Biokjemiske reaksjonsruter. Glykolyse. Nedbrytning av glukose til cellulær energi

Transkript

1 Forelesning i glykolyse. Medisin stadium 1A, Geir Slupphaug, IKM Biokjemiske reaksjonsruter Kan virke svært forvirrende ved første øyekast. Slike oversikter er imidlertid ikke annet enn en form for kart, som f. eks. kartet over Londons undergrunnssystem Det er viktig å huske at målet ofte kan nåes på flere ulike måter, og med flere stopp underveis. En kan også snu og dra tilbake om ønskelig Nedbrytning av glukose til cellulær energi Nedbrytning av karbohydrater, og spesielt glukose er en viktig kilde til energi i cellene. Fullstendig nedbrytning (forbrenning) av glukose til C 2 og 2 skjer i følgende reaksjon C C Energi Denne reaksjonen frigjør mye energi, men for at cellene skal kunne nyttegjøre seg denne energien, skjer nedbrytningen via en rekke mindre trinn. Flere av disse trinnene er koblet til syntese av ATP, som er cellenes viktigste kilde til lett tilgjengelig energi Glykolyse Den første delen av nedbrytningen av glukose kalles glykolyse. I denne prosessen spaltes ett glukosemolekyl i to, samtidig som det foretas en intern rearrangering av atomene. Det dannes derved to molekyler pyruvat (pyrodruesyre), samtidig som det dannes litt energi i form av to molekyler ATP og to molekyler NAD. Glykolysen skjer via flere trinn, som hvert katalyseres av ett bestemt enzym. Samtlige av disse enzymene befinner seg i cellenes cytosol Glykolyse skjer i så godt som alle levende celler Pyruvat kan igjen kanaliseres inn i TCA-syklus (Krebs syklus) og brytes fullstendig ned til C 2 og vann. Denne fullstendige nedbrytningen genererer mye ATP 1

2 istorikk Cytosol ppdagelsen og kartleggingen av glykolysen var sentral i utviklingen innen biokjemi, men startet ved en tilfeldighet En nøkkeloppdagelse skjedde i 1897, da ans og Eduard Buchner prøvde å finne nye konserveringsmidler for terapeutiske gjærekstrakt. Da de prøvde sukrose, oppdaget de at dette raskt ble fermentert til etanol Eduard Buchner Senere studier med muskelekstrakt viste at disse kunne danne melkesyre, via mange av de samme reaksjonene som ved fermentering i gjær De fullstendige reaksjonene i glykolysen ble kartlagt i 1940, med bidrag fra bl. A Gustav Embden, tto Meyerhof, Carl og Gerty Cori mfl. Glykolysen kalles derfor også Embden-Meyerhof reaksjonsveien Cytosol er den tyktflytende (kolloide) væsken som alle cellens formede bestanddeler er omgitt av Kjernemembranen Kjernelegemet (nukleolus) Cytosol Cellemembranen Det endoplasmatiske retikulum (ER) Cellekjernen Lysosomer Mitokondrier Innbuktninger i cellemembranen Ribosomer Centrioler Golgiapparatet ATP Bindingene mellom fosfatgruppene i adenosin trifosfat (ATP) er meget energirike. ATP er derfor den viktigste bæreren av raskt tilgjengelig energi i cellene ATP forbrukes nesten straks det er dannet, slik at det må kontinuerlig erstattes i cellene ydrolyse av den terminale fosfatbindingen frigjør 30.5 kj/mol Adenin Ribose-sukker Energirik binding Fosfat-grupper Energien som frigjøres ved hydrolyse av ATP skyldes Ladningsrepulsjon mellom negative ladninger Resonansstabilisering av avspaltet fosfat ADP og fosfat solvatiseres bedre enn ATP C Adenin Energi fra nedbrytning av næringsstoffer 2 Adenin C 2 -P -P -P Ribose ATP ADP+Pi C 2 -P -P + Ribose 2 Energi til biosyntese og arbeid -P C N P 2

3 ksydasjon/reduksjon ksydasjon innebærer fjerning av et elektron - enten alene eller i form av et hydrogenatom. ksydasjoner er nedbrytningseaksjoner (katabolske) som frigjør energi Redusert molekyl Frigitt energi ksydert molekyl + I syntesereaksjoner (anabolske) skjer det motsatte. Forbindelser reduseres ved at elektroner eller hydrogenatomer tas opp. ksydert molekyl + ydrogenatomer ydrogenatomer Energi Redusert molekyl I cellene skjer oksydasjons- og reduksjonsprosesser samtidig. Når næringsmolekyler oksyderes, tas ofte elektronene opp av bestemte elektronbærere, som så reduseres. Disse elektronbærerne kan så avgi elektronene til syntesereaksjoner i cellene, blant annet til dannelse av ATP De viktigste elektronbærerne er NAD, NADP og FAD 2 NAD og NADP er de viktigste elektronbærerene i cellene, og inngår som kofaktor i mer enn 200 kjente enzymer i kroppen. Nikotinamidgruppen dannes fra niacin (vitamin B 3 ), og mangel på niacin kan resultere i pellagra Nikotinamidgruppen kan akseptere to elektroner og et proton (= hydridion, - ) og danner NAD. I denne reduserte formen har nikotinamid nedsatt stabilitet (det er aktivert) og kan lett overføre hydridionet til andre molekyler NAD, NADP ksydert (NADP + ) Mangler i NAD+ Redusert (NADP) Trinnene i glykolysen 3

4 Energiinnholdet i intermediatene De første mellomproduktene i glykolysen har høyere innhold av energi enn glukose selv Disse krever derfor en investering av energi, og gjøres for å fange glukose i cellen, og omdanne den til fosforylerte trekarbonprodukt, som lett kan brytes videre ned og gi energi Trinn 1 Glukose ΔG o = kj/mol Glukose-6-fosfat eksokinase (hjerne) Glukokinase (lever) (induced fit) Glukose tas opp i cellene gjennom spesifikke transportproteiner. Straks et glukosemolekyl kommer inn i cytosol, vil fosfat bli addert og vi får dannet glukose-6-fosfat under forbruk av 1 ATP. Glukose-6-fosfat har relativt lav energi, men de følgende reaksjonstrinn vil gjøre dette til en fosfat med høyt overføringspotensial (høy energi). Fosfatgruppen vil dessuten gjøre molekylet svært polart, slik at det ikke lekker ut av cellen igjen Trinn 2 Trinn 3 Fruktose-6-fosfat Glukose-6-fosfat ΔG o = 1.7 kj/mol Fruktose-6-fosfat Fosfoglukoisomerase Aldosesukkeret i denne reversible reaksjonen overfører ring-oksygenbindingen fra C1 til C2 (danner ketose), og derved eksponeres -gruppen på C1 og klargjøres for fosforylering Katalysen skjer via åpning av sukkerringen ΔG o = kj/mol Fruktose-1,6-bisfosfat Fosfofruktokinase-1 (PFK1) Dette er det andre energi-investeringstrinnet i glykolysen. ATP donerer både fosforylgruppen og energien til å drive denne irreversible reaksjonen Fosfofruktokinasen utgjør det viktigste kontrollpunktet i glykolysen 4

5 Trinn 4 Fruktose-1,6-bisfosfat Trinn 5 NAD + Glyseraldehyd-3-fosfat ΔG o = 23.8 kj/mol ΔG o = 6.3 kj/mol Dihydroksyacetonfosfat Glyseraldehyd- 3-fosfat ΔG o = 7.5 kj/mol Aldolase Triosefosfat isomerase Aldolase spalter fruktose-1,6-bisfosfat i to triosefosfater, en ketose og en aldose. Disse vil danne en innbyrdes likevekt katalysert av triosefosfat-isomerase, hvor forholdet mellom de to er 96:4 Siden glyseraldehyd-3-fosfat er substratet for den energigivende delen av glykolysen, vil likevel reaksjonen konstant dras mot dannelse av aldose 1,3-Bisfosfoglysersyre Glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase I denne reaksjonen oksyderes aldehydgruppen til en karboksylgruppe ved hjelp av NAD +. Den frigjorte energien er tilstrekkelig til å addere en fosfatgruppe (fra uorganisk fosfat) til karboksylgruppen. Da NAD + i cellene er begrenset, må NAD raskt reoksyderes for at glykolysen ikke skal stoppe opp NB! Arsenat kan kobles på i stedet for fosfat. I det påfølgende trinnet vil den imidlertid spaltes av uten å produsere ATP. Arsenikk virker derved som en utkobler av ATP-syntesen i dette trinnet Trinn 6 1,3-Bisfosfoglysersyre ΔG o = -18.5kJ/mol 3-Fosfoglysersyre Fosfoglyserat kinase 1-Fosfatgruppen i 1,3-bisfosfoglysersyre er en acyl-fosfat, som har meget høy energi (-49.4 kj/mol). Dette er betydelig høyere enn den terminale fosfatgruppen i ATP. Fosfatgruppen, og energien i bindingen, kan derfor lett overføres til ADP Dette er den første av de to såkalte substrat-nivå fosforyleringene i glykolysen Trinn 7 3-Fosfoglysersyre ΔG o = 4.4 kj/mol 2-Fosfoglysersyre Fosfoglyserat mutase 3-fosfoglyserat rearrangeres av fosfoglyserat mutase (Mg 2+ -avhengig) til 2-fosfoglysersyre for å klargjøre til dannelse av den neste høyenergiforbindelsen. I denne reaksjonen dannes mellomproduktet 2,3 bisfosfoglycersyre, som kan diffundere ut av det aktive setet og etterlate enzymet inaktivt. Cellene produserer overskudd 2,3BPG for å fylle opp enzymet og komplettere reaksjonen 5

6 Trinn 8 Trinn 9 2-Fosfoglysersyre Fosfoenol-pyrodruesyre (PEP) ΔG o = 7.5 kj/mol Fosfoenol-pyrodruesyre (PEP) 2 Enolase ΔG o = kj/mol Pyrodruesyre Pyruvat kinase Enolase (Mg ++ -avhengig) katalyserer dehydratisering av 2- fosfoglysersyre til fosfoenolpyrodruesyre, som er den andre høyenergi-fosfatforbindelsen i glykolysen. Denne fosfatgruppen har en mye høyere (-61.9 kj/mol) i forhold til fosfatgruppen i 2-fosfoglysersyre (-17.6 kj/mol). Fosfoenolpyrodruesyre har en energirik enolfosfatbinding (-61.9 kj/mol) som er mye høyere enn den terminale bindingen i ATP. Fosfatgruppen kan derfor lett overføres til ADP og danne ATP Dette er den andre substratnivå-fosforyleringen i glykolysen Regulering av flyten i glykolysen Når cellenes energinivå er lavt, vil glykolyseaktiviteten øke (dersom karbohydrater er tilgjengelige). Dette reguleres blant annet ved at aktiviteten av flere enzymatiske trinn i glykolysen øker. Slike enzymer kalles regulatorenzymer. eksokinase Inhib. (ikke i lever) I glykolysen har vi tre slike regulatorenzymer: eksokinase Fosfofruktokinase 1 Pyruvat kinase Fosfofruktokinase Pyruvat kinase 6

7 Fosfofruktokinase 1-ovedregulatoren i glykolysen? Fosfofruktokinase 1 er et allosterisk enzym som består av 4 like subenheter. Aktiviteten hemmes når cellens energitilgang er god. Dette skjer ved at ATP binder enzymet og nedsetter dets affinitet for fruktose-6-fosfat (økt Km). Når cellen har rik tilgang på prekursorer til Krebs syklus (pyruvat, fettsyrer mm), vil sitronsyreinnholdet i mitokondriene øke. Sitronsyre transporteres da ut til cytosol og øker ATP-bindingen til fosfofruktokinase og hemmer glykolysen. AMP kan binde i stedet for ATP, og konformasjonsendringen fører da til økt enzymaktivitet ADP (Regulatorisk) ADP (Produkt) Mg 2+ Fruktose 1,6-bisfosfat I mange lærebøker angis PFK1 å være hovedregulatoren i glykolysen. Dette synet deles ikke av alle, blant annet den kjente enzymbiokjemikeren Athel Cornish Bowden. an refererer til flere eksperiment hvor celler har blitt tilført ekstra genkopier slik at de overuttrykker PFK1, uten at dette har noen som helst effekt på totalflyten gjennom glykolysen (f eks. til etanol i gjær). PFK1 aktiveres også av fruktose 2,6-bisfosfat Leverens spesielle funksjon i regulering av blodglukose, krever mange kontrollmekanismer. En av disse skjer via hormonet glukagon, som signaliserer at leveren ikke skal bruke glukose selv, men i stedet skille ut glukose til blodet Dette skjer ved at glukagon forårsaker hemming av aktiviteten til enzymet fosfofruktokinase2 som omdanner fruktose 6-fosfat til fruktose 2,6-bisfosfat, mens det stimulerer aktiviteten til fruktose bisfosfatase2 som katalyserer den motsatte reaksjonen. Siden PFK1 i praksis er nesten inaktivt i fravær av fruktose 2,6- bisfosfat, vil altså glukagon stenge av aktiviteten av glykolysen i leveren. Denne reguleringen vil bli omtalt nærmere i en egen forelesning. eksokinase Inhib. (ikke i lever) Fosfofruktokinase Pyruvat kinase 7

8 eksokinase reguleres av produktinhibering Når fosfofruktokinasen hemmes, vil glukose-6-fosfat akkumuleres, og virke hemmende på heksokinase. I leveren benyttes et annet enzym, glukokinase i dette trinnet. Glukokinase hemmes ikke av glukose-6-fosfat, og har samtidig en lavere affinitet (høyere Km) for glukose. Dette har stor betydning for fordelingen av glukose i kroppen. Km=0.1 mm Ved lave blodkonsentrasjoner av glukose vil ikke leveren konkurrere med f. eks. Km=10 mm hjernen og røde blodlegemer om glukosen eksokinase Inhib. (ikke i lever) Fosfofruktokinase Pyruvat kinase Pyruvat kinase reguleres både allosterisk og av kovalent modifisering Det finnes ulike former av pyruvat kinase. L i lever og M i muskler. L-formen kan hemmes via hormonet glukagon, som fører til at fosfat binder enzymet og nedsetter dets aktivitet. Enzymet aktiveres imidlertid av økte mengder av fruktose 1-6-bisfosfat, som signaliserer at substratmolekyl er tilgjengelige lenger opp i reaksjonsveien. En tredje reguleringsmekanisme er kooperativ binding av PEP. Enzymet har 4 subenheter, og binding av PEP til den første, øker bindingsaffiniteten til den neste osv. Dette er analogt til binding av oksygen til hemoglobin Glykolysen er også avhengig av tilgang på NAD + For at glykolysen skal kunne passere trinn 5, er det nødvendig med kontinuerlig tilførsel av oksydert NAD +. Ved god oksygentilførsel til cellene (aerobe forhold) vil dette produseres i mitokondriene, ved at pyrodruesyre omsettes videre Under anaerobe forhold, f. eks under lange løp, må cellene ty til en krise mekanisme, ved at pyrodruesyre i stedet omdannes til melkesyre, katalysert av laktat dehydrogenase. Denne reaksjonen produserer NAD+ fra NAD. pphoping av melkesyre i vevene gir imidlertid fall i p, som til slutt kan føre til muskelkrampe. 8

9 Under anaerobe forhold kan celler holde glykolysen gående og skaffe seg energi ved omsetning av pyrodruesyre til melkesyre Mange typer kreftceller kan vokse under relativt anaerobe forhold, da de kan dekke mye av sitt energibehov via glykolysen. Dette skjer blant annet ved at de produserer mye laktat dehydrogenase Glykolyse NAD + NAD ATP Pyrodruesyre NAD C - C C 3 NAD + Laktat dehydrogenase C - C C 3 Melkesyre Anaerobe forhold Animalske celler Glukose Aerobe forhold Sitronsyresyklus C 2 Acetaldehyd C C 3 NAD NAD + C 2 C 3 Etanol Gjærceller ksygenmangelen som oppstår under tung fysisk trening vil vedvare en stund også etter at treningen er opphørt. Dette skyldes blant annet at den akkumulerte melkesyren må omsettes aerobt. Mye av dette skjer ved at melkesyren transporteres via blodet til leveren, hvor melkesyre tilbakedannes til glukose Cori syklus Melkesyre Glukose Lever Melkesyre Glukose Blod Muskler Mellomprodukter i glykolysen kan omdannes til andre produkt Glukose Glukose-6-fosfat Fruktose-6-fosfat Glyseraldehyd- 3-fosfat Dihydroacetonfosfat Pentosefosfater Aminosukkere Nukleotider Glykolipider, glykoproteiner Lipider 1,3-Bisfosfoglysersyre 2,3-Bisfosfoglysersyre 3-Fosfoglysersyre Serin 2-Fosfoglysersyre Fosfoenolpyrodruesyre Aromatiske aminosyrer Asparginsyre Pyrimidiner Pyrodruesyre Alanin Aspargin 9