TRANSKRIPSJONSFAKTORER

Transkript

1 TRANSKRIPSJONSFAKTORER Artikler: *Yang VW. Eukaryotic transkription factors: identification, characterization and functions. J Nutr 1998 Nov 128: *Chen L. Combinatorialgene regultion by eukaryotic transcription factors. Curr Opin Struct Biol. 9: , Familier: Helix-turn-helix Helix-loop-helix Leucine zippere Sink finger proteiner Andre familier Eks) p53 og NF-κB Metoder: EMSA (electrophoretic mobility shift assay) DNA footprint

2 Helix-turn-helix Satt sammen av to eller flere α-helixer, som igjen er bundet sammen av en kort utstrekt kjede av aminosyrer danner en bøy (turn) F α-helix 3 kalles gjenkjennelses helixen og bindes til hovedgropen (major groove) i DNA α-helix 3 fungerer som DNA-binding domenet To helix-turn-helix monomerer bindes som symmetriske dimerer. Monmerene holdes sammen ved assosiasjon av to antiparalelle β-tråder Fig De andre helixene kan binde seg direkte eller ved hjelp av ko-proteiner til transkripsjonskomplekset Kan fungere som aktivatorer og repressorer Eks) trp repressor phag λ repressor homeodomain porteiner spiller en viktig rolle i utviklingen av organer

3 Helix-Loop-Helix (HLH) Motif HLH består av en kort α-heliks bundet av en fleksibel løkke (loop) til en annen, vanligvis lengre α-heliks eller til to α-helikser med en kort aminosyre sekvens mellom (figur) Relatert til Leucine zipper. Det finnes strukturelle enheter bestående av både HLH- og Leucine zipper proteiner (eks. Max, figur i boka) N-terminal del på den lengste α-heliksen er DNA-bindende domene. C-terminal del på den korte α-heliksen har en netto minus ladning og er aktiveringsdomenet. Dimerisering danner både homo- og heterodimerer Noen HLH proteiner mangler den forlengede α-heliksen; disse avstumpede proteinene danner heterodimerer med de full-lengde HLH proteinene, men gir svakere bindinger til DNA pga redusert bindingsoverflate Heterodimerer kan derfor fungere som inhibitorer; en kontroll mekanisme til å inaktivere spesifikke gen regulatoriske proteiner (figur) HLH motiver er funnet i store mengder av transkripsjons aktivatorer Fam. Cellesyklus kontroll faktorer Subfam. Myc c-myc v-myc Subfam. Mad/Max Subfam. E2F

4 Leucine Zipper transkripsjonsfaktorer sekvens spesifikke DNA-bindende aktivatorer klassifisert i forskjellige familier utfra proteinstruktur. minst to funksjonelle domener; et DNA-bindende- og et aktiveringsdomene. leucine zipper har i tillegg et dimeriserings-domene. Klassifisering av leucine zipper (eller bzip) Proteiner som danner dimerer som inneholder et C- terminalt tvunnet coil dimeriseringsområde og et N- terminalt DNA bindende område stor underklasse i superklassen basiske domener. 7 kjente familier i denne klassen. eks. AP-1 like komponenter med 7 subfamilier, 8 undergrupper og flere sideordnede under-grupper av disse igjen f.eks. subfamiliene Jun og Fos, CREB- familien. Hydrofobe aminosyre sidekjedene (ofte leuciner) på hver av de monomere α-heliksene Danner en homo- eller hetero dimer som en tvunnet coil Y-formet struktur som som tillater sidekjedene deres å kontakte major groove på DNA

5 Leucine zipper motivet bidrar både til DNA binding og protein dimerisering. Dimeren griper tvers over DNA dobbelheliksen med et saksegrep, til to ved siden av hverandre liggende major groves adskilt med ca en halv dreining av dobbeltheliksen. Delen av α-heliksen som kontakter DNA inkluderer basiske seter som interagerer med fosfater i DNA ryggraden og i tillegg seter som interagerer med spesifikke baser i den store kløfta (major groove) på DNA. Kombinatorisk kontroll homo- eller heterodimerer. kombinasjon av proteiner i stedet for bare enkeltproteiner kooperativ binding til DNA Aktiveringsdomene polypeptidsekvens fusjonert med et DNA-bindende domene aktiverer transkripsjon fra et nærliggende promoter-enhancer område sammen andre proteiner.

6 Sure aktiveringsdomener, høy andel sure aminosyrer, er veldig fleksible og kan stimulere transkripsjon i nesten alle eukaryote celler. De ulike domenene i transkripsjonsfaktorer er bundet sammen av fleksible polypeptid områder. Aktiveringsdomener i ulike aktivatorer å kan interagere selv om DNA-bindingsdomenene deres sitter flere titalls baser fra hverandre. F.eks. kan Fos- Jun bundet til DNA interagere med NFAT og danne et kompleks som påvirker konformasjonen av DNA tråden i dette området og er med på å danne høyere ordens komplekser NMR spekter av isolerte aktiveringsdomener til CREB Ustrukturert tilfeldig coil.

7 I respons til økt camp fosforylerer PKA ser 133 i CREBs aktiveringsdomene og det skjer en konformasjonsendring som fremmer interaksjon med en spesifikk region i ko-aktivatoren CBP /p300. Fysisk interaksjon og aktivering av transkripsjon av målgener som inneholder en CRE sekvens. CBP/p300 interagerer også fysisk med transkripsjonsfaktorer som reguleres via andre signalspor, og har dessuten histon acetylase aktivitet.

8 Sink-finger-proteiner - Kjennetegn: har sink (Zn 2+ ) som en viktig komponent i det DNA-bindende domenet. - Figur 3.9: Èn sink-finger-enhet (zink finger motif) består av en α-heliks og en β-foldet plate* som holdes sammen av Zn 2+. (* Består egentlig av to antiparallelle β-foldede plater.) Navnet kommer av at den to-dimensjonale strukturen til zink-finger-enheten ligner en finger. - Sink er tetrahedrisk bundet til 4 aminosyrer; to fra α- heliksen og to fra β-sheet. Dette bidrar til å folde det DNA-bindende domenet til en kompakt struktur på polypeptidkjeden. - Hver transkribsjonsfaktor kan ha en eller flere sinkfinger-enheter i sitt DNA-bindende domene. - Det er α-heliksene som bindes til DNA i hovedgroper (major grooves) på DNAet. Transkribsjonsfaktorene med flere DNA-bindende α-helikser kan vikles rundt DNA. - Zink finger-proteiner inndeles i klasser, alt etter hvilke fire aminosyrer sink er bundet til. Vanligst er cystein og histidin. To av klassene er C 2 H 2 - og C 4 -sink-fingerproteiner.

9 Klasse 1. C 2 H 2 -sink-finger-proteiner - Kjennetegn: Sink er bundet til to cystein og to histidin. - Denne er en av de mest vanlige DNA-bindenede motifs blant eukaryote transkribsjonsfaktorer. - Generelt: De inneholder 3 eller flere finger-enheter per transkribsjonsfaktor og binder til DNA som momomere. - Figur a): Eks. 1. Transkribsjonsfaktoren GL 1 har 5 finger-enheter i DNA-bindende domene. 4 av disse binder til DNA via α-heliksene. - Eks. 2. Koaktvatoren TFIIA som er involvert i transkribsjonen av ribosomale gener og har 4 sinkfingre.

10 2. C 4 -sink-finger-proteiner - Kjennetegn: Sink er bundet til 4 cystein. - Har 2 sink-fingre i DNA-bindende domene og bindes til DNA som dimere; som homo- eller heterodimere. - Omfatter >100 transkribsjonsfaktorer. De fleste av disse er hormon-reseptorer/nukleære reseptorer. De er reseptorer for små, lipid-løselige hormoner som diffunderer gjennom plasma- og kjernemembranen. Hormonene bindes til hormon-reseptorene og regulerer deres aktivitet som transkribsjonsfaktorer. Eksempler på slike hormoner er østrogener, progesteron, thyroidhormoner, retinoider og kortikoider. - Figur b): Eks. Transkribsjonsfaktoren glukokortikoid-reseptor. Binder til DNA som homo-dimer, og èn α-heliks fra hver dimer bindes til DNA.

11 - Figur 10.64: Den generelle strukturen til C 4 -sink-fingerproteiner er: I N-terminal ende er det en varierende region med en eller flere transkribsjons-aktiverende domener. På midten av polypeptidkjeden fins det DNAbindende domenet, altså med to C 4 -sink-fingre. I C-terminal ende ligger det hormon/ligand-bindende domenet. Det transkribsjonsaktiverende domenet virker aktiverende på DNA-transkribsjonen bare når et hormon/ligand tilbundet den C-terminale enden. Da acetylerer de histoner DNA er kveilet opp på, og har interaksjon med andre faktorer, noe stimulerer dannelsen av et DNAreplikasjons-initieringskompleks. Heterodimerene kan være bundet til DNA uten å være bundet til en ligand, og vil i slike tilfeller virke hemmende på DNA-transkribsjonen ved å deacetylere histoner. Heterodimerene fins bare i kjernen. Figur 10.67: Homodimerene fins i cytoplasma som inaktive, og de er da bundet opp i spesielle komplekser. Ligandtilbinding medfører frigjøring av homodimeren, og den kan da gå inn i kjernen og virke aktiverende på DNAtranskribsjonen. Aktiviteten reguleres her av lokaliseringen av reseptoren. F.eks glukokortikoidreseptoren.

12 Figur 3.9. c) s. 59. En sink-finger-enhet (zink finger motif).

13 Figur a) s Ett C2H2-sink-finger-protein (GL1), bundet som en monomer til DNA. GL1 har 5 fingre, hvorav 4 er bundet til DNA via α-heliksene.

14 Figur b) s Glukokortikoid-reseptoren (et C4sink-finger protein) bundet til DNA som en homodimer.

15 Figur s Generell oppbygning av C 4 -sink-fingertranskribsjonsfaktorer (nuklære reseptorer).

16 Figur s Hormon-avhengig genaktivering av glukokortikoid-reseptoren (et C4-zink-finger-protein som binder som en homodimer til DNA NB! Dette vises ikke her!). GR = glukokortikoidreseptor AD = aktiverende domene DBD = DNA-bindende domene LBD = ligand-bindende domene Hsp90 = et inhibitorprotein for GR

17 EMSA Electrophoretic Mobility Shift Assay, Båndskifts assay Identifikasjon og karakterisering av transkripsjonsfaktorer bygger på deres evne til å gjenkjenne og binde seg til spesifikke DNA-sekvenser. Først merkes et lite DNA-fragment (<100 bp). Dette fragmentet inneholder en spesifikk DNA-sekvens man er interessert i å studere. Dette kan gjøres på flere måter. DNA merkes både radioaktivt og fluorescent. Deretter blandes det merkede DNA-fragmentet med en løsning som inneholder transkripsjonsfaktoren. Dette kan for eksempel være kjerneekstrakt som i større eller mindre grad er renset. Transkripsjonsfaktoren vil nå binde seg til DNA. Blandingen kjøres på en ikke-denaturerende polyakrylamidgel. DNA som har DNA bundet til seg vil vandre senere enn DNA uten protein bundet til seg. Transkripsjonsfaktoren kan identifiseres hvis man har antistoff mot den. Komplekset av DNA, transkripsjonsfaktor og antistoff vil nå vandre enda senere. Om bindingen mellom DNA og transkripsjonsfaktor er spesifikk, kan bestemmes ved å tilsette varierende mengder DNA med identisk eller forskjellig sekvens, som ikke merkes. Dette vil konkurrere med det merkede DNA om binding til transkripsjonsfaktoren. Hvis bindingen er spesifikk, vil økende mengde av DNA med samme sekvens føre til at intensiteten til båndet minker. Økende mengde av DNA med forskjellig sekvens vil ikke påvirke båndintensiteten.

18 Fig 1: EMSA

19 Fig. 2: Tilsetting av antistoff fører til at et kompleks som vandrer enda senere. Fig. 3: Undersøkelse av spesifisiteten til bindingen mellom protein og DNA.

20 DNA-footprinting En metode for å detektere og kartlegge spesifikke nukleinsyre-bindene proteiner. Et DNA-fragment merkes i den ene enden med et 32 P. Deler av prøven behandles med DNase I i nærvær og i fravær av protein som bindes til spesifikke sekvenser i DNA-fragmentet (f.eks. transkripsjonsfaktorer). DNAse I hydrolyserer fosfodiester-bindingene i DNAet mellom 3 oksygenet på deoxyribosen på det ene nukleotidet og 5 fosfatet på det neste nukleotidet uspesifikt (i motsetning til f.eks. restriksjons-enzymer). Sagt på en enklere måte: DNA et kuttes tilfeldig. Det brukes lave konsentrasjoner av Dnase I, slik at hvert DNA-molekyl kuttes gjennomsnittelig kun èn gang. I fravær av DNA-bindene protein, vil DNA et i prøven kuttes i alle mulige posisjoner mellom den merkede og den umerkede enden av original-fragmentet. DNA som har protein bundet til seg blir ikke kuttet i området der proteinet er bundet. De to DNA-prøvene (med og uten protein) blir så separert fra protein, denaturert til enkelt-tråder, og kjørt på gel-elektroforese. Gelen blir analysert v.hj.a. autoradiogarfi..kun merkede tråder detekteres og avslører fragmentets størrelse, som vil gå fra den 32 P-merket enden til Dnase I kutte-setet. EMSA vs DNA-footprinting

21 - Ved bruk EMSA er det mulig å observere et shifted bånd selv om det kun er en liten mengde DNAfragmenter med bundet protein.. - Ved DNA-footprinting må større mengder DNA-fragmenter m/ protein være tilstede for at det skal være mulig å detektere savnede bånd/footprints. - Av praktiske grunner brukes derfor kanskje EMSA oftere, selv om DNA-footprinting er kan være informativ.