfôre en rekke fiskearter med naturlig dyreplankton er beskrevet i tallrike studier, har de underliggende mekanismene som skaper forskjellene i vekst og utvikling ikke vært forstått. I CODE er vi kommet et langt skritt videre med å beskrive disse mekanismene. Foto: Per Eide Studio Netwax NI 3 Fortsatt på topp etter mer enn 25 år. Norges mest solgte notimpregnering. Netwax E4 Greenline Utviklet for grønne konsesjoner. Kan med fordel brukes til alle typer notposer. Fra planktonfangst til fiskepredator; endring av syn gjennom utvikling Hvordan oppfatter torsken fargen på sluken, og hvordan den er i stand til å se omgivelsene rundt seg? Ved å studere synet til torsken kan vi finne svar på dette, samt finne ut om synet er likt gjennom hele livet Langtidseffekter av ulike startfôr Torsk som ble startfôret enten på naturlig dyreplankton eller med rotatorier etterfulgt av Artemia, ble fulgt frem til kjønnsmodning ved to års alder. Selv om fisken økte i vekt fra 10 g til 1 kg, kunne vi spore effekten av ulikt fôr i larvestadiene hos den kjønnsmodne fisken to år senere. Netwax NI Gold Gir optimal beskyttelse mot groe. Netpolish NP Super Coating som beskytter mot mekanisk slitasje ved gjentatt spyling av nøter i sjøen. Kontakt din forhandler for mer informasjon Telefon:

6

7 Leder Av professor Ivar Rønnestad og professor Kristin Hamre, hhv leder og nestleder av CODE Foto: Norges Sjømatråd/Per Eide Studios En god start er av avgjørende betydning Forskningen på torskens tidlige utvikling har lange og stolte tradisjoner i Norge. Noen av våre mest kjente havforskere, bl.a. G.O. Sars, startet for over 100 år siden med og systematisk beskrive torskens utvikling og biologi fra det befruktede egget. I dag arbeider vi fremdeles med mange av de samme spørsmål og problemstillinger, men verktøyene vi har til rådighet blir stadig bedre og åpner helt nye muligheter. I løpet av det siste tiåret har vi tatt i bruk molekylære analysemetoder som fullstendig har revolusjonert våre muligheter til å beskrive torskens utvikling, finne grunnleggende biologiske mekanismer og få en dypere forståelse av cellulære og molekylære prosesser. Dette har gjort oss i stand til å etablere en mer helhetlig forståelse for torskens fysiologi og biologi. Vi kan dermed for eksempel identifisere de underliggende faktorene som bestemmer yngelkvalitet og hva som skal til for å produsere en robust fisk. I dette særnummeret av Norsk Fiskeoppdrett vil vi presentere nye og spennende resultater fra prosjektet Cod Development (CODE). Prosjektet er nylig avsluttet og har hatt som mål å bygge langsiktig kompetanse og grunnleggende kunnskap om tidlige livsstadier hos torsk. Den brede kunnskapen vi nå har fått er viktig ikke bare for fremtidig torskeoppdrett, men er også overførbar til mange av de andre marine fiskeartene i oppdrett, bl. a. berggylt. Internasjonalt er oppdrett av marin fisk mer utbredt enn oppdrett av laksefisk og selv om aktiviteten i oppdrett av marine arter i Norge for tiden er lav, vil dette trolig ta seg opp igjen. Torsken har en unik stilling i norsk marin fauna og for norske fiskerier, og CODE har etablert kunnskap om grunnleggende utviklingsbiologi som er relevant for forvaltning av ville bestander og hvordan torsken påvirkes av miljøendringer. Resultatene i CODE kan også brukes i praktisk oppdrett. Vi har vist at temperatur og ernæring i de tidlige livsstadier har betydning for hele livsløpet. De samlede miljøbetingelsene i de tidlige stadiene hos fisk kan derfor ha langtidseffekter som holder stand senere i livssyklusen og som vil ha betydning for fiskens produksjonsegenskaper i oppdrett. Vi har dessuten vist at feilernæring gir store forskjeller i vekst på larvestadiet og identifisert næringsstoffer som er for lave i fôrorganismene som brukes i intensivt oppdrett, og som trolig kan forklare disse vekstforskjellene. Oversikt over alle bidragsyterne og deres adresser, finnes på side 31. CODE - Torskens utvikling Cod Development CODE er et prosjekt som har vært finansiert (med 21 mill. kr) av Havbruksprogrammet i Norges Forskningsråd, og har hatt med deltagere fra ni ulike forskningsmiljøer i Norge. Prosjektet er nettopp avsluttet CODE har vært en strategisk satsing på grunnforskning, en såkalt kunnskapsplattform, og har hatt som mål å bygge langsiktig kompetanse og grunnleggende kunnskap av utviklingsprosesser i torsk, samt hvordan miljøfaktorer (ernæring og temperatur) påvirker utviklingen. En viktig del av arbeidet har bestått i å identifisere mekanismene som forklarer forskjeller i larvekvalitet og utvikling. Norske partnere har vært Universitetet i Bergen, Nifes, Havforskningsinstituttet, Nofima Marin, Sintef, NTNU, Universitetet i Nordland, Universitetet i Tromsø og Uni Research Miljø. CODE har vært ledet fra Universitetet i Bergen. 7

8 Temperatur Epigenetikk Epigenetikk betyr «over genetikk» og refererer til endringer i genuttrykk uten endringer av den underliggende DNA-sekvensen. Epigenomet regulerer hvordan genene uttrykkes. Forandringer i epigenomet kan skje på grunn av ytre faktorer slik som temperatur og ernæring og kan være forbigående eller permanente og refereres ofte til som epigenetisk programmering. Slik programmering er en viktig del av embryoutvikling fra befruktning til utvikling av vev og organer. For å studere sammenhengen mellom eksterne temperaturfaktorer og epigenetisk programmering hos torsk analyserte vi graden av metylering i genomet. Det ble gjort ved hjelp av en metode som heter RRBS (Reduced Representation Bisulphite sequencing). Høyere temperatur i tidlige livsstadier kan forbedre torskens vekst og kvalitet Det er en vanlig oppfatning at høye temperaturer under inkubasjon av egg vil resultere i mer misdannelser, lavere overlevelse og lavere vekst hos torsk sammenliknet med lave temperaturer. Nye resultater fra Nofima viser imidlertid at yngel som i eggfasen ble utsatt for relativt høye temperaturer faktisk hadde mindre misdannelser, høyere overlevelse og bedre vekst enn de som gikk på lave temperaturer. To andre forsøk har også bekreftet disse resultatene. Derfor kommer vi til å innføre protokollen (høy temperatur inkubasjon) i avlsprogrammet for torsk. Velmurugu Puvanendran, Hilde Toften, Helge Tveiten, Ingrid Lein, Bjørn-Steinar Sæther & Hanne Johnsen Velmurugu.Puvanendran@nofima.no Oppdrett av torsk vokste raskt tidlig på 2000-tallet, men siden opplevde man FIGUR 1 en nedgang på grunn av flere biologiske, teknologiske og økonomiske flaskehalser. Dårlig egg-, larve- og yngelkvalitet har blitt identifisert som de største biologiske problemområdene. I plattformprosjektet CODE har en jobbet med disse problemområdene gjennom å studere funksjon, mekanismer og prosesser i torskens tidlige livsstadier, spesielt knyttet til ernæring og miljøforhold. Økt kunnskap om dette er ikke bare en forutsetning for en vellykket utvikling av akvakulturnæringen, men kan Torskeyngel holdt ved lav (A) og høy temperatur (B) fra eggstadiet. Ved dag 135 etter klekkingen var fisk holdt ved høyere temperaturer større og hadde langt mindre deformiteter enn yngel holdt ved lavere temperaturer (Bilder av Hege Lysne). 8

9 Temperatur FIGUR 2 Nivåer av tyroksin (T4) i torskeembryoer (A) og kortisolnivåer i yngel etter akutt temperaturstress (B). også bidra i forskingen på naturlige torskebestander. Kunnskapen kan i tillegg brukes til å bedre forståelsen av biologien til andre marine fiskearter. Vi vet at fiskelarver gjennomgår mange utviklingsendringer i løpet av en meget kort tidsperiode og at denne prosessen kan påvirkes av mange ytre faktorer slik som endringer i diett og miljø. Det er imidlertid lite konkret kunnskap om hvordan slike forandringer kan påvirke torskens utvikling og funksjonsnivå på kort og lang sikt. Temperaturens rolle i tidlig livsutvikling Temperatur påvirker hvor hurtig fiskeembryoer og larver utvikler seg og hvordan fiskens utseende, vevsfunksjon og stoffskifte blir. Temperaturskapte forandringer kan trolig også påvirke fiskens fysiologi og dermed fiskens evne til å takle miljømessige utfordringer senere i livet. Inkubasjonstemperatur på tidlige livsstadier kan gi langtidseffekter på fiskens ytelsesevne senere i livet gjennom noe som kalles en programmeringseffekt og epigenetikk. Vi vet lite om langtidseffekten av slike tidlige programmeringseffekter hos torsk. I CODE har vi derfor studert temperaturens rolle i forhold til livshistorieprogrammering. Vi så på fiskens tilpasning til temperatur på kort sikt og om eventuelle forskjeller ville vedvare til senere livsstadier. I forsøket ble torskeegg og larver holdt ved både lave (4-5 C) og høye (9-12 C) temperaturer. Vekst, overlevelse og misdannelser ble registrert fra larvestadiet til slakting (~2.4 kg). Resultatene viste at torskelarver holdt ved høyere temperatur var tyngre både som yngel ved 6 måneder og som voksne ved slakting. Selv om andre studier har vist negative effekter av høy temperatur på eggkvalitet, har disse til forskjell fra vårt vært korttidsstudier som ikke gir hele bildet. Vi fant også at temperaturforskjeller gjennom de tidlige livsstadiene påvirket nivåene av tyroideahormoner (THs- triiodothyronin og tyroksin). Disse hormonene spiller en viktig rolle under embryoutviklingen og organutviklingen. Vi har studert uttrykket av gener relatert til stress-aksen i løpet av torskens tidlige livsstadier. I samme tidsrom ble også nivået av stresshormonet kortisol undersøkt. THs og kortisol virker sammen med andre hormoner (f.eks. prolaktin og veksthormon) under fiskens utvikling. Dermed kan endringer i disse komponentene påvirke vekst og utvikling av torsk og være viktig i produksjonssammenheng. Resultatene fra epigenetiske analyser viste signifikante forskjeller i metyleringsmønster mellom larver fra alle temperaturbehandlinger, noe som tyder på at temperaturforskjeller på tidlige tidspunkt i livet kan forandre epigenomet. Det gjenstår å se om slike forandringer vil vedvare og eventuelt ha transgenerasjonseffekt. Implikasjoner for oppdrettsnæringen Høyere vanntemperatur i klekkeriet og under startfôringen vil redusere produksjonstiden av egg og yngel og vil tillate mer effektiv bruk av anlegget. Det er noen indikasjoner på forskjeller i stressaksens utvikling når torsk har blitt holdt ved forskjellig temperatur i løpet av tidlige utviklingsstadier. I tillegg ble evnen til å mestre akutt stress bedre i høy-temperaturgruppa, noe som kan reflektere økende robusthet hos yngelen. Det trengs imidlertid mer forskning før vi kan dra sikre konklusjoner. Videre viste data fra epigenetiske analyser en klar sammenheng mellom temperatur og metyleringsmønster. Viktigheten av dette, samt mulige trans-generasjons effekter, bør studeres videre. Det er kjent at epigenetisk programmering kan forandre individets fenotype, og det kan igjen ha innvirkninger på produksjon i akvakultur. Det er sannsynligvis et stort potensial for oppdrettsnæringen å kunne bruke informasjon fra studier på epigenetikk for å bedre produksjonspraksis. Våre resultater kan også gi innsikt til oppdrettsnæringen om hvordan best tilpasse seg klimaendringer. Spørsmålet om temperatureffekt er også svært relevant i forhold til hvilken framtidig rolle klimaendringer (global oppvarming) kan tenkes å ha på villfisk. 9

10 Byttedyrtype Oppdrettsmetoder for torskeyngel og bruk av ulike typer levende byttedyr. Effekter av byttedyrtype på vekst hos torskelarver: Naturlig dyreplankton versus hjuldyr og saltkreps Det har lenge vært kjent at naturlig dyreplankton gir god vekst hos torskelarver. I tidligere forsøk ved Havforskningsinstituttets forskningsstasjon i Austevoll har larver som spiser plankton økt vekten med mellom 14 og 22% daglig fra dag 4 etter klekking til de er ca 5 uker gamle. I ett tilfelle var vektøkningen faktisk hele 37% daglig hos 7 uker gamle torskelarver. Alle disse forsøkene ble utført i store poser (5,2 m 3 ) der fôret bestod av ulike stadier av hoppekreps (copepoder) samlet inn fra et pollsystem. Samlet har forsøkene vist at torskelarver har et stort vekstpotensial når ernæring og oppdrettsmiljø er optimale. Terje van der Meeren, Ørjan Karlsen, Anders Mangor-Jensen, Ivar Rønnestad og Kristin Hamre terjem@imr.no Produksjon av torskeyngel i industriell skala skjer imidlertid med hjuldyr (rotatorier) og saltkreps (Artemia) som byttedyr i den perioden larvene må ha levendefôr. Det benyttes grønt vann (alger eller algepasta), og oppdrettet foregår innendørs i kar av ulike størrelser. Metoden kalles intensivt oppdrett i motsetning til oppdrett i poll der yngelen produseres ved en ekstensiv metode. Yngel produsert med den intensive metoden har oftest betydelig mer skjelettdeformiteter enn ved ekstensivt oppdrett i poll. En del av arbeidspakkene i CODE-prosjektet ble derfor etablert for å kartlegge effekter av ernæring på torskelarvers vekst og utvikling, helt ned til et molekylært nivå. Det er klare forskjeller i innhold av essensielle næringsstoffer hos rotatorier, Artemia og copepoder, og det er også forskjeller i størrelse på disse byttedyrene. Et sentralt spørsmål her var hvordan 10

11 Byttedyrtype FIGUR 1 disse byttedyrtypene ville påvirke vekst og utvikling hos torskelarver drettet opp under samme miljøforhold som ved den intensive metoden. Copepoder fra Svartatjern For å skaffe nok copepoder til et slikt forsøk ble det tidligere pollsystemet Svartatjern i Austevoll gjenoppbygget. I Svartatjern produseres copepoder fra hvileegg som overvintrer i sedimentet. Eggene klekker når bassenget fylles med sjøvann i mars, og da blir det store mengder copepodelarver (nauplier) tilgjengelig samtidig med at torsken gyter. Nauplier er den viktigste maten til fiskelarver i sjøen, og fiskelarvers fordøyelse, metabolisme, ernæring og utvikling er trolig tilpasset disse byttedyrene gjennom mange millioner år med evolusjon. Et hjulfiltersystem i Svartatjern både konsentrerer og fraksjonerer copepodene i ulike størrelser. Etter at dødt organisk materiale er skilt fra det levende planktonet kan copepodene ytterligere konsentreres og enkelt bringes til oppdrettskarene med torskelarver. Startfôring med ulike byttedyr Det ble gjennomført to forsøk ved Austevoll forskningsstasjon der fordøyelse, ernæring, vekst og utvikling hos torskelarver ble undersøkt. I begge forsøkene fikk en larvegruppe nauplier og siden umodne copepoder av økende størrelse (copepoditter), mens en annen larvegruppe ble fôret med rotatorier fulgt av Artemia når larvene ble eldre. Disse to byttedyrregimene var den eneste behandlingen i det første forsøket (Forsøk-1), mens i det andre forsøket (Forsøk-2) ble en tredje larvegruppe kun tilbudt små copepodstadier (hovedsakelig nauplier som var like store eller mindre enn rotatoriene). Dette ble gjort for å undersøke om byttedyrstørrelse kunne forklare observerte forskjeller i vekst i det første forsøket. Lengde hos torskelarver med ulike fôrregimer i de to forsøkene. Pilene i figuren til venstre angir tidspunkt for tilvenning til formulert fôr. og det ble gitt byttedyr i overskudd slik at det alltid var en liten rest igjen ved neste fôring. Det ble tatt prøver av torskelarvene og byttedyrene for analyse av biokjemisk innhold. Videre ble det tatt prøver for andre arbeidspakker i CODE-prosjektet for blant annet å undersøke regulering av gener og biologiske prosesser som appetitt, fordøyelse, metabolisme, vekst, vann- og ionebalanse, utvikling av syn, samt bein- og muskelutvikling hos larvene. Prøvetakingen ble tilpasset larvenes Omfattende innsamling av prøver Forsøk-1 ble gjennomført i 12 stk. 500 liters kar, med torskelarver satt ut i hvert kar på dag 4 etter klekking. Det ble brukt grøntvann (algepasta) til larvene var 5 uker gamle, og i halvparten av karene ble ulike stadier av copepoder benyttet som fôr (planktongruppen) mens den andre halvparten kun fikk rotatorier og Artemia (intensivgruppen). Fôring ble gjennomført som tre måltider om dagen: formiddag, ettermiddag og kveld. Mengde av byttedyr ble vurdert ut fra torskelarvenes størrelse, 11

12 Byttedyrtype FIGUR 2 Sammenligning av torskelarver som er fôret med copepoder (nauplier/copepoditter) og rotatorier/artemia (fra Forsøk-1). Tabell 1: Vekstdata beregnet fra standardlengde og tørrvekt for torskelarvene i ulike faser av Forsøk-1. Periode Fôr Lengdeøkning Vektøkning Kondisjon* (dag etter (%/døgn) (%/døgn) klekking) Intensivgruppen: 4-22 Rotatorier 2,4 13,9 0, Rotatorier/Artemia 2,4 8,6 1, Formulert fôr 4,0 11,6 1,52 Planktongruppen: 4-22 Nauplier 2,5 14,3 0, Nauplier/Copepoditter 4,5 15,2 1, Formulert fôr 4,0 11,9 1,64 * Kondisjon = 1000 x Vekt (mg)/lengde (mm) 3 størrelse i hvert av de to fôrregimene, og på denne måten kunne sammenligninger gjøres ved noenlunde like utviklingstrinn hos larvene. Copepoder gir raskere vekst Resultatene viste at begge gruppene av torskelarvene vokste omtrent like bra frem til dag 22 etter klekking (Figur 1). Deretter var daglig vekst i lengde og vekt hos larvene som fikk nauplier nesten dobbelt så høy som i gruppen som fikk rotatorier (Tabell 1), og i samsvar med tidligere observasjoner fra pollene. Larvene som fikk copepoder var også kraftigere pigmentert enn rotatorielarvene (Figur 2). Vekstforskjellene førte til at tilvenning til formulert fôr 12

13 Byttedyrtype startet på dag 36 i planktongruppen, mens i intensivgruppen skjedde dette først på dag 57. Etter tilvenning til formulert fôr økte lengdeveksten hos larvene som hadde fått rotatorier og Artemia og ble den samme som i planktongruppen. Samtidig ble den daglige økningen i vekt noe redusert i planktongruppen, mens intensivgruppen økte veksten til samme nivå som planktongruppen (Tabell 1). Kondisjonsfaktoren, som var minst i planktongruppen etter dag 22 i perioden med levendefôr, ble jevnet ut mellom de to fôrregimene etter overgangen til formulert fôr. Endringer i kondisjon gjennom larvefasen skyldes for øvrig også at vanninnholdet i larvene synker med økende alder og at veksten ikke er isometrisk (lik i alle kroppsretningene). Er byttedyrstørrelse viktig? En mulig forklaring på vekstforskjellene mellom de to gruppene i Forsøk-1 kunne være at de eldre torskelarvene ikke klarte å spise nok rotatorier, mens larvene som spiste copepoder fikk dekket energibehovet sitt ved tilførsel av stadig større byttedyr gjennom en økende andel copepoditter i fôret. For å teste effekten av byttedyrstørrelse ble derfor Forsøk-2 gjennomført i 12 stk. 50 liters kar med tre ulike fôrregimer. To av disse var de samme som i Forsøk-1, mens det tredje fôrregimet bestod hovedsakelig av nauplier. Nauplier finnes i seks stadier som er like store eller mindre enn rotatoriene. På dag 4 etter klekking ble det satt ut 1900 larver i hvert kar, og algepasta ble benyttet frem til dag 33 etter klekking. Som i Forsøk-1 ble tre måltider gitt pr. dag, og forsøket ble avsluttet på dag 47 før tilvenning til formulert fôr. Næringsinnholdet er viktigst Resultatene fra dette forsøket viste akkurat det samme som i Forsøk-1. Torskelarvene i de tre fôrregimene vokste nesten likt frem til dag 20 (Figur 1). Deretter hadde gruppen som fikk rotatorier og Artemia betydelig dårligere vekst enn begge copepodgruppene. Det mest interessante var at gruppen som kun fikk nauplier vokste nesten like godt som gruppen med økende byttedyrstørrelse. Av dette kan man slutte at det ikke er byttedyrstørrelse som fører til de observerte vekstforskjellene hos torskelarvene. Den mest nærliggende forklaringen er derfor at dette skyldes forskjeller i næringsinnhold i de ulike byttedyrtypene. Utfordringen er å avdekke hvilke ernæringsmessige faktorer som er viktige i denne sammenheng, og hvordan disse påvirker torskelarvenes utvikling og vekst. De etterfølgende artiklene vil belyse noe av dette med utgangspunkt i materialet som er samlet inn fra Forsøk-1. 13

14 Stadier Utviklingsstadier i torsk basert på beindannelse Opp gjennom årene er det gjennomført en rekke studier der et bredt spekter av torskens tidlige biologi er karakterisert i forhold til f.eks temperatur, ernæring, både i felt og i laboratorier. Vi ser imidlertid at det kan være vanskelig å sammenligne data fra mange av disse forsøkene siden utviklingshastigheten og vekst varierer sterkt avhengig av en rekke faktorer bl.a. i miljø. Alder er de fleste enige om gir dårlig sammenligningsgrunnlag. I CODE forsøket har vi derfor definert og karakterisert utviklingsstadier som gir mulighet til å ta prøver fra ulike grupper med svært ulik behandling og sammenligne og beskrive forskjeller mellom dem. Øystein Sæle, Trine Haugen, Ørjan Karlsen, Terje van der Meeren, Kristin Hamre, Ivar Rønnestad og Kai K. Lie. oyse@nifes.no Det finnes over arter av beinfisk, men utviklingsstrategien kan i hovedsak deles opp i to hovedtyper: direkte og indirekte utvikling. Hos arter med direkte utvikling ligner det nyklekte individet på en liten voksen, mens hos arter med indirekte utvikling skjer mye av utviklingen etter at embryoet er klekket, også etter at larven har begynt å spise. Torsk er en typisk art med sistnevnte strategi. Først når den er blitt en yngel (juvenil) ligner den på en liten voksen. Når plommesekken er oppbrukt og larvene begynner å spise krepsdyr nauplier er larven kun litt over 4 mm og gjennomsiktig, bortsett fra pigmenterte øyne den trenger for å se. Skjelettet består på dette tidspunktet kun av brusk, ikke ett eneste mineralisert bein. Men det varer ikke lenge, bare dager etter at larvene begynner å spise starter forbeiningen (mineraliseringen) av de første knoklene. Og det er nettopp rekkefølgen på knokler som blir forbeinet som er spennende. En rekke studier viser at rekkefølgen de forskjellige knoklene i hodet blir forbeinet er mer eller mindre den samme i all fisk som er beskrevet. Vi har tidligere brukt denne forbeiningsrekkefølgen i hodet på kveite til å definere utviklingsstadier, og nå har vi gjort det samme på torsk. Ved å farge bein røde med alizarin mens resten av fiskelarven er gjennomsiktig kan vi gi hodebeina en karakter fra 1 til 3, der 1 betyr begynnende forbeining, 2 betyr at knokkelen kan gjenkjennes på form og 3 betyr at knokkelen har en ferdig «juvenil» form. Karakterer på larver fôret med rotatorier etterfulgt av Artemia og så tørrfôr, er gitt i figur 1. Beskrivelse av stadiene er som følger: Stadium 1: Plommesekken er absorbert, tarmen har formet en løkke og hele finnefolden er på plass. Ryggstrengen er tykkere enn musklene i halen. Få spredte pigmentceller kan sees på ryggsiden av hodet og på halen. Skulderbuen er den første strukturen som forbeines, men da den ikke er en del av kraniet er den ikke med i figur 1. I dette stadiet vil også knokkeldannelsen starte i kjeven. Stadium 2: Musklene i halen er nå tykkere enn ryggstrengen. Forbeiningen i hodet er dominert av kjeveknoklene, mens FIGUR 2 Det delvise forbeinede kraniet på en torskelarve i stadium 4. Navn på knokler som er navngitt i teksten er indikert. 14

15 Stadier FIGUR 1 Karakterer gitt til larver med økende størrelse, alder er også oppgitt. Larvene ble fôret rotatorier fulgt av Artemia før tørrfôr. Fargefeltene illustrerer de forskjellige utviklingsstadiene fra 1 til 5. Yngel (juvenil) er gitt til sist i mørk blå. 15

16 Stadier FIGUR 3 HAVBRUK - FREMTIDENS OLJENÆRING Torsk ved ulike utviklingsstadier. Fargekoden på hvert stadium er den samme som i figur 1. noen av knoklene i hyoidbuen vil starte å forbeine i dette stadiet. Begynnende forbeining kan også observeres i gjellebuene, samt i deler av neurocraniet (spenoid beinet og i occipital gruppen). Stadium 3: Muskler er det dominerende vevet i halen nå, og pigmentceller er spredt over det meste av larvens overflate, men ikke på finnefolden. I dette stadiet vil finnefolden starte forvandlingen fra en fold til differensierte finner. Hos enkelte individer kan røde blodceller observeres i hjerteog gjelle regionen. Enkelte bein i kjeven har nå kommet så langt i forbeiningen at de kan identifiseres basert på form, og ikke bare hvor i kroppen de befinner seg. Flere av de neurocraniale knoklene blir forbeinet i dette stadiet. Mot slutten av stadium 3 vil ryggstrengen i haletippen bøyes oppover (flexion). Stadium 4: I dette stadiet vil den spredte forekomsten av pigmentceller tette seg til, men finnene forblir upigmenterte og halen vil fortsatt være gjennomsiktig. Finnene er utviklet, til torskens karakteristiske tre ryggfinner og to gattfinner. Flexion er nå på plass. De fleste bein i hodet er påbegynt/delvis forbeinet. De flate knoklene i gjellelokket har også startet å forbeine. Stadium 5: Dette stadet er best karakterisert av at de neurokraniale beinplatene vokser sammen. Det er den økte forbeiningen av den otiske knokkelgruppen som er viktigst her. Ser man larvens hode fra siden så er snutens profil svakt kurvet (litt oppstoppernese) i stadium 4. I stadium 5 forsvinner oppstoppernesen, og profilen fra pannen til nesen blir rettere. Dette skyldes veksten av en gruppe bein som heter ethmoid gruppen, samt et bein som heter nasale. Pigmentcellene er fortsatt ikke tett nok samlet til å forhindre at indre strukturer som ryggraden kan sees, og finnene er fortsatt ikke pigmentert. Juvenil fisk: Nå er pigmenteringen av fisken komplett, med mørk rygg, hale og finner og lys buk. Ethmoid knoklene og nasale beinet er fullt utviklet, noe som gir torsken rund snute i profil. Forbeining er godt kriterium for stadiuminndeling Vi har vist at rekkefølgen av forbeining av knokler i hodet hos torsk følger det samme mønsteret som vi ser hos andre beinfiskarter. Dette viser at forbeining av kraniet er et godt kriterium for stadiuminndeling. Som tidligere nevnt er denne inndelingen svært viktig for å analysere og ikke minst sammenligne resultater fra ulike forsøk og behandlinger. Veksten i ernæringsforsøket (van der Meeren m.fl. annet sted i bladet) viser at de to ulike fôrene ga svært ulik vekst. Imidlertid viste beinfarging av larver fra de to gruppene at forbeiningen av skjelettet var den samme i larver på samme størrelse og at de to behandlingene gjør at fisken når samme utviklingsstadium til forskjellig tid. Dette illustrerer at det lite hensiktsmessig å sammenligne effekten av behandling med hensyn på alder. 16

17 Ernæring Næringsstoffer som begrenser vekst hos torskelarver fôret med hjuldyr Det er allment kjent at naturlig dyreplankton gir bedre vekst hos torskelarver enn hjuldyr (rotatorier) og saltkreps (Artemia) selv om årsakene har vært en gåte. I CODE prosjektet har vi nå vist at forskjellene i vekst hovedsakelig skyldes ernæring, og mest sannsynlig store forskjeller i innhold av protein og taurin i fôrdyrene. I tillegg kan innholdet av sink, jod, fettsyrer, fosfolipider og pigmenter ha vært begrensende for vekst hos hjuldyr-fôrede larver, men nivåene her lå over antatt behov. Larvens proteinsammensetning er bestemt av den genetiske koden og er tilnærmet konstant. Mangel på protein eller enkelte aminosyrer vil derfor i første omgang gi redusert vekst. Taurin blir ofte gruppert som aminosyre, men er egentlig en sulfonsyre som er løst i kroppsvæskene og som ikke inngår som en bestanddel i proteiner. Taurin er nødvendig for dannelse av galle, for osmoregulering og for funksjon av mitokondrier, cellenes energikraftverk. Taurinmangel fører bl.a. til oksidativt stress. Kristin Hamre, Ørjan Karlsen, Terje van der Meeren og Ivar Rønnestad kha@nifes.no Før oppstart av CODE prosjektet hadde vi på NIFES studert ernæringsmessige forskjeller mellom rotatorier og naturlig zooplankton (som består hovedsakelig av copepoder) og funnet at spesielt når det gjaldt mikromineraler, hadde rotatoriene lave nivåer. Fettsyrer og vitaminer var stort sett til stede i riktige mengder i de kommersielle rotatoriefôrene. Det ble etablert anrikningsmetoder for mikromineraler hos rotatorier slik at man kunne kjøre behovsforsøk. Disse forsøkene viste at mineralbehovene hos torskelarver lå langt under det høye innholdet som finnes i copepoder, men ofte litt høyere enn innholdet i rotatorier. Denne kunnskapen ble brukt da en skulle designe dyrknings- og anrikningsprosedyrer for rotatorier (se faktaboks) i ernæringsforsøket i CODE (van der Meeren m.fl. annet sted i bladet). Det ble kjørt en pilotproduksjon av rotatorier før forsøket startet og analysene viste antatt riktig sammensetning for de næringsstoffene vi hadde kunnskap om og kunne kontrollere. Innhold av næringsstoffer i byttedyr Som vist i en annen artikkel i bladet (van der Meeren m.fl.) var det likevel stor forskjell i vekst mellom torskelarver fôret med rotatorier og copepoder, noe som i hovedsak ser ut til å skyldes forskjellen i byttedyrenes næringsinnhold. Tabell 1 angir nivået av de næringsstoffene som potensielt kan ha begrenset veksten hos larver fôret med rotatorier og Artemia. Innholdet av de Dyrkning og anrikning av rotatorier i CODE prosjektet Dyrkning 7-dager batch-kultur, 2m3 kar med kon, 24 C, hjuldyr/ml, fôring 4 ganger per time: Tørrgjær 0,11-0,18 g/million hjuldyr, Rotifer Diet (Reed Mariculture Inc.) 0,3-1,5 g/ million hjuldyr Anrikning hjuldyr/ml, fôring 1 gang per time, 0,6 mg Sel-Plex (Alltech Inc.) + 0,2 g Larviva Multigain (Biomar) per million hjuldyr. FIGUR 1 Fôrdyr for marine fiskelarver 17

18 Ernæring FIGUR 2 Torskelarvens sammensetning av kroppsprotein er bestemt av den genetiske koden og kan ikke påvirkes gjennom fôring. Hvis larven får for lite protein, eller den mangler en eller flere aminosyrer, vil dannelsen av protein og dermed veksten begrenses. Fiskelarver ser ut til å kompensere for lavt proteininnhold i byttedyrene ved å spise mer. Dette vil uansett føre til ubalanse i inntak av de ulike næringsstoffene. Et lavt totalt proteinnivå, kan øke larvenes sårbarhet for mangel på enkeltaminosyrer, for eksempel er metionin kjent å være lav i rotatorie-protein sammenlignet med andre animalske protein. Næringsstoffanalyser NIFES. næringsstoffene som ikke er inkludert i tabellen var omtrent som i copepoder eller litt høyere. Totalt fettinnhold og innhold av omega- 3 fettsyrer var noenlunde likt i rotatorier og copepoder. Arachidonsyre var noe lavere i copepoder enn i rotatorier, men ikke nok til å gi den store forskjellen i vekst. Heller ikke forskjellen i pigmentinnhold er forventet å gi en så stor vekstforskjell. Når det gjelder jod, har vi funnet at behovet ligger på ca 3,5 mg/kg tørrstoff og burde derfor være dekket av innholdet i rotatoriene. Det var stor forskjell i innhold av sink i byttedyrene, men torskelarvene hadde likevel ganske likt sinkinnhold. Siden sinknivået er strengt regulert i de fleste dyr, er det sannsynlig at rotatorier inneholdt tilstrekkelige mengder sink til å dekke behovet, og at overskuddet ble skilt ut i de larvene som fikk copepoder. Forskjellig nivå av polart lipid kan ha gitt en forskjell i vekst, men siden rotatoriene inneholdt mer enn 20% av fetter som fosfolipid er det lite sannsynlig at forskjellen ville blitt så stor som i dette forsøket. Protein og taurin kan forklare vekstforskjeller Lave nivå av protein og taurin i rotatorier er den mest sannsynlige årsaken til vekstforskjellen. Proteininnholdet i hjuldyr var bare ca 2/3 av nivået i copepoder. Protein er det viktigste av hovednæringsstoffene og danner grunnlaget for alle biologiske prosesser. Det består av aminosyrer som i tillegg til å gi proteinene sine unike funksjoner har en rekke andre roller i metabolismen. Tabell 1. Nivå av næringsstoffer i byttedyr brukt i ernæringsforsøket i CODE (TS: tørrstoff; TFS: totale fettsyrer; TL: total lipid; Asterixer angir signifikante forskjeller mellom rotatorier og copepoder: * p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,001) Rotaorier Artemia copepoder Protein (g/100 g TS) 37 ± 4 39 ± 0 60 ± 2*** Taurin (µmol/g TS) 0,8 ± 0,3 29 ± 1 50 ± 6*** Pigmenter (mg/kg TS) Canthaxanthin 32 ± 4 86 ± ± 1*** Astaxanthin 11,1 ± 1,0 n.d. 141 ± 15*** Mineraler (mg/kg TS) Jod 2,6 ± 0,8 3.9 ± ± 13* Zink 41 ± ± ± 75*** Fett og fettsyrer 20:4n-6 ARA (% TFS) 1,9 ± 0,1 2,4± 0,0 0,6 ± 0,1* 20:5n-3 EPA (% TFS) 4,4 ± 0,2 4,1 ± 0,3 10,8 ± 1,9** 22:6n-3 DHA (% TFS) 32 ± 3 19 ± 3 22 ± 4* EPA/ARA 2,3 1,7 18,0 Sum totale fettsyrer (g/kg 98 ± ± ± 39 TS) Sum PL (% TL) 22 ± 2 25 ± 0 29 ± 2* Taurin viktig for fettmetabolisme og osmoregulering Taurin var mer enn 50 ganger lavere i rotatorier sammenlignet med copepoder. Taurin er kjent som en viktig komponent i galle, og lavt taurin kan derfor føre til dårlig fettfordøyelse. Taurin er også en osmolytt, og er derfor viktig for larvens osmoregulering. En velbalansert osmoregulering er kritisk for små fiskelarver som lever i sjøvann som er saltere enn kroppsvesken, og som også har svært stor overflate i forhold til volum. En annen viktig funksjon av taurin er som buffer i mitokondrier- cellenes energikraftverk. Aktiv inn-transport av taurin skaper et høyt osmotisk trykk i mitokondriene, noe som er en forutsetning for energiproduksjonen. Hvis denne funksjonen forsvinner vil mitokondriene begynne å produsere frie radikaler og forårsake oksidativt stress og celledød. Det er interessant å se at fôring av rotatorier anriket med taurin til larver av en flyndre (Rock sole) førte til en tilvarende vekststimulering som med dyreplankton i vårt forsøk (Hawkyard et al 2014). Anrike hjuldyr med protein og taurin Kan man anrike hjuldyr med protein og taurin? Proteinanrikning er vanskelig fordi rotatoriene har sin egen metabolisme og vil lage sitt kroppsprotein kun basert på sin genetiske kode. Ekstra protein i tarmen som kan imidlertid øke totalproteinet, og i våre forsøk er 45 % av tørrstoff det høyeste proteinnivå som er oppnådd. Under oppbevaring av rotatoriene vil anrikningen dessverre forsvinne etter kort tid. Man kan imidlertid kanskje utvikle fôrings-strategier der man gir ekstra protein som et tørt fôr ved siden av rotatoriene, for å bedre proteintilførselen til fiskelarver. 18

19 Ernæring Taurin er vannløselig. Man kan anrike rotatorier med taurin ved å løse det i vannet i anrikningstanken, men det kreves store mengder for å få riktig nivå. Det er kanskje mindre kostnadskrevende å anrike partikler med taurin som hjuldyrene kan filtrere ut av vannet. Slike metoder er under utvikling (Hawkyard et al., 2014). Analyser rotatoriene før bruk Hvordan kan man vite om man har et riktig sammensatt rotatorie ernæringsmessig sett? Mange ulike dyrknings- og anrikningsdietter kan gi rotatorier som har en god ernæringsmessig sammensetning for marine fiskelarver, men valg av dietter er et sjansespill fordi ulike dietter har ulike nivåer av mange av næringsstoffene. Det man kan gjøre er å analysere rotatoriene for kritiske næringsstoffer før man bruker dem i produksjonen. Ved eventuelle mangler kan man så tilsette ekstra av det aktuelle næringsstoffet i dyrknings- eller anrikningsfôret. Antatt optimale nivå av en del kritiske næringsstoff er gitt i Tabell 2. Tabell 2. Antatt optimale nivå av endel næringsstoffer i hjuldyr som skal brukes til torskelarver. Tallene er estimater, og hjuldyrene kan fungere også med store avvik fra anbefalingen. Dette er imidlertid et første forsøk på å anslå noen behov hos fiskelarver. (TS: tørrstoff; TFS: totale fettsyrer; TL: total lipid) A Anbefalt nivå Protein (g/100 g TS) 60 1 Taurin (µmol/g TS) 50 1 Vitaminer (mg/kg TS) A 2,4 2 C E (α-tokoferol.) Tiamin >15 4 Mineraler (mg/kg TS) Jod 3,5 3 Selen 0,3-2 3 Fett og fettsyrer 4 20:4n-6 ARA (% TFS) 0,6-2,4 20:5n-3 EPA (% TFS) :6n-3 DHA (% TFS) >20 Sum fatty acids (g/kg TS) Basert på innhold I naturlig plankton i dette studiet. Ikke oppnåelig med dagens metoder 2 Basert på forsøk med kveite postlarver (Moren m.fl., 2004) 3 Basert på forsøk med torskelarver (Penglase m.fl., 2010; 2013) 4 Basert på innhold i copepoder. 5 Basert på erfaring Fiskestørrelse fra 0.2g - 400g Over 99% nøyaktighet Opp til smolt i timen Snittvekt og størrelsesfordeling Database med bilde av hver fisk Tellerapport En til fire kanaler Spesial brønnbåt versjon vaki.is 19

20 Metabolisme NMR OG METABOLOMICS Kjernemagnetisk resonans spektroskopi (NMR) brukes for å studere atomkjerner som spinner i et sterkt magnetfelt. Metoden kan brukes til å studere bl.a. 1 H og 13 C, som forekommer i organiske molekyler. Signalene fra ulike kjerner endrer seg dersom de kjemiske omgivelsene endrer seg, så man kan se på forandringer i kjemiske prosesser. NMR-analyse gir store datasett som kan analyseres ved hjelp av statistikk for å hente ut informasjon, og metoden brukes til å studere opprinnelse og kvalitet i f.eks. olivenoljer, vindruer, juice, eller til å studere kvalitet/nedbrytning i fiskefilet el tran. Metoden brukes i medisin for å se etter tegn til sykdom i urin- eller plasmaprøver fra pasienter, og man kan avdekke f.eks. endringer i stoffskiftet eller ulike kreftformer. Magnet-resonans-signaler kan også avleses i bilder, og magnet resonans imaging (MRI) brukes i forskning og medisin for å avbilde organismer og se etter skader eller endringer i vev og strukturer. Alle levende organismer har et stoffskifte (metabolisme), der ulike "byggesteiner" bygges opp eller brytes ned. Metabolomics er studiet av de stoffene som inngår i dette stoffskiftet. NMR er godt egnet til å studere metabolisme og dynamiske prosesser, og man kan rette analysen mot spesifikke deler av et svært komplekst system. Det er mulig å analysere hele celler eller små organismer som f.eks. larver eller biller uten å dele de opp, men ofte brukes ekstrakter for å få bedre oppløsning eller mer spesifikk informasjon om visse byggesteiner eller molekyler. Effekt av temperatur og ernæring på utvikling av torskelarver i tidlige stadier: Hvordan påvirkes metabolismen? I alle levende organismer foregår et stoffskifte, eller metabolisme, som betegner kjemiske prosesser der stoffer brytes ned til enklere forbindelser eller nye forbindelser bygges opp. Stoffskiftet pågår hele tiden, og det er svært mange prosesser som må fungere for at organismen skal vokse og utvikle seg normalt. Prosessene er tilpasset en gitt kroppstemperatur og hos beinfisk som torsk reguleres kroppstemperatur i takt med omgivelsene. Endringer i vanntemperatur vil derfor kunne påvirke stoffskifteprosesser. Det samme gjelder for ernæring, fordi mange prosesser må tilføres «byggesteiner» fra maten som torskelarvene spiser, og kostholdet har innvirkning fra det øyeblikket larvene begynner å spise. Torskeyngel i ernæringsforsøk. Foto: Ivar Rønnestad Matilde S. Chauton matilde.skogen.chauton@sintef.no Kjernemagnetisk resonans spektroskopi (NMR) er en metode der man studerer visse atomer i forskjellige forbindelser, og man kan observere isotoper av H, C, P, Si og N, for å nevne noen. Analysen fanger opp mange ulike forbindelser i en prøve, og gir stort datautbytte som kan bearbeides videre ved hjelp av statistiske analyser. Metoden brukes til å studere metabolomet (de stoffene som inngår stoffskiftet) hos mange ulike organismer, og det er mulig å studere hele celler eller organismer uten å ødelegge dem 1. Det er imidlertid en del utfordringer med å studere hele celler, så vanligvis ekstraheres vevsprøver før man foretar NMR-analysen. Hvordan påvirker metabolomet torskelarvene? Vi vet en del om enkeltprosesser i fiskens stoffskifte, og moderne analysemetoder gir oss mulighet til å analysere prøver for å få "øyeblikksbilder" av mange stoffskifteprosesser eller deler av dem for å utvide kunnskapen. I CODE-prosjektet har vi brukt NMR til å analysere ekstrakt fra hele torskelarver, og analysen gir oss informasjon om mange viktige forbindelser som inngår i stoffskiftet: aminosyrer, energiforbindelser, laktat, eller osmolytter. Analysene av stoffskifte hos torskelarver i temperatur- og ernæringsforsøkene i CODE-prosjektet har gitt viktig informasjon om hvordan disse variablene påvirker torskelarvene. Et eksempel fra ernæringsforsøket er gitt i figur 1, og NMR-dataene viser larver som er fra hhv stadium 1, 2, 3, 4 og 5. Man ser at det er forskjeller i metabolismen ettersom larvene blir eldre og får ulik diett (hjuldyr vs. copepoder). Fordi metabolomet påvirkes av mange faktorer må man tolke dataene både som følge av eksperimentelt oppsett og som følge av utvikling. Noen endringer skyldes forskjeller som følge av kostholdet (eksperimentelt oppsett) mens andre forskjeller kan skyldes f.eks. økt muskelaktivitet i eldre larver (biologisk variabel). 20