Tuberkulose - diagnostiske og epidemiologiske laboratoriemetoder

Transkript

1 Tuberkulose - diagnostiske og epidemiologiske laboratoriemetoder Turid Mannsåker Nasjonalt referanselaboratorium for mykobakterier Smitteverndivisjonen, FHI

2 Dagens tuberkulosekontrollprogram: Viktigste langsiktige mål å eliminere smittespredning i Norge Forutsetninger: Alle nye tilfeller oppdages, aktiv og latent infeksjon Alle smittsomme tilfeller «tas ut av sirkulasjon» Alle diagnostiserte tilfeller behandles effektivt Aktivering av latent infeksjon forebygges

3 Bryte smittekjeden Smittestoff? Smittemottaker Smittekilde Inngangsport Utgangsport Smittemåte

4 Optimalt: -Smittestoff (Mycobacterium tuberculosis = MTBc) påvises og identifiseres raskt og riktig på grunnlag av TB-mistanke - Smittekilden(pasienten) isoleres dersom lunge-tuberkulose - Pasienten får effektiv behandling blir smittefri - Det søkes etter smitte hos mulige smittemottakere SMITTEOPPSPORING

5 Laboratorienettverkets rolle 1. Korrekt bakteriologisk diagnose av smittekilden 2. Korrekt rådgivning om medikamentell behandling 3. Undersøke prøver fra potensielle smittemottakere for å forhindre utvikling av aktiv sykdom hvis smittet for å stoppe videre smittespredning 4. Fastslå smittesammenheng ved genetisk karakterisiering -hviler påkompetanse og kapasitet i laboratorietjenestene

6 Laboratorienettverkets rolle 1. Korrekt bakteriologisk diagnose av smittekilden 2. Korrekt rådgivning om medikamentell behandling 3. Undersøke prøver fra potensielle smittemottakere for å forhindre utvikling av aktiv sykdom hvis smittet for å stoppe videre smittespredning 4. Fastslå smittesammenheng ved genetisk karakterisiering -hviler påkompetanse og kapasitet i laboratorietjenestene

7 1. Korrekt bakteriologisk diagnose Forutsetninger: Riktig prøvetaking flere prøvetakinger fra luftveier, smittevern Korrekt prøveforsendelse- rett adresse, påkrevet transportutstyr Analysemetoder -Rett kompetanse pårett sted, dokumentert kvalitetssikring, hensiktsmessig formidling av resultater i et fungerende nettverk av laboratorier.

8 1. Korrekt bakteriologisk diagnose Påvise aktiv TB-infeksjon Mikroskopifor direkte påvisning av syrefaste stavbakterier (mykobakterier), Ziehl-Nilsens fargemetode / fluorescens PCR-reaksjon (polymerase chain reaction) for direkte påvisning av MTB komplekset Dyrkning av mykobakterier Identifikasjon av Mycobacterium på speciesnivå Resistensundersøkelse Molekylærepidemiologiske undersøkelser «fingerprinting»

9 1. Korrekt laboratoriediagnose Identifikasjon av Mycobacterium species M. tuberculosis complex = MTBc M. tuberculosis M. bovis M. bovis BCG M. africanum M. caprae M. canettii M. microti M. pinnipedii M. leprae Non-tuberculosis mykobakterier = NTM Ofte patogene M. avium complex= MAC M. malmoense M. marinum M. abscessus M. fortuitum m.m.fl. Sjelden patogene / apatogene M. gordonae M. scrofulaceum m.m.fl.

10 1. Korrekt bakteriologisk diagnose Mikroskopi av syrefaste stavbakterier i pasientprøve ved mistenkt TB Krever smitteverntiltak og kjemisk avtrekk

11 1. Korrekt bakteriologisk diagnose Påvisning av DNA fra M.tuberculosis-komplekset i pasientprøve Konvensjonell PCR med probe for MTBc DNA Real time PCR GeneXpert Lukket system for PCR-påvisning av MTBc og rifampicinresistens (mutasjon i rpob-genet som koder for rifampicinresistens) Line probe assay (LPA) med flere prober impregnert i strips Påvisning av MTBc Påvisning av rifampicinresistens

12 1. Korrekt bakteriologisk diagnose Dyrkning av mykobakterier Krever høy smittevernberedskap i laboratoriet (P3-lab.) spesialkompetanse god kommunikasjon med kliniker og referanselaboratorium Tar tid

13 1. Korrekt bakteriologisk diagnose Optimalt valg av dyrkningsmedium Fast medium: Løwenstein-Jensen-medium, evt. med tilsetning Flytende medium: 7H9 7H12 MGIT (mycobacterium growth indicator tube)

14 1. Korrekt bakteriologisk diagnose Identifikasjon av dyrket bakteriekultur Morfologi - mikro- og makroskopisk Hurtigtest for identifikasjon av MTB kompleks - immunkromatografisk påvisning av spesifikt protein Genetisk identifikasjon på speciesnivå - LIPA-metode (- sekvensering)

15 1. Korrekt bakteriologisk diagnose Morfologi

16 Identifisering MTBc

17 Identifisering av Mycobacterium species med LIPA

18 Laboratoriets rolle 1. Korrekt bakteriologisk diagnose av smittekilden 2. Korrekt rådgivning om medikamentell behandling 3. Undersøke prøver fra potensielle smittemottakere for å forhindre utvikling av aktiv sykdom hvis smittet for å stoppe videre smittespredning 4. Fastslå smittesammenheng ved genetisk karakterisiering -hviler påkompetanse og kapasitet i laboratorietjenestene

19 2. Korrekt rådgivning om medikamentell behandling Påvise fenotypisk resistens BACTEC MIGIT 960 system er internasjonal standard -inkubering og daglig avlesing av fluorescens i maskinen. Automatisk utflagging av prøver. Utskrift med konklusjon.

20 2. Korrekt rådgivning om medikamentell behandling Påvise genetisk resistens GenetiGenoType MTBDRPlus : Rifampicin og isoniazid-resistens Etterutdanningskurs FHI/Ullevål mars 2012

21 Etterutdanningskurs FHI/Ullevål mars 2012

22 Laboratoriets rolle 1. Korrekt bakteriologisk diagnose av smittekilden 2. Korrekt rådgivning om medikamentell behandling 3. Undersøke prøver fra potensielle smittemottakere for å forhindre utvikling av aktiv sykdom hvis smittet for å stoppe videre smittespredning 4. Fastslå smittesammenheng ved genetisk karakterisiering -hviler påkompetanse og kapasitet i laboratorietjenestene

23 3. Korrekt undersøkelse av potensielle smittemottakere Kommunehelsetjenesten definerer omfang av smitteoppsporingen Kliniske symptomer på aktiv lungeinfeksjon: Funn ved røntgen-u.s. av lunger Prøver fra luftveier til laboratorium for påvisning av M. tuberculosis-bakterier Påvisning av latent infeksjon: Hudtest (Mantoux) NB. Hudtesten blir positiv ogsåetter gjennomgått vaksinasjon eller infeksjon med andre mykobakterier Serumprøve til laboratorium for IGRA-testing Interferon-Gamma Release Assay påviser gjennomgått eksponering og immunstimulering spesifikt rettet mot M. tuberculosis.

24 IGRA: Nye spesifikke blod-tester for TB: IFN-γ baserte assay Stimulering av T celler med M. tuberculosisspesifikke Ag: ESAT-6, CFP10 som mangler i BCG og andre mykobakterier Frigjort IFN- γmåles med ELISA eller ELISPOT metode Bedre spesifisitet og sensitivitet Ikke kryssreaksjon med BCG vaksinering Ikke kryssreaksjon med andre mykobakterier (noen få unntak) Testen påviser effektor T celle respons mot tilstedeværende bakterier Testen differensierer ikke mellom aktiv og latent TB Kan ikke brukes til monitorering av behandlingseffekt Fredrik Oftung, mars 2009

25 3. Korrekt undersøkelse av potensielle smittemottakere IGRA-tester Quantiferon Måler mengde IF- γ produsert i T-celler ved stimulering med MTBc-antigen. Blir utført ved flere regionsykehus. Dersom inkonklusivt resultat på grunn av nedsatt immunitet: T-SPOT TB. Måler antall IF-γ-produserende T-celler etter stimulering med MTBcantigen. Litt mer sensitiv Nasjonalt tilbud ved FHI

26 Laboratoriets rolle 1. Korrekt bakteriologisk diagnose av smittekilden 2. Korrekt rådgivning om medikamentell behandling 3. Undersøke prøver fra potensielle smittemottakere for å forhindre utvikling av aktiv sykdom hvis smittet for å stoppe videre smittespredning 4. Fastslå smittesammenheng ved genetisk karakterisiering -hviler påkompetanse og kapasitet i laboratorietjenestene

27 4. Fastslå smittesammenheng ved genetisk karakterisiering Molekylærepidemiologiske analyser = «fingerprinting» Påviser genetisk likhet som uttrykk for at bakteriestammer kommer fra samme smittekilde Påvise smittekjeder oppklaring av utbrudd (clustere) Påvise krysskontaminering av prøve i laboratoriet Epidemiologisk overvåking Evolusjons-studier

28 4. Fastslå smittesammenheng ved genetisk karakterisiering Sammenligner utvalgte DNA-sekvenser hos stammer fra ulike pasienter. Spoligotyping- egnet til å vise tilhørighet til «TB-familie» RFLP = Restriction Fragment Length Polymorphism diskriminerer bra mellom clustere tidligere internasjonal standard MIRU-VNTR= Mycobacterial Interspersed Repetitive Units-Variable Number of Tandem Repeats diskriminerer bra mellom clustere Lettere å sammenligne mellom laboratorier ny internasjonal standard og database

29 4. Fastslå smittesammenheng ved genetisk karakterisiering Genetisk variasjon av M. tuberculosis i Norge Beijing CAS EAI Africanum H LAM MANU T X FAM 35/36 Wornæs JC. Hovedfamilier av Mycobacterium tuberculosis blant innvandrere i Norge. A thesis, UMB 2008 N: 1892? Kinander W. Major M. tuberculosis lineages among elderly Norwegians; A thesis, UMB 2009 N: 213 Beijing CAS EAI Africanum H LAM MANU T X FAM 35/36?

30 4. Fastslå smittesammenheng ved genetisk karakterisiering Påvisning av cluster (klynge) Rutine: Bakteriestamme fra alle nydiagnostiserte TB-tilfeller testes med MIRU-VNTR fortløpende DNA PCR sekvensering 24 lokasjoner på genomet karakteriseres Rådata prosesseres i eget dataprogram, kan påvise evt. genetisk «nært slektskap» med tidligere testede stammer Rapporteres til avdeling for infeksjonsovervåking som vurderer om tiltak skal settes inn.

31 4. Fastslå smittesammenheng ved genetisk karakterisering Profil på funn i 24 genlokasjoner

32

33

34

35 Molekylærepidemiologiske undersøkelser Status pr febr 2013 og foreløpige planer fremover 1.Rutinemessig molekylærepidemiologisk undersøkelse av alle nye tilfeller med fortløpende vurdering ved overvåkingsavdelingen. 2. MIRU-VNTR testing av MTB-stammer som representerer clustere påvist med RFLP tidligere - Ikke full overensstemmelse - ulike deler av genomet som undersøkes! 3. MIRU-testing av alle stammer som er testet med RFLP i , sammenligning av metoder og epidemiologisk konklusjon.

36 Oppgavefordeling innenfor laboratoriediagnostikk av tuberkulose Lab.nivå 1 Lab.nivå 2 Lab.nivå 3 (3-5) (6) (3) Direkte mikroskopi Direkte mikroskopi Direkte mikroskopi Videresende prøve Direkte PCR-påvisning Direkte PCR-påvisning Dyrkning Dyrkning Identifisere MTBC Endelig identifikasjon Sende kultur til Ref.lab Resistenstesting Melde til MSIS Sende kultur til Ref.lab (IGRA-test) Melde til MSIS IGRA-test Referanselaboratoriet: Endelig identifikasjon, utvidet resistenstesting, nasjonal stammebank, molekylærepidemiologisk overvåking, melder til MSIS Tuberkulosekonferanse mars 2013

37 Dir. mikroskopi Dyrkning Dyrkning, res.best., ident. Nasjonalt referanselab. Tuberkulosekonferanse mars 2013