Jakten på krepsepesten!

Transkript

1 Nationell Kräftkonferens, Jönköping, november 2013 Jakten på krepsepesten! David A. Strand & Trude Vrålstad

2 Oversikt Innledning Krepsepest Hva er krepsepest Molekylære verktøy A. astaci på Kreps Prevalens og agensnivå A. astaci sporer i vann På lab og i akvariet I felt Deteksjon av sporer Sporer fra bærerkreps (Signalkreps) Sporer fra infisert edelkreps Vann med bærer kreps Krepsepest utbrudd Andre resultater Alternative verter Historiske utbrudd

3 Aphanomyces astaci - krepsepest vann Europeisk Amerikansk B A Frittlevende sporer og cyster i vann Spres og infiserer via svømmende sporer Parasittisk / patogen fase i kreps

4 Spredning av krepsepest i Europa? David Alderman, CEFAS, UK (with permission)

5 Krepsepestens opprinnelse Ukjent Genotype A «Old-type» Spiny cheek crayfish (Orconectes limosus) Genotype E Signalkreps (Pacifastacus leniusculus) Genotype B, C Rød sumpkreps (Procambarus clarkii) Genotype D ?? 1973?? 1890

6 <1000 gjenværende Edelkrepspopulasjoner > 4000 signalkreps populasjoner

7 Krepsepest i Norge , Edelkreps populasjoner Ulovlig introdusert signalkreps

8 Den gamle verktøykassen for Krepsepest diagnostikk Field diagnosis Disease observations Gross pathology Microscopic pathology Microscopic presumptive identification Isolation in pure culture Verification of identity and/or virulence Veldig lav suksessrate i de fleste diagnostikk laboratorier

9 Den nye verktøykassen for krepsepest diagnostikk Spesifikk PCR DNA sekvensering Arts identifisering Spesifikk Kvantifisering av A. astaci real-time PCR Mikrosatellitt analyse A. astaci genotype Høy suksessrate i de fleste diagnostikk laboratorier

10 Alle genotyper TaqMan MGB Real-time PCR for spesifikk påvisning og kvantifisering av A. astaci Primer F Probe Primer R Unik A. astaci DNA sekvens for alle kjente genotyper Svært spesifikk, ingen kryssreaksjoner med kjente nære slektninger/agens Svært sensitiv Deteksjonsgrense (LOD) = 5 DNA kopier Kvantifiseringsgrense (LOQ) = 50 DNA kopier Påviser og kvantifiserer Spesifikk probe 97 Unik A. astaci DNA målsekvens Spesifikk primer F A. astaci Speifikk primer R Vrålstad et al, 2009

11 Molekylær diagnostikk: -påvisning av sykdomsagens i infisert vev Bærerstatus/ Prevalens Krepsepest diagnostikk vann

12 Deteksjon i Kreps Rask analyse (1 2 dager) Antall smittede individer (Prevalens) Infeksjonsnivå på kreps (Agensnivå) LOD = Deteksjonsgrense LOQ = Kvantifiseringsgrense Antall DNA kopier

13 A. astaci positive kreps (%) Prevalens av A. astaci i signalkreps 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% Negative Positive 20% 10% 0% Total Kutikula Bein Halevifte Flekk Vevsprøve Antall kreps: 44, Antall kreps med flekker 13 (29.5 %) Vrålstad et al, 2011

14 Prevalens av A. astaci i signalkreps Forskjellige vann i Sverige

15 A. astaci positive kreps (%) Prevalens av A. astaci i signalkreps Stora Le, Sverige % 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%

16 Molekylær ovevåking: påvisning av sporer i vann Smittesporing i vann Bærerstatus/ Prevalens Krepsepest diagnostikk vann

17 Hvor mange A. astaci sporer trenger vi for å påvise og kvantisisere dem? Krepsepestspore < 10 mm Laboratorie forsøk Test av sporer i vann Test av vann fra akvarier med Bærerkreps (Signalkreps) Infisert edelkreps (Utbrudd) Feltstudier Innsjøer med bærerkreps (Signalkreps) Utbrudd i edelkreps populasjon

18 Deteksjon av Sporer i Vann Påviser ned til én spore i prøven Kvantifiserer fra > 10 sporer i prøven Antall DNA kopier LOD LOQ LOD = Deteksjonsgrense LOQ = Kvantifiseringsgrense Strand et al, 2011

19 Hvor mye sporer avgis fra amerikansk bærerkreps? Når? Hele tiden eller kun ved død og skallskifte? Sesong (temperatur)?

20 Signalkreps med positiv bærerstatus Singelkreps 2L vann 1 kreps 18 ºC (x10 rep) 2L vann 1 kreps 4 ºC (x10 rep) Sambokreps 100L vann 20 kreps Romtemp (17-23) ºC (x4 rep) Strand et al, 2012

21 # sporer per kreps/uke # sporer per kreps/uke # sporer per kreps/uke 10 7 Singelkreps Sambokreps Gjennomsnitt ~ Median ~800 ~ Gjennomsitt ~2300 Median Strand et al, ~500 Levende ~ ~ ~ Døende, død & skallskifte ~250 ~ ºC 18 ºC

22 # sporer per kreps/uke # sporer per kreps/uke 10 7 Singelkreps Sambokreps Gjennomsnitt ~ Median ~800 ~ Gjennomsitt ~2300 Median Strand et al, Negativ korrelasjon # sporer - vanntemp ~2000 ~ Levende Død & skallskifte Vanntemperatur ºC

23 Hvor mye sporer avgis under infeksjon og død av edelkreps? Hvor raskt etter infeksjon og død produseres sporer?

24 Lab. forsøk - Sporulering fra infisert edelkreps (Utbrudd) Rask økning i antall sporer etter 12 timer Spore-topp etter Makkonen et al, 2013

25 Laboratorie forsøk - Konklusjon Sensitiv metode Kan detektere en spore Gir et røft spore estimat Sporer produseres kontinuerlig av infisert bærerkreps Ved 4 ºC og 18 ºC Økt sporeproduksjon ved skallskifte og død Høyere sporetetthet ved bunn Rask og kraftig sporulering rett etter død av infisert edelkreps Økt sporulering 12 timer etter død Spore topp ca timer etter død Strand et al. 2011, Strand et al. 2012, Makkonen et al. 2013

26 Strand et al. submitted Feltstudier - Spore deteksjon i naturlige vassdrag Membran-filtrering Polykarbonat-filter 3µm pore størrelse L vann Passer for små systemer Ultra-filtrering Hemodialyse-filter 1.8m 2 membranoverflate >100 L vann Tangiental-flow eller dead-end setup Passer for store systemer Dybde-filtrering Glassfiber-filter Partikler>0.9µm 2 to 10 L vann Passer for store systemer

27 Feltstudier - Lokasjoner Krepsepest utbrudd i en Edelkreps populasjon Innsjø og farm med Signalkreps

28 Strand et al. submitted A. astaci sporetettheter Innsjøer Øymarksjøen, Norge Ultra filtrering 100L vannprøver 1 prøve ved bunn & overflate

29 Strand et al. submitted Sammenligning tre innsjøer Sporer i vann Infeksjonsnivå Prevalens

30 Spores/L Krepsepestutbrudd i edelkrepspopulasjon 1000,00 Bridge 1 Bridge 2 100,00 10,00 1, August Week September Elv med edelkreps Krepsepestutbrudd Invasjonsfront Glassfiber-filtrering 3L x 5 Høye sporetettheter Strand et al. submitted

31 Strand et al. submitted Feltstudier - Oppsummering Innsjøer med signalkreps Krepsepest utbrudd Farm med signalkreps

32 Feltstudier - Konklusjon Populasjon med Bærerkreps Relativt få sporer Heterogen fordeling Høyere sporetetthet ved bunn Assosiasjon mellom prevalens, infeksjonsnivå og sporetetthet Krepsepest utbrudd Høy sporetetthet Høyt infeksjons press Strand et al, submittet

33 Genotyper av Krepsepest i Norge 5 genotyper kjent: A-E ,1974 A genotype (150 år) B genotype (45 år) Vrålstad et al. submitted Edelkreps populasjoner Ulovlig introdusert signalkreps

34 Alternative verter - Ferskvannskrabbe Svoboda et al. submitted

35 Applikasjoner av nye molekylære verktøy Testing av kreps for A. astaci infeksjon Tidlig deteksjon av A. astaci i naturlige miljøer Overvåking av Elver og innsjøer etter utbrudd Bærerpopulasjoner (signalkreps) Evaluering av habitater for reetablering av edelkreps Mer nøyaktig risikovurderinger i forhold til sykdoms kontroll og smittespreding Søke etter alternative verter Undersøke sykdomshistorie for nye og gamle utbrudd (genotype)

36 Acknowledgements Norwegian Research Council Co-authors and collaborators Trude Vrålstad, Hildegunn Viljugrein, Arne Holst-Jensen, Rosa Fristad (NVI), Jannicke Wiik-Nielsen Bente Edvardsen, Dag Klaveness, MERG, UiO Lennart Edsman, Fredrik Engdahl, SLU Stein Ivar Johnsen, NINA Swedish University of Agricultural Scien Norwegian Institute for Nature Research Japo Jussila, Harri Kokko, Jenny Makkonen, UEF Satu Viljamaa-Dirks, EVIRA Frederic Grandjean, Adam Petrusek, Jiri Svoboda, University of Poitiers Finnish Food Safety Authority Charles University in Prague